CN113875781A - 一种模拟养殖场区利用噬菌体抑制巴氏杆菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种模拟养殖场区的利用噬菌体抑制巴氏杆菌的效果评价方法。本发明评价方法建立了菌液OD600与菌量、菌液用量及噬菌体效价之间的关系，可保证菌液用量满足噬菌体效价的测定，评价结果稳定且可信度高，可用于指导养殖者选择适宜的噬菌体和适宜浓度的抗生素联用，进行科学养殖，进而有效地抑制养殖过程中病原菌的生长，大大降低了人力成本，显著提高了经济效益。

Description

一种模拟养殖场区利用噬菌体抑制巴氏杆菌的方法

技术领域

本发明涉及养殖技术领域，尤其涉及一种模拟养殖场区利用噬菌体抑制巴氏杆菌的方法。

背景技术

细菌病是导致动物养殖业经济损失一直居高不下的主重要原因，尤其是生猪养殖业，生产上可造成较大损失的常见猪病就有16种以上，如巴氏杆菌病(Pasteurellosis)、链球菌病(Streptococcosis)、大肠杆菌病(Colibacillosis)、梭菌病(Clostridiosis)以及放线杆菌病(Actinobacillosis)等；其中，猪巴氏杆菌病又名猪肺疫、猪出血性败血症、肿脖瘟、锁喉风，是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)引起的一种急性传染病。该病一年四季均可发生，多见于保育猪和育肥猪，可引起猪萎缩性鼻炎、肺炎和败血症等。通常情况下，用于巴氏杆菌病治疗的药物包括头孢噻呋、恩氟沙星、托拉菌素，但长期使用抗生素导致了耐药性的产生，给疾病防控带来更大的难度。随着疫苗的研发和问世，一些添加PMT类毒素的疫苗能够提供较好的免疫保护；

噬菌体作为一种能够寄生在细菌上的病毒，可特异性的侵染细菌，并利用细菌体内的物质完成自身的增殖，最终导致细菌裂解死亡；鉴于噬菌体具有特异性强、自我增殖快、繁殖能力强等优点，且噬菌体会随着宿主的死亡而死亡，对人和动物细胞无毒，所以噬菌体在治疗细菌性疾病方面具有得天独厚的优势，利用噬菌体治疗细菌性疾病越来越受到人们的关注，在生猪养殖场的使用量也越来越高。噬菌体治疗单一细菌性疾病时，是以噬菌体为主要成分进行实践的，根据剂型及使用方法的不同，即可用于预防，也可用于治疗。

目前尚无噬菌体抗菌治疗的应用规范，更缺乏噬菌体在生猪养殖场的应用剂量评估方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种模拟养殖场区利用抑制巴氏杆菌的方法。本发明在实验室模拟场区环境，采用高效简便的方法对巴氏噬菌体的应用剂量和使用周期进行了探究，对后续的动物实验和生产实践具有重要的参考意义。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种模拟养殖场区利用噬菌体抑制巴氏杆菌的方法，包括：

步骤1：将纱布清洗、灭菌、干燥后，平铺于培养皿中间；

步骤2：制备浓度为1×10⁵CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的巴氏杆菌菌液和浓度为8×10⁵PFU/mL～8×10⁶PFU/mL的巴氏噬菌体溶液；

步骤3：将1ml所述巴氏杆菌菌液和1ml所述巴氏噬菌体溶液滴加到所述纱布上，密封，30℃恒温、静置培养；

步骤4：制备固体平板；将所述静置培养后的培养液滴加到所述固体平板上平板表面，晾干，倒置，37℃恒温、静置培养8～10h后统计菌落个数。

一些实施方案中，所述灭菌为120℃高压湿热灭菌40min。

一些实施方案中，所述干燥为80℃烘干箱中烘干。

一些实施方案中，所述纱布的尺寸为2cm×2cm。

一些实施方案中，所述巴氏杆菌菌液由以下方法制得：

取巴氏杆菌甘油菌，加入含5％马血清的TSB培养基，37℃恒温，145rpm振荡培养12～13小时。

一些实施方案中，所述巴氏杆菌菌液的浓度为1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1×10⁸CFU/mL或1×10⁹CFU/mL。

一些实施方案中，所述固体平板为含血清的TSA固体平板。

本发明在实验室模拟场区环境，在合理的使用范围内，采用高效简便的方法对巴氏噬菌体的应用剂量和使用周期进行了探究，对后续的动物实验和生产实践具有重要的参考意义。

附图说明

图1示72小时内各组巴氏杆菌活菌数在噬菌体作用下随时间变化趋势；

图2示2周内各组巴氏杆菌在噬菌体作用下活菌数的变化趋势。

具体实施方式

本发明提供了一种模拟养殖场区利用噬菌体抑制巴氏杆菌的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

巴氏杆菌病(pasteurellosis):由多杀性巴氏杆菌引起的以出血性败血症或传染性肺炎为主要症状的动物传染病。

噬菌体(phage)：是寄生于细菌、支原体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等的一类病毒，亦称细菌病毒。在自然界分布极广，凡是有上述各类微生物的地方，都有相应种类噬菌体的存在。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(一)实验设计

表1

①制备巴氏杆菌菌液后检测菌液OD₆₀₀，结合生产经验，1OD₆₀₀对应巴氏杆菌浓度为10～15亿CFU/mL，由此计算种子液中巴氏杆菌的浓度；

②本实验设置巴氏杆菌组别应用剂量分别为1×10⁵CFU、1×10⁶CFU、1×10⁷CFU、1×10⁸CFU、1×10⁹CFU；

③噬菌体同样来自实验室自存；结合场区整体噬菌体的使用情况，计算得到每m²噬菌体的用量，由此来设计本次实验噬菌体的用量分别为8×10⁵PFU/4cm²；为了探究更高应用剂量噬菌体的杀菌效果，另增设了噬菌体含量：8×10⁶PFU/4cm²、巴氏杆菌含量1×10⁷CFU组为对照；

④结合生产实际，巴氏噬菌体的用量设为两组：8×10⁵PFU和8×10⁶PFU；巴氏噬菌体也为实验室自制，效价约为400～700亿PFU/mL；

⑤以不加巴氏噬菌体的组别为空白对照；

⑥结合生产上噬菌体的使用周期，本实验设置的实验周期为2周；取样时间节点分别设置为：0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d、12d、13d、14d、15d；

⑦本发明以纱布为载体，承载噬菌体和菌液的作用体系。将菌液与噬菌体先后均匀滴加在使一定面积的纱布上，既能保证噬菌体用量符合生产实际，又模拟了两者的作用条件，符合猪舍地面环境。

为了探究环境中巴氏杆菌在一定量噬菌体作用下数量的变化趋势，在不同的时间节点取样检测样液中巴氏杆菌的活菌数，总时长为72h，结果见图1。为了更持久的追踪噬菌体的作用效果，选取巴氏杆菌应用剂量为1×10⁷CFU、噬菌体用量为8×10⁵PFU/4cm²进行持续监测，以不加噬菌体的空白对照组，检测时间为2周，并绘制时间-活菌数之间的关系图，获得巴氏杆菌在噬菌体作用下2周内的变化趋势，结果见图2，经过噬菌体效价验证，在这个过程中噬菌体可保持正常的侵染活性。

以上检测指标为每个时间段的活菌数；

(二)实验方法

(1)准备巴氏菌液

①配置100mL TSB(Tryptone SoyaBroth)培养基，115℃高压湿热灭菌20min，放置室温备用；

②取出存放于-20℃的实验室自存巴氏杆菌甘油菌，置于4℃冰箱中约3～5分钟，使其融化；

③向TSB培养基中接入5％马血清(5mL)，轻轻摇匀；

④取0.5mL甘油菌加入③中，轻轻摇匀；

⑤将培养瓶置于37℃恒温摇床中145rpm振荡培养12～13小时后取出备用；

(3)铺设实验体系

①将纱布剪成2cm×2cm大小的正方块，用纯水清洗3～5遍，置于高压锅中120℃高压湿热灭菌40min，然后置于80℃烘干箱中烘干备用；

②预实验表明，纱布上可承载2mL的液体，即可保证菌液和噬菌体不因缺少水分死亡，又满足实验需求；所以，根据实验需要，将巴氏杆菌分别稀释为1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1×10⁸CFU/mL、1×10⁹CFU/mL；将巴氏噬菌体用0.9％生理盐水(pH 7.0～7.2)稀释为8×10⁵PFU/mL和8×10⁶PFU/mL；

③取直径90mm的圆形塑料培养皿，将无菌纱布平铺在中央；

④取1mL巴氏杆菌菌液均匀滴加在纱布上(注意不要滴加在纱布之外)；

⑤取1mL噬菌体菌液均匀滴加在④中纱布上(注意不要滴加在纱布之外)；

⑥对照组滴加1mLpH为7.0～7.2的0.9％生理盐水(注意不要滴加在纱布之外)；

⑦用封口膜小心密封；

⑧将密封好的平板小心转移置30℃恒温培养箱中静置培养，挪动时注意不要让样液流出纱布，避免造成实验误差；

(3)制备TSA+血清固体平板

①配置TSA(Tryptone SoyaAgar)培养基：称量30g TSA，溶于1000mL纯水中，115℃高压蒸汽灭菌20min；

②待其温度降到40～50℃，加入10％马血清，轻轻摇匀；

③取直径10cm的玻璃皿，每皿倒入约25mL TSA+血清培养基，待其凝固，即可得TSA+血清固体平板；

(4)菌落计数

①收集样液：当培养至设定时间节点，将纱布用枪头小心挑入10mL离心管内，并尽量吸净皿中残液；

②向皿内加入3mL含5％马血清的TSB培养基，冲洗皿底，将其一并转入离心管内，确保巴氏杆菌被完全回收；

③将离心管置于涡旋仪上涡旋1min，取0.5mL样液加入4.5mL BHI培养基中，即可得10^-1倍稀释液；并依次稀释至所需梯度；

④取100μL样液稀释液滴加在TSA+血清固体平板表面，轻轻旋转平板，是样液在平板表面均匀分布；

⑤超净台内晾干；

⑥倒置放在37℃恒温培养箱中静置培养8～10h后统计菌落个数，并计算得到最终样液中巴氏杆菌的含量，单位表示为CFU/ml。

(三)实验结果

(1)各组巴氏杆菌活菌数在噬菌体作用下随时间变化趋势(72h)。

由图1结果可知，与对照组2相比，实验组巴氏杆菌在0～48h内活菌数先增后减，48h后呈不断下降趋势，表明噬菌体在48h内即可有效抑制数量在10万CFU～10亿CFU之间的巴氏杆菌增长；10^9组可能是由于菌含量过高，菌群竞争较大，故数量不断下降；

800万PFU和80万PFU的噬菌体用量24h前对整体活菌数没有数量级的影响，48h后800万PFU噬菌体含量的组别活菌数率先明显下降；

48h～72h之间实验组活菌数呈缓慢下降趋势，变化不大，暂时趋于稳定，这个阶段噬菌体与巴氏杆菌即将处于共生阶段。

(2)巴氏杆菌在噬菌体作用下2周内的变化趋势。

由图2可知，72h后两组实验活菌数持续下降；其中对照组在噬菌体和营养竞争的双重作用下数量不断下降；为了更贴合厂区实际(实际中饲料撒落，也相当与给巴氏杆菌补给营养)，故在第7d分被在两组样液中添加了0.5mL TSB培养基；截止到第15d，实验组和对照组的活菌数分别120万cfu和210万CFU，噬菌体与巴氏杆菌即将处于共生阶段；如果在第7d未补给营养，这个结果预计将提前5～6d出现；

实验室模拟养殖场区环境评估噬菌体应用剂量的评估实验中，80万PFU/4cm²(20万PFU/cm²)的噬菌体用量在48～72h之间即可显著抑制巴氏杆菌10^7CFU巴氏杆菌生长；且环境中若无营养补给，巴氏杆菌数量将会维持在一个较低的水平；

实施例2

本发明将此噬菌体用量(20万PFU/cm²)应用在某地养殖场区的育肥段和哺乳段，进行多个批次、数十万头猪只的验证，结果如下：

在育肥段，按照噬菌体20万PFU/cm²的剂量利用雾化器对猪鼻雾化使用，结果显示，雾化1～2次整体优于未雾化的批次；雾化2～3次的批次末增重、成活率、合格上市率、头均药费和日增重均明显优于未雾化批次；

在哺乳段，无论是高效过滤猪舍还是粗效过滤猪舍，雾化效果明显优于未雾化；雾化3次的情况下，头均药费、21d校正末重、成活专栏率和单位公斤成本均优于未雾化批次；雾化批次窝产健仔数、窝均断奶仔猪数均优于未雾化批次。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种模拟养殖场区的利用噬菌体抑制巴氏杆菌的方法，其特征在于，包括：

步骤1：将纱布清洗、灭菌、干燥后，平铺于培养皿中间；

步骤2：制备浓度为1×10⁵CFU/mL～1×10⁹CFU/mL的巴氏杆菌菌液和浓度为8×10⁵PFU/mL～8×10⁶PFU/mL的巴氏噬菌体溶液；

步骤3：将1ml所述巴氏杆菌菌液和1ml所述巴氏噬菌体溶液滴加到所述纱布上，密封，30℃恒温、静置培养；

步骤4：制备固体平板；将所述静置培养后的培养液滴加到所述固体平板上平板表面，晾干，倒置，37℃恒温、静置培养8～10h后统计菌落个数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭菌为120℃高压湿热灭菌40min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥为80℃烘干箱中烘干。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纱布的尺寸为2cm×2cm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巴氏杆菌菌液由以下方法制得：

取巴氏杆菌甘油菌，加入含5％马血清的TSB培养基，37℃恒温，145rpm振荡培养12～13小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巴氏杆菌菌液的浓度为1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1×10⁸CFU/mL或1×10⁹CFU/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体平板为含血清的TSA固体平板。

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