CN113912747B - 一种连续提取黄精皂甙和黄精多糖的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种连续提取黄精皂甙和黄精多糖的工艺，将139.6g的氯化胆碱与120.1‑240.2g的尿素混合(即摩尔比控制在1：2‑4)，在80℃的水浴锅中磁力搅拌2‑3h,直到形成透明溶液，然后在60℃真空干燥箱中干燥36h,即得深度共熔溶剂氯化胆碱/尿素，保藏在干燥器中，黄精皂苷制备：将滤液置于分液漏斗中，分别加入等体积的正丁醇，提取3次，合并正丁醇，旋转蒸发除去正丁醇，得到粗制黄精皂苷，备用，将粗制皂苷用70％乙醇稀释至约1.0mg/mL上样，采用湿法装柱，AB‑8型大孔树脂，装入层析柱(15mm*500mm)中，柱体积为50mL，收集70％乙醇浓度的洗脱液，蒸发浓缩除去乙醇，真空冷冻干燥至恒重，得到高纯度黄精皂苷。

Description

一种连续提取黄精皂甙和黄精多糖的工艺
技术领域
本发明涉及食品加工领域，具体是一种连续提取黄精皂甙和黄精多糖的工艺。
背景技术
黄精是百合科植物的干燥根茎，也是我国卫生部认定的药食同源资源之一，作为传统中草药中最常用的药物，中医认为其具有增气、滋阴、润肺、健脾的功效，现代研究表明其主要的活性化学成分有皂苷、多糖、黄酮类，具有降血糖、降血脂、抗菌、提高免疫、改善睡眠等作用。
目前，对黄精皂苷和多糖的提取方法主要有有机溶剂提取法、超声波法、微波法、酶法以及超声波辅助酶法等，一般来说,生物活性物质的提取得率与其相关理化性质,包括H-bonding交互、粘度、极性和pH值等密不可分，由于其复杂的物理化学性质,目前鲜有简单、绿色的提取方法，基于上述，本文利用深度共熔溶剂氯化胆碱/尿素对植物细胞壁具有溶解破坏作用，以及复合纤维素酶和果胶酶共同进行黄精皂苷和黄精多糖的提取，致力于构建一种环保、高效的提取方法。
发明内容
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种连续提取黄精皂甙和黄精多糖的工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：氯化胆碱/尿素的制备：将139.6g的氯化胆碱与 120.1-240.2g的尿素混合(即摩尔比控制在1：2-4)，在80℃的水浴锅中磁力搅拌2-3h,直到形成透明溶液，然后在60℃真空干燥箱中干燥36h,即得深度共熔溶剂氯化胆碱/尿素，保藏在干燥器中，待用。
步骤2：用蒸馏水配置提取溶液，包含20-40％氯化胆碱/尿素和20-40％乙醇，然后添加至80目的黄精粉中并搅拌均匀，超声提取后得到含黄精皂苷和多糖的粗提液。
步骤3.：所述黄精粉与提取液的料液比在1：10-25g/mL。
步骤4：加入1-3％的纤维素酶和果胶酶(双酶质量比为1：5)。
步骤5：提取过程中，超声温度在40-70℃，超声时间在30-90 min,柠檬酸调节提取液pH 5.0，提取结束后，煮沸灭酶活20min，趁热过滤。
步骤6：黄精皂苷制备：将滤液置于分液漏斗中，分别加入等体积的正丁醇，提取3次，合并正丁醇，旋转蒸发除去正丁醇。得到粗制黄精皂苷，备用，将粗制皂苷用70％乙醇稀释至约 1.0mg/mL上样，采用湿法装柱，AB-8型大孔树脂，装入层析柱 (15mm*500mm)中，柱体积为50mL，收集70％乙醇浓度的洗脱液，蒸发浓缩除去乙醇，真空冷冻干燥至恒重，得到高纯度黄精皂苷。
步骤7：黄精多糖的制备：向萃取后的提取液中加入5倍体积无水乙醇并搅拌均匀，于4℃下静置过夜，4000rpm离心20min，经无水乙醇洗涤3次，真空冷冻干燥至恒重，得到黄精多糖。
步骤8：称量黄精皂苷和多糖的重量，提取率分别为14.28％、 21.77％。
步骤9：黄精皂苷纯度鉴定：高效液相色谱(HPLC)分析，色谱条件：Hyper 0DS2 C18色谱柱(4.6×250mm)，柱温25℃，检测波长203nm，流动相为乙腈：水(75:25，v:v)，流速1.0mL/min，进样量20μL，根据样品峰面积占比分析化合物纯度。
步骤10：测定黄精多糖的羟基自由基清除率和DPPH清除率，
本发明进一步改进为：氯化胆碱和尿素的摩尔比为1：3，在 60℃真空干燥箱内干燥24h。
本发明进一步改进为：黄精粉末过80目筛，按照料液比1:20 (g/mL)加入提取液，加入提取结束后，煮沸灭酶活20min，趁热过滤。
本发明进一步改进为：添加2％的纤维素酶和果胶酶(双酶质量比为1：5)，提取液pH 5.0，50℃超声提取1h。
本发明进一步改进为：将粗制皂苷用70％乙醇稀释至约 1.0mg/mL上样，采用湿法装柱，AB-8型大孔树脂，装入层析柱 (15mm*500mm)中，柱体积为50mL。
本发明进一步改进为：向萃取后的提取液中加入5倍体积无水乙醇并搅拌均匀，于4℃下静置过夜，4000rpm离心20min，经无水乙醇洗涤3次。
具体实施方式
实施例一
1.深度共熔溶剂制备，将纯度为99％的氯化胆碱和尿素在 60℃真空干燥箱内干燥24h后，按照1:2，1：3，1：4的摩尔比混合，装于50mL圆底烧瓶中，塞上塞子，在100℃水浴锅内，300rpm 转速下搅拌加热约2～3h，直至形成均一、透明的溶液，冷却至室温，在60℃的真空干燥箱内干燥36h后转移至干燥器内密封保存，用前将氯化胆碱/尿素，乙醇和蒸馏水按一定比例混合，得到氯化胆碱/尿素浓度为20％，乙醇浓度为40％的提取液。
2.将黄精切片后烘干，再用中药粉碎机磨碎打粉，过80目筛，细粉装袋室温干燥器内保存。
3.提取：称量黄精粉末，按照料液比1:20(g/mL)加入提取液，加入1％的纤维素酶和果胶酶(双酶质量比为1：5)，调节 pH 5.0，然后在50℃超声提取1h，提取结束后，煮沸灭酶活20min，趁热过滤。
4.黄精皂苷纯化：将滤液置于分液漏斗中，分别加入等体积的正丁醇，提取3次，合并正丁醇，旋转蒸发除去正丁醇，得到粗制黄精皂苷，备用，将粗制皂苷用70％乙醇稀释至约1.0mg/mL 上样，采用湿法装柱，AB-8型大孔树脂，装入层析柱(15mm*500mm) 中，柱体积为50mL，先用去离子水洗脱其他杂质，再用70％的乙醇溶液洗脱并收集直至皂苷洗脱完全，蒸发浓缩除去乙醇，真空冷冻干燥至恒重，得到高纯度黄精皂苷，经HPLC测定皂苷纯度。
5.黄精多糖的制备：向萃取后的提取液中加入5倍体积无水乙醇并搅拌均匀，于4℃下静置过夜，4000rpm离心20min，经无水乙醇洗涤3次，真空冷冻干燥至恒重，得到黄精多糖。
摩尔比 1：2 1：3 1：4
黄精皂苷得率(％) 10.02 12.94 12.13
黄精多糖得率(％) 15.11 17.17 17.11
实施例二
1.深度共熔溶剂制备，将纯度为99％的氯化胆碱和尿素在 60℃真空干燥箱内干燥24h后，按照1：3的摩尔比混合，装于 50mL圆底烧瓶中，塞上塞子，在100℃水浴锅内，300rpm转速下搅拌加热约2～3h，直至形成均一、透明的溶液，冷却至室温，在60℃的真空干燥箱内干燥36h后转移至干燥器内密封保存，用前将氯化胆碱/尿素，乙醇和蒸馏水按一定比例混合，得到氯化胆碱/尿素浓度为20％，乙醇浓度为40％的提取液。
2.将黄精切片后烘干，再用中药粉碎机磨碎打粉，过80目筛，细粉装袋室温干燥器内保存。
3.提取：称量黄精粉末，按照料液比1:20(g/mL)加入提取液，加入1％、2％、3％的纤维素酶和果胶酶(双酶质量比为1：5)，调节pH 5.0，然后在50℃超声提取1h，提取结束后，煮沸灭酶活20min，趁热过滤。
4.黄精皂苷纯化：将滤液置于分液漏斗中，分别加入等体积的正丁醇，提取3次，合并正丁醇，旋转蒸发除去正丁醇，得到粗制黄精皂苷，备用，将粗制皂苷用70％乙醇稀释至约1.0mg/mL 上样，采用湿法装柱，AB-8型大孔树脂，装入层析柱(15mm*500mm) 中，柱体积为50mL，先用去离子水洗脱其他杂质，再用70％的乙醇溶液洗脱并收集直至皂苷洗脱完全，蒸发浓缩除去乙醇，真空冷冻干燥至恒重，得到高纯度黄精皂苷，经HPLC测定皂苷纯度。
5.黄精多糖的制备：向萃取后的提取液中加入5倍体积无水乙醇并搅拌均匀，于4℃下静置过夜，4000rpm离心20min，经无水乙醇洗涤3次，真空冷冻干燥至恒重，得到黄精多糖。
酶量％ 1 2 3
黄精皂苷得率(％) 12.94 14.28 13.11
黄精多糖得率(％) 17.17 21.77 21.18
实施例二
1.深度共熔溶剂制备，将纯度为99％的氯化胆碱和尿素在 60℃真空干燥箱内干燥24h后，按照1：3的摩尔比混合，装于 50mL圆底烧瓶中，塞上塞子，在100℃水浴锅内，300rpm转速下搅拌加热约2～3h，直至形成均一、透明的溶液，冷却至室温，在60℃的真空干燥箱内干燥36h后转移至干燥器内密封保存，用前将氯化胆碱/尿素，乙醇和蒸馏水按一定比例混合，得到氯化胆碱/尿素浓度为20％，乙醇浓度为40％的提取液。
2.将黄精切片后烘干，再用中药粉碎机磨碎打粉，过80目筛，细粉装袋室温干燥器内保存。
3.提取：称量黄精粉末，按照料液比1:10-25(g/mL)加入提取液，加入2％的纤维素酶和果胶酶(双酶质量比为1：5)，调节pH 5.0，然后在50℃超声提取1h，提取结束后，煮沸灭酶活 20min，趁热过滤。
4.黄精皂苷纯化：将滤液置于分液漏斗中，分别加入等体积的正丁醇，提取3次，合并正丁醇，旋转蒸发除去正丁醇，得到粗制黄精皂苷，备用，将粗制皂苷用70％乙醇稀释至约1.0mg/mL 上样，采用湿法装柱，AB-8型大孔树脂，装入层析柱(15mm*500mm) 中，柱体积为50mL，先用去离子水洗脱其他杂质，再用70％的乙醇溶液洗脱并收集直至皂苷洗脱完全，蒸发浓缩除去乙醇，真空冷冻干燥至恒重，得到高纯度黄精皂苷，经HPLC测定皂苷纯度。
5.黄精多糖的制备：向萃取后的提取液中加入5倍体积无水乙醇并搅拌均匀，于4℃下静置过夜，4000rpm离心20min，经无水乙醇洗涤3次，真空冷冻干燥至恒重，得到黄精多糖。
料液比(g/mL) 1：10 1：20 1：25
黄精皂苷得率(％) 11.91 14.28 14.00
黄精多糖得率(％) 19.47 21.77 20.12
HPLC测定黄精皂苷的纯度为89.13±1.23％。
测定黄精多糖的羟基自由基清除率、DPPH清除率。
羟基自由基清除率(％) DPPH清除率(％)
黄精多糖 25.3 40.1
羟基自由基清除率(％)测定方法修改如下：配制8mmol/L的FeSO4溶液、20mmol/L的H2O2和3mmol/L水杨酸，取0.335mL 样液与0.1mL FeSO4、0.335mL水杨酸及0.08mL H2O2混匀， 37℃水浴30min，冷却后补足至体积为1mL，8000rpm离心10 min后于510nm波长处测定上清液吸光值，分别以蒸馏水代替样品和H2O2溶液作为空白组和对照组，以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照组，0.5mmol/L Vc的羟自由基清除率为27.3％。
DPPH清除率(％)测定方法修改如下：2mL不同浓度多糖溶液液加入2mL新配制的0.2mmol/L DPPH溶液，混匀后在37℃避光水浴30min，后在波长517nm处测定吸光值，用无水乙醇代替样品做为空白对照组，以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照组，0.5 mmol/L Vc的DPPH自由基清除率为61.8％。
凡是依据本发明中的设计精神所作出的等效变化或修饰或等比例放大或缩小等，均应认为落入本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种连续提取黄精皂苷和黄精多糖的工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：氯化胆碱/尿素的制备：将139.6g的氯化胆碱与120.1-240.2g的尿素混合，即摩尔比控制在1:2-4,在80℃的水浴锅中磁力搅拌2-3h,直到形成透明溶液，然后在60℃真空干燥箱中干燥36h,即得深度共熔溶剂氯化胆碱/尿素，保藏在干燥器中，待用；
步骤2：用蒸馏水配置提取溶液，包含20-40％氯化胆碱/尿素和20-40％乙醇，然后添加至80目的黄精粉中并搅拌均匀，超声提取后得到含黄精皂苷和多糖的粗提液；
步骤3：所述黄精粉与提取液的料液比在1:10-25g/mL；
步骤4：加入1-3％的纤维素酶和果胶酶,双酶质量比为1:5；
步骤5：提取过程中，超声温度在40-70℃，超声时间在30-90min,柠檬酸调节提取液pH5.0，提取结束后，煮沸灭酶活20min，趁热过滤；
步骤6：黄精皂苷制备：将滤液置于分液漏斗中，分别加入等体积的正丁醇，提取3次，合并正丁醇，旋转蒸发除去正丁醇，得到粗制黄精皂苷，备用，将粗制皂苷用70％乙醇稀释至1.0mg/mL上样，采用湿法装柱，AB-8型大孔树脂，装入层析柱(15mm*500mm)中，柱体积为50mL，收集70％乙醇浓度的洗脱液，蒸发浓缩除去乙醇，真空冷冻干燥至恒重，得到高纯度黄精皂苷；
步骤7：黄精多糖的制备：向萃取后的提取液中加入5倍体积无水乙醇并搅拌均匀，于4℃下静置过夜，4000rpm离心20min，经无水乙醇洗涤3次，真空冷冻干燥至恒重，得到黄精多糖。
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