CN113913300A - 一种以秸秆发酵产球毛壳菌孢子液的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，过程包括：将秸秆、麸皮、玉米粉按照20％、44％、36％的质量配比混合成混合料，制备发酵培养基；将球毛壳菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，25‑28℃培养21d，得发酵料；将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。本发明控制了发酵温度、原料配比和发酵时间，得到的菌剂中活菌数较多，可显著促进植物的生长。

Description

一种以秸秆发酵产球毛壳菌孢子液的方法及应用
技术领域
本发明涉及球毛壳菌发酵技术领域，更具体地说是涉及一种以秸秆发酵产球毛壳菌孢子液的方法及应用。
背景技术
在杀菌剂的研发中，从植物或微生物中提取具有抗病原菌活性的天然物质发挥着重要的潜力作用。植物体中的内生真菌，作为一种新的微生物资源及其产生的天然活性物质，已经得到了越来越多的关注。
球毛壳菌是毛壳属中的重要菌群，属于子囊菌亚门(Aseomyeotina)、核菌纲(Pyrenomyeetes)、球壳目(Sphaeriales)、黑孢壳科(Melanosporaceae)、毛壳菌属(Chaetomium spp.)，是常见的植物内生真菌，广泛分布于空气、土壤等多种自然环境中，对多种植物病害具有潜在的生物防治作用。生防菌规模化生产的基础是发酵工艺的优化，而发酵工艺的基本目标是降低成本，简化工艺流程，获得最大产孢量或次生代谢物。目前尚未有通过秸秆对球毛壳菌进行发酵的具体配方及配比的报道，其对植物的促生作用有待进一步的推广和应用。
因此，如何提供一种以秸秆发酵产球毛壳菌孢子液的方法，并将其进一步应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，控制了发酵温度、原料配比和发酵时间，得到的菌剂中活菌数较多，可显著促进植物的生长。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，包括下述过程：
1)制备发酵培养基：将秸秆、麸皮、玉米粉按照20％、44％、36％的质量配比混合成混合料，制备发酵培养基；
2)菌株培养：将球毛壳菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，25-28℃培养21d，得发酵料；
3)水洗分离：将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；
4)制备菌剂：按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。
作为相同的发明构思，以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，还可以为：
步骤1)中，将制备发酵培养基的过程替换为：将秸秆、玉米粉按照30％、70％的质量配比混合，制备发酵培养基。
作为上述技术方案优选的技术方案，步骤1)中，所述秸秆的长度为2cm，且用水浸泡12h；所述发酵为向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置1-2d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基。
作为上述技术方案优选的技术方案，步骤2)中，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基的原料包括：去皮马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。
作为上述技术方案优选的技术方案，步骤3)中，球毛壳菌孢子液中孢子数为1.4×108个/g或9×107个/g。
作为上述技术方案优选的技术方案，步骤4)中，所述羧甲基纤维素钠溶液的质量分数为4％。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述球毛壳菌菌株为球毛壳菌12XP1-2-3。
作为一个相同的发明构思，上述制备方法制备得到的球毛壳菌菌剂在促进植物生长中的应用。
作为本发明优选的技术方案，所述球毛壳菌菌剂应用于增加棉花株高、根长、茎秆鲜重和茎秆干重中。
作为本发明优选的技术方案，所述球毛壳菌菌剂应用于增加玉米株高、根长、鲜重和干重中。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供的球毛壳菌12XP1-2-3菌株于2019年1月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17183，分类命名为球毛壳菌Chaetomium globosum；同时提供了一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，采用的原料为秸秆、麸皮和玉米粉，生产成本低，产孢量高，田间试验结果表明使用球毛壳菌12XP1-2-3进行种子包衣处理后，能够促进玉米和棉花的生长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为不同发酵培养基培养21天后的产孢量；其中，a表示1号培养基，b表示2号培养基，c表示3号培养基，d表示4号培养基，e表示5号培养基，f表示麦粒培养基；
图2附图为球毛壳菌拌种对玉米和棉花的促生效果；其中，A表示播种15天后的玉米，左边为不使用球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理后的玉米，右边表示使用球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理后的玉米；B表示播种25天后不使用球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理后的棉花；C表示播种25天后使用球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理后的棉花。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法。
本发明公开提供的球毛壳菌12XP1-2-3菌株于2019年1月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17183，分类命名为球毛壳菌Chaetomium globosum
实施例1
以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，包括下述过程：
1)制备发酵培养基：将麦秆的长度设置为2cm，用水浸泡12h，将秸秆、麸皮、玉米粉按照20％、44％、36％的质量配比混合成混合料，向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置2d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基；
2)菌株培养：将球毛壳菌12XP1-2-3菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，25℃培养21d，得发酵料；
3)水洗分离：将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；孢子中的活菌数量为1.4×108个/ml；
4)制备菌剂：按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至质量分数为4％的羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。
实施例2
以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，包括下述过程：
1)制备发酵培养基：将麦秆的长度设置为2cm，用水浸泡12h，将秸秆、麸皮、玉米粉按照20％、44％、36％的质量配比混合成混合料，向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置1d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基；
2)菌株培养：将球毛壳菌12XP1-2-3菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，28℃培养21d，得发酵料；
3)水洗分离：将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；
4)制备菌剂：按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至质量分数为4％的羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。
实施例3
以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，包括下述过程：
1)制备发酵培养基：将麦秆的长度设置为2cm，用水浸泡12h，将秸秆、麸皮、玉米粉按照20％、44％、36％的质量配比混合成混合料，向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置1.5d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基；
2)菌株培养：将球毛壳菌12XP1-2-3菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，25℃培养21d，得发酵料；
3)水洗分离：将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；孢子中的活菌数量为1.4×108个/ml；
4)制备菌剂：按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至质量分数为4％的羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。
实施例4
以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，包括下述过程：
1)制备发酵培养基：将麦秆的长度设置为2cm，用水浸泡12h，将秸秆、麸皮、玉米粉按照30％、70％的质量配比混合成混合料，向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置1d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基；
2)菌株培养：将球毛壳菌12XP1-2-3菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，25℃培养21d，得发酵料；
3)水洗分离：将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；
4)制备菌剂：按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至质量分数为4％的羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。
实施例5
以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，包括下述过程：
1)制备发酵培养基：将麦秆的长度设置为2cm，用水浸泡12h，将秸秆、玉米粉按照30％、70％的质量配比混合成混合料，向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置1.5d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基；
2)菌株培养：将球毛壳菌12XP1-2-3菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，28℃培养21d，得发酵料；
3)水洗分离：将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；
4)制备菌剂：按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至质量分数为4％的羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。
实施例6
以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，包括下述过程：
1)制备发酵培养基：将麦秆的长度设置为2cm，用水浸泡12h，将秸秆、玉米粉按照30％、70％的质量配比混合成混合料，向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置2d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基；
2)菌株培养：将球毛壳菌12XP1-2-3菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，26℃培养21d，得发酵料；
3)水洗分离：将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；
4)制备菌剂：按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至质量分数为4％的羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。
实施例7不同温度下球毛壳菌生长速度比较
用无菌牙签挑取球毛壳菌12XP1-2-3菌饼置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，原料组成为：去皮马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g及蒸馏水1000ml)平板上，在20℃下培养5-7天后，从菌落边缘打取直径为5mm的菌丝块，接种在直径9cm的PDA平板中央，每个平板接种1个菌丝块，分别置于20℃、25℃、28℃、30℃和35℃温度下培养，每个温度4个重复，每24h测量球毛壳菌菌落直径，至生长速度最快的温度下平板长满球毛壳菌菌落，计算不同处理球毛壳菌菌丝每日生长速度，见表1
表1球毛壳菌12XP1-2-3在不同温度下的生长速度
Figure BDA0003350038280000061
Figure BDA0003350038280000071
由表1可知，球毛壳菌的生长受温度影响较大，在20℃下，平均生长速度仅为0.20cm/天，随着培养温度的升高，菌丝生长速度加快。在25℃下，平均生长速度为0.49cm/天，在28℃下达到最高值，为0.64cm/天，随着温度的进一步升高，菌丝生长受到抑制，在35℃下，平均生长速度下降到0.10cm/天。25℃和28℃温度下，菌丝的平均生长速度与其他温度条件相比，在0.05和0.01水平上均有显著性差异。因此球毛壳菌的最佳培养温度为25-28℃。
实施例8不同发酵配方培养不同天数后的产孢量比较
将麦秆剪成2cm片段，用水浸泡12h，然后与麸皮和玉米粉按照表2的不同比例进行混合，加水量0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋后灭菌1h，放置1-2天后，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基，不同比例培养基进行编号，分别为1、2、3、4和5，并以灭菌两次的麦粒作为对照培养基。将球毛壳菌12XP1-2-3接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在25℃下培养15天后，将菌饼接种到不同发酵培养基上，每袋接种一个培养皿的菌饼量，封袋后将菌饼揉碎，并与发酵培养基混合均匀。25℃温度下培养，在培养7天、10天、14天、21天时，分别统计产孢量。具体方法为：对每袋发酵料进行称重，加一定量的水洗搓，静置30-60min后，用三层纱布过滤，得到球毛壳菌12XP1-2-3孢子液，用血球计数板统计孢子浓度，用如下公式获得产孢量：
Figure BDA0003350038280000072
表2不同培养基成分含量
Figure BDA0003350038280000073
Figure BDA0003350038280000081
表3不同培养基在不同培养天数后的产孢量比较
Figure BDA0003350038280000082
由表3可知，球毛壳菌在1号培养基上产孢最快，在10天已达到0.35亿/每克，培养14天后达到0.9214亿/克，21天后达到1.4286亿/克；其次是5号培养基，培养21天后产孢量达0.9亿/克，而麦粒培养基在培养21天后仅有0.1192亿/克。因此最佳培养配方为1号培养基，即麦秆、麸皮和玉米粉按照20％、44％和36％的质量百分比进行混合，加水量0.5mL/g。
图1表示不同发酵料培养21天后的产孢量，由图1可知，图a是1号培养基，其产生的孢子量最多，颜色最黑，其次是图e，即5号培养基，图c是3号培养基，产生的孢子量最少。
实施例9球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣对玉米生长的影响
球毛壳菌种子包衣处理
将麦秆的长度设置为2cm，用水浸泡12h，将秸秆、麸皮、玉米粉按照20％、44％、36％的质量配比混合成混合料，向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置1.5d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基；将球毛壳菌12XP1-2-3菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，25℃培养21d，得发酵料，水洗分离，得球毛壳菌孢子液，按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至质量分数为4％的羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。将该菌剂按照每千克20mL的比例与玉米和棉花种子混合均匀，晾干后播种。
田间试验调查
在温室进行盆栽试验，将沙土与蛭石按照2：1的体积比混合均匀，装入营养钵中，选取本实施例制备的球毛壳菌12XP1-2-3生防菌剂玉米种子包衣处理组和空白对照处理组(即该区域玉米种子在种植时不采用球毛壳菌12XP1-2-3生防菌剂进行包衣处理)进行播种，5天后统计出苗率。15天后测量玉米株高、根长、鲜重和干重。每个处理3个重复，每个重复10株。试验采用SPASS软件对试验结果进行LSD法方差分析。
结果见表4。
表4球毛壳菌12XP1-2-3包衣对玉米生长的影响
出苗率(％) 株高(cm) 根长(cm) 鲜重(g) 干重(g)
球毛壳拌种 96 38.29±1.13 21.83±0.83 3.99±0.09 0.427±0.028
空白对照 98 34.38±0.70 20.61±0.62 3.25±0.12 0.309±0.032
显著性 - 0.043 0.307 0.008 0.040
增长率(％) - 11.37 5.92 22.77 38.19
由表4可知，与空白对照相比，球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理对玉米出苗率没有影响，对株高、鲜重和干重均有明显促进作用，在0.05水平上有显著差异，其中鲜重在0.01水平上有极显著差异；对根长也有促进作用，但在0.05水平上没有显著差异。与空白对照相比，球毛壳菌拌种处理的玉米株高增长了11.37％，根长增长了5.92％，鲜重增加了22.77％，干重增加了38.19％。
由图2所示，A表示播种15天后的玉米，左边为空白对照，右边为球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理后的玉米，株高明显比空白对照高，说明球毛壳菌种子包衣对玉米生长有促进作用。
实施例10球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣对棉花生长的影响
用球毛壳菌12XP1-2-3对棉花种子包衣处理方法同上述实施例9的方法。试验于2021年6月10日在河南省新乡市原阳县境内的河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地进行播种。分别选取100粒棉花种子，在播种后12天统计出苗率。在播种后25天，选取球毛壳菌12XP1-2-3生防菌剂棉花种子包衣处理组和空白对照处理组(即该区域棉花种子在种植时不采用球毛壳菌12XP1-2-3生防菌剂进行包衣处理)的各3个点，每点10株苗，测量棉花株高、根长、鲜重和干重。试验采用SPASS软件对试验结果进行LSD法方差分析。
表5球毛壳菌12XP1-2-3包衣对棉花生长的影响
出苗率(％) 株高(cm) 根长(cm) 鲜重(g) 干重(g)
球毛壳拌种 76.9 22.10±0.53 7.05±0.41 6.09±0.44 1.14±0.10
空白对照 70.8 19.97±0.69 6.57±0.39 4.82±0.41 0.85±0.07
显著性 - 0.020 0.402 0.042 0.089
增长率(％) - 10.67 7.31 26.35 34.12
由表5可知，球毛壳菌种子包衣处理对棉花株高和鲜重均有明显促进作用，在0.05显著性水平上差异显著；对棉花根长和干重也有促进作用，但在0.05水平上差异不显著。与空白对照相比，球毛壳菌包衣处理的棉花株高增长了10.67％，根长增长了7.31％，鲜重增加了26.35％，干重增加了34.12％。
由图2所示，B为播种后25天的空白对照棉花，C为同期球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理的棉花，说明球毛壳菌种子包衣对棉花生长有促进作用。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，其特征在于，包括下述过程：
1)制备发酵培养基：将秸秆、麸皮、玉米粉按照20％、44％、36％的质量配比混合成混合料，制备发酵培养基；
2)菌株培养：将球毛壳菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养15d，然后挑取菌落接种到所述发酵培养基上，25-28℃培养21d，得发酵料；
3)水洗分离：将所述发酵料进行水洗分离，得球毛壳菌孢子液；
4)制备菌剂：按照体积比3:1的比例将所述球毛壳菌孢子液分散至羧甲基纤维素钠溶液中，得球毛壳菌菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，其特征在于，步骤1)中，将制备发酵培养基的过程替换为：将秸秆、玉米粉按照30％、70％的质量配比混合发酵，制备发酵培养基。
3.根据权利要求1或2所述的一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，其特征在于，步骤1)中，所述秸秆的长度为2cm，且用水浸泡12h；所述发酵为向混合料中加水，加水量为0.5mL/g，搅拌均匀，装入发酵袋灭菌1h，放置1-2d，再次灭菌30min，制成所需的发酵培养基。
4.根据权利要求3所述的一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，其特征在于，步骤2)中，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基的原料包括：去皮马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。
5.根据权利要求3所述的一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，其特征在于，步骤3)中，球毛壳菌孢子液中孢子数为1.4×108个/g或9×107个/g。
6.根据权利要求3所述的一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，其特征在于，步骤4)中，所述羧甲基纤维素钠溶液的质量分数为4％。
7.根据权利要求4-6任一所述的一种以秸秆发酵产球毛壳菌菌剂的方法，其特征在于，所述球毛壳菌菌株为球毛壳菌12XP1-2-3。
8.根据权利要求7的制备方法制备得到的球毛壳菌菌剂在促进植物生长中的应用。
9.根据权利要求8所述的球毛壳菌菌剂在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述球毛壳菌菌剂应用于增加棉花株高、根长、茎秆鲜重和茎秆干重中。
10.根据权利要求8所述的球毛壳菌菌剂在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述球毛壳菌菌剂应用于增加玉米株高、根长、鲜重和干重中。
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