CN113905752A - 治疗白癜风的五环三萜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含至少一种五环三萜或其一种药学上可接受的盐的药物组合物，其用于治疗和/或预防白癜风的用途。

Description

治疗白癜风的五环三萜

技术领域

本发明涉及包含至少一种五环三萜的药物组合物，其用于治疗白癜风的用途。

背景技术

白癜风是一种皮肤感染，其特征在于手、脚、脸或身体任何其他部位出现白斑。这些斑是由脱色引起的，即黑色素细胞消失。脱色的严重程度不同，白斑大小不一。在某些情况下，脱色的区域内生长的身体或头部的毛发也是白色的。白癜风既不是传染性的，也不是疼痛的，但其会引起严重的心理困扰。事实上，白癜风通常是被最小化，并且医生对其管理不足。深色皮肤的个体最容易患这种病。白癜风影响世界人口的0.5％到1％，所有种族加起来。其通常出现在10岁至30岁之间，其中一半患者在20岁之前受到影响。因此，白癜风在幼儿中相当罕见。其影响男人和女人。

白癜风有几种类型：

-节段性白癜风，位于身体一侧，例如面部、上身、腿部或手臂的一部分。这种形式的白癜风更常见于儿童或青少年。脱色的区域对应于神经支配区域，即由特定神经支配的皮肤区域。这种形式在几个月内迅速出现，然后通常停止发展。

-全身性白癜风，以斑的形式出现，通常相对对称，影响身体两侧，特别是反复摩擦或压迫的区域。广义的这一术语并不一定意味着斑是广泛的。这种演变是不可预测的，因为斑可能仍然很小且局部的或迅速扩散。

-普遍性白癜风，较少见，迅速扩散，且几乎可以影响全身。

最常见的情况是，这种疾病以不可预测的速度发展，并可能在没有明显原因的情况下停止或扩散。白癜风可以分阶段发展，有时在心理或身体触发事件后恶化。在极少数情况下，斑会自行消失。除了美感受损外，白癜风不是一种严重的疾病。然而，白癜风患者患皮肤癌的风险增加，因为脱色的区域不再是阻挡太阳光线的屏障。这些人也更有可能患上其他自身免疫性疾病。

白癜风的病因尚不清楚，尽管已知白斑的出现是由于黑色素细胞的破坏。现在已经提出了几个假说来解释黑色素细胞的破坏。白癜风很可能是一种遗传性、环境性和自身免疫性起源的疾病。白癜风是一种具有强烈自身免疫成分的疾病。事实上，白癜风患者会产生异常抗体，该异常抗体会直接攻击黑色素细胞并帮助破坏它们。此外，白癜风通常与其他自身免疫性疾病相关，如甲状腺疾病，这表明了常见的机制。白癜风也与遗传因素有关，并不是所有的遗传因素都已被明确确认。在同一个家庭中，多人患白癜风是很常见的。据信，至少有10个基因参与其中。根据几项研究，白癜风患者的黑色素细胞积累大量自由基，导致黑色素细胞自我破坏。

在最近的文献中，有两个假说引起了研究者的注意。第一个聚焦于黑色素细胞死亡，这被认为是由于CD8“杀手”T淋巴细胞。第二个假设是基于黑色素细胞分离(détachement)，E-钙粘蛋白提供的黑色素细胞-角质形成细胞粘附在该病理过程中受到影响，该蛋白被9型金属蛋白酶(MMP-9)特异性降解。当角质形成细胞经受氧化应激或诱导因子如分化的CD4 T淋巴细胞(Th17)产生的白细胞介素17(IL-17)时，MMP-9由角质形成细胞过度产生。MMP-9特异性降解E-钙粘蛋白并导致黑色素细胞失去与角质形成细胞的粘附(Boukhedouni等人,Pigment Cell Melanoma Research,31(6),P003,756–757,2018)。此外，淋巴细胞产生的IL-17在角质形成细胞中诱导促炎细胞因子和趋化因子，后者也对黑色素细胞产生有害作用，导致其黑色素生成功能受损(Kotobuki等人,Pigment CellMelanoma Research,25(2),219–230,2012)。

到目前为止，现有的治疗方法是广泛的。有UVB光疗、准分子激光局部治疗、外科治疗、细胞移植。所有这些治疗方法都有风险，而且副作用可能很大。对于白癜风所考虑的新治疗方法是通过注射施用的生物分子。能够特异性抑制Th17通路的抗体目前正在临床试验中。这也有缺点，因为这些治疗方法非常昂贵，而且具有副作用和成瘾性。

因此，强烈需要一种更有效、无副作用、在花费上更容易获得的治疗方法。局部途径是另一种选择，但只有小分子适合通过表皮并有效靶向角质形成细胞和黑色素细胞。

发明内容

本申请人提出将“从头(de novo)”分子作为局部制剂，以减缓和/或稳定白癜风的进展，甚至逆转白癜风。

因此，本发明涉及包含至少一种五环三萜或其药学上可接受的盐的组合物，其用于治疗和/或预防白癜风的用途。

本发明还涉及治疗和/或预防白癜风的方法，该方法向需要其的患者施用有效量的包含至少一种五环三萜或其药学上可接受的盐的组合物。

本发明还涉及包含至少一种五环三萜或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于治疗和/或预防白癜风的药物中的用途。

本发明还涉及包含至少一种五环三萜或其药学上可接受的盐的组合物用于治疗和/或预防白癜风的用途。

发明详细说明

定义

在本发明中，“药学上可接受的”意指可其用于制备药物组合物，通常是安全、无毒且无生物学上或其他方面所不合意的，且对于兽医和人类药物用途是可接受的。

化合物的“药学上可接受的盐”意指如本文所定义的药学上可接受的且具有母体化合物的期望药理学活性的盐。

特别地，药学上可接受的盐包括：

(1)药学上可接受的酸加成盐，其为与药学上可接受的无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与药学上可接受的有机酸如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基萘甲酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸，扁桃酸、甲磺酸、黏糠酸、2-萘磺酸、丙酸、水杨酸、琥珀酸、二苯甲酰-L-酒石酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三甲基乙酸、三氟乙酸等形成；

(2)药学上可接受的碱加成盐，其为当母体化合物中存在的酸质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)取代时形成；或与药学上可接受的有机碱如二乙醇胺、乙醇胺、N-甲基葡萄糖胺、三乙醇胺、氨丁三胺等配位形成；或与药学上可接受的无机碱如氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等配位形成。

当化合物具有酸功能时，其可以是钠盐。

“局部应用”应被理解为是指应用于皮肤、粘膜和/或皮肤附属器。

根据本发明，“治疗”应被理解为是指抑制和/或减少白癜风的演变或发展，更特别是白癜风的消退，优选是白癜风的消失。

根据本发明，“预防”应被理解为是指预防、避免或延迟白癜风的发病。

五环三萜

五环萜是草药中已知的用于治疗自身免疫性疾病和某些炎症性疾病，如银屑病、特应性皮炎、类风湿性关节炎的那些。其中，已知来自卫矛科(Celastraceae)植物(雷公藤(Tripterygium wilfordii)、东北雷公藤(Tripterygium regeli)、昆明山海棠(Tripterygium hydroglaucum)、灯油藤(Celastrus paniculatus))的五环三萜。

根据本发明，“五环三萜”应被理解为是指由卫矛科植物的细胞自然产生的五环三萜，特别是卫矛素A(Tingénine A)，也称为卫矛酮(Tingénone)或美登素(Mayténine)(下面化学式I)，卫矛素B(Tingénine B)，也称为22β-羟基-卫矛酮(下面化学式II)和南蛇藤醇(Célastrol)，也称为雷公藤红素(triptérine)(下面化学式III)。

[化学式I]

[化学式II]

[化学式III]

在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含一种或多种五环三萜，其选自卫矛素A、卫矛素B、南蛇藤醇及其药学上可接受的盐。在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含卫矛素A、卫矛素B和南蛇藤醇或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物可以包含至少一种纯化形式的五环三萜或其药学上可接受的盐。

在本发明的意义上，五环三萜或其药学上可接受的盐的“纯化形式”应被理解为是指纯形式的化合物，即包含至少按重量计90％，特别是至少按重量计95％，特别是至少按重量计99％的五环三萜化合物，特别是卫矛素A、卫矛素B和/或南蛇藤醇，或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，五环三萜或其药学上可接受的盐可以以卫矛科植物提取物的形式存在于根据本发明的组合物中。

根据本发明，“卫矛科植物”应被理解为是指属于该科的所有植物，特别是雷公藤属(Tripterygium)、膝柄木属(Bhesa)、Kokkona属、巧茶属(Catha)、卫矛属(Euonymus)、直楔木属(Orthosphenia)、双堂木属(Dicarpellum)、南蛇藤属(Celastrus)、美登木属(Maytenus)、隐龙榄(Peritassa)属、木瓜桐属(Siphonodon)和杜黄杨属(Rzedowskia)的植物，特别是雷公藤属、美登木属和南蛇藤属的植物。优选的植物例如雷公藤(Tripterygiumwilfordii)、东北雷公藤(Tripterygium regelii)、昆明山海棠(Tripterygiumhypoglaucum)、南蛇藤(Celastrus orbiculatus)或刺叶美登木(Maytenus ilicifolia)，特别是雷公藤、昆明山海棠或南蛇藤，特别是雷公藤。

在一个实施方案中，该提取物可以是粗的或富集五环三萜，特别是卫矛素A、卫矛素B和/或南蛇藤醇。则提取物可以任选地包含除五环三萜之外的来自植物的成分(包括活性成分)。

“粗提取物”应被理解为是指直接从植物中提取的提取物。

“富集的粗提取物”应被理解为是指提取物，其中基于粗提取物中五环三萜的量，五环三萜(特别是卫矛素A、卫矛素B和/或南蛇藤醇)的量大于按重量计30％，特别大于按重量计50％。

在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物的富集的粗提取物包含基于富集的粗提取物的总重量按重量计90％至100％的五环三萜。

纯化的、粗的或富集的提取物可以从卫矛科植物的任何部位获得，包括根、种子和地上部分。

或者，它们可以从这些植物的植物细胞培养物中获得。在植物细胞培养物的情况下，该提取物特别可以从所述细胞培养物的上清液、悬浮液或生物质中获得(特别如Coppede等人,Plant Cell Tiss Organ Cult,118:33-43,2014所述)。

在一个实施方案中，根据以下方法获得富集的粗提取物：

(i)卫矛科植物在增殖培养基中的细胞增殖阶段，

(ii)诱出(élicitation)阶段，通过向步骤(i)中获得的细胞培养物中加入诱出混合物，所述诱出混合物包含至少一种一元羧酸化合物型诱出剂(éliciteur)和至少一种生物诱出剂，和

(iii)从步骤(ii)中获得的细胞培养物中制备富集五环三萜的粗提取物。

根据本发明，“卫矛科植物的细胞”应被理解为是指植物任何部位：种子、根、地上部分，特别是地上部分的细胞。

根据本发明，“地上部分”应被理解为是指植物位于地面以上的部分，例如叶、茎、叶柄和/或花序，特别是叶。

根据本发明，“卫矛科植物的细胞增殖阶段”应被理解为是指将卫矛科植物的细胞悬浮在增殖培养基中并在适合它们增殖的条件下的阶段。这些细胞特别可以在悬浮之前从愈合组织获得。如有必要，可以定期重新接种细胞悬液，以使其保持在增殖条件下。

根据本发明，“愈合组织(cal)”应被理解为是指去分化细胞群，也称为干细胞或分生细胞。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得愈合组织诱导。根据本发明的愈合组织可以特别以下述方式获得。本领域技术人员公知从卫矛科(例如雷公藤)的植物部位(特别是地上部分)的组织外植体中诱导愈合组织。愈合组织诱导可以特别通过以下实现：

-获得植物组织的外植体，例如一片约1cm²大小的叶子，

-在琼脂增殖培养基上培养外植体，

-在大约25-30℃的温度，特别是在黑暗中孵育。

步骤(i)：细胞增殖阶段

熟悉卫矛科植物细胞培养的本领域技术人员将能够容易地确定其增殖所需的增殖培养基的组成。优选地，该增殖培养基将允许细胞以去分化形式(即全能形式)增殖。去分化形式的维持尤其可以特别通过在增殖培养基中使用特定的细胞分裂素/生长素比例来获得。增殖培养基可以特别包含：

-至少一种大量元素，特别选自NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4及其混合物，例如总大量元素浓度为基于增殖培养基1000至9000mg/L，例如3000至8000mg/L：在增殖阶段，增殖培养基的总大量元素浓度特别为基于增殖培养基3000至5500mg/L；

-至少一种微量元素，特别选自KI、H3BO3、MnSO4.4H2O、ZnSO4.H2O、Na2MoO4.2H2O、CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O、FeSO4.7H2O、Na2EDTA.2H2O及其混合物，例如总微量元素浓度为基于增殖培养基10至200mg/L，特别是50至150mg/L；

-至少一种维生素，特别选自肌醇、烟酸、吡哆醇-HCl、硫胺素-HCl及其混合物，例如总维生素浓度范围为基于增殖培养基0.01至3g/L，特别是0.05至1g/L；

-至少一种氨基酸，特别是甘氨酸，例如总氨基酸浓度范围为基于增殖培养基0.15至5mg/L，特别是1至4mg/L：在增殖阶段，增殖培养基的氨基酸浓度特别为基于增殖培养基1至2.5mg/L；

-至少一种碳源，特别是蔗糖，例如总碳源浓度为基于增殖培养基10至70g/L，例如约30g/L；

-至少一种植物激素(也称为植物生长激素或植物生长因子或植物生长调节剂)，特别选自一种或多种细胞分裂素，特别是激动素和/或6-糠氨基嘌呤，一种或多种生长素，特别是2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4D)和/或萘乙酸(NAA)，及其混合物。在增殖阶段，增殖培养基特别包含至少一种细胞分裂素和至少一种生长素。

植物生长激素将被特别加入到增殖培养基中，其浓度和比例允许细胞以去分化形式增殖。它们将特别选自激动素、6-糠氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4D)、萘乙酸(NAA)及其混合物中选；特别选自激动素、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4D)、萘乙酸(NAA)及其混合物。特别地，其可以是激动素、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4D)和萘乙酸的混合物。

特别地，生长素的浓度为基于增殖培养基0.001至10mg/L，例如基于增值培养基0.1至3mg/L。

特别地，细胞因子的浓度为基于增殖培养基0.01至0.5mg/L，例如基于增值培养基0.05至0.15mg/L。

在一个实施方案中，生长素/细胞分裂素激素比例在0.2至2.5/0.01至0.5之间，特别是在1至2/0.05至0.2之间，特别为约1.5/0.1。

特别地，根据本发明的增殖培养基可以包含1.5mg/L生长素，特别是2,4-二氯苯氧乙酸(2,4D)和萘乙酸(NAA)，以及0.1mg/L细胞分裂素，特别是激动素。

增殖培养基将是无菌的，并且优选在接近中性的pH值。

特别由Murashige&Skoog(1962)或在本申请的实施例中描述了根据本发明的适于卫矛科植物细胞增殖的增殖培养基的示例。

例如，该增殖培养基可以具有以下组成(浓度以相对于无细胞增殖培养基的体积表示)：大量营养素：1650mg/L的NH4NO3、1900mg/L的KNO3、440mg/L的CaCl2.2H2O、370mg/L的MgSO4.7H2O、170mg/L的KH2PO4；微量元素：0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4.4H2O、6.6mg/L的ZnSO4.H2O、0.25mg/L的Na2MoO4.2H2O、0.025mg/L的CuSO4.5H2O、0.025mg/L的CoCl2.6H2O、27.8mg/L的FeSO4.7H2O、37.3mg/L的Na2EDTA.2H2O；维生素：100mg/L的肌醇、0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的吡哆醇-HCl、0.5mg/L的硫胺素-HCl；氨基酸：2mg/L的甘氨酸；碳源：30g/L的蔗糖；和植物激素：1mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.1mg/L的激动素，在灭菌前(例如，在121℃高压灭菌20分钟或通过0.2μm过滤器过滤)均调节至pH 6。

或者，增殖培养基可具有以下组成(浓度以相对于无细胞增殖培养基的体积表示)：大量营养素：1650mg/L的NH4NO3、2500mg/L的KNO3、440mg/L的CaCl2.2H2O、370mg/L的MgSO4.7H2O、130mg/L的KH2PO4；微量元素：0.41mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、22.3mg/L的MnSO4.4H2O、7.5mg/L的ZnSO4.H2O、0.25mg/L的Na2MoO4.2H2O、0.025mg/L的CuSO4.5H2O、0.025mg/L的CoCl2.6H2O、19.85mg/L的FeSO4.7H2O、26.64mg/L的Na2EDTA.2H2O；维生素：50mg/L的肌醇、0.25mg/L的烟酸、0.25mg/L的吡哆醇-HCl、0.25mg/L的硫胺素-HCl；碳源：30g/L的蔗糖；和植物激素：0.083mg/L的激动素、0.575mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4D)、0.350mg/L的萘乙酸(NAA)。

或者，增殖培养基可具有以下组成(浓度以相对于无细胞增殖培养基的体积表示)：20mM的NH4NO3、19mM的KNO3、3mM的CaCl2.2H2O、1.50mM的MgSO4.7H2O、1.2mM的KH2PO4、0.005mM的KI、0.1mM的H3BO3、0.1mM的MnSO4.4H2O、0.04mM的ZnSO4.H2O、0.001mM的Na2MoO4.2H2O、0.0001mM的CuSO4.5H2O、0.0001mM的CoCl2.6H2O、0.1mM的FeSO4.7H2O、0.1mM的Na2EDTA.2H2O、0.5mM的肌醇、0.004mM的烟酸、0.002mM的吡哆醇-HCl、0.0015mM的硫胺素-HCl、0.03mM的甘氨酸、87.6mM的蔗糖、0.005mM的萘乙酸、0.002mM的2,4-二氯苯氧乙酸和0.0005mM的激动素。

增殖培养基的接种可以通过悬浮愈合组织细胞来进行，其浓度为1L增殖培养基中20至300g，优选1L增殖培养基中100至200g，例如1L增殖培养基中约150g。增殖阶段将在生物质扩增条件下发生。

根据本发明，“生物质扩增条件”应被理解为特别是指悬浮细胞增殖所需的温度、持续时间、搅拌和光度条件。熟悉卫矛科植物细胞培养的本领域技术人员将能够容易地确定生物质扩增的条件。在根据本发明的一个实施方案中，生物质增殖步骤将在黑暗中进行，温度在20至35℃，特别在27至28℃，特别在约27或28℃，特别在100至200rpm的搅拌下，特别在约125rpm(22.5mm轨道)的搅拌下，在10至30天的时间内，特别是15天的培养时间。

在此步骤中，细胞可以“传代培养”或繁殖，例如每7至15天。细胞的传代培养是本领域技术人员熟知的，特别可以包括在新的浓缩培养基中稀释一部分的细胞培养物。例如，将1/5的培养物重新悬浮在与初始培养物体积相对应的新培养基体积中。这允许将液体培养基中的细胞系维持在增殖状态。

步骤(ii)：诱出阶段

在增殖阶段之后，在阶段(i)中获得的细胞通过加入诱出混合物进行诱出。加入了诱出混合物的增殖培养基将被称为“诱出培养基”。诱出阶段是细胞维持生理状态的阶段，促进次级代谢物如五环三萜的生物合成。

在诱出阶段，五环三萜的产生发生在细胞的细胞质中，并且可能部分扩散到诱出培养基中。因此，本发明意义上的诱出阶段对应于五环三萜，更特别是南蛇藤醇、卫矛素A和卫矛素B的产生阶段(生物合成)。

优选在7至21天，特别是12至20天，特别是15、16或17天(特别是没有传代培养)的增殖阶段之后进行诱出。或者，当在增殖阶段获得的细胞浓度是增殖培养基中初始细胞浓度的两倍，特别是多于两倍时，可以加入诱出混合物。特别地，当细胞浓度大于200g/L，例如在200至400g/L，特别是约300g/L(按每升增殖培养基的细胞数计)时，可以加入诱出混合物。在一个实施方案中，将诱出混合物加入至细胞浓度从增殖阶段开始时的150至200g/L增加至增殖阶段结束时的300至400g/L的浓度的培养物中。

在增殖阶段之后，植物细胞消耗了增殖培养基中包含的大部分(如果不是全部)元素，特别是碳源如蔗糖。因此，可能有必要在加入诱出混合物之前或同时恢复培养基的组成。

为了恢复培养基的组成，在增殖步骤之后获得的细胞培养物可以特别地被浓缩，例如通过倾析或过滤，然后可以将新的增殖培养基加入到由此获得的细胞中。在这种情况下，细胞将被重新悬浮在新的增殖培养基中，以获得200g/L至400g/L，例如250g/L至350g/L，特别是约300g/L的浓度(按每升增殖培养基的细胞数计)。

或者，可将浓缩混合物加入细胞培养物中以恢复增殖培养基元素的浓度。特别地，浓缩混合物可以恰好在诱出混合物之前、之后或同时加入。例如，1/5的细胞培养物可以用等效体积的5倍浓缩的增殖培养基代替。

在增殖阶段的14、15或16天后，增殖培养基中元素的浓度被认为接近或等于零。特别地，在增殖阶段的14、15或16天之后，矿物元素(更特别是大量元素和微量元素)和含碳元素(更特别是碳源)的浓度被认为接近或等于零。

在一个实施方案中，在诱出阶段开始时根据本发明的增殖培养基将在其中包含：

-至少一种大量营养素，特别选自NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4及其混合物，例如总大量营养素浓度为基于增殖培养基5000至8000mg/L，优选大于6000mg/L，有利地为6000至8000mg/L；

-至少一种微量元素，特别选自KI、H3BO3、MnSO4.4H2O、ZnSO4.H2O、Na2MoO4.2H2O、CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O、FeSO4.7H2O、Na2EDTA.2H2O及其混合物，例如总微量元素浓度为基于增殖培养基10至200mg/L，特别是50至150mg/L，

-至少一种维生素，特别选自肌醇、烟酸、吡哆醇-HCl、硫胺素-HCl及其混合物，例如总维生素浓度范围可以为基于增殖培养基0.01至3g/L，特别是0.05至1g/L；

-至少一种氨基酸，特别是甘氨酸，例如在增殖培养基中的浓度为基于增殖培养基3至4mg/L；

-至少一种碳源，特别是蔗糖，例如总碳源浓度为基于增殖培养基10至70g/L，例如约30g/L。在一个实施方案中，诱出阶段开始时的增殖培养基将不包含或包含可忽略量的，特别是小于0.001g/mL的细胞分裂素和生长素。诱出阶段期间的增殖培养基有利地是无菌的并且优选处于接近中性的pH。

诱出阶段期间的增殖培养基可以特别具有以下组成：大量营养素：2.8g/L的NH4NO3、3g/L的KNO3、0.45g/L的CaCl2.2H2O、74mg/L的MgSO4.7H2O、34mg/L的KH2PO4；微量元素：0.16mg/L的KI、6.2mg/L的H3BO3、18.5mg/L的MnSO4.4H2O、6.6mg/L的ZnSO4.H2O、0.25mg/L的Na2MoO4.2H2O、0.5mg/L的CuSO4.5H2O、0.025mg/L的CoCl2.6H2O、28mg/L的FeSO4.7H2O，37mg/L的Na2EDTA.2H2O；维生素：250mg/L的肌醇、1.7mg/L的烟酸、1mg/L的吡哆醇-HCl、1mg/L的硫胺素-HCl；氨基酸：4mg/L的甘氨酸；碳源：30g/L的蔗糖。

根据本发明，“诱出混合物”应被理解为是指用于停止细胞分裂的混合物。该诱出混合物包含至少一种一元羧酸化合物型诱出剂和至少一种生物诱出剂。例如，通过浓缩原液将诱出混合物引入培养基中。

根据本发明，“一元羧酸化合物型诱出剂”应被理解为更特别是指诱出剂，其选自包括以下的组，优选自由以下组成的组：5-氯水杨酸(5-Chloro SA)、水杨酸(SA)、乙酰水杨酸(ASA)、甲酯特别是茉莉酮酸甲酯(MeJa)，以及其混合物。在根据本发明的一个实施方案中，一元羧酸化合物型诱出剂是茉莉酮酸甲酯、水杨酸和/或5-氯水杨酸，特别是茉莉酮酸甲酯。将特别加入一元羧酸化合物型诱出剂以获得终浓度为基于诱出培养基0.005至0.1g/L，特别是0.01至0.05g/L，特别是基于诱出培养基0.002至0.004g/L。

根据本发明，“生物诱出剂”应被理解为更特别地是指生物诱出剂，其选自包括以下的组，优选自由以下组成的组：N-乙酰氨基葡糖胺，特别是甲壳质、壳聚糖，微生物或真菌的提取物，寡糖(多糖、果胶、纤维素)。在一个实施方案中，生物诱出剂是甲壳质。甲壳质是一种具有重复单元的线性聚合物：β-1,4N-乙酰基-D-葡糖胺。特别地，将加入生物诱出剂以获得终浓度为基于诱出培养基0.05至50g/L，例如0.1至10g/L，例如0.5至7g/L，特别是基于诱出培养基1至5g/L。

在一个实施方案中，诱出混合物包含茉莉酮酸甲酯，特别是在诱出培养基中的终浓度为0.002至0.005g/L，和甲壳质，特别是在诱出培养基中的终浓度为1至4g/L。

在一个实施方案中，根据本发明的诱出混合物将进一步包含至少一种植物细胞分化因子和/或至少一种萜合成路径前体。

根据本发明的“植物细胞分化因子”可以特别地选自包括以下的组，优选自由以下组成的组：细胞分裂素特别是苄氨基嘌呤(BAP)、脱落酸、激动素、噻苯隆、6-γ,γ-二甲基烯丙基氨基嘌呤(2iP或异戊烯基腺嘌呤)或玉米素、赤霉素及其混合物，特别是BAP和/或2iP，特别是2iP。

根据本发明的“萜合成前体”可以特别地选自包括以下的组，优选自由以下组成的组：丙酮酸钠；焦磷酸钾；甲羟戊酸；香叶醇；法尼醇；异戊烯基、二甲基烯丙基，包括它们的焦磷酸形式；乙酸钠；丙酮酸及其混合物，特别是香叶醇、法呢醇、丙酮酸钠、焦磷酸钾及其混合物，例如丙酮酸钠和/或焦磷酸钾。

特别地，BAP可在诱出培养基中以基于诱出培养基0.01至5mg/L，例如0.5至5mg/L的终浓度使用。

特别地，5-氯水杨酸(5-Chloro SA)可在诱出培养基中以0.1至15mg/L的终浓度使用。

特别地，水杨酸可在诱出培养基中以0.1至100mg/L，例如20至60mg/L，例如约45mg/L的终浓度使用。

特别地，法尼醇可在诱出培养基中以1至100mg/L，例如15至30mg/L，例如约30mg/L的终浓度使用。

特别地，香叶醇可在诱出培养基中以1至100mg/L，例如20至30mg/L的终浓度使用。

特别地，丙酮酸钠可在诱出培养基中以100至5000mg/L，例如500至2000mg/L的终浓度使用。

特别地，焦磷酸钾可在诱出培养基中以基于诱出培养基1至2000mg/L，例如100至1000mg/L的终浓度使用。

特别地，2iP可在诱出培养基中以0.005至10mg/L，例如0.01mg/L至3mg/L，例如0.1mg/L至2mg/L的终浓度使用。

在本发明的一个实施方案中，诱出混合物包含茉莉酮酸甲酯、甲壳质、丙酮酸钠、焦磷酸钾或其混合物。

在本发明的一个实施方案中，诱出混合物包含茉莉酸甲酯、甲壳质、丙酮酸钠、焦磷酸钾和任选的BAP和/或2iP。

在本发明的一个实施方案中，诱出混合物包含以下或由以下组成(括号中给出的浓度对应于诱出培养基中的浓度，取决于设想的稀释度，初始混合物可以或多或少地浓缩)：丙酮酸钠(500至2000mg/L)、焦磷酸钾(100至1000mg/L)、2iP(0.1至2mg/L)、茉莉酮酸甲酯(0.002至0.005g/L)和甲壳质(1至4g/L)。

在另一个实施方案中，诱出混合物包含以下或由以下组成(括号中给出的浓度对应于诱出培养基中的浓度，取决于设想的稀释度，初始混合物可以或多或少地浓缩)：苄基氨基嘌呤(BAP)(0.5至5mg/L，特别是0.5至3mg/L)；5-氯水杨酸(5-Chloro SA)(2至6mg/L，特别是3至5mg/L，例如约3或约5mg/L)、乙酰水杨酸(ASA)和/或水杨酸(SA)(20至60mg/L，特别是30至50mg/L，特别是33至45mg/L)；茉莉酮酸甲酯(MeJA)(0.002至0.005g/L，特别是10至40mg/L)；甲壳质(1至4g/L)；和法尼醇(F-OH)(19至40mg/L)和/或香叶醇(20至30mg/L)。

在另一个实施方案中，诱出混合物包含以下或由以下组成(括号中给出的浓度对应于诱出培养基中的浓度，取决于设想的稀释度，初始混合物可以或多或少地浓缩)：丙酮酸钠(500至2000mg/L)、焦磷酸钾(100至1000mg/L)、2iP(0.1至1mg/L)、茉莉酮酸甲酯(MeJA)(0.002至0.005g/L，特别是10至40mg/L)和甲壳质(1至4g/L)。

在另一个实施方案中，诱出混合物包含以下或由以下组成(括号中给出的浓度对应于诱出培养基中的浓度，取决于设想的稀释度，混合物可以或多或少地浓缩)：丙酮酸钠(约1.5g/L)，焦磷酸钾(约0.4g/L)、2iP(约0.4mg/L)、茉莉酮酸甲酯(MeJA)(约0.03mg/L)、甲壳质(约2g/L)。

在诱出阶段期间，在加入诱出混合物后，将培养物保持在搅拌下，特别是在50至200rpm，特别是在约125rpm，持续3至30天，特别是10至25天的时间，特别是12至15天，特别是在20至35℃的温度，特别是在约27℃，并且有利地溶解在培养基中的氧水平为2至40％，优选为约16％。如果需要，特别是在生物反应器的死体积中或通过在培养基中的扩散，可以提供充分富集氧气的无菌空气的供应。优选地，诱出阶段(iii)在黑暗中进行。在诱出阶段期间，细胞培养物优选不进行传代培养。

步骤(iii)：富集五环三萜的粗提取物的制备

在诱出阶段之后，方法包含制备富集五环三萜的粗提取物的步骤。

特别地，富集的粗提取物可以通过分离生物质和培养物上清液获得。特别地，可以通过直接过滤(0-50μm)，通过离心，或通过倾析细胞完成分离。

在一个实施方案中，包含在根据本发明的用途的组合物中的富集的粗提取物可由如此回收的培养物上清液组成。

还可以在生物质裂解后获得富集的粗提取物。例如，可以通过物理(超声处理或研磨)或化学(酸裂解)方法裂解回收的生物质中包含的细胞，然后对该裂解物进行溶剂提取。然后，特别是通过倾析或离心来回收有机相，特别是包含来自细胞溶质的三萜。溶剂将特别是酯型溶剂，更特别是乙酸烷基酯，烷基更特别是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，特别是乙酸乙酯或乙酸异丙酯。所用溶剂的体积特别为每重量生物质2体积。

优选地，根据本发明的用途的组合物的富集的粗提取物将对应于由此回收的有机相。

或者，在蒸发溶剂并用适合于提取物使用领域(化妆品、药物)的载体替换溶剂后可获得富集的粗提取物，所述载体特别是植物油或溶剂如特别是戊二醇(或Pentiol)或

富集的粗提取物未经纯化。可任选地在随后的步骤中纯化富集的粗提取物。

当富集的粗提取物被纯化以得到纯化提取物时，根据本发明的方法进一步包括从步骤(iii)中获得的富集的粗提取物获得一种或多种五环三萜的纯化提取物的步骤(iv)。

然后，根据本发明的纯化提取物将包含基于提取物的总重量按重量计大于90％，特别是大于95％，特别是大于98％的一种或多种根据本发明的五环三萜。

在一个实施方案中，根据本发明的纯化提取物包含基于提取物的总重量按重量计60％或更多，特别是80％或更多，特别是90％或更多，特别是95％或更多，特别是大于98％或更多，特别是100％的南蛇藤醇。其可以特别包含基于提取物的总重量按重量计50％至98％，特别是70％至90％，特别是76％至84％的南蛇藤醇。

在一个实施方案中，根据本发明的纯化提取物包含基于提取物的总重量按重量计1至20％，特别是5至15％，特别是8至12％的卫矛素A。

在一个实施方案中，根据本发明的纯化提取物包含基于提取物的总重量按重量计1至20％，特别是5至15％，特别是8至12％的卫矛素B。

在一个实施方案中，根据本发明的纯化提取物包含：

-基于提取物的总重量按重量计50％至98％，特别是70％至90％，特别是76％至84％的南蛇藤醇；

-基于提取物的总重量按重量计1％至20％，特别是5％至15％，特别是8％至12％的卫矛素A；和

-基于提取物的总重量按重量计1和20％，特别是5％至15％，特别是8％至12％的卫矛素B。

根据本发明的富集的提取物的纯化可以特别地通过五环三萜，特别是南蛇藤醇、卫矛素A和/或卫矛素B的分离阶段进行，特别是通过高效液相色谱法(HPLC)分级，其间在426nm的峰包括分别在19.75min、18.03min和16.21min出现的南蛇藤醇、卫矛素A和卫矛素B。

组合物

在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含基于组合物的总重量按重量计0.002至10％，特别是0.01至2％，特别是0.1至1％的南蛇藤醇。

在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含基于组合物的总重量按重量计0.002至10％，特别是0.01至2％，特别是0.1至1％的卫矛素A。

在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含基于组合物的总重量按重量计0.002至10％，特别是0.01至2％，特别是0.1至1％的卫矛素B。

在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含基于组合物的总重量按重量计0.002至10％，特别是0.01至2％，特别是0.1至1％的五环三萜，所述五环三萜特别选自南蛇藤醇、卫矛素A、卫矛素B及其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含基于组合物的总重量按重量计0.002至10％，特别是0.01至和2％，特别是0.1至1％的富集五环三萜的粗提取物。

在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含0.5至2％的南蛇藤醇、0.01％至1％的卫矛素A和/或0.01％至1％的卫矛素B。在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含0.5至2％的南蛇藤醇、0.01％至1％的卫矛素A和0.01％至1％的卫矛素B。

根据本发明的用途的组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本发明优选涉及适于局部施用形式的根据本发明的组合物。

因此，根据本发明的组合物可以是通常已知的用于局部施用的形式，即特别是洗剂、洗发剂、香膏、泡沫剂、凝胶、分散剂、乳剂、喷雾剂、精华、面膜或霜剂，其中的赋形剂为允许，特别是渗透，以改善活性成分的特性和可及性。

除了根据本发明的五环三萜之外，这些组合物通常包含生理学可接受的介质，通常基于水或溶剂，例如醇、醚或二醇。它们还可以含有表面活性剂、络合剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂、湿润剂、润肤剂、微量元素、精油、芳香剂、染料、保湿剂或地热水等。

根据本发明的这些组合物可以每天使用，每天一次或多次使用，而不受治疗持续时间的限制。

附图说明

图1：提取物CCV的HPLC色谱。

具体实施方式

实施例

实施例1：获得富集五环三萜的雷公藤植物细胞培养提取物CCV

在Sartorius Stedim Biotech(德国)波反应器(体积5L)中进行培养。反应器接种了来自锥形瓶的雷公藤细胞悬浮液(如上提及的培养基组成、参数)。在连续搅拌下，在约17天后达到最大生物质后，用诱出剂混合物(茉莉酮酸甲酯和甲壳质)进行诱出。诱出15天后停止培养。通过尼龙过滤器(20-50μm)过滤细胞悬浮液来回收大部分生物质。从5L悬浮液中回收了约1925g生物质。该生物质用乙酸乙酯(或乙酸异丙酯)以2:1(体积：重量)与生物质重量的比例(此处为3850mL溶剂用于1925g生物质)提取。然后通过超声或研磨对生物质/溶剂混合物进行物理提取。然后在搅拌下浸渍后回收有机相。溶剂的加入(随后在搅拌下浸渍并回收有机相)重复两次。溶剂可以在真空下浓缩，然后溶解在例如戊二醇中，并通过真空抽吸除去残留的有机溶剂来完成该步骤。由此获得一个名为“提取物CCV”的溶液，其含有以下五环三萜：南蛇藤醇(主峰)、卫矛素A和卫矛素B(见图1)。

HPLC条件：Alliance液相色谱仪(Waters 2695版本2.03)；Sunfire C18柱，

5μm(4.6mm×150mm)。溶剂梯度：水/乙腈，流速3mL/min，在λ460nm处检测三萜。这种用于药理活性的提取物(实施例2和3)在南蛇藤醇浓度中滴定。南蛇藤醇、卫矛素A和卫矛素B经HPLC分离后可通过收集纯化。纯化的化合物重新悬浮在DMSO中，然后在适当缓冲液中稀释用于每个测试。

实施例2：两种提取物与纯化分子卫矛素A、卫矛素B和南蛇藤醇的抗炎和抗-MMP-9 活性

本实施例中测试了两种不同的提取物，它们来自植物细胞培养物。根据实施例1获得提取物2，使用不同的诱出从相同的培养物获得提取物1，即使用茉莉酮酸甲酯和乙酰水杨酸代替茉莉酮酸甲酯和甲壳质。提取物1和2表示为基于提取物中TA、TB和CEL总量的每种三萜成分(卫矛素A：TA，卫矛素B：TB，南蛇藤醇：CEL)的％，见下表1。

[表1]

通过HPLC(相对于标准品)定量以μg/mL为单位的提取物原液(TA、TB和CEL的干重)。将测试产物溶解在DMSO中(原液)。对于TA和TB，测试了三个浓度，45、135和405ng/mL。对于南蛇藤醇，也测试了三个浓度，15、45和135ng/mL。对于两种提取物，也测试了三种浓度，对于提取物1(45、135和405ng/mL)和对于提取物2(20、60和180ng/mL)。

阳性对照由JAK抑制剂(CAS 457081-03-7Calbiochem)组成，测试浓度为10μM(在DMSO中稀释)。

使用的细胞系是人角质形成细胞系，在37℃和5％CO₂的气氛中培养。

将人角质形成细胞接种在24孔板(每孔75000个细胞)中，并在培养基(角质形成细胞-SFM，补充有表皮生长因子0.25ng/mL、垂体提取物25μg/mL和庆大霉素25μg/mL)中培养48小时。然后将培养基替换为含有待测样品或不含待测样品(对照组)的新鲜培养基，将细胞再次孵育24小时(测试培养基：角质形成细胞-SFM，补充有庆大霉素25μg/mL)。在角质形成细胞刺激细胞因子：各3ng/mL的IL-17、制瘤素M和TNFα的混合物的存在下再次重复该过程。RT-qPCR实验的培养时间为24小时，ELISA实验的培养时间为48小时。然后将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中洗涤，并立即在-80℃冷冻。实验一式三份进行。

RT-qPCR分析

如文献中描述的，使用反向转录酶(Roche)和定量PCR试剂盒，通过RT-qPCR确定角质形成细胞在诱导后的标志物DEFB4A、S100A7、CXCL10、CXCL11、CXCL16、CCL5、CCL20、IL-8(CXCL8)、IL-23A和MMP-9的表达。平行使用两个阳性PCR对照(RPS28和GAPDH，组成型表达)以标准化获得的结果。

标记蛋白IL-8和MMP-9的ELISA分析

在本实验中测试了每种化合物的单一浓度：TA(500ng/mL)、TB(500ng/mL)、提取物1(200ng/mL)和提取物2(150ng/mL)、阳性对照(JAK抑制剂，10μM)。将人角质形成细胞接种在24孔板(每孔75000个细胞)中，并在与上述相同的培养基中仅培养24小时。然后该方案与前一个相同，所有实验条件均一式三份进行。在孵育时间结束时，回收上清液用于标志物定量(IL-8和MMP-9)。使用Microsoft Excel软件分析原始数据。通过未配对的学生t检验进行组间比较。

结果(RT-qPCR)

用细胞因子各3ng/mL的IL-17、制瘤素M和TNFα的混合物刺激角质形成细胞，持续24小时，诱导典型的炎症特征，其特征是编码先天免疫标志物和其他炎症标志物的基因强烈上调(表2)。

[表2]

以10μM测试的参照化合物(JAK抑制剂)抵消了角质形成细胞刺激的所有作用，事实上，在该抑制剂的存在下，所有上调的基因都不再如此。这个结果验证了该测试。

卫矛素A、卫矛素B、南蛇藤醇及两种提取物对炎症标志物的作用总结在下表3(卫矛素A和B和南蛇藤醇对受刺激的人角质形成细胞中基因表达的作用)和表4(提取物1和2对受刺激的人角质形成细胞中基因表达的作用)中。

[表3]

[表4]

在这些实验条件下，在45、135和405ng/mL测试的卫矛素A和卫矛素B在所有评估的标志物上均显示出这些基因以浓度依赖性方式下调。卫矛素A和B的作用特别强，具有最高测试浓度。同样，测试的两种提取物的作用以浓度依赖性方式降低了在该测试中评估的标志物的表达。

因此，本发明人表明存在于两种提取物中的三萜主要是在两个最高浓度下具有抗-Th17作用。

结果(IL-8和MMP-9的ELISA)

卫矛素A、卫矛素B、南蛇藤醇和两种提取物对IL-8和MMP-9释放的作用总结在下表5中(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001vs对照)。

[表5]

在未受刺激的条件下，角质形成细胞分泌低水平的IL-8和MMP-9。细胞因子混合物对角质形成细胞的刺激导致IL-8和MMP-9的大量释放。JAK抑制剂(10μM)，被选为参照化合物，其在统计学上强烈抑制这两种标志物的释放。这些预期结果验证了该测试。

在这些实验条件下，卫矛素A(500ng/mL)、卫矛素B(500ng/mL)、南蛇藤醇(100ng/mL)、提取物1(200ng/mL)和提取物2(150ng/mL)均清楚地显示出对由于角质形成细胞的刺激的IL-8和MMP-9释放的抑制作用。两种提取物和南蛇藤醇显示出较卫矛素A和B强的抗炎活性。

因此，本发明人在受到细胞因子混合物刺激的人角质形成细胞模型中证明提取物1和2以及这些提取物中存在并单独测试的五环三萜在基因表达水平上具有抗-Th17作用，并且该作用在蛋白质水平被确认。需要注意的是，含有可调节量的三种五环三萜的提取物具有更强的抑制活性(Th17)。此外，测试的所有这些单独化合物和提取物均能够抑制MMP-9，MMP-9是治疗白癜风的主要靶标之一。

实施例3：两种提取物和纯化分子卫矛素A、卫矛素B和南蛇藤醇的抗氧化活性

氧化应激是白癜风发展的可能原因之一。本实验的目的是测量每种五环三萜和两种提取物的抗氧化活性，并与众所周知的阳性对照维生素C进行比较。使用的管内(intubo)方法是改编自Davalos等人(JAgric Food Chem 52(1):48-54,2004)描述的ORAC(氧自由基抗氧化能力)评估方法。ORAC指数可以评估实施例2中测试的每种化合物的抗氧化能力。该测试可以根据它们对过氧自由基的抗氧化能力来评估和分类所测试的各种化合物。AAPH(2,2'-偶氮双-2-甲基-丙脒，二盐酸盐)是过氧自由基的来源。该测试用于模拟自由基降解荧光素的动力学。这导致荧光随时间和测试提取物中存在的抗氧化活性剂的浓度而降低。3,4-二氢-6-羟基-2,5,7,8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-羧酸或Trolox用作标准物，其是维生素E的亲水类似物(已知的抗氧化剂)。加入Trolox(参照系列)或提取物或五环三萜防止荧光素降解。这可以评估相对于Trolox系列测量的抗氧化活性。

所有溶液均在pH 7.6的75mM磷酸盐缓冲液中制备。荧光素浓度为1.17μM(117mM原液)。在使用前制备125mM的AAPH，1mM的Trolox。在黑色96孔板中，加入20μL抗氧化剂(Trolox系列或测试化合物)，160μL 1.17μM荧光素。孔板用薄膜覆盖，然后在37℃孵育15分钟。AAPH溶液以每孔20μL的比率手动加入并尽快加入。然后将孔板立即在荧光分光计(SpectraMax)中在37℃孵育。每分钟记录一次读数，持续90分钟。激发波长为485nm，发射波长为520nm。每个测试一式三份进行。

计算每个试验的曲线下面积(AUC)。净AUC(AUC net)如下确定：

净AUC＝范围点或样本AUC–空白AUC。

使用Trolox浓度(μM)相对于净AUC建立校准线。直线方程用于确定所确定的每个样品的Trolox当量(μM)。

以μM为单位的Trolox当量＝a×(净AUC)2+b×(净AUC)，a和b由直线方程确定。

待测定时，将样品稀释，使测定值在测定所用的标准范围内。抗坏血酸(维生素C)用作参照。

ORAC指数对应于Trolox的摩尔％/100g材料。

以下结果是对100g提取物的三萜、卫矛素A、卫矛素B和南蛇藤醇进行计算的，即计算：

ORAC指数＝以μM为单位的Trolox当量×20(测试部分)×(100000/[测试提取物μg/mL]×20(测试部分))。

结果

该实验在抗氧化活性方面的结果以及ORAC指数/100g三萜的比较示于下表6中。

[表6]

因此，ORAC指数越高，抗氧化活性越大。按降序排列(ORAC指数/100g三萜)：提取物1>提取物2>南蛇藤醇≥卫矛素B>维生素C>卫矛素A。

本发明人证明在这些实验条件下，提取物1和2具有较参照物(维生素C)更高的抗氧化能力，并且提取物较单独使用的三萜具有更强的抗氧化活性。只有卫矛素A的抗氧化能力低于维生素C。

总之，本发明人惊奇地证明包含三萜(卫矛素A和B、南蛇藤醇)的提取物不仅具有很强的抗-Th17活性，而且还具有显著的抗氧化特性。这两种作用结合起来非常有益于保持正常的黑色素细胞和角质形成细胞的功能，预防和稳定白癜风的进展，并可能恢复色素沉着。

Claims (11)

1.一种包含卫矛素A、卫矛素B和南蛇藤醇或其药学上可接受的盐的药物组合物，其用于治疗和/或预防白癜风的用途。

2.根据权利要求1所述的用途的组合物，其中卫矛素A、卫矛素B和南蛇藤醇或其药学上可接受的盐存在于卫矛科植物的提取物中。

3.根据权利要求2所述的用途的组合物，其中所述卫矛科植物选自雷公藤(Tripterygium wilfordii)、昆明山海棠(Tripterygium hypoglaucum)和南蛇藤(Celastrus orbiculatus)。

4.根据权利要求2或3所述的用途的组合物，其中所述提取物是富集的粗提取物，其通过以下方法获得：

(i)卫矛科植物在增殖培养基中的细胞增殖阶段，

(ii)诱出阶段，通过向步骤(i)中获得的细胞培养物中加入诱出混合物，所述诱出混合物包含至少一种一元羧酸化合物型诱出剂和至少一种生物诱出剂，和

(iii)从步骤(ii)中获得的细胞培养物中制备富集卫矛素A、卫矛素B和南蛇藤醇的粗提取物。

5.根据权利要求4所述的用途的组合物，其包含基于组合物的总重量按重量计0.01至2％的富集的粗提取物。

6.根据权利要求4或5所述的用途的组合物，其中所述富集的粗提取物包含基于富集的粗提取物的总重量按重量计90％至100％的卫矛素A、卫矛素B和南蛇藤醇。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的用途的组合物，其中所述富集的粗提取物包含：

基于提取物的总重量按重量计1至20％，特别是5至15％，特别是8至12％的卫矛素A，

基于提取物的总重量按重量计1至20％，特别是5至15％，特别是8至12％的卫矛素B，和

基于提取物的总重量按重量计至少60％，特别是至少80％的南蛇藤醇。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途的组合物，其特征在于其为适合于局部应用的形式。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途的组合物，其中白癜风由Th17型细胞因子和趋化因子介导。

10.根据权利要求9所述的用途的组合物，其中Th17细胞因子诱导黑色素细胞产生黑色素的抑制作用。

11.根据权利要求9或10所述的用途的组合物，其中MMP-9蛋白质由角质形成细胞过表达。

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