CN113892432A - 一种利用麻疯树叶片直接再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用麻疯树叶片直接再生的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法为选取麻疯树叶片作为外植体，对其进行表面消毒和切割处理；外植体以叶背接触培养基接种进行愈伤组织诱导，培养基为MS+0.80‑1.20mg/L BAP+0.20‑0.60mg/L TDZ+0‑0.10mg/L NAA；愈伤组织移至诱导不定芽培养基中，培养基为MS+1.00‑2.00mg/L BAP+0.05‑0.15mg/L IBA+0.50mg/L GA3；将生长至2‑3cm不定芽移入生根培养基，进行生根培养。本发明麻疯树组织培养体系效果较好，为麻疯树转基因研究、代谢组学研究和产业化生产奠定基础。

Description

一种利用麻疯树叶片直接再生的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用麻疯树叶片直接再生的方法。
背景技术
麻疯树(Jatropha curcas L.)是大戟科的一类喜光阳性植物，多为落叶灌丛或小乔木，又名臭桐油树、小桐子等。麻疯树的应用及经济价值非常高，在医学方面，从麻疯树中提纯获得的二萜类化合物及其多种次生代谢物(如黄酮类物质)具有显著的抗肿瘤及抗癌作用；在生态环境保护方面，麻疯树的根系很发达，生命力强，能够很好的防止水土流失，防风固沙，对改善生态环境有所助益；麻疯树还具有生物质能源价值，种子含油量可达40％-60％，从种子中提取出来的种油，可作为生物柴油，适用于各类柴油机。所以麻疯树具备较高的研究意义以及良好的发展前景。
组培体系的研究，不仅有利于植物的快速扩繁，获得大量的植物材料，还有周期短，成本低的优点。植物的组培体系的建立，还可以培育新品种的脱毒材料，在去除植物体内的病毒的同时，可以保留植物的优良性状，对新的无毒的品种进行大量的扩繁，而且有利于人工管理和批量生产。麻疯树以真叶为外植体的组培体系还未完善，建立麻疯树的组培体系，进行大规模的扩繁培养，使麻疯树不需要考虑天气和环境的影响，在短期内获得大量的无菌植株，保证了麻疯树材料的数量充足。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题在于提供一种利用麻疯树叶片直接再生的方法。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种利用麻疯树叶片直接再生的方法，包括以下步骤：
(1)选取麻疯树顶端分生组织的第三片叶片作为外植体，对其表面消毒处理，并进行切割处理；
(2)将外植体以叶背接触培养基的方式接种至诱导愈伤组织培养基中，进行愈伤组织诱导，诱导愈伤组织培养基为在MS基本培养基中加入0.80-1.20mg/L BAP、0.20-0.60mg/L TDZ和0-0.10mg/L NAA；
(3)将愈伤组织移至到诱导不定芽培养基中，进行不定芽诱导，诱导不定芽培养基为在MS基本培养基中加入1.00-2.00mg/L BAP、0.05-0.15mg/L IBA和0.50mg/L GA3；
(4)将生长至2-3cm的不定芽连同基部的愈伤组织一同切下，移入生根培养基中，进行生根培养，培养基为在MS基本培养基中加入0-1.20mg/L IBA和0-1.50mg/L NAA。
所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，外植体消毒处理：先用水冲洗0.50-1.00min，洗去叶片表面灰尘，用体积分数为70％乙醇浸泡15s后，放入质量分数为3％NaClO溶液中，浸泡12-16min，中间适当摇晃，消毒完成后，在超净工作台中，用组培剪和镊子将叶片切割成1cm×1cm大小。
所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，在剪切叶片时，保留叶片的经脉，并且在叶片方块边缘多剪切3-5个切口。
所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，诱导愈伤组织的培养基配方为MS+0.80mg/L BAP+0.60mg/L TDZ+0.10mg/L NAA。
所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，诱导不定芽的最佳培养基配方为MS+1.00mg/L BAP+0.10mg/L IBA+0.50mg/L GA3。
所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，愈伤组织诱导培养方式：25℃、黑暗条件，培养三周；不定芽诱导培养方式：25℃、光照14h/黑暗10h，光照强度为40μmol/(m2·s)。
所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，生根培养的培养基配方为MS+1.20mg/LNAA。
所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，不定芽移入生根培养基之前先在MS培养基中培养1周。
所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，不定芽移入生根培养基之前先在浓度为200mg/L的NAA中浸泡1h。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
本发明利用麻疯树叶片作为外植体建立的麻疯树组织培养体系培养效果较好，为麻疯树转基因研究、麻疯树代谢组学研究和大规模产业化生产奠定了良好基础。
附图说明
图1为不经任何激素刺激诱导的不定根；
图2为不经MS培养基过渡直接生根诱导的不定根；
图3为经MS培养基过渡一周后生根诱导的不定根；
图4为不经高浓度生长素刺激诱导的根；
图5为经高浓度生长素刺激诱导的根。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
(1)叶片外植体的消毒
选取广西麻疯树顶端分生组织的第三片叶片，用水冲洗0.50-1.00min，洗去叶片表面灰尘，用体积分数为70％乙醇浸泡15s后，放入配制好的质量分数为3％NaClO溶液中，浸泡15min，中间适当摇晃，上述消毒操作完成后，在超净工作台中，用组培剪和镊子将叶片切割成1cm×1cm大小。在剪切叶片时，保留叶片的经脉，并且在叶片方块边缘多剪切3-5个切口，有利于愈伤组织的生成。
(2)麻疯树愈伤组织诱导
在MS培养基中加入不同浓度的BAP、TDZ、NAA组合(见表1)配制成愈伤组织诱导培养基，取上一步处理好的外植体以叶背接触培养基的方式接种入培养瓶，每瓶3-4片外植体(在超净工作台中进行)。将培养瓶放在25℃、黑暗条件下进行培养，每周观察3次，三周后统计愈伤组织诱导率。
表1不同激素组合下对麻疯树子叶愈伤组织诱导结果
培养基编号 BAP(mg/L) TDZ(mg/L) NAA(mg/L) 愈伤组织诱导率(％)
1 0.80 0.20 0.00 47.30
2 0.80 0.40 0.05 75.30
3 0.80 0.60 0.10 87.60
4 1.00 0.20 0.05 72.40
5 1.00 0.40 0.10 74.60
6 1.00 0.60 0.00 53.20
7 1.20 0.20 0.10 72.40
8 1.20 0.40 0.00 65.70
9 1.20 0.60 0.05 63.50
外植体诱导至第10天有愈伤组织产生，三周后不同的激素配比下均能产生愈伤组织。不同的激素配比下，外植体的愈伤组织诱导率存在差别(表1)。3号培养基中愈伤组织诱导率可以达到87.60％，效果较好，而1号和6号培养基愈伤组织诱导率较低；在这9种培养基中，愈伤组织诱导率差距最大达到40.30％；1-3号培养基获得的愈伤组织呈冰淇淋状，质量较高。试验过程中还发现7号、8号和9号培养基中产生的愈伤组织褐化情况比较严重，分析原因是BAP浓度过高导致的。因此，激素种类、用量及其组合对愈伤组织诱导率和愈伤组织质量都有显著的影响。
(3)麻疯树不定芽诱导
在不定芽的诱导阶段常用的有BAP、IBA和GA3这3种激素，不定芽诱导培养基的配方：MS基本培养基+1.00-2.00mg/L BAP+0.05-0.15mg/L IBA+0.50mg/L GA3，如表2所示，共9组试验，每组需30个进瓶，每瓶接种2-3个愈伤组织，放在25℃、光照14h/黑暗10h，光照强度为40μmol/(m2·s)的条件下对不定芽进行诱导，每周观察3次，30天后继代一次，四周后统计不定芽的生长数目和状况。
结果发现，由表2可知，在30天内9种培养基中，2号培养基不定芽诱导率最高，其愈伤组织移到不定芽的培养基中4天后，颜色微微发绿，8天后愈伤组织接近培养基的部分出现芽点，15天后愈伤组织全部变为绿色，不定芽增多并冒出头，30天之后，不定芽逐渐伸长；3号、6号培养基诱导率最低，只有在靠近培养基的部分有芽点分化出来，继代培养后不定芽伸长情况不明显，其中这两种培养基的IBA浓度都为0.15mg/L，诱导率低是因为IBA浓度过高，抑制不定芽的生长，其他培养基中不定芽的诱导率都在70％以上，分化效果相近，都可以诱导出不定芽，但伸长效果都不如2号培养基。
表2相同时间段不同激素组合下对麻疯树子叶不定芽诱导结果
培养基编号 BAP(mg/L) IBA(mg/L) GA<sub>3</sub>(mg/L) 诱导率(％)
1 1.00 0.05 0.50 80.00
2 1.00 0.10 0.50 100.00
3 1.00 0.15 0.50 23.30
4 1.50 0.05 0.50 83.30
5 1.50 0.10 0.50 73.30
6 1.50 0.15 0.50 26.70
7 2.00 0.05 0.50 86.70
8 2.00 0.10 0.50 73.30
9 2.00 0.15 0.50 76.60
(4)生根培养
生根培养基配方为MS基本培养基+0-1.20mg/L IBA+0-1.50mg/L NAA(如表3)；每个处理10个不定芽，重复3次。
分化的不定芽在不含激素的MS培养基中也能够诱导出不定根，但诱导出的根很细，在继代过程中很容易断裂(如图1)；由表3可知，在MS基本培养基中只添加1.20mg/L NAA的5号培养基为最合适的生根培养基，其生根的诱导率可达78％，并且根的生长状态良好，根系发达，主根和侧根都很明显，根的颜色呈现黄绿色。
表3不同生长素类物质对生根诱导的影响
Figure BDA0003367659680000041
Figure BDA0003367659680000051
注：表中“—”表示培养基中不添加该种激素
实施例2
当不定芽伸长至2-3cm时，将诱导芽切下一部分转移到未添加任何激素的MS培养基中培养一周，降低材料中的内源性激素含量，然后再移入生根培养基(MS+1.20mg/LNAA)；一部分直接转移到生根培养基(MS+1.20mg/L NAA)中。通过对照试验比较经MS过渡对生根诱导的影响，每个处理10个不定芽，重复3次。
如图2和3所示，发现经MS过渡一周后的材料在生根培养基中长势比直接进行生根诱导的材料好。生根阶段材料对细胞分裂素以及生长素的需求没有诱导不定芽阶段时高，在MS培养基中培养一周后，能过渡掉材料表面残留的上个阶段所需的细胞分裂素和生长素以及材料的内源性激素，从而降低对生根诱导的不利影响。
实施例3
将2-3cm的诱导芽切下，将一部分诱导芽的切口放在浓度为200mg/L的生长素NAA中浸泡1h，然后再移入生根培养基(MS+1.20mg/L NAA)中培养；一部分不经高浓度生长素NAA刺激，直接移入生根培养基(MS+1.20mg/L NAA)。通过对照试验比较高浓度生长素刺激对生根诱导的影响，每个处理10个不定芽，重复3次。
将不定芽剪切下，不放在浓度为200mg/L的生长素NAA中浸泡1h，直接转入生根培养基中诱导出的不定根只含有主根部分，侧根较少，根呈白色且较为脆弱(如图4)；将切下的不定芽放在浓度为200mg/L的生长素NAA中浸泡1h后转入生根培养基，诱导出的不定根除了含有主根外，还生长出许多侧根，主根粗壮侧根细长(如图5)。表明用高浓度生长素刺激能够推动材料分化出不定根，其长势良好。

Claims (9)

1.一种利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取麻疯树顶端分生组织的第三片叶片作为外植体，对其表面消毒处理，并进行切割处理；
(2)将外植体以叶背接触培养基的方式接种至诱导愈伤组织培养基中，进行愈伤组织诱导，诱导愈伤组织培养基为在MS基本培养基中加入0.80-1.20mg/L BAP、0.20-0.60mg/LTDZ和0-0.10mg/L NAA；
(3)将愈伤组织移至诱导不定芽培养基中，进行不定芽诱导，诱导不定芽培养基为在MS基本培养基中加入1.00-2.00mg/L BAP、0.05-0.15mg/L IBA和0.50mg/L GA3；
(4)将生长至2-3cm的不定芽连同基部的愈伤组织一同切下，移入生根培养基中，进行生根培养，培养基为在MS基本培养基中加入0-1.20mg/L IBA和0-1.50mg/L NAA。
2.根据权利要求1所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，外植体消毒处理：先用水冲洗0.50-1.00min，洗去叶片表面灰尘，用体积分数为70％乙醇浸泡15s后，放入质量分数为3％NaClO溶液中，浸泡12-16min，中间适当摇晃，消毒完成后，在超净工作台中，用组培剪和镊子将叶片切割成1cm×1cm大小。
3.根据权利要求2所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，在剪切叶片时，保留叶片的经脉，并且在叶片方块边缘多剪切3-5个切口。
4.根据权利要求1所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，诱导愈伤组织的培养基配方为MS+0.80mg/L BAP+0.60mg/L TDZ+0.10mg/L NAA。
5.根据权利要求1所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，诱导不定芽的最佳培养基配方为MS+1.00mg/L BAP+0.10mg/LIBA+0.50mg/L GA3。
6.根据权利要求1所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，愈伤组织诱导培养方式：25℃、黑暗条件，培养三周；不定芽诱导培养方式：25℃、光照14h/黑暗10h，光照强度为40μmol/(m2·s)。
7.根据权利要求1所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，生根培养的培养基配方为MS+1.20mg/L NAA。
8.根据权利要求1所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，不定芽移入生根培养基之前先在MS培养基中培养1周。
9.根据权利要求1所述利用麻疯树叶片直接再生的方法，其特征在于，不定芽移入生根培养基之前先在浓度为200mg/L的NAA中浸泡1h。
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