CN113874398A - Cd19结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了特异性结合至CD19的CD19结合分子，包括单特异性、双特异性和三特异性结合分子；包含所述CD19结合分子的缀合物；以及包含所述CD19结合分子和缀合物的药物组合物。本披露进一步提供了使用所述C19结合分子治疗与CD19表达相关的疾病和障碍的方法。本披露还进一步提供了被工程化以表达所述CD19结合分子的重组宿主细胞，以及通过在表达所述CD19结合分子的条件下培养所述宿主细胞来产生所述CD19结合分子的方法。

Description

CD19结合分子及其用途
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2019年5月21日提交的美国临时申请号62/850,901以及2019年5月30日提交的美国临时申请号62/854,695的优先权益，各申请的内容通过引用以其全文并入本文。
2.序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且所述序列表特此通过引用以其全文并入。所述ASCII副本创建于2020年5月4日，名称为NOV-007WO_SL.txt并且大小为776,262字节。
3.技术领域
本披露总体上涉及特异性结合至CD19的CD19结合分子，包括单特异性、双特异性和三特异性结合分子，以及它们用于治疗与CD19表达相关的疾病和障碍的用途。
4.背景技术
B细胞在分化和增殖过程中表达多种细胞表面分子。CD19是一种泛B细胞膜糖蛋白，其在前B细胞发育的早期通过终末分化表达，从而调节B淋巴细胞的发育和功能。在大多数淋巴源性癌症、绝大多数非霍奇金淋巴瘤(NHL)和白血病(包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和华氏巨球蛋白血症(WM))中鉴定出CD19的表达。
博纳吐单抗是一种CD19-CD3双特异性T细胞接合物，被批准用于治疗ALL。然而，用博纳吐单抗治疗缺乏持久的响应，并且其特征是复发率高。Von Stackelberg等人,2016,Journal of Clinical Oncology[临床肿瘤学杂志]34(36):4381-4389。此外，博纳吐单抗具有短的半衰期，这需要持续药物暴露才能发挥足够的功效和可控制的毒性。Porter等人,2013,Clin Pharmacol.[临床药理学杂志]5(增刊1):5-11。
尽管癌症治疗取得了重大进展，但B细胞恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤的B细胞亚型和慢性淋巴细胞性白血病，是癌症相关死亡的主要原因。因此，仍然需要进一步的治疗剂来治疗B细胞恶性肿瘤。
5.发明内容
本披露提供了特异性结合至人CD19的CD19结合分子(例如，抗体、其抗原结合片段)、和特异性结合至人CD19的多特异性分子。
在一个方面，本披露提供了包含CD19抗原结合结构域或抗原结合模块(“ABM”)的单特异性CD19结合分子(例如，抗体及其抗原结合片段)。可能是单特异性的示例性CD19结合分子描述于下文中的7.2节和具体实施例1至具体实施例15中。
在另一方面，本披露提供了包含本披露CD19 ABM的多特异性结合分子(“MBM”)。
在某些实施例中，所述MBM是双特异性结合分子(“BBM”)。本披露的BBM包含特异性结合至人CD19的第一ABM(“ABM1”或“CD19 ABM”)和特异性结合至第二抗原的第二ABM(“ABM2”)，例如，人CD3或T细胞受体(TCR)复合物的其他组分(本文中有时被称为“TCRABM”)。所述术语ABM1、ABM2、CD19 ABM、和TCR ABM仅仅为了方便起见使用并不旨在传达BBM的任何特定构型。在一些实施例中，TCR ABM结合至CD3(本文中被称为“CD3 ABM”等)。因此，涉及ABM2和TCR ABM的披露也适用于CD3 ABM。此类多特异性分子可以用于引导CD3+效应T细胞至CD19+位点，从而允许CD3+效应T细胞攻击并裂解CD19+细胞和肿瘤。示例性MBM的特征描述于下文中的7.5节至7.6节和具体实施例16至具体实施例1190中。
本披露还通过提供与CD19、CD3或T细胞上的TCR复合物的其他组分，以及CD2或人肿瘤相关抗原(“TAA”)，例如除了CD19之外的B细胞抗原接合的三特异性结合分子(“TBM”)，扩展了重定向靶向T细胞裂解(RTCC)的原理。本披露的TBM包含至少三个抗原结合模块(“ABM”)，其可以结合(i)CD19(ABM1)，(ii)TCR复合物的组分(ABM2)，和(iii)CD2或TAA(ABM3)。为了方便起见，结合至(1)人CD19，(2)CD3或TCR复合物其他组分，和(3)CD2的TBM在本文中称为“1型TBM”。为了方便起见，结合至(1)人CD19，(2)CD3或TCR复合物其他组分，和(3)TAA的TBM在本文中称为“2型TBM”。
不受理论的束缚，本发明人相信在1型TBM中结合CD2-和TCR复合物-接合可以刺激促进T细胞介导的肿瘤细胞裂解的主要信号通路(例如，通过聚集TCR)和第二共刺激通路两者以诱导T细胞增殖并潜在地克服无反应性。同样不受理论的束缚，据信接合除CD19和TCR复合物的组分之外的TAA，与使用仅靶向CD19和TCR复合物组分的双特异性接合物相比，通过靶向更多数量的癌性B细胞，2型TBM将改善癌症(例如B细胞恶性肿瘤)的RTCC治疗的临床结果。
因此，在一个方面，本披露提供了结合至(1)人CD19，(2)CD3或TCR复合物的其他组分，和(3)CD2的1型TBM。
在另一方面，本披露提供了结合至(1)人CD19，(2)CD3或TCR复合物的其他组分，和(3)TAA的2型TBM。
除非另外明确指出或者除非上下文另有规定，否则本披露中对TBM的引用适用于1型和2型TBM两者。
在一些实施例中，本披露的MBM的每个抗原结合模块能够在一个或多个额外的抗原结合模块中的每一个与其各自的靶结合的同时结合其各自的靶。ABM1是基于免疫球蛋白的，而ABM2和ABM3(当存在时)可以是基于免疫球蛋白的或基于非免疫球蛋白的。因此，MBM可以包括基于免疫球蛋白的ABM或基于免疫球蛋白和基于非免疫球蛋白的ABM的任何组合。可以用于MBM的基于免疫球蛋白的ABM描述于下文中的7.3.1节和具体实施例17至21、24至29中。可以用于MBM的基于非免疫球蛋白的ABM描述于下文中的7.3.2节和具体实施例22至23中。结合至人CD19的示例性ABM的其他特征描述于下文中的7.2节和具体实施例17至21中。结合至TCR复合物的组分的示例性ABM的其他特征描述于下文中的7.7节和具体实施例30至621中。结合至CD2的示例性ABM的其他特征描述于下文中的7.8节和具体实施例726至775中。结合至TAA的示例性ABM的其他特征描述于下文中的7.9节和具体实施例776至894中。
MBM的ABM(或其部分)可以相互连接，例如，通过短肽接头或通过Fc结构域相互连接。用于连接ABM以形成MBM的方法和组分描述于下文中的7.4节和具体实施例895至1190中。
BBM具有至少两个ABM(例如，BBM至少是二价的)，并且TBM具有至少三个ABM(例如，TBM至少是三价的)，但它们可以具有更大的化合价。例如，BBM可以具有三个、四个或更多个ABM(即，是三价的、四价的，或者具有大于四价的化合价)。示例性二价、三价、和四价BBM构型示出于图1中并描述于下文中的7.5节和具体实施例624至684中。
TBM可以具有四个ABM(即四价)、五个ABM(即五价)、或六个ABM(即六价)，条件是所述TBM具有至少一个可以结合CD19的ABM，至少一个可以结合TCR复合物的组分的ABM，和至少一个可以结合CD2或TAA的ABM。示例性三价、四价、五价、和六价TBM构型示出于图2中并描述于下文中的7.6节和具体实施例687至724中。
本披露进一步提供了编码所述CD19结合分子的核酸(以单个核酸或多个核酸的形式)和工程化以表达本披露的核酸和CD19结合分子的重组宿主细胞和细胞系。示例性核酸、宿主细胞、和细胞系描述于下文中的7.10节和具体实施例1241至1248中。
本披露进一步提供了包含本披露的CD19结合分子的药物缀合物。为了方便起见，此类缀合物在本文中被称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”，尽管一些ABM可能是非免疫球蛋白结构域。ADC的实例描述于下文中的7.12节和具体实施例1191至1230中。
还提供了包含所述CD19结合分子和ADC的药物组合物。药物组合物的实例描述于下文中的7.15节和具体实施例1231中。
本文进一步提供了使用所述CD19结合分子、所述ADC和本披露的所述药物组合物，例如用于治疗增殖性病症(例如，癌症)(CD19在其上表达)、用于治疗自身免疫性障碍、和用于治疗与CD19表达相关的其他疾病和病症的方法。示例性方法描述于下文中的7.16节和具体实施例1232至1239中。
本披露进一步提供了使用与其他的药剂和疗法组合的所述CD19结合分子、所述ADC、和所述药物组合物的方法。组合疗法的示例性药剂、疗法、和方法描述于下文中的7.17节和具体实施例1240中。
6.附图说明
图1A-1AH：示例性BBM构型。图1A示出了图1B-1AH中示出的示例性BBM构型的组分。并未示出连接每条链的不同结构域的全部区(例如，省略了连接scFv的VH结构域和VL结构域的接头、连接Fc结构域的CH2结构域和CH3结构域的铰链等)。图1B-1F示出了二价BBM；图1G-1Z示出了三价BBM；图1AA-1AH示出了四价BBM。
图2A-2V：示例性TBM构型。图2A示出了图2B-2V中示出的示例性TBM构型的组分。并未示出连接每条链的不同结构域的全部区(例如，省略了连接scFv的VH结构域和VL结构域的接头、连接Fc的CH2结构域和CH3结构域的铰链等)。图2B-2P示出了三价TBM；图2Q-2S示出了四价TBM；图2T示出了五价TBM，并且图2U-2V示出了六价TBM。
图3A-3B：实例1的双特异性(图3A和图3C)和三特异性(图3B)构建体的示意图。
图4A-4B：CD19 BBM引发针对CD19+靶细胞的重定向T细胞毒性活性(RTCC)的能力。基于NEG258和基于NEG218的BBM两者介导了针对CD19+靶细胞系的RTCC活性。在效应细胞:靶细胞(E:T)比为3:1的系列稀释BBM的存在下，将Nalm6-luc(图4A)和Karpas422-luc(图4B)细胞与扩增的T细胞共培养。在孵育24h后测量发光信号。
图5A-5B：CD19 BBM引发T细胞增殖的能力。基于NEG258和基于NEG218的BBM两者均诱导T细胞增殖。在E:T比为1:1的系列稀释BBM的存在下，将Karpas422-luc(图5A)和Nalm6-luc(图5B)细胞与扩增的T细胞共培养。在孵育96h后测量发光信号。
图6A-6F：CD19 TBM引发CD2依赖性T细胞活化的能力。CD2敲除减弱了三特异性构建体的优势。图6A-6B示出了JNL CD2 WT(图6A)和KO(图6B)细胞上CD2表达的代表性流式细胞术分析。抗CD2 mAb的染色(点填充直方图)与mIgG1同种型对照的染色(斜线填充直方图)或未染色(开放直方图)重叠。图6C-6F示出了在E:T比为3:1的系列稀释BBM和TBM的存在下，JNL CD2+(图6C-6D)和CD2-(图6E-6F)细胞与CD19+靶细胞共培养的数据。在孵育24h后测量发光信号。
图7A-7B：CD19 TBM与食蟹猴B细胞的结合。图7A示出了具有基于NEG218的CD19结合臂的TBM的数据，并且图7B示出了具有基于NEG 258的CD19结合臂的TBM的数据。
图8A-8H：PBMC中的食蟹猴B细胞耗尽后，CD19 TBM诱导T细胞活化的能力。在图8A中，使用ficoll梯度离心从食蟹猴全血中分离出PBMC并将其与双特异性或三特异性构建体一起孵育过夜。收获样品，并同时对CD3和CD20进行染色，以鉴定PBMC群体中的B细胞和T细胞。如8.6.1节中所述地计算B细胞耗尽的百分比。图8B-8H示出了CD3+T细胞上CD69和CD25表达的FACS分析结果，以确定单个(CD69+CD25-或CD69-CD25+)或双阳性细胞(CD69+CD25+)。图8B：未处理(仅介质)；图8C-8E：CD3hi TSP1L；图8F-8H：CD3hi TSP1。
图9A-9P：基于NEG258和基于NEG218的TBM诱导人供体细胞针对Nalm6(图9A-9H)和Karpas422(图9I-9P)靶细胞的重定向的T细胞毒性的能力。
图10A-10P：具有不同CD3亲和力的基于NEG258和基于NEG218的TBM诱导人供体细胞针对Nalm6(图10A-10H)和Karpas422(图10I-10P)靶细胞的重定向的T细胞毒性的能力。
图11A-11L：包含CD2结合臂和包含对照溶菌酶结合臂的基于NEG258的TBM诱导人供体细胞针对Nalm6(图11A-11H)和Karpas422(图11I-11L)靶细胞的重定向的T细胞毒性的能力。
图12A-12C：由基于NEG258和基于NEG218的TBM诱导T细胞细胞因子释放。图12A：IFN-γ；图12B：TNF-α；图12C：IL2。
图13A-13C：基于NEG258和基于NEG218的TBM与过度表达人CD19(图13A)或食蟹猴CD19(图13B)的鼠300.19细胞系的结合。所述TBM显示与野生型300.19细胞系的结合可忽略不计(图13C)。
图14：CD58的示意性图示。
图15：含有CD58变体序列的TBM的重定向的T细胞毒性。
图16：含有CD58变体序列的TBM的抗原非依赖性T细胞活化。以相对发光单位(RLU)表示的数据。
图17A-17H：CD19和CD58在多种细胞系上的表达：图17A-17B：CD19和CD58分别在OCI-LY-19细胞上的表达；图17C-17D：CD19和CD58分别在Karpas-422细胞上的表达；图17E-17F：CD19和CD58分别在托莱多细胞上的表达；图17G-17H：CD19和CD58分别在Nalm-6细胞上的表达。
图18A-18B：基于NEG258的TBM和BBM诱导人供体细胞针对Karpas422靶细胞的重定向的T细胞毒性的能力。图18A和图18B示出了使用来自两个不同供体的T细胞的数据。
图19A-19F：由基于NEG258的TBM和BBM诱导T细胞细胞因子释放。图19A-19B：IFN-γ(分别为供体1和供体2)；图19C-19D：IL-2(分别为供体1和供体2)；图19E-19F：TNF-α(分别为供体1和供体2)。X轴上的三角形表示图中从左到右构建体的集中度降低。
图20：结合至T细胞的基于NEG-258的TBM和BBM。
图21A-21C：基于NEG-258的TBM和BBM介导的T细胞增殖。图21A：OC-LY-19共培养中的T细胞增殖；图21B：Karpas422共培养中的T细胞增殖；图21C：托莱多共培养中的T细胞增殖。
图22A-22B：基于NEG258的TBM和BBM诱导人供体细胞针对Karpas422靶细胞的重定向的T细胞毒性的能力。图22A和图22B示出了使用来自两个不同供体的T细胞的数据。
图23A-23J：基于NEG258的TBM和BBM诱导人供体细胞针对多种靶细胞的重定向的T细胞毒性的能力。图23A-23B：OC-LY-19(分别为供体1和供体2)；图23C-23D：托莱多(分别为供体1和供体2)；图23E-23F：Nalm6(分别为供体1和供体2)；图23G-23H：Nalm6 KO(分别为供体1和供体2)；图23I-23J：K562(分别为供体1和供体2)。
图24A-24J：在多种靶细胞中由基于NEG258的TBM和BBM诱导T细胞细胞因子释放。图24A-24B：来自OC-LY-19的TNF-α(分别为供体1和供体2)；图24C-24D：来自托莱多的TNF-α(分别为供体1和供体2)；图24E-24F：来自Nalm6的TNF-α(分别为供体1和供体2)；图24G-24H：来自Nalm6 KO的TNF-α(分别为供体1和供体2)；图24I-24J：来自K562的TNF-α(分别为供体1和供体2)。
图25A-25H：用Karpas 422和OCI-LY-19细胞系再考验RTCC测定。图25A：测定设置。图25B-25D：Karpas 422(分别为第一次挑战后、第二次挑战后、和第三次挑战后)；图25E-25H OCI-LY-19(分别为第一次挑战后、第二次挑战后、第三次挑战后、和第四次挑战后)。
图26A-26P：用Karpas 422和OCI-LY-19细胞系再考验T细胞表型。图26A-26H：Karpas 422表型；图26I-26P：OCI-LY-19表型。图26A和26I：％IL-2+CD4 T细胞；图26B和26J：％IFNγ+CD4 T细胞；图26C和26K：％IL-2+CD8 T细胞；图26D和26L：％IFNγ+CD8 T细胞；图26E和26M：CD3年轻；图26F和26N：CD4年老；图26G和26O：CD8年轻；图26H和26P：CD8年老。图中的线条代表不同的T细胞供体。
图27A-27D：CD3hi TSP1与CD3hi BSP1在CD19+靶细胞存在下引发T细胞增殖的能力。在存在1nM(图27A-27B)或0.1nM(图27C-27D)CD3hi TSP1或CD3hi BSP1且存在(图27A和27C)或不存在(图27B和27D)经照射的自体PBMC(T细胞耗尽)的情况下，将Nalm6-luc细胞与分选的CD28+或CD28-CD8 T细胞以1:3的E:T比率共培养72h。将增殖测量为CFSE稀释细胞在活细胞中的百分比。
图28A-28L：CD3hi TSP1和CD3hi BSP1在Nalm6 CD19+靶细胞(E:T 1:3)存在下诱导T细胞细胞因子产生的能力。图28A-28B：当在经照射的PBMC和1nM CD3hi TSP1或1nMCD3hi BSP1存在下共培养时，产生CD28-和CD28+CD8 T细胞的GzB(图28A)和IFN-γ(图28B)的中值荧光强度(MFI)。图28C-28D：当在不存在经照射的PBMC和1nM CD3hi TSP1或1nMCD3hi BSP1的情况下共培养时，产生CD28-和CD28+CD8 T细胞的GzB(图28C)和IFN-γ(图28D)的MFI。图28E-28F：当在经照射的PBMC和0.1nM CD3hi TSP1或0.1nM CD3hi BSP1存在下共培养时，产生CD28-和CD28+CD8 T细胞的GzB(图28E)和IFN-γ(图28F)的MFI。图28G-28H：当在不存在经照射的PBMC和0.1nM CD3hi TSP1或0.1nM CD3hi BSP1的情况下共培养时，产生CD28-和CD28+CD8 T细胞的GzB(图28G)和IFN-γ(图28H)的MFI。图28I-28L：当在存在(图28I和28K)或不存在(图28J和28L)经照射的PBMC和1nM(图28I和28J)或0.1nM(图28K和图28L)CD3hi TSP1或CD3hi BSP1的情况下共培养时，活T细胞的比例。
图：29A-29I：CD3hi TSP1与CD3hi BSP1诱导T细胞表型变化的能力。图29A：针对CCR7和CD45RO表达分选的CD28-和CD28+T细胞的代表性实例。图29B-29I：在存在(图29B-29E)或不存在(图29F-29I)PBMC以及存在1nM(图29B-29C和29F-29G)或0.1nM(图29D-29E和29H-29I)CD3hi TSP1或CD3hi BSP1的情况下共培养(E:T 1:3)72小时后根据两个表面标记物CD45RO和CCR7(幼稚的，CD45RO-CCR7+；中枢记忆(CM)，CD45RO+CCR7+；效应记忆(EM)，CD45RO+CCR7-；和终末分化(TEMRA)，CD45RO-CCR7-)的组合表达所定义的不同T细胞群的分布。增殖细胞(CFSE-)的数据示出于图29B、29D、29F、和29H中。非增殖细胞(CSFE+)的数据示出于图29C、29E、29G、和29I中。CD28-细胞的数据显示在每个图的左侧上，并且CD28+细胞的数据显示在图的右侧上。
图30A-30D：CD3hi TSP1与CD3hi BSP1引发针对CD19+靶细胞的重定向T细胞毒性活性(RTCC)的能力。在存在1nM(图30A和30C)或0.1nM(图30B和30D)CD3hi BSP1、CD3hiTSP1或CD3hi TSP1C且存在(图30A和30B)或不存在(图30C和30D)经照射的自体PBMC(T细胞耗尽)的情况下，来自与分选的CD28+或CD28-CD8 T细胞以1:3的E:T比率共培养72h的Nalm6-luc细胞的RTCC结果。(n＝3)在共培养孵育结束时测量发光信号。结果表示为与未处理条件相比的倍数增加，在未处理条件下，不添加抗体以便评估由对照抗体给出的背景信号。
图31A-31B：CD3hi TSP1(图31A)和CD3med TSP1(图31B)在OCI-LY-19皮下肿瘤模型的人PBMC过继转移适应中的抗肿瘤活性。
图32A-32B：在OCI-LY-19皮下肿瘤模型的人PBMC过继转移适应中，用CD3hi TSP1(图32A)和CD3med TSP1(图32B)治疗后的体重变化。
图33：NSG小鼠人源化过程的示意图。
图34A-34B：CD3 TSP1、CD3hi BSP1和CD3med TSP1在huCD34+NSG小鼠的DLBCL皮下肿瘤模型中的抗肿瘤活性(图34A)，以及在huCD34+NSG小鼠的DLBCL皮下肿瘤模型中用CD3TSP1、CD3hi BSP1和CD3med TSP1治疗后的体重变化(图34B)。
图35A-35D：在huCD34+NSG小鼠的OCI-LY-19DLBCL皮下肿瘤模型中用CD3hi TSP1(图35A和35B)和CD3med TSP1(图35C和35D)进行抗体治疗后的抗肿瘤活性(图35A和35C)和体重响应(图35B和35D)。
图36A-36C：CD3hi BSP1(图36A)、CD3hi TSP1(图36B)和CD3med TSP1(图36C)在Daudi-Luc皮下肿瘤模型的人PBMC过继转移适应中的抗肿瘤活性。
图37A-37C：在Daudi-Luc皮下肿瘤模型的人PBMC过继转移适应中，用CD3hi BSP1(图37A)、CD3hi TSP1(图37B)或CD3med TSP1(图37C)进行抗体治疗后的体重变化。
图38A-38C：实例32的三特异性构建体的示意图。图38A：具有全长CD58部分AB2-1的TBM；图38B：具有包含CD58的IgV样结构域的截短CD58部分的TBM；图38C：具有对应于抗CD2抗体Medi 507的scFv的TBM。
图39A-39E：实例33的三特异性构建体的示意图。图39A：具有来自实例32的CD58IgV结构域的TBM；图39B：具有“左”半抗体和“右”半抗体的TBM，所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有CD58 IgV结构域、抗CD3 scFab和Fc结构域，并且所述“右”半抗体对于Fc结构域具有抗CD19 Fab N-末端；图39C：具有“左”半抗体和“右”半抗体的TBM，所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有CD58 IgV结构域、抗CD3 scFv和Fc结构域，并且所述“右”半抗体对于Fc结构域具有抗CD19 Fab N-末端；图39D：具有“左”半抗体和“右”半抗体的TBM，所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有抗CD3scFv、CD58 IgV结构域和Fc结构域，并且所述“右”半抗体对于Fc结构域具有抗CD19 Fab N-末端；图39E：具有“左”半抗体和“右”半抗体的TBM，所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有抗CD3 scFv、Fc结构域和CD58 IgV结构域，并且所述“右”半抗体对于Fc结构域具有抗CD19 Fab N-末端。
图40A-40C：实例34的三特异性构建体的示意图。图40A：具有来自实例32的CD58IgV结构域的TBM；图40B：具有“左”半抗体和“右”半抗体的TBM，所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有抗CD3 scFv、Fc结构域和CD19 scFv结构域，并且所述“右”半抗体对于Fc结构域具有CD58 IgV结构域N-末端。图40C：具有“左”半抗体和“右”半抗体的TBM，所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有抗CD3 scFv、Fc结构域和CD19 Fab结构域，并且所述“右”半抗体对于Fc结构域具有CD58 IgV结构域N-末端。
7.具体实施方式
7.1.定义
如本文所用的，以下术语旨在具有以下含义：
ABM链：单个ABM可以作为一个多肽链存在(例如，在scFv的情况下)或通过多于一个多肽链的缔合形成(例如，在Fab的情况下)。如本文所用的，所述术语“ABM链”是指存在于单一多肽链上的ABM的全部或部分。所述术语“ABM链”的使用旨在为了方便起见并且仅出于描述的目的，并且不意味着特定构型或生产方法。
ADCC：如本文所用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致所述靶细胞的裂解。ADCC与结合至FcγRIIIa相关；结合至FcγRIIIa的提高导致ADCC活性的提高。
ADCP：如本文所用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性吞噬细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致所述靶细胞的吞噬作用。
另外的药剂：为了方便起见，与本披露的抗原结合分子组合使用的药剂在本文中被称为“另外的”药剂。
抗体：如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽(或多肽的组)，所述多肽(或多肽的组)能够非共价、可逆地并且特异性地结合抗原。例如，天然存在的IgG类型的“抗体”是包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区由一个结构域(在本文缩写为CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其间穿插有称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。所述术语“抗体”包括但不限于：单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化(camelised)抗体、嵌合抗体、双特异性或多特异性抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本披露的抗体的抗Id抗体)。这些抗体可以属于任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
将轻链和重链两者分成结构同源性区和功能同源性区。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。在这点上，应当理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域均决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要生物学特性例如分泌、经胎盘移动性(transplacentalmobility)、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或者氨基末端越远，它的编号越大。在野生型抗体中，可变区在N-末端并且恒定区在C-末端；CH3结构域和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
抗体片段：如本文所用的，所述术语抗体的“抗体片段”是指抗体的一个或多个部分。在一些实施例中，这些部分是抗体的一个或多个接触结构域的一部分。在一些其他的实施例中，这些部分是抗原结合片段(其保留了非共价地、可逆地并且特异性地结合抗原的能力)，有时在本文中被称为“抗原结合片段”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”等。结合片段的实例包括但不限于，单链Fv(scFv)，Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,1989,Nature[自然]341:544-546)；以及分离的互补决定区(CDR)。因此，所述术语“抗体片段”涵盖抗体的蛋白水解片段(例如，Fab和F(ab)2片段)和包含抗体(例如，scFv)的一个或多个部分的工程化的蛋白质。
抗体片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,2005Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136)。可以将抗体片段移植到基于多肽例如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单体)。
可以将抗体片段掺入包含一对串联Fv片段(例如，VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，与互补的轻链多肽(例如，VL-VC-VL-VC)一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,1995,Protein Eng.[蛋白工程]8:1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
抗体编号系统：在本说明书中，除非另外说明，对抗体结构域中编号的氨基酸残基的参考基于EU编号系统(例如，在表1中)。该系统最初由Edelman等人,1969,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]63:78-85设计并且由Kabat等人,1991，于Sequencesof Proteins of Immunological Interest[免疫学相关蛋白序列],美国国立卫生研究院美国卫生与人力资源服务部(US Department of Health and Human Services,NIH,USA)中做了详细描述。
抗原结合模块：如本文所用的术语“抗原结合模块”或“ABM”是指MBM具有非共价地、可逆地并且特异性结合至抗原的能力的部分。ABM可以是基于免疫球蛋白的或基于非免疫球蛋白的。如本文所用的，所述术语“ABM1”和“CD19 ABM”(等)是指特异性结合至CD19的ABM，所述术语“ABM2”和“TCR ABM”(等)是指特异性结合至TCR复合物组分的ABM，所述术语“ABM3”是指特异性结合至CD2或TAA(取决于上下文)的ABM，所述术语“CD2 ABM”(等)是指特异性结合至CD2的ABM，并且所述术语“TAA ABM”(等)是指特异性结合至TAA的ABM。所述术语ABM1、ABM2、和ABM3仅仅为了方便起见使用并不旨在传达MBM的任何特定构型。在一些实施例中，ABM2结合至CD3(本文中被称为“CD3 ABM”等)。因此，涉及ABM2和多个ABM2的披露也适用于CD3 ABM。
抗原结合片段：所述术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体保留了非共价地、可逆地并且特异性结合至抗原的能力的部分。
抗原结合分子：所述术语“抗原结合分子”是指包含一个或多个抗原结合结构域的分子，例如抗体。所述抗原结合分子可以包含一个或多个多肽链，例如，一个、两个、三个、四个或更多个多肽链。抗原结合分子中的这些多肽链可以与彼此直接或间接缔合(例如，第一多肽链可以与第二多肽链缔合，所述第二多肽链反过来可以与第三多肽链缔合以形成抗原结合分子，其中所述第一和第二多肽链直接与彼此缔合，所述第二和第三多肽链直接与彼此缔合，并且所述第一和第三多肽链通过所述第二多肽链间接与彼此缔合)。
缔合：在抗原结合分子的上下文中，所述术语“缔合”是指两个或更多个多肽链和/或单一多肽链的两个或更多个部分之间的功能性关系。特别地，所述术语“缔合”意指两个或更多个多肽(或单一多肽的部分)彼此缔合，例如，通过分子相互作用非共价缔合和/或通过一个或多个二硫桥或化学交联共价缔合，从而产生功能性抗原结合分子，例如，其中抗原结合结构域可以结合其各自靶标的BBM或TBM。MBM中可能存在的缔合的实例包括(但不限于)Fc结构域中的Fc区之间的缔合(如在7.4.1.5节中所述的同二聚体或异二聚体)、Fab或Fv中的VH区与VL区之间的缔合、以及Fab中的CH1与CL之间的缔合。
B细胞：如本文所用的，所述术语“B细胞”是指B细胞谱系的细胞，所述细胞是淋巴细胞亚型的白细胞中的一个类型。B细胞的实例包括浆母细胞、浆细胞、淋巴浆细胞样细胞、记忆B细胞、滤泡B细胞、边缘区B细胞、B-1细胞、B-2细胞、和调节B细胞。
B细胞恶性肿瘤：如本文所用的，B细胞恶性肿瘤是指B细胞的不受控增殖。B细胞恶性肿瘤的实例包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤。例如，B细胞恶性肿瘤可以是但不限于：多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、纵隔灰区淋巴瘤(MGZL)、脾边缘区B细胞淋巴瘤、MALT的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、和原发性渗出性淋巴瘤、和浆细胞样树突状细胞瘤。
结合序列：参考表1、12、13、14、16、或17(包括其子部分)，所述术语“结合序列”意指具有一整组该表中所列出的CDR、VH-VL对、或scFv的ABM。
双特异性结合分子：所述术语“双特异性结合分子”或“BBM”是指特异性结合至两个抗原并且包含两个或更多个ABM的分子。本披露的BBM包含至少一个对CD19具有特异性的抗原结合结构域和至少一个对不同的抗原(例如TCR复合物的组分)具有特异性的抗原结合结构域。代表性BBM示出在图1B-1AH中。BBM可以包含一个、两个、三个、四个或甚至更多个多肽链。
二价：如本文所用的，在抗原结合分子的上下文中，所述术语“二价”是指具有两个抗原结合结构域的抗原结合分子。所述结构域可以是相同的或不同的。因此，二价抗原结合分子可以是单特异性或双特异性的。二价BBM可以包含特异性结合至CD19的ABM和结合至另一抗原(例如，TCR复合物的组分)的另一种ABM。
癌症：所述术语“癌症”是指以异常细胞的不受控(并且常常是迅速的)生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了多种癌症的实例并且所述实例包括但不限于：白血病、多发性骨髓瘤、无症状性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如，任何前述任何类型的CD19阳性癌症。所述术语“癌性B细胞”是指正在经历或已经经历不受控增殖的B细胞。
CD3：所述术语“CD3”或“分化簇3”是指T细胞受体的分化簇3共受体。CD3有助于活化细胞毒性T细胞(例如，CD8+初始T细胞)和辅助性T细胞(例如，CD4+初始T细胞)并且由四条不同的链构成：一条CD3γ链(例如，Genbank登录号NM_000073和MP_000064(人))、一条CD3δ链(例如，Genbank登录号NM_000732、NM_001040651、NP_00732和NP_001035741(人))、和两条CD3ε链(例如，Genbank登录号NM_000733和NP_00724(人))。CD3的链是含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子与T细胞受体(TCR)和ζ链缔合以形成T细胞受体(TCR)复合物，所述复合物的作用是在T淋巴细胞中产生活化信号。除非明确地另有说明，否则在本申请中对CD3的引用可以是指CD3共受体、CD3共受体复合物、或CD3共受体复合物的任何多肽链。
CD19：：所述术语“CD19”或“分化簇19”是指分化簇19蛋白，它是在白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD19的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，并且编码人CD19的核苷酸序列可以登录号NM_001178098找到。CD19在大多数B谱系癌症上表达，这些B谱系癌症包括例如急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。具有表达CD19的其他细胞在下文“与CD19表达相关的疾病”的定义中提供。它也是B细胞祖细胞的早期标记物。参见例如，Nicholson等人,1997,Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165。
嵌合抗体：所述术语“嵌合抗体”(或其抗原结合片段)是抗体分子(或其抗原结合片段)，其中(a)所述恒定区或其部分被改变、置换或更换，使得所述抗原结合位点(可变区)与不同或改变的类型、效应子功能和/或种类的恒定区连接，或者与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因素、药物等)连接；或(b)所述可变区或其部分被改变、置换或更换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。例如，可以通过用来自人免疫球蛋白的恒定区替代其恒定区来修饰小鼠抗体。由于被人恒定区置换，所述嵌合抗体可以保留其识别抗原的特异性，同时与原始小鼠抗体相比在人体中具有降低的抗原性。
组合：如本文所用的，“组合”给予意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有障碍后并且在所述障碍被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。
互补性决定区：如本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸的序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三种CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)，并且每个轻链可变区中存在三种CDR(CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人,1991,“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,JMB 273:927-948(“乔西亚”编号方案)，和ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,1999,TheImmunologist[免疫学者]7:132-136；Lefranc等人,2003,Dev.Comp.Immunol.[发育免疫学与比较免疫学]27:55-77(“IMGT”编号方案)。例如，对于经典形式，根据Kabat，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(CDR-H1)、50-65(CDR-H2)和95-102(CDR-H3)；并且将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(CDR-L1)、50-56(CDR-L2)和89-97(CDR-L3)。根据Chothia，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(CDR-H1)、52-56(CDR-H2)和95-102(CDR-H3)；并且将VL中的氨基酸残基编号为26-32(CDR-L1)、50-52(CDR-L2)和91-96(CDR-L3)。通过结合卡巴特和乔西亚两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(CDR-H1)、50-65(CDR-H2)和95-102(CDR-H3)和人VL中的氨基酸残基24-34(CDR-L1)、50-56(CDR-L2)和89-97(CDR-L3)组成。根据IMGT，将VH中的CDR氨基酸残基编号为大约26-35(CDR-H1)、51-57(CDR-H2)和93-102(CDR-H3)，并将VL中的CDR氨基酸残基编号为大约27-32(CDR-L1)、50-52(CDR-L2)和89-97(CDR-L3)(根据“Kabat”编号)。根据IMGT，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
并行：所述术语“并行”不限于在完全相同的时间给予疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是意指将包含本披露的抗原结合分子的药物组合物以一种顺序并在一定时间间隔内向受试者给予，使得所述分子可以与一种或多种另外的疗法一起发挥作用，以提供增加的益处(与如果以其他方式给予它们时相比)。
保守序列修饰：所述术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变CD19结合分子或其组分(例如，CD19结合结构域或Fc区)的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入结合分子中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，结合分子中的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基来置换，并且可以测试所述改变的结合分子的例如与靶分子的结合和/或有效异源二聚化和/或效应子功能。
双体抗体：如本文所用的，所述术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其典型地由scFv链的配对形成。每个scFv包含连接至相同多肽链(VH-VL，其中VH位于VL的N-末端或C-末端)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。不同于典型的scFv(其中VH和VL通过接头分离，所述接头允许相同多肽链上的VH和VL配对并形成抗原结合结构域)，双体抗体典型地包含接头，但所述接头太短不足以允许相同链上的VH和VL结构域配对，从而迫使VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对并产生了两个抗原结合位点。双体抗体更全面地描绘于以下文献中：例如，EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:6444-6448。
dsFv：所述术语“dsFv”是指二硫键稳定型Fv片段。在dsFv中，VH和VL通过结构域间二硫键连接。为产生此类分子，将VH和VL的框架区中的各一个氨基酸突变为半胱氨酸，其反过来形成稳定的链间二硫键。典型地，VH中的位置44和VL中的位置100突变为半胱氨酸。参见Brinkmann,2010,Antibody Engineering[抗体工程化]181-189,DOI:10.1007/978-3-642-01147-4_14。所述术语dsFv涵盖所谓的dsFv(其中VH和VL通过链间二硫键而不是接头肽连接的分子)或scdsFv(其中VH和VL通过接头和链间二硫键连接的分子)。
效应子功能：所述术语“效应子功能”是指抗体分子的活性，其是由通过抗体的结构域而不是抗原结合结构域的结合介导的，通常由效应分子的结合介导的。效应子功能包括补体介导的效应子功能，其是由例如所述补体的C1组分与所述抗体的结合介导的。补体的活化在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体的活化还刺激炎症响应并且可参与自身免疫性超敏响应。效应子功能还包括Fc受体(FcR)介导的效应子功能，其可以由抗体的恒定结构域与Fc受体(FcR)的结合触发。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要的和多种的生物响应，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包覆的靶细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移以及免疫球蛋白产生的控制。抗体的效应子功能可以通过改变例如，增强或减少抗体对效应分子如Fc受体或补体组分的亲和力来改变。通常将通过修饰效应分子结合位点来改变结合亲和力，并且在此情况下，定位感兴趣的位点并以合适的方式修饰至少部分位点是适宜的。还设想，针对效应分子的抗体上的结合位点的改变不需要显著地改变整体结合亲和力，但可以改变相互作用的几何形状，导致效应子机制无效，如在非生产性结合中一样。进一步设想的是，效应子功能还可以通过修饰不直接参与效应分子结合但是以其他方式参与效应子功能的性能的位点来改变。
表位：表位或抗原决定簇是抗原的部分，所述抗原可被如本文所述的抗体或其他的抗原结合部分识别。表位可以是线性的或构象型的。
Fab：如本文所用的，“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL、和CL免疫球蛋白结构域的多肽区。这些术语可以指单独的这一区域，或指在本披露的抗原结合分子的背景中的这一区域。
通过附接至VH结构域的CH1结构域与附接至VL结构域的CL结构域的缔合，形成了Fab结构域。所述VH结构域与所述VL结构域配对以构成Fv区，并且所述CH1结构域与所述CL结构域配对以进一步稳定结合模块。两个恒定结构域之间的二硫键可以进一步稳定Fab结构域。
Fab区可以通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割(例如，使用酶例如木瓜蛋白酶)或通过重组表达来产生。在天然免疫球蛋白分子中，通过两条不同的多肽链的缔合(例如，一条链上的VH-CH1与另一条链上的VL-CL缔合)，形成了Fab。所述Fab区典型地重组表达，典型地在两条多肽链上，尽管单链Fab在本文中也考虑在内。
Fc结构域：所述术语“Fc结构域”是指一对缔合的Fc区。这两个Fc区二聚化以产生Fc结构域。Fc结构域中的两个Fc区可以是相同的(这样的Fc结构域在本文中被称为“Fc同型二聚体”)或彼此不同的(这样的Fc结构域在本文中被称为“Fc异二聚体”)。
Fc区：如本文所用的，所述术语“Fc区”或“Fc链”意指包含IgG分子的CH2-CH3结构域的多肽，并且在一些情况下，包括铰链。在人IgG1的EU编号中，所述CH2-CH3结构域包含氨基酸231至氨基酸447，并且所述铰链是氨基酸216至氨基酸230。因此，“Fc区”的定义包括氨基酸231-447(CH2-CH3)或216-447(铰链-CH2-CH3)、或其片段。在此上下文中的“Fc片段”可以含有来自N-末端和C-末端中的一者或两者的更少的氨基酸，但仍然保留了与另一Fc区形成二聚体的能力，所述能力是如使用标准方法(通常基于尺寸)可以检测的(例如，非变性色谱法、尺寸排阻色谱法)。人IgG Fc区在本披露中具有特定的用途，并且可以是来自人IgG1、IgG2或IgG4的Fc区。
Fv：所述术语“Fv”是指可从免疫球蛋白衍生的最小抗体片段，其含有完整的靶识别和结合位点。该区域由以紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的靶结合位点。通常，六种CDR赋予靶标对抗体的结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单一可变结构域(或仅包含对靶标具有特异性的三种CDR的Fv的一半)也可以具有识别并结合靶标的能力。在本文中对VH-VL二聚体的引用并不旨在传达任何特定构型。通过举例但不限制的方式，所述VH和VL可以以本文所述的任何构型结合在一起形成半抗体，或者可以各自存在于单独的半抗体上，并且当单独的半抗体缔合时结合在一起形成抗原结合结构域，例如形成本披露的TBM。当存在于单一多肽链(例如，scFv)上时，所述VH是所述VL的N-末端或C-末端。
半抗体：所述术语“半抗体”是指包含至少一个ABM或一条ABM链并且可以与包含ABM或ABM链的另一个分子通过例如二硫桥或分子相互作用(例如，Fc异二聚体之间的杵臼结构相互作用)缔合的分子。半抗体可以由一条多肽链或多于一条多肽链(例如，Fab的两条多肽链)组成。在实施例中，半抗体包含Fc区。
半抗体的实例是包含抗体(例如，IgG抗体)的重链和轻链的分子。半抗体的另一实例是包含第一多肽和第二多肽的分子，所述第一多肽包含VL结构域和CL结构域，所述第二多肽包含VH结构域、CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域、和CH3结构域，其中VL和VH结构域形成ABM。半抗体的又一实例是包含scFv结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽。
半抗体可能包括多于一个ABM，例如包含(以从N-末端至C-末端的顺序)scFv结构域、CH2结构域、CH3结构域、和另一scFv结构域的半抗体。
半抗体还可能包括ABM链，当与在另一个半抗体中的另一条ABM链缔合时，所述ABM链形成了完整的ABM。
因此，MBM可以包含一个，更典型地两个，或甚至多于两个半抗体，并且半抗体可以包含一个或多个ABM或一条或多条ABM链。
在一些MBM中，第一半抗体将与第二半抗体缔合，例如，异源二聚体化。在其他的MBM中，第一半抗体将共价连接至第二半抗体，例如通过二硫桥或化学交联。在又其他的MBM中，第一半抗体将与第二半抗体通过共价附接和非共价相互作用，例如二硫桥和杵臼结构相互作用缔合。
所述术语“半抗体”仅旨在用于描述性目的并且不表示特定构型或生产方法。半抗体作为“第一”半抗体、“第二”半抗体、“左”半抗体、“右”半抗体等的描述仅仅是为了方便起见和描述性目的。
六价：在抗原结合分子(例如，TBM)的上下文中，如本文所用的术语“六价”是指具有六个抗原结合结构域的抗原结合分子。尽管不同的构型(例如，结合至CD19的三个抗原结合结构域、结合至TCR复合物组分的两个抗原结合结构域、以及结合至CD2或TAA的一个抗原结合结构域，或结合至CD19的三个抗原结合结构域、结合至CD2或TAA的两个抗原结合结构域、以及结合至TCR复合物组分的一个抗原结合结构域)在本披露的范围内，但本披露的六价TBM通常具有三对各自结合至相同抗原的抗原结合结构域。六价TBM的实例示意性地示出于图1U-1V中。
臼：在杵臼结构的上下文中，“臼”是指至少一条氨基酸侧链，其凹进第一Fc链的界面并且因此可定位在第二Fc链的相邻交界表面上的互补性“杵”中，从而稳定Fc异二聚体，并且从而例如相比于Fc同型二聚体，更有利于Fc异二聚体形成。
宿主细胞或重组宿主细胞：所述术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”是指例如，通过引入异源核酸，进行基因工程化的细胞。应当理解，这种术语不仅意指特定的受试者细胞，而且意指这种细胞的子代。因为某些修饰可以在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”范围内。宿主细胞例如在染色体外异源表达载体上可以瞬时地携带异源核酸，或例如通过将异源核酸整合进宿主细胞基因组稳定地携带异源核酸。为了表达抗原结合分子的目的，宿主细胞可以是哺乳动物来源的细胞系或具有哺乳动物样特征的细胞系，例如猴肾细胞(COS，例如，COS-1、COS-7)、HEK293、幼仑鼠肾(BHK，例如，BHK21)、中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO、PerC6、BSC-1、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、SP2/0、HeLa、马-达氏牛肾(MDBK)、骨髓瘤和淋巴瘤细胞、或其衍生物和/或工程化的变体。工程化的变体包括，例如，聚糖谱(glycanprofile)修饰的和/或位点特异性整合位点衍生物。
人抗体：如本文所用的，所述术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区两者均衍生自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自此类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人,2000,J Mol Biol[分子生物学杂志]296,57-86所述。免疫球蛋白可变结构域(例如，CDR)的结构和位置可以使用熟知的编号方案(例如，卡巴特编号方案、乔西亚编号方案、或卡巴特和乔西亚的组合)来定义(参见例如，Lazikani等人,1997,J.Mol.Bio.[分子生物学杂志]273:927 948；Kabat等人,1991,Sequences ofProteins of Immunological Interest[免疫学相关蛋白序列],第5版,NIH公开号91-3242美国卫生与人力资源服务部；Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)。
人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变、或通过在体内体细胞突变、或保守取代来引入突变以促进稳定性或生产)。然而，如本文所用的，术语“人抗体”不旨在包括衍生自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
人源化：术语非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人类物种(如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的具有所希望特异性、亲和力和容量的高变区(供体抗体)的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应非人类残基置换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有如下项：至少一个，典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的那些高变环，且所有或基本上所有FR是人类免疫球蛋白lo序列的那些FR。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,1986,Nature[自然]321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature[自然]332:323-329；和Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学的研究现状]2:593-596。另参见以下评论文章和其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton,1998,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.[过敏、哮喘和免疫学年鉴]1:105-115；Harris,1995,Biochem.Soc.Transactions[生化学会会刊]23:1035-1038；Hurle和Gross,1994,Curr.Op.Biotech.[当前生物技术观点]5:428-433。
杵：在杵臼结构的上下文中，“杵”是指至少一条氨基酸侧链，其从第一Fc链的表面突出并且因此可定位于第二Fc链的界面上的互补性“臼”中，从而稳定所述Fc异二聚体，并且从而例如相比于Fc同型二聚体，更有利于Fc异二聚体形成。
杵臼(Knobs and holes)(或杵臼结构(knobs-into-holes))：Fc异源二聚化的一个机制在本领域中通常称为“杵臼(knobs and holes)”、或“杵臼结构(knob-in-holes)”、或“杵臼结构(knobs-into-holes)”。这些术语是指产生空间影响以有利于Fc异二聚体(相比于Fc同型二聚体)形成的氨基酸突变，如以下所描述，例如Ridgway等人,1996,ProteinEngineering[蛋白质工程]9(7):617；Atwell等人,1997,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]270:26；和美国专利号8,216,805。杵臼结构突变可以与其他策略组合以改善异源二聚化，例如，如在7.4.1.6节中所述。
单克隆抗体：如本文所用的，所述术语“单克隆抗体”是指衍生自相同遗传来源的多肽，包括抗体、抗体片段、分子(包括MBM)等。
单价：如本文所用的，在抗原结合分子的上下文中，所述术语“单价”是指具有单一抗原结合结构域的抗原结合分子。
多特异性结合分子：所述术语“多特异性结合分子”或“MBM”是指特异性结合至至少两个抗原并包含两个或更多个抗原结合结构域的分子。所述抗原结合结构域可以各自独立地是抗体片段(例如，scFv、Fab、纳米抗体)、配体、或非抗体衍生的结合物(例如，纤连蛋白、Fynomer、DARPin)。
突变或修饰：在多肽的伯氨基酸序列的上下文中，所述术语“修饰”和“突变”是指相对于参考多肽多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失。另外，所述术语“修饰”进一步涵盖对氨基酸残基的改变，例如通过化学缀合(例如，药物或聚乙二醇部分的化学缀合)或翻译后修饰(例如，糖基化)。
核酸：所述术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、和肽-核酸(PNA)。
除非另外说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体地，如下文详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而实现，在这些序列中，一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,1991,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081；Ohtsuka等人,1985,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608；和Rossolini等人,1994,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98)。
可操作地连接：所述术语“可操作地连接”是指两个或更多个肽或多肽结构域或核酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。在融合蛋白或其他多肽的上下文中，所述术语“可操作地连接”意指连接两个或更多个氨基酸区段从而产生功能多肽。例如，在抗原结合分子的上下文中，单独的ABM(或ABM的链)可以通过肽接头序列可以操作地连接。在编码融合蛋白的核酸，例如抗原结合分子的多肽链的上下文中，“可操作地连接”意指连接两个核酸使得由所述两个核酸编码的氨基酸序列保持在框内。在转录调节的上下文中，所述术语是指转录调节序列与转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则所述启动子或增强子序列可操作地连接至编码序列。
五价：在抗原结合分子(例如，TBM)的上下文中，如本文所用的术语“五价”是指具有五个抗原结合结构域的抗原结合分子。本披露的五价TBM通常具有(a)各自结合至相同抗原的两对抗原结合结构域，和结合至第三抗原的单个抗原结合结构域，或者(b)结合至相同抗原的三个抗原结合结构域，和各自结合至单独抗原的两个抗原结合结构域。五价TBM的实例示意性地示出于图1T中。
多肽和蛋白质：术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语涵盖氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。另外，所述术语涵盖例如通过一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、循环排列、环化、连接至其他分子的接头、融合至蛋白质或蛋白质结构域、和添加肽标签或肽标记来衍生化的氨基酸聚合物。
识别：如本文所用的，所述术语“识别”是指发现并与其表位相互作用(例如，结合)的ABM。
序列同一性：两个相似的序列(例如，抗体可变结构域)的序列同一性可以通过算法，例如以下的算法测量：Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)"Comparison OfBiosequences[生物序列比对],"Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482[局部同源性算法(local homology algorithm)]；Needleman,S.B.和Wunsch,CD.(1970)"A General MethodApplicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of TwoProteins[适用于寻找两种蛋白质氨基酸序列相似性的通用方法],"J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443[同源比对算法(homology alignment algorithm)],Pearson,W.R.和Lipman,D.J.(1988)"Improved Tools For Biological Sequence Comparison[改进的生物序列比对工具],"Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[国家科学院院刊](美国)85:2444[寻找相似性方法(search for similarity method)]；或Altschul,S.F.等人,1990,"BasicLocal Alignment Search Tool[基本局部比对搜索工具],"J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10,“BLAST”算法(the“BLAST”algorithm)，参见blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。当使用任一前述算法时，使用了默认参数(针对窗口长度、空位罚分等)。在一个实施例中，使用BLAST算法，使用默认参数，计算序列同一性。
任选地，在长度为至少约50个核苷酸(或在肽或多肽的情况下，至少约10个氨基酸)的区域上测定同一性，或者在一些情况下，在长度为100至500个或1000个或更多个核苷酸(或者20、50、200或更多个氨基酸)的区域上测定同一性。在一些实施例中，同一性是在确定的结构域(例如，抗体的VH或VL)上测定的。除非另有说明，两个序列之间的序列同一性在所述两个序列中更短一个的整个长度上测定。
单链Fab或scFab：所述术语“单链Fab”和“scFab”意指多肽，所述多肽包含抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头，使得所述VH和VL与彼此缔合并且所述CH1和CL与彼此缔合。在一些实施例中，抗体结构域和接头在N-末端至C-末端的方向上具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。所述接头可以是具有至少30个氨基酸，例如32个与50个之间的氨基酸的多肽。所述单链Fab通过CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定化。
单链Fv或scFv：如本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。所述Fv多肽可以进一步在VH与VL结构域之间包含多肽接头，所述多肽接头使scFv能够形成抗原结合所希望的结构。关于scFv的综述，参见Plückthun，于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编,1994,Springer-Verlag[施普林格],纽约,第269页-第315页。
特异性(或选择性)结合：所述术语“特异性(或选择性)结合”至抗原或表位是指一种结合反应，其决定了在蛋白质与其他生物制品的异质群体中同源抗原或表位的存在。所述结合反应可以但不需要由抗体或抗体片段介导，但也可以由例如7.3节中所述的任何类型的ABM(如配体、DARPin等)介导。ABM典型地还具有小于5x10-2M、小于10-2M、小于5x10-3M、小于10-3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、或小于10-9M的离解速率常数(KD)(koff/kon)，并且以比其结合至非特异性抗原(例如，HSA)的亲和力大至少两倍的亲和力结合至靶抗原。结合亲和力可以使用Biacore、SPR或BLI测定来测量。所述术语“特异性结合”不排除跨物种反应性。例如，“特异性结合”至来自一个物种的抗原的抗原结合模块(例如，抗体的抗原结合片段)还可以“特异性结合”至一个或多个其他的物种中的所述抗原。因此，此类跨物种反应性本身不改变抗原结合模块作为“特异性”结合物的分类。在某些实施例中，特异性结合至人抗原的抗原结合模块与一个或多个非人哺乳动物物种，例如，灵长类动物物种(包括但不限于食蟹猴(Macaca fascicularis)、普通猕猴(Macaca mulatta)、和豚尾猴(Macaca nemestrina)中的一个或多个)或啮齿动物物种(例如，小鼠(Mus musculus))具有跨物种反应性。在其他实施例中，所述抗原结合模块不具有跨物种反应性。
受试者：所述术语“受试者”包括人和非人动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。
VH结构域的串联：如本文所用的，所述术语“VH结构域(或VH)的串联”是指一串VH结构域，其由抗体的许多相同的VH结构域组成。VH结构域中的每一个(除了串联的末端的最后一个)的C-末端均连接至(使用或不使用接头)另一个VH结构域的N-末端。串联具有至少2个VH结构域，并且在具体的实施例中，抗原结合分子具有3、4、5、6、7、8、9、或10个VH结构域。VH的串联可以通过使用重组方法(使用或不使用接头)以所希望的顺序连接每个VH结构域的编码核酸(这确保了所述核酸被制备为单一多肽链)来产生(例如，如7.4.3节所述)。所述串联中的第一VH结构域的N-末端被定义为所述串联的N-末端，而所述串联中的最后的VH结构域的C-末端被定义为所述串联的C-末端。
VL结构域的串联：如本文所用的，所述术语“VL结构域(或VL)的串联”是指一串VL结构域，其由抗体的许多相同的VL结构域组成。VL结构域中的每一个(除了串联的末端的最后一个)的C-末端连接至(使用或不使用接头)另一个VL的N-末端。串联具有至少2个VL结构域，并且在具体的实施例中，抗原结合分子具有3、4、5、6、7、8、9、或10个VL结构域。VL的串联可以通过使用重组方法(使用或不使用接头)以所希望的顺序连接每个VL结构域的编码核酸(这确保了所述核酸被制备为单一多肽链)来产生(例如，如7.4.3节所述)。所述串联中的第一VL结构域的N-末端被定义为所述串联的N-末端，而所述串联中的最后的VL结构域的C-末端被定义为所述串联的C-末端。
靶抗原：如本文所用的，“靶抗原”意指非共价地、可逆地并且特异性地被抗原结合结构域结合的分子。
四价：在抗原结合分子(例如，BBM或TBM)的上下文中，如本文所用的术语“四价”是指具有四个抗原结合结构域的抗原结合分子。本披露的四价TBM通常具有结合至相同抗原(例如CD19)的两个抗原结合结构域和各自结合至单独抗原(例如TCR复合物的组分和CD2或TAA)的两个抗原结合结构域。四价BBM的实例示意性地示出于图1AA-1AH中，并且四价TBM的实例示意性地示出于图2Q-2S中。
治疗有效量：“治疗有效量”是指在所需的剂量和持续时间下有效实现所希望治疗结果的量。
治疗(Treat、Treatment和Treating)：如本文所用的，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指由给予一种或多种本披露的CD19结合分子导致的疾病或障碍(例如增殖性障碍)的进展、严重性和/或持续时间的减少或缓解，或者障碍的一种或多种症状(例如，一种或多种可辨别的症状)的缓解。在一些实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制障碍的进展。在一些实施例中，所述术语“治疗(treat、treatment和treating)”可以是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
三特异性结合分子：所述术语“三特异性结合分子”或“TBM”是指特异性结合至三个抗原并包含三个或更多个抗原结合结构域的分子。本披露的TBM包含至少一个对CD19具有特异性的抗原结合结构域、至少一个对TCR复合物的组分具有特异性的抗原结合结构域、以及至少一个对CD2或TAA具有特异性的抗原结合结构域。所述抗原结合结构域可以各自独立地是抗体片段(例如，scFv、Fab、纳米抗体)、配体、或非抗体衍生的结合物(例如，纤连蛋白、Fynomer、DARPin)。代表性TBM示出在图1中。TBM可以包含一个、两个、三个、四个或甚至更多个多肽链。例如，图1M中所示的TBM包含单一多肽链，所述单一多肽链包含通过ABM接头连接的三个scFv和一个单一多肽链。图1K中所示的TBM包含两条多肽链，所述多肽链包含三个通过Fc结构域等连接的scFv。图1J中所示的TBM包含三条多肽链，形成scFv、配体和通过Fc结构域等连接的Fab。图1C中所示的TBM包含四条多肽链，形成通过Fc结构域等连接的三个Fab。图1U中所示的TBM包含6条多肽链，形成通过Fc结构域等连接的四个Fab和两个scFv。
三价：在抗原结合分子(例如，MBM)的上下文中，如本文所用的术语“三价”是指具有三个抗原结合结构域的抗原结合分子。本披露的MBM典型地是双特异性或三特异性的。双特异性BBM特异性结合至CD19和TCR复合物的组分。三特异性TBM特异性结合至CD19、TCR复合物的组分、以及CD2或TAA。因此，三价BBM具有三个抗原结合结构域，其中两个结合至CD19并且其中一个结合至TCR的组分，或者反之亦然。TBM具有三个各自结合至不同抗原的抗原结合结构域。三价BBM的实例示意性地示出于图1G-1Z中，并且三价TBM的实例示意性地示出于图2B-2V中。
肿瘤：所述术语“肿瘤”可与本文中的术语“癌症”互换使用，例如，两个术语均涵盖实体和液体瘤，例如弥漫型或循环肿瘤。如本文所用的，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
肿瘤相关抗原：所述术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物、脂质或它们的一些组合)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，TAA是由正常细胞和癌细胞两者表达的标记物，例如谱系标记物，例如B细胞上的CD19。在一些实施例中，TAA是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中，TAA是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，TAA将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。因此，所述术语“TAA”涵盖对癌细胞特异的抗原，有时称为肿瘤特异性抗原(“TSA”)。尽管CD19具有肿瘤相关抗原的特征，但术语“肿瘤相关抗原”和“TAA”在整个披露中用于指除了CD19之外的分子。
可变区：如本文所用的“可变区”或“可变结构域”意指免疫球蛋白的区，其包含基本上由Vκ、Vλ、和/或VH基因(这些基因分别组成了κ、λ、和重链免疫球蛋白遗传基因座)中的任一种编码的一个或多个Ig结构域并且含有赋予抗原特异性的CDR。“可以变重结构域”可以与“可以变轻结构域”配对以形成抗原结合结构域(“ABD”)或抗原结合模块(“ABM”)。另外，每个可变结构域包含三个高变区(“互补决定区”、“CDR”)(对于可变重结构域为CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3并且对于可变轻结构域为CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)和四个框架(FR)区，其从氨基末端至羧基末端以如下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
载体：所述术语“载体”旨在是指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本披露旨在包括这种其他形式的表达载体如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相同的功能。
VH：所述术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的重链)的可变区。
VL：所述术语“VL”是指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。
VH-VL或VH-VL对：在参考VH-VL对时，无论位于相同的多肽链或不同的多肽链上，所述术语“VH-VL”和“VH-VL对”是为了方便起见使用，并且不旨在传达任何特定的方向，除非上下文中做了另外的说明。因此，包含“VH-VL”或“VH-VL对”的scFv可以具有处于任何方向的VH和VL结构域，例如，VH位于VL的N-末端或VL位于VH的N-末端。
7.2.CD19结合分子
在一个方面，本披露提供了CD19结合分子，其包括结合至人CD19的单特异性和多特异性分子。在一些实施例中，所述CD19结合分子是单特异性结合分子。例如，单特异性结合分子可以是抗体或其抗原结合片段(例如，抗体片段、scFv、dsFv、Fv、Fab、scFab、(Fab’)2、或单一结构域抗体(SDAB))。在其他实施例中，所述CD19结合分子是多特异性(例如，双特异性)CD19结合分子(例如，双特异性抗体)。
在一些实施例中，所述CD19结合分子是嵌合或人源化单克隆抗体。可以工程化嵌合和/或人源化抗体以使人患者对非人类受试者中产生的抗体或衍生自非人类抗体基因表达的抗体的免疫响应最小化。嵌合抗体包含非人类动物抗体可变区和人抗体恒定区。此类抗体保留了原始单克隆抗体的表位结合特异性，但当向人给予时可以具有较低的免疫原性，并且因此更可能被患者耐受。例如，小鼠抗体(例如小鼠单克隆抗体)的一条或多条轻链的可变区中的一个或全部(例如，一个、两个或三个)和/或一条或多条重链的可变区中的一个或全部(例如，一个、两个或三个)各自都可以连接到人恒定区，例如但不限于IgG1人恒定区。嵌合单克隆抗体可以通过已知的重组DNA技术产生。例如，编码非人类抗体分子的恒定区的基因可以用编码人恒定区的基因取代(参见Robinson等人,PCT专利公开PCT/US 86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；或Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496)。另外，可以用于产生嵌合抗体的其他合适技术描述于例如美国专利号4,816,567、4,978,775；4,975,369；和4,816,397。
本披露的嵌合或人源化抗体及其抗原结合片段可以基于鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠杂交瘤中获得，并使用标准分子生物学技术工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用已知的方法将鼠可变区与人恒定区连接(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为产生人源化抗体，可以使用已知的方法将鼠CDR区域插入人框架中。参见例如，美国专利号5,225,539(属于Winter)和美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6180370(属于Queen等人)。
可以使用多种已知的技术产生人源化抗体，所述技术包括但不限于CDR移植(参见例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101、和5,585,089)，饰面或表面重修(参见例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814；以及Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973)、链改组(参见例如，美国专利号5,565,332)、和披露于例如以下中的技术：美国专利申请公开号US 2005/0042664，美国专利申请公开号US 2005/0048617，美国专利号6,407,213，美国专利号5,766,886，国际公开号WO 9317105，Tan等人,J.Immunol.[免疫学杂志],169:1119-25(2002)，Caldas等人,Protein Eng.[蛋白质工程],13(5):353-60(2000)，Morea等人,Methods[方法],20(3):267-79(2000)，Baca等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],272(16):10678-84(1997)，Roguska等人,Protein Eng.[蛋白质工程],9(10):895-904(1996)，Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(23增刊):5973s-5977s(1995)，Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(8):1717-22(1995)，Sandhu J S,Gene[基因],150(2):409-10(1994)，以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],235(3):959-73(1994)。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变例如改善抗原结合。这些框架取代(例如，保守性取代)是通过已知的方法鉴定的，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合和序列比较而言重要的框架残基，从而鉴定特定位置处的异常框架残基。(参见例如，Queen等人,美国专利号5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature[自然],332:323)。
如本文提供的，人源化抗体或抗体片段可以包含来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和框架区，其中构成框架的氨基酸残基完全或大部分衍生自人种系。用于将抗体或抗体片段人源化的多种技术是熟知的，并且基本上可以按照Winter和同事的方法进行(Jones等人,Nature[自然],321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然],332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学],239:1534-1536(1988))，所述方法是通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即CDR移植(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；和美国专利号4,816,567、6,331,415、5,225,539、5,530,101、5,585,089、6,548,640)。在此类人源化抗体和抗体片段中，实质上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中的类似部位的残基取代。抗体和抗体片段的人源化也可以通过饰面或重修来实现(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814(1994)；和Roguska等人,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)的选择是降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901(1987))。另一种方法采用衍生自具有特定亚组轻链或重链的全部人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(参见例如Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2623(1993)。在一些实施例中，重链可变区的框架区(例如全部四个框架区)衍生自VH4_4-59种系序列。在一个实施例中，所述框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，取代，例如保守性取代，例如来自相应鼠序列处的氨基酸的取代。在一个实施例中，轻链可变区的框架区(例如全部四个框架区)衍生自VK3_1.25种系序列。在一个实施例中，所述框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，取代，例如保守性取代，例如来自相应鼠序列处的氨基酸的取代。
在某些实施例中，所述CD19结合分子包含来自特定的种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定的种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包含人抗体或由其组成，所述人抗体包含作为特定种系序列“的产物”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择在序列中与人抗体序列最接近(即，最大的同一性％)的人种系免疫球蛋白序列，可以照此来鉴定人抗体是人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列(使用本文所概述的方法)。作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变而含有与种系序列相比的氨基酸差异。然而，人源化抗体通常与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90％同一并且含有如下氨基酸残基，当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)比较时，所述氨基酸残基将所述抗体鉴定为衍生自人序列。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％或甚至至少96％、97％、98％或99％同一的。典型地，衍生自特定人种系序列的人源化抗体将展示出与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有不大于10-20个氨基酸的差异(在引入本文的任何偏移(skew)、pI和消融(ablation)变体之前；即，在引入本披露的变体之前，变体的数量通常是低的)。在某些情况下，人源化抗体可以展示出与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有不大于5个，或甚至不大于4、3、2、或1个氨基酸的差异(同样，在引入本文的任何偏移、pI和消融变体之前；即，在引入本披露的变体之前，变体的数量通常是低的)。
在一个实施例中，所述亲本抗体已亲和力成熟。可以使用基于结构的方法用于人源化和亲和力成熟，例如，如在USSN 11/004,590中所述。可以使用基于选择的方法来使抗体可变区人源化和/或亲和力成熟，包括但不限于以下中描述的方法：Wu等人,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]294:151-162；Baca等人,1997,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271(37):22611-22618；Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95:8910-8915；Krauss等人,2003,Protein Engineering[蛋白质工程]16(10):753-759。其他的人源化方法可以涉及仅部分CDR的移植，包括但不限于以下中描述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人,2002,J.Immunol.[免疫学杂志]169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.[免疫学杂志]169:3076-3084。
在一些实施例中，所述CD19结合分子包含ABM(其为Fab)。Fab结构域可以通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割，使用酶例如木瓜蛋白酶，或通过重组表达来产生。Fab结构域典型地包含附接至VH结构域的CH1结构域，所述CH1结构域与附接至VL结构域的CL结构域配对。在野生型免疫球蛋白中，所述VH结构域与所述VL结构域配对以构成Fv区，并且所述CH1结构域与所述CL结构域配对以进一步稳定结合模块。两个恒定结构域之间的二硫键可以进一步稳定Fab结构域。
在一些实施例中，所述CD19结合分子包含ABM(其为scFab)。在实施例中，scFab片段中的抗体结构域和接头在N-末端至C-末端的方向上具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，或b)VL-CL-接头-VH-CH1。在一些情况下，使用了VL-CL-接头-VH-CH1。
在另一个实施例中，scFab片段中的抗体结构域和接头在N-末端至C-末端的方向上具有以下顺序之一：a)VH-CL-接头-VL-CH1或b)VL-CH1-接头-VH-CL。
任选地，在scFab片段中，除了CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键之外，抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)也通过在以下位置之间引入二硫键而被二硫键稳定：i)重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100，ii)重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43，或iii)重链可变结构域位置101与轻链可变结构域位置100(根据卡巴特的EU指数编号)。
scFab片段的此类进一步的二硫键稳定化通过在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间引入二硫键来实现。引入非天然二硫桥以稳定单链Fv的技术描述于以下文献中：例如，WO 94/029350,Rajagopal等人,1997,Prot.Engin.[蛋白质工程]10:1453-59；Kobayashi等人,1998,Nuclear Medicine&Biology[核医学和生物学],25:387-393；和Schmidt,等人,1999,Oncogene[致癌基因]18:1711-1721。在一个实施例中，scFab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施例中，scFab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(根据卡巴特的EU索引进行编号)。
在一些实施例中，所述CD19结合分子包含ABM(其为scFv)。单链Fv抗体片段包含单一多肽链中的抗体的VH和VL结构域，能够作为单链多肽进行表达，并且保留了衍生其的完整抗体的特异性。通常，所述scFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，所述接头能够使scFv形成所希望的结构用于靶结合。适合用于连接scFV的VH和VL链的接头的实例是在7.4.3节中鉴定的ABM接头，例如指定为L1至L58的任何接头。
除非另有说明，否则如本文所用的，scFv可以例如相对于多肽的N-末端和C-末端以任一顺序具有VL和VH可变区，即所述scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。
为产生scFv编码核酸，所述VH和VL编码DNA片段可以操作地连接至编码接头的另一片段，例如编码7.4.3节中所述的任何接头(如氨基酸序列(Gly4～Ser)3(SEQ ID NO:53))，使得所述VH和VL序列可以作为连续单链蛋白质(其VL和VH区通过柔性接头连接)进行表达(参见例如，Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；McCafferty等人,1990,Nature[自然]348:552-554)。
CD19结合分子还可以包含ABM(其是Fv、dsFv、(Fab’)2、单一结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、或骆驼科动物VHH结构域(还称为纳米抗体))。
CD19结合分子可以包含由单一VH或VL结构域构成的单一结构域抗体，所述单一VH或VL结构域表现出对CD19的充分亲和力。在实施例中，所述单一结构域抗体是骆驼科动物VHH结构域(参见例如，Riechmann,1999,Journal of Immunological Methods[免疫学方法杂志]231:25-38；WO 94/04678)。
表1A和1B(统称为“表1”)列出了可以包括在CD19结合分子中的示例性CD19结合序列的序列。表1A中列出的序列基于CD19抗体NEG258。
Figure BDA0003360067460000411
Figure BDA0003360067460000421
在一些实施例中，CD19结合分子包含如在表1A中所列出的NEG258的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列可以如由卡巴特(分别为SEQ ID NO:17-19和4-6)、乔西亚(分别为SEQ ID NO:20-22和7-9)或IMGT(分别为SEQ ID NO:23-25和10-12)、或组合的乔西亚和卡巴特CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列(分别为SEQ ID NO:14-16和1-3)定义。所述CD19结合分子还可以包含如在表1A中所列出的抗CD19抗体NEG258的轻链可以变序列(SEQID NO:26)和/或重链可以变序列(SEQ ID NO:13)。
表1B中列出的序列基于CD19抗体NEG218。
Figure BDA0003360067460000431
在一些实施例中，CD19结合分子包含如在表1B中所列出的NEG218的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列。所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列可以如由卡巴特(分别为SEQ ID NO:43-45和30-32)、乔西亚(分别为SEQ IDNO:46-48和33-35)或IMGT(分别为SEQ ID NO:49-51和36-38)、或组合的乔西亚和卡巴特CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列(分别为SEQ ID NO:40-42和27-29)定义。所述CD19结合分子还可以包含如在表1B中所列出的抗CD19抗体NEG218的轻链可以变序列(SEQ ID NO:52)和/或重链可以变序列(SEQ ID NO:39)。
其他CD19结合分子包括已突变的氨基酸，但其CDR区与表1中所述的CDR序列仍然具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些实施例中，此类CD19结合分子包括突变型氨基酸序列，其中当与表1中所述的CDR序列相比时，CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已突变。
其他的CD19结合分子包括VH和/或VL结构域，所述结构域包含与表1中所述的VH和/或VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19结合分子包括VH和/或VL结构域，其中当与表1中所述的序列中所描述的VH和/或VL结构域相比时，不超过1、2、3、4或5个氨基酸已突变，同时保留了基本上相同的治疗活性。
所述CD19结合分子可以融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合两者)至异源蛋白质或多肽(或其片段，例如至至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)上。例如，CD19结合分子可以直接或间接融合至可以检测的蛋白质，例如，酶或荧光蛋白如在7.13节中所述的那些上。用于融合或缀合蛋白质、多肽、或肽至抗体或抗体片段上的方法是已知的并且可以用于融合或缀合蛋白质或多肽至本披露的CD19结合分子上。参见例如，美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、和5,112,946；欧洲专利号EP 307,434和EP 367,166；国际公开号WO96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:10535-10539；Zheng等人,1995,J.Immunol.[免疫学杂志]154:5590-5600；和Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:11337-11341。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术生成另外的CD19结合分子。DNA改组可以用来改变本披露的分子或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低解离速率的分子或其片段)。通常参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458；Patten等人,1997,Curr.OpinionBiotechnol.[当前生物技术观点]8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]16(2):76-82；Hansson等人,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques[生物技术]24(2):308-313。可以通过在重组之前借助易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变，改变本文所述的CD19结合分子或其片段。编码本文所述的CD19结合分子的片段的多核苷酸可以与一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、段、部分、结构域、片段等重组。
此外，CD19结合分子可以与标记物序列(如肽)融合以促进纯化。在一些实施例中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽(SEQ ID NO:54)，如pQE载体中提供的标记(凯杰公司(QIAGEN,Inc.)，伊顿大街(Eton Avenue)9259号，查茨沃思(Chatsworth)，加利福尼亚州，91311)等，其中许多是商购可得的。如Gentz等人,1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:821-824中所述，例如六组氨酸(SEQ ID NO:54)为融合蛋白的纯化提供了方便。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,1984Cell[细胞]37:767)的血凝素(“HA”)标签和“旗帜(flag)”标签。
7.3.多特异性结合分子的抗原结合模块
典型地，MBM的一个或多个ABD包含基于免疫球蛋白的抗原结合结构域，例如抗体片段或衍生物的序列。这些抗体片段和衍生物典型地包括抗体的CDR并且可以包括更大的片段和其衍生物，例如，Fab、scFab、Fv、和scFv。
基于免疫球蛋白的ABM可以包含对VH和/或VL内的框架残基的修饰，例如，以改善含有ABM的MBM的特性。例如，可以进行框架修饰以降低MBM的免疫原性。用于进行此类框架修饰的一种方法是将ABM的一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。可以通过将框架序列与衍生出所述ABM的种系序列进行比较来鉴定此类残基。为了使框架区序列“匹配”所希望的种系构型，可以通过例如定点诱变将残基“回复突变”成相应的种系序列。具有这种“回复突变的”ABM的MBM旨在为本披露所涵盖。
另一种类型的框架修饰包括使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，从而降低MBM的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，并在Carr等人的美国专利公开20030153043中进一步详细描述。
ABM也可以被修饰为具有改变的糖基化，这可以是有用的，例如增加MBM对其一种或多种抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变ABM序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这消除了一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除了所述位点的糖基化。这种无糖基化可以增加MBM对于抗原的亲和力。此种方法描述于例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
7.3.1.基于免疫球蛋白的ABM
7.3.1.1.Fab
在某些方面，ABM是Fab结构域。
对于本披露的MBM，有利的是使用Fab异源二聚化策略以允许属于相同的ABM的Fab结构域的正确缔合并且最小化属于不同ABM的Fab结构域的异常配对。例如，可以使用下表2中所示的Fab异源二聚化策略：
Figure BDA0003360067460000471
因此，在某些实施例中，通过彼此交换Fab的VL和VH结构域或彼此交换CH1和CL结构域，例如，WO 2009/080251中所述，来促进Fab的两个多肽之间的正确缔合。
还可以通过在CH1结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和在Fab的CL结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和/或在VH结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和在VL结构域中引入一个或多个氨基酸修饰，来促进正确的Fab配对。被修饰的氨基酸典型地是VH:VL和CH1:CL相互作用的一部分，使得Fab组分优先相互配对，而不是与其他Fab的组分配对。
在一个实施例中，所述一个或多个氨基酸修饰限于可变(VH、VL)和恒定(CH1、CL)结构域的保守框架残基，如通过残基的卡巴特编号所指示。Almagro,2008,Frontiers InBioscience[生物科学前沿]13:1619-1633提供了基于卡巴特、乔西亚和IMGT编号方案的框架残基的定义。
在一个实施例中，所述在VH和CH1和/或VL和CL结构域中引入的修饰是彼此互补的。可以基于空间和疏水性接触、静电/电荷相互作用或所述多种相互作用的组合来实现重链和轻链界面的互补性。蛋白质表面之间的互补性在文献中以如下术语：锁钥组合(lockand key fit)、杵臼结构、凸起和空腔、供体和受体等进行了广泛的描述，其全部暗示了两个接触表面之间的结构和化学匹配的本质。
在一个实施例中，所述一个或多个引入的修饰引入了跨越Fab组分的界面的新的氢键。在一个实施例中，所述一个或多个引入的修饰引入了跨越Fab组分的界面的新的盐桥。示例性取代描述于WO 2014/150973和WO 2014/082179中。
在一些实施例中，所述Fab结构域包含在CH1结构域中的192E取代和在CL结构域中的114A和137K取代，其中在CH1和CL结构域之间引入了盐桥(参见Golay等人,2016,JImmunol[免疫学杂志]196:3199-211)。
在一些实施例中，所述Fab结构域包含在CH1结构域中的143Q和188V取代和在CL结构域中的113T和176V取代，其作用是交换CH1和CL结构域之间的疏水性和极性接触区(参见Golay等人,2016,J Immunol[免疫学杂志]196:3199-211)。
在一些实施例中，所述Fab结构域在VH、CH1、VL、CL结构域的一些或全部中可以包含修饰以引入正交Fab界面，其促进Fab结构域的正确装配(Lewis等人,2014NatureBiotechnology[自然生物技术]32:191-198)。在实施例中，在VH结构域中引入39K、62E修饰，在CH1结构域中引入H172A、F174G修饰，在VL结构域中引入1R、38D、(36F)修饰，并且在CL结构域中引入L135Y、S176W修饰。在另一个实施例中，在VH结构域中引入39Y修饰并且在VL结构域中引入38R修饰。
Fab结构域也可以被修饰以用工程化二硫键置换天然CH1:CL二硫键，从而提高Fab组分配对的效率。例如，可以通过在CH1结构域中引入126C和在CL结构域中引入121C来引入工程化的二硫键(参见Mazor等人,2015,MAbs 7:377-89)。
还可以通过用促进正确装配的替代性结构域来置换CH1结构域和CL结构域来修饰Fab结构域。例如，Wu等人,2015,MAbs 7:364-76，描述了用αT细胞受体的恒定结构域置换CH1结构域并且用T细胞受体的β结构域取代CL结构域，并且通过在VL结构域中引入38D修饰并且在VH结构域中引入39K修饰，将这些结构域置换与VL和VH结构域之间的另外的电荷-电荷相互作用配对。
ABM可以包含单链Fab片段，其是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽。在一些实施例中，抗体结构域和接头在N-末端至C-末端的方向上具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。所述接头可以是具有至少30个氨基酸，例如，32个和50个之间的氨基酸的多肽。所述单链Fab结构域通过CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键稳定化。
在实施例中，单链Fab片段中的抗体结构域和接头在N-末端至C-末端的方向上具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，或b)VL-CL-接头-VH-CH1。在一些情况下，使用了VL-CL-接头-VH-CH1。
在另一个实施例中，单链Fab片段中的抗体结构域和接头在N-末端至C-末端的方向上具有以下顺序之一：a)VH-CL-接头-VL-CH1或b)VL-CH1-接头-VH-CL。
任选地，在单链Fab片段中，除了CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键之外，抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)ABM也通过在以下位置之间引入二硫键而被二硫键稳定：i)重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100，ii)重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43，或iii)重链可变结构域位置101与轻链可变结构域位置100(根据卡巴特的EU指数编号)。
在一个实施例中，单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100之间。在一个实施例中，单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43之间(根据卡巴特的EU索引进行编号)。
7.3.1.2.scFv
在某些方面，ABM是单链Fv或“scFv”。适合用于连接scFV的VH和VL链的接头的实例是在7.4.3节中鉴定的ABM接头，例如指定为L1至L54的任何接头。
为了产生编码scFv的核酸，编码VH和VL的DNA片段可操作地连接到编码接头(例如编码7.4.3节中所述的任何ABM接头)的另一个片段(如氨基酸序列(Gly4～Ser)3(SEQ IDNO:53)
7.3.1.3.其他基于免疫球蛋白的ABM
MBM还可以包含具有免疫球蛋白形式的ABM，所述免疫球蛋白形式除了Fab或scFv之外的例如Fv、dsFv、(Fab’)2、单一结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、或骆驼科动物VHH结构域(还称为纳米抗体)。
ABM可以是由单一VH或VL结构域构成的单一结构域抗体，所述单一VH或VL结构域表现出对靶标的充分的亲和力。在实施例中，所述单一结构域抗体是骆驼科动物VHH结构域(参见例如，Riechmann,1999,Journal of Immunological Methods[免疫学方法杂志]231:25-38；WO 94/04678)。
7.3.2.基于非免疫球蛋白的ABM
在某些实施例中，MBM包含一个或多个ABM，所述ABM衍生自非抗体支架蛋白质(包括但不限于：设计型锚蛋白重复序列蛋白(designed ankyrin repeat protein，DARPin)、Avimer(亲合力多聚体(avidity multimer)的简称)、抗运载蛋白(Anticalin)/脂质运载蛋白、Centyrin、库尼茨结构域(Kunitz domain)、Adnexin、Affilin、Affitin(也称为Nonfitin)、打结素(Knottin)、Pronectin、Versabody、Duocalin、和Fynomer)、配体、受体、细胞因子或趋化因子。
可以用于MBM的非免疫球蛋白支架包括在如下中列出的那些：Mintz和Crea,2013,Bioprocess International[生物工艺国际期刊]11(2):40-48的表3和4；Vazquez-Lombardi等人,2015,Drug Discovery Today[今日药物发现]20(10):1271-83的图1、表1和图I；Skrlec等人,2015,Trends in Biotechnology[生物技术趋势]33(7):408-18的表1和第2栏。Mintz和Crea,2013,Bioprocess International[生物工艺国际期刊]11(2):40-48的表3和4；Vazquez-Lombardi等人,2015,Drug Discovery Today[今日药物发现]20(10):1271-83的图1、表1和图I；Skrlec等人,2015,Trends in Biotechnology[生物技术趋势]33(7):408-18的表1和第2栏(统称为“支架披露”)。在具体的实施例中，披露内容涉及Adnexin的支架披露通过引用并入。在另一个实施例中，披露内容涉及Avimer的支架披露通过引用并入。在另一个实施例中，披露内容涉及Affibody的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及抗运载蛋白的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及DARPin的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及库尼茨结构域的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及打结素(Knottin)的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Pronectin的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Nanofitin的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Affilin的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及腺连蛋白(Adnectin)的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及ABM的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Adhiron的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Affimer的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Alphabody的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及犰狳重复蛋白(Armadillo Repeat Protein)的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Atrimer/四连接素(Tetranectin)的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Obody/OB-fold的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Centyrin的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Repebody的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及抗运载蛋白的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Atrimer的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及二环肽(bicyclic peptide)的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及cys-knot的支架披露通过引用并入。在又另一个实施例中，披露内容涉及Fn3支架(包括腺连蛋白、Centryrin、Pronectin、和Tn3)的支架披露通过引用并入。
在实施例中，ABM可以是设计型锚蛋白重复序列蛋白(“DARPin”)。DARPin是抗体模拟蛋白，其典型地表现出高特异性和高亲和力靶蛋白结合。它们一般经基因工程化并衍生自天然锚蛋白质并且由这些蛋白质中的至少三个、通常四个或五个重复基序组成。对于四重复或五重复DARPin，它们的分子质量分别是约14或18kDa(千道尔顿)。DARPin的实例可以见于例如美国专利号7,417,130中。包含DARPin结合模块和基于免疫球蛋白的结合模块的多特异性结合分子披露于，例如，美国公开号2015/0030596 A1中。
在另一个实施例中，ABM可以是Affibody。Affibody是熟知的并且是指衍生自葡萄球菌蛋白A的一个IgG结合结构域的基于58个氨基酸残基蛋白结构域的亲和蛋白。
在另一个实施例中，ABM可以是抗运载蛋白。抗运载蛋白是熟知的并且是指另一抗体模拟技术，其中所述结合特异性衍生自脂质运载蛋白。抗运载蛋白还可以格式化为双重靶向蛋白，称为Duocalin。
在另一个实施例中，ABM可以是Versabody。Versabody是熟知的并且是指另一抗体模拟技术。它们是具有>15％半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白质，其形成高二硫键密度支架，置换了典型蛋白质的疏水核。
其他的非免疫球蛋白ABM包括“A”结构域寡聚物(也称为Avimer)(参见例如，美国专利申请公开号2005/0164301、2005/0048512、和2004/017576)、基于Fn3的蛋白质支架(参见例如，美国专利申请公开2003/0170753)、VASP多肽、禽类胰腺多肽(Avian pancreaticpolypeptide，aPP)、四连接素(基于CTLD3)、Affililin(基于γB-晶体蛋白/泛素)、打结素、SH3结构域、PDZ结构域、淀粉酶抑肽(Tendamistat)、新制癌菌素(Neocarzinostatin)、蛋白质A结构域、脂质运载蛋白、转铁蛋白、或库尼茨结构域。在一个方面，用于构建MBM的ABM包含如在WO 2011/130324中所示的基于纤连蛋白的支架。
此外，在某些方面，ABM包含受体的配体结合结构域或配体的受体结合结构域。
7.4.连接子
预期的是，所述CD19结合分子可以在一些情况下包括直接互相连接的成对的ABM或ABM链(例如，Fab的VH-CH1或VL-CL组分)，例如，作为没有接头的融合蛋白。例如，所述CD19结合分子包含连接单个ABM或ABM链的连接子部分。连接子部分的使用可以改善靶结合，例如通过提高CD19结合分子中ABM的柔性并且因此减少空间位阻。通过例如，Fc结构域(各Fc结构域代表一对缔合的Fc区)和/或ABM接头，ABM或ABM链可以互相连接。Fc结构域的使用将典型地需要使用铰链区作为ABM或ABM链的连接子用于最佳的抗原结合。因此，所述术语“连接子”涵盖但不限于Fc区、Fc结构域、和铰链区。
可以选择或修饰连接子以，例如提高或降低CD19结合分子的生物半衰期。例如，为了降低生物半衰期，可以将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，使得包含所述片段的CD19结合分子相比于天然Fc-铰链结构域SpA结合，具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。在美国专利号6,165,745中，由Ward等人进一步详细描述了这一方法。可替代地，可以修饰CD19结合分子以提高其生物半衰期。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：如在美国专利号6,277,375中由Ward所述的T252L、T254S、T256F。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变CD19结合分子，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
Fc结构域(由两个Fc区配对形成)、铰链区和ABM接头的实例分别描述于7.4.1节、7.4.2节、和7.4.3节中。
7.4.1.Fc结构域
所述CD19结合分子可以包括衍生自任何合适物种的Fc结构域。在一个实施例中，所述Fc结构域衍生自人Fc结构域。
所述Fc结构域可以衍生自任何合适类型的抗体，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、和IgM。在一个实施例中，所述Fc结构域衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施例中，所述Fc结构域衍生自IgG1。在一个实施例中，所述Fc结构域衍生自IgG4。
所述Fc结构域包含两条多肽链，各自被称为重链Fc区。这两个重链Fc区二聚化以产生Fc结构域。所述Fc结构域中的这两个Fc区可以彼此相同或不同。在天然抗体中，所述Fc区典型地是同一的，但出于产生本披露的多特异性结合分子的目的，所述Fc区可有利地不同以允许异源二聚化，如下文7.4.1.5节所述。
典型地，每个重链Fc区包含两个或三个重链恒定结构域或由其组成。
在天然抗体中，IgA、IgD和IgG的重链Fc区由两个重链恒定结构域(CH2和CH3)构成并且IgE和IgM的Fc区由三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4)构成。这些抗体二聚化以产生Fc结构域。
在本披露中，所述重链Fc区可以包含来自一个或多个不同类型(例如一个、两个或三个不同类型)的抗体的重链恒定结构域。
在一个实施例中，所述重链Fc区包含衍生自IgG1的CH2和CH3结构域。衍生自人IgG1的重链Fc区的示例性序列在SEQ ID NO:1109中给出：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:1109)。
在一些实施例中，本披露的CD19结合分子包含Fc区，其氨基酸序列包含用7.4.1节及其子节中所述的一种或多种取代修饰的SEQ ID NO:1109的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述重链Fc区包含衍生自IgG2的CH2和CH3结构域。
在一个实施例中，所述重链Fc区包含衍生自IgG3的CH2和CH3结构域。
在一个实施例中，所述重链Fc区包含衍生自IgG4的CH2和CH3结构域。
在一个实施例中，所述重链Fc区包含来自IgM的CH4结构域。所述IgM CH4结构域典型地位于CH3结构域的C-末端。
在一个实施例中，所述重链Fc区包含衍生自IgG的CH2和CH3结构域和衍生自IgM的CH4结构域。
将认识到，用于产生针对本披露的CD19结合分子的重链Fc区的重链恒定结构域可以包括如上所述的天然存在的恒定结构域的变体。此类变体相比于野生型恒定结构域可以包含一个或多个氨基酸变异。在一个实例中，本披露的所述重链Fc区包含至少一个恒定结构域，其在序列上与野生型恒定结构域不同。将认识到，所述变体恒定结构域可以比野生型恒定结构域更长或更短。例如，所述变体恒定结构域与野生型恒定结构域是至少60％同一或相似的。在另一个实例中，所述恒定结构域是至少70％同一或相似的。在另一个实例中，所述恒定结构域是至少75％同一或相似的。在另一个实例中，所述恒定结构域是至少80％同一或相似的。在另一个实例中，所述恒定结构域是至少85％同一或相似的。在另一个实例中，所述恒定结构域是至少90％同一或相似的。在另一个实例中，所述恒定结构域是至少95％同一或相似的。在另一个实例中，所述恒定结构域是至少99％同一或相似的。示例性Fc变体描述于下文中的7.4.1.1节至7.4.1.5节中。
IgM和IgA作为常见H2L2抗体单元的共价多聚物天然存在于人类中。当掺入J-链时，IgM作为五聚体存在，或者当缺乏J-链时，IgM作为六聚体存在。IgA作为单体和二聚体形式存在。IgM和IgA的重链具有至C-末端恒定结构域的18个氨基酸的延伸，其称为尾部(tailpiece)。所述尾部包括形成多聚物中的重链之间的二硫键的半胱氨酸残基，并且据信在聚合中具有重要作用。所述尾部还含有糖基化位点。在某些实施例中，本披露的所述CD19结合分子不包含尾部。
掺入本披露的CD19结合分子中的所述Fc结构域可以包含改变蛋白质的一个或多个功能特性的一个或多个修饰，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，CD19结合分子可以经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以附接至CD19结合分子)或经修饰以改变其糖基化，从而再次改变CD19结合分子的一种或多种功能特性。
抗体分子的效应子功能包括补体介导的效应子功能，其是由例如所述补体的C1组分与所述抗体的结合介导的。补体的活化在病原体的调理作用和直接裂解中是重要的。另外，它通过募集和活化吞噬细胞至补体活化的位点刺激炎症响应。效应子功能包括Fc受体(FcR)介导的效应子功能，其可以由抗体的恒定结构域与Fc受体(FcR)的结合触发。效应细胞表面上Fc受体的抗原-抗体复合物介导的交联触发大量重要和不同的生物学响应，包括抗体包被的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、或ADCC)、炎性介质的释放、胎盘转运和免疫球蛋白产生的控制。
可以通过以下方式改变Fc区：将至少一个氨基酸残基置换为不同氨基酸残基以改变效应子功能。例如，一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基置换，使得Fc区对效应配体具有改变的亲和力。改变亲和力的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。例如，Winter等人在美国专利号5,624,821和5,648,260中均描述了这一方法。修饰的Fc区还可以改变C1q结合和/或减少或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。例如，Idusogie等人在美国专利号6,194,551中描述了这一方法。修饰的Fc区还可以改变Fc区固定补体的能力。例如，Bodmer等人在PCT公开WO 94/29351中描述了这一方法。同种异型氨基酸残基包括但不限于：IgG1、IgG2、和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如Jefferis等人,2009,MAbs,1:332-338所述。
还可以修饰Fc区以“沉默”所述效应子功能，例如，减少或消除CD19结合分子介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的能力。例如，可以通过在Fc区中引入突变来实现这一目标。本领域中已描述了此类突变：LALA和N297A(Strohl,2009,Curr.Opin.Biotechnol.[当前生物技术观点]20(6):685-691)；和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.[免疫学杂志]181:6664-69；Strohl,同上)。沉默Fc IgG1抗体的实例包含号称的LALA突变体，所述突变体在IgG1 Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变。沉默IgG1抗体的另一个实例包含D265A突变。另一沉默IgG1抗体包含所谓的DAPA突变体，所述突变体包含IgG1 Fc氨基酸序列中的D265A和P329A突变。另一个沉默IgG1抗体包含N297A突变，所述突变导致无糖基化/非糖基化的抗体。
可以修饰Fc区以提高含有所述Fc区的CD19结合分子介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的能力，例如，通过修饰一个或多个氨基酸残基以提高CD19结合分子对活化Fcγ受体的亲和力，或降低CD19结合分子对抑制性Fcγ受体的亲和力。人活化Fcγ受体包括FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa、和FcγRIIIb，并且人抑制性Fcγ受体包括FcγRIIb。例如Presta在PCT公开WO 00/42072中描述了这一方法。此外，已经绘制了人IgG1上针对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]276:6591-6604,2001)。已经描述了单克隆抗体的Fc介导的效应子功能的优化例如提高的ADCC/ADCP功能(参见Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology[当前生物技术观点]20:685-691)。可以增强ADCC/ADCP功能的突变包括一个或多个选自以下的突变：G236A、S239D、F243L、P247I、D280H、K290S、R292P、S298A、S298D、S298V、Y300L、V305I、A330L、I332E、E333A、K334A、A339D、A339Q、A339T、和P396L(所有位置通过EU编号)。
还可以修饰Fc区以提高CD19结合分子介导ADCC和/或ADCP的能力，例如，通过修饰一个或多个氨基酸以提高CD19结合分子对活化受体的亲和力，所述活化受体典型地不识别所述亲本CD19结合分子，如FcαRI。这一方法描述于例如，Borrok等人,2015,mAbs.7(4):743-751。
因此，在某些方面，本披露的所述CD19结合分子可以包括具有改变的效应子功能(例如但不限于结合至Fc受体，例如FcRn或白细胞受体(例如，如上所述或在7.4.1.1节所述)、结合至补体(例如如上所述或在7.4.1.2节所述)、修饰的二硫键结构(例如如上所述或在7.4.1.3节所述)或改变的糖基化模式(例如如上所述或在7.4.1.4节所述))的Fc结构域。还可以改变Fc结构域以包括改善非对称CD19结合分子的可以制造性的修饰，例如通过允许异源二聚化(所述异源二聚化是不同Fc区相对同一Fc区的优先配对)。异源二聚化允许CD19结合分子的产生，其中不同ABM通过含有具有不同序列的Fc区的Fc结构域相互连接。异源二聚化策略的实例示例于7.4.1.5节(及其子节)中。
将认识到，可以按任何合适的方式组合7.4.1.1节至7.4.1.5节中所述的任何修饰以实现所希望的功能特性和/或将7.4.1.1节至7.4.1.5节中所述的任何修饰与其他修饰组合以改变所述CD19结合分子的特性。在一些实施例中，CD19结合分子包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332(EU编号)的1、2、3、4、5、6、或多于6处具有突变的IgG1 Fc结构域。例如，CD19结合分子可以包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332的1、2、3、4、5、6、或多于6处具有突变的SEQ ID NO:1109的IgG1序列。
7.4.1.1.具有改变的FcR结合的Fc结构域
与对应天然免疫球蛋白相比，所述CD19结合分子的Fc结构域可以示出改变的与一个或多个Fc受体(FcR)的结合。与任何具体Fc受体的结合可以被提高或降低。在一个实施例中，所述Fc结构域包含一个或多个修饰，所述修饰改变其Fc-受体结合谱。
人细胞可以表达大量膜结合FcR，其选自FcαR、FcεR、FcγR、FcRn和聚糖受体。一些细胞还能够表达可溶性(胞外结构域)FcR(Fridman等人,1993,J Leukocyte Biology[白细胞生物学杂志]54:504-512)。FcγR可以进一步通过IgG结合亲和力(高/低)和生物学作用(活化/抑制)划分。人FcγRI广泛地被认为是唯一的“高亲和力”受体，而所有其他的都被认为是中等至低等。由于其细胞内ITIM基序，FcγRIIb是具有“抑制性”功能性的唯一受体，而由于ITAM基序或与常见FcγR--γ链配对，所有其他的被认为是“活化的”。FcγRIIIb在以下方面也是独特的：尽管是活化的，但它与所述细胞通过GPI锚缔合。总之，人表达六种“标准”FcγR：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、和FcγRIIIb。除了这些序列，还有大量序列或同种异型变体分散在这些家族中。这些序列中的一些据发现具有重要的功能后果并且因此有时被认为是它们自己的受体亚型。实例包括FcγRIIaH134R、FcγRIIbI190T、FcγRIIIaF158V、FcγRIIIbNA1、FcγRIIIbNA2、和FcγRIIISH。每个受体序列已示出对IgG的4种亚类具有不同的亲和力：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(Bruhns,1993,Blood[血液]113:3716-3725)。其他的物种具有略微不同的FcγR数量和功能性，其中小鼠系统是目前研究最完善的并且由4FcγR，FcγRI FcγRIIb FcγRIII FcγRIV组成(Bruhns,2012,Blood[血液]119:5640-5649)。由于细胞上的人FcγRI对IgG1/IgG3/IgG4的亲和力(约10-8M)和这些IgG在血清中的浓度(约10mg/ml)，细胞上的人FcγRI通常被认为被正常血清条件中的单体IgG“占据”。因此，在其表面上携带FcγRI的细胞被认为能够通过结合的多特异性IgG替代性地对它们的抗原环境进行“筛选”或“取样”。对IgG亚类具有较低亲和力的其他受体(在约10-5-10-7M的范围内)通常被认为是“未占据的”。低亲和力受体因此内在地对涉及抗体的免疫复合物的检测和通过其的活化敏感。在抗体免疫复合物中的所述提高的Fc密度导致结合亲合力与低亲和力FcγR的提高的功能亲和力。使用许多方法，体外示出了这一点(Shields等人,2001,J Biol Chem[生物化学杂志]276(9):6591-6604；Lux等人,2013,JImmunol[免疫学杂志]190:4315-4323)。这还被认为是使用抗RhD治疗人ITP的主要作用方式之一(Crow,2008,Transfusion Medicine Reviews[输血医学评论]22:103-116)。
许多细胞类型表达多种类型的FcγR并且因此取决于生物学背景，IgG或抗体免疫复合物结合至携带FcγR的细胞可以具有多种的和复杂的结果。最简单的是，细胞可以接受活化的、抑制性的或混合的信号。这可以导致以下事件，例如吞噬作用(例如，巨噬细胞和中性粒细胞)、抗原加工(例如，树突细胞)、减少的IgG产生(例如，B细胞)或脱粒(例如，中性粒细胞、肥大细胞)。有数据支持以下结论：来自FcγRIIb的抑制性信号可以主导活化信号(Proulx,2010,Clinical Immunology[临床免疫学]135:422-429)。
可以制备大量有用的Fc取代以改变与FcγR受体中的一个或多个的结合。导致提高的结合和降低的结合的取代可以是有用的。例如，已知提高的与FcγRIIIa的结合通常导致提高的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合的抗体并且随后导致靶细胞的裂解)。相似地，降低的与FcγRIIb(抑制性受体)的结合在一些情况下也可以是有益的。可用于本披露中的氨基酸取代包括US 2006/0024298(尤其是图41)、US 2006/0121032、US 2006/0235208、US2007/0148170、和US 2019/0100587中所列出的那些。可使用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V、299T、265A/297A/329A、265N/297D/329G、和265E/297Q/329S。
FcRn在维持成人和儿童的血清中的IgG的长期半衰期具有关键的作用。所述受体在酸化囊泡(pH<6.5)中结合IgG，保护IgG分子不被降解，并且然后将其在血液中在7.4的更高pH中释放。
FcRn不同于白细胞Fc受体，并且相反地，具有与MHC I类分子的结构相似性。由β2-微球蛋白链构成的异二聚体非共价附接至包括三个细胞外结构域的膜结合链上。这些结构域之一(包括碳水化合物链)与β2-微球蛋白一起与Fc的CH2和CH3结构域之间的位点相互作用。所述相互作用包括针对IgG上的组氨酸残基制备的盐桥，所述组氨酸残基在pH<6.5是带正电的。在更高的pH，所述His残基失去了它们的正电荷，FcRn-IgG相互作用被减弱并且IgG解离。
在一个实施例中，CD19结合分子包含结合至人FcRn的Fc结构域。
在一个实施例中，所述Fc结构域具有一个或多个(例如一个或两个)Fc区，所述Fc区包含在位置310处的组氨酸残基，并且在一些情况下还包含在位置435处的组氨酸残基。这些组氨酸残基对于人FcRn结合是重要的。在一个实施例中，在位置310和435处的组氨酸残基是天然残基，即位置310和435是未经修饰的。可替代地，这些组氨酸残基中的一个或两个可能由于修饰而存在。
所述CD19结合分子可以包含改变Fc结合至FcRn的一个或多个Fc区。所述改变的结合可以是提高的结合或降低的结合。
在一个实施例中，所述CD19结合分子包含Fc结构域，其中至少一个(和任选地两个)Fc区包含一个或多个修饰，使得它以比相应的天然免疫球蛋白以更高的亲和力和亲合力结合至FcRn。
提高与FcRn受体结合并提高血清半衰期的Fc取代描述于US 2009/0163699中，包括但不限于：434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。
在一个实施例中，通过用谷氨酰胺残基取代位置250处的苏氨酸残基(T250Q)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用酪氨酸残基取代位置252处的甲硫氨酸残基(M252Y)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用苏氨酸残基取代位置254处的丝氨酸残基(S254T)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用谷氨酸残基取代位置256处的苏氨酸残基(T256E)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置307处的苏氨酸残基(T307A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用脯氨酸残基取代位置307处的苏氨酸残基(T307P)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用半胱氨酸残基取代位置308处的缬氨酸残基(V308C)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用苯丙氨酸残基取代位置308处的缬氨酸残基(V308F)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用脯氨酸残基取代位置308处的缬氨酸残基(V308P)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置311处的谷氨酰胺残基(Q311A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用精氨酸残基取代位置311处的谷氨酰胺残基(Q311R)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用亮氨酸残基取代位置428处的甲硫氨酸残基(M428L)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用赖氨酸残基取代位置433处的组氨酸残基(H433K)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用苯丙氨酸残基取代位置434处的天冬酰胺残基(N434F)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用酪氨酸残基取代位置434处的天冬酰胺残基(N434Y)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用酪氨酸残基取代位置252处的甲硫氨酸残基，用苏氨酸残基取代位置254处的丝氨酸残基，和用谷氨酸残基取代位置256处的苏氨酸残基(M252Y/S254T/T256E)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用脯氨酸残基取代位置308处的缬氨酸残基，和用酪氨酸残基取代位置434处的天冬酰胺残基(V308P/N434Y)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用酪氨酸残基取代位置252处的甲硫氨酸残基，用苏氨酸残基取代位置254处的丝氨酸残基，用谷氨酸残基取代位置256处的苏氨酸残基，用赖氨酸残基取代位置433处的组氨酸残基和用苯丙氨酸残基取代位置434处的天冬酰胺残基(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)来修饰所述Fc区。
将认识到，上述所列的任一修饰可以组合以改变FcRn结合。
在一个实施例中，所述CD19结合分子包含Fc结构域，其中一个或两个Fc区包含一个或多个修饰，使得所述Fc结构域比相应的天然免疫球蛋白以更低亲和力和亲合力结合至FcRn。
在一个实施例中，除了在位置310处和/或位置435处的组氨酸，所述Fc区包含任何氨基酸残基。
所述CD19结合分子可以包含Fc结构域，其中一个或两个Fc区包含提高其与FcγRIIb结合的一个或多个修饰。FcγRIIb是人类中唯一的抑制性受体并且是在B细胞上发现的唯一的Fc受体。
在一个实施例中，通过用天冬氨酸残基取代位置238处的脯氨酸残基(P238D)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置258处的谷氨酸残基(E258A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置267处的丝氨酸残基(S267A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用谷氨酸残基取代位置267处的丝氨酸残基(S267E)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用苯丙氨酸残基取代位置328处的亮氨酸残基(L328F)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置258处的谷氨酸残基并且用丙氨酸残基取代位置267处的丝氨酸残基(E258A/S267A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用谷氨酸残基取代位置267处的丝氨酸残基并且用苯丙氨酸残基取代位置328处的亮氨酸残基(S267E/L328F)来修饰所述Fc区。
将认识到，上述所列的任一修饰可以组合以提高FcγRIIb结合。
在一个实施例中，提供了包含Fc结构域的CD19结合分子，所述Fc结构域展示出与FcγR降低的结合。
在一个实施例中，所述CD19结合分子包含Fc结构域，其中一个或两个Fc区包含一个或多个降低与FcγR的Fc结合的修饰。
所述Fc结构域可以衍生自IgG1。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置234处的亮氨酸残基(L234A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置235处的亮氨酸残基(L235A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用精氨酸残基取代位置236处的甘氨酸残基(G236R)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基(N297A)或谷氨酰胺残基(N297Q)取代位置297处的天冬酰胺残基来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置298处的丝氨酸残基(S298A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用精氨酸残基取代位置328处的亮氨酸残基(L328R)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置234处的亮氨酸残基并且用丙氨酸残基取代位置235处的亮氨酸残基(L234A/L235A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置234处的苯丙氨酸残基并且用丙氨酸残基取代位置235处的亮氨酸残基(F234A/L235A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用精氨酸残基取代位置236处的甘氨酸残基并且用精氨酸残基取代位置328处的亮氨酸残基(G236R/L328R)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置265处的天冬氨酸残基、用丙氨酸残基取代位置297处的天冬酰胺残基，并且用丙氨酸残基取代位置329处的脯氨酸残基(D265A/N297A/P329A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用天冬酰胺残基取代位置265处的天冬氨酸残基、用天冬氨酸残基取代位置297处的天冬酰胺残基，并且用甘氨酸残基取代位置329处的脯氨酸残基(D265N/N297D/P329G)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用谷氨酸盐残基取代位置265处的天冬氨酸残基、用谷氨酸盐残基取代位置297处的天冬酰胺残基，并且用丝氨酸残基取代位置329处的脯氨酸残基(D265E/N297Q/P329S)来修饰所述Fc区。
将认识到，上述所列的任一修饰可以组合以降低FcγR结合。
在一个实施例中，CD19结合分子包含Fc结构域，其中一个或两个Fc区包含一个或多个修饰，所述修饰降低Fc结合至FcγRIIIa而不影响Fc结合至FcγRII。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置239处的丝氨酸残基(S239A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置269处的谷氨酸残基(E269A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置293处的谷氨酸残基(E293A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用苯丙氨酸残基取代位置296处的酪氨酸残基(Y296F)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置303处的缬氨酸残基(V303A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用甘氨酸残基取代位置327处的丙氨酸残基(A327G)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置338处的赖氨酸残基(K338A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置376处的天冬氨酸残基(D376A)来修饰所述Fc区。
将认识到，上述所列的任一修饰可以组合以降低FcγRIIIa结合。
具有降低的FcR结合的Fc区变体可以称为“FcγR消融变体”、“FcγR沉默变体”或“Fc敲出(FcKO或KO)”变体。针对一些治疗性应用，希望的是减少或除去Fc结构域与一个或多个或全部Fcγ受体(例如，FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa)的正常结合以避免另外的作用机制。即，例如，在许多实施例中，尤其在单价结合CD3的MBM的用途中，通常希望的是消融FcγRIIIa结合以消除或显著地降低ADCC活性。在一些实施例中，本文所述的MBM的至少一个Fc区包含一个或多个Fcγ受体消融变体。在一些实施例中，两个Fc区均包含一个或多个Fcγ受体消融变体。这些消融变体描述于表3中，并且每一个可以独立地并任选地被包括或排除，其中一些方面利用了消融变体，所述消融变体选自由以下组成的组：G236R/L328R、
E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、
E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、
E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、
E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、
E233P/L234V/L235A/G236del、D265A/N297A/P329A、
D265N/N297D/P329G、和D265E/N297Q/P329S(“del”表示缺失，例如，G236del是指在位置236处的甘氨酸的缺失)。应当注意，本文所引用的消融变体消融FcγR结合但通常不消融FcRn结合。
Figure BDA0003360067460000671
Figure BDA0003360067460000681
在一些实施例中，本披露的MBM包含第一Fc区和第二Fc区。在一些实施例中，所述第一Fc区和/或所述第二Fc区可以包含以下突变：E233P、L234V、L235A、G236del、和S267K。
人IgG1的Fc结构域具有与Fcγ受体最高的结合，并且因此当异二聚体抗体的主链中的恒定结构域(或Fc结构域)是IgG1时，可以使用消融变体。
可替代地，或除了IgG1背景中的消融变体，在糖基化位置297处的突变，例如，用丙氨酸残基(N297A)或用谷氨酰胺残基(N297Q)取代位置297处的天冬酰胺残基例如，可以显著地消融与例如FcγRIIIa结合。人IgG2和IgG4与Fcγ受体的结合天然减少，并且因此那些主链可以在具有或不具有消融变体的情况下使用。
7.4.1.2.具有改变的补体结合的Fc结构域
所述CD19结合分子可以包含Fc结构域，其中一个或两个Fc区包含改变Fc与补体结合的一个或多个修饰。改变的补体结合可以是提高的结合或降低的结合。
在一个实施例中，所述Fc区包含降低其结合至C1q的一个或多个修饰。经典补体途径的引发以将六聚C1q蛋白质与抗原结合的IgG和IgM的CH2结构域结合开始。
在一个实施例中，所述CD19结合分子包含Fc结构域，其中一个或两个Fc区包含降低Fc与C1q结合的一个或多个修饰。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置234处的亮氨酸残基(L234A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置235处的亮氨酸残基(L235A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用谷氨酸残基取代位置235处的亮氨酸残基(L235E)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置237处的甘氨酸残基(G237A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置322处的赖氨酸残基(K322A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基取代位置331处的脯氨酸残基(P331A)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过用丝氨酸残基取代位置331处的脯氨酸残基(P331S)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，CD19结合分子包含衍生自IgG4的Fc结构域。IgG4比IgG1具有天然更低的补体活化谱，还具有与FcγR的更弱的结合。因此，在一个实施例中，所述CD19结合分子包含IgG4 Fc结构域并且还包含提高FcγR结合的一个或多个修饰。
将认识到，上述所列的任一修饰可以组合以降低C1q结合。
7.4.1.3.具有改变的二硫键结构的Fc结构域
所述CD19结合分子可以包括包含一个或多个修饰以产生和/或除去半胱氨酸残基的Fc结构域。通过在单对的多肽单体之间形成二硫桥，半胱氨酸残基在基于Fc的多特异性结合分子的同时装配中具有重要作用。因此，通过改变半胱氨酸残基的数量和/或位置，修饰CD19结合分子结构以产生具有改善的治疗性质的蛋白质是可能的。
本披露的CD19结合分子可以包含Fc结构域，其中一个或两个Fc区(例如，两个Fc区)包含在位置309处的半胱氨酸残基。在一个实施例中，通过修饰来产生在位置309处的半胱氨酸残基，例如，针对衍生自IgG1的Fc结构域，用半胱氨酸残基(L309C)取代在位置309处的亮氨酸残基，针对衍生自IgG2的Fc结构域，用半胱氨酸残基(V309C)取代在位置309处的缬氨酸残基。
在一个实施例中，通过用半胱氨酸残基取代位置308处的缬氨酸残基(V308C)来修饰所述Fc区。
在一个实施例中，通过将核心铰链序列CPPC(SEQ ID NO:55)突变为SPPS(SEQ IDNO:56)来除去铰链区中的两个二硫键。
7.4.1.4.具有改变的糖基化的Fc结构域
在某些方面，提供了具有改善的可制造性的CD19结合分子，所述CD19结合分子包含比相应的免疫球蛋白更少的糖基化位点。这些蛋白质具有较不复杂的翻译后糖基化模式并且因此对于制造商来说更简单并且花费更少。
在一个实施例中，通过用丙氨酸残基(N297A)或谷氨酰胺残基(N297Q)取代位置297处的天冬酰胺残基来除去CH2结构域中的糖基化位点。除了改善的可制造性，这些糖基化突变体还降低了如上在本文所述的FcγR结合。
在一些实施例中，可以制备如下的CD19结合分子，其具有改变的糖基化类型，如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化的抗体或具有提高的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。可以通过例如，在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达CD19结合分子，来实现此类碳水化合物修饰。本领域已描述了具有改变的糖基化机制的细胞并且所述细胞可以用作表达CD19结合分子，从而产生具有改变的糖基化的CD19结合分子的宿主细胞。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Presta在PCT公开WO 03/035835中描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，还导致在所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见Shields等人,2002,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人在PCT公开WO 99/54342中描述了如下细胞系，所述细胞系被工程化以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，所述二等分GlcNac结构导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180,1999)。
7.4.1.5.Fc异源二聚化
许多多特异性分子形式需要两个Fc区之间的二聚化，不同于天然免疫球蛋白，所述两个Fc区可操作地连接至非同一的抗原结合结构域(或其部分，例如，Fab的VH或VH-CH1)。形成Fc结构域的两个Fc区的不充分的异源二聚化一直是提高所希望的多特异性分子的产生的障碍并且代表了纯化的挑战。本领域可以获得的多种方法可以用于增强可能存在于CD19结合分子(和尤其是在本披露的MBM)中的Fc区的二聚化，例如如在以下所披露的：EP1870459 A1；美国专利号5,582,996；美国专利号5,731,168；美国专利号5,910,573；美国专利号5,932,448；美国专利号6,833,441；美国专利号7,183,076；美国专利申请公开号2006204493A1；和PCT公开号WO 2009/089004 A1。
本披露提供了包含Fc异二聚体的CD19结合分子，即包含异源、非同一Fc区的Fc结构域。异源二聚化策略用于增强可操作地连接至不同的ABM(或其部分，例如，Fab的VH或VH-CH1)的Fc区的二聚化并降低可操作地连接至相同ABM或其部分的Fc区的二聚化。典型地，Fc异二聚体中的每个Fc区包含抗体的CH3结构域。所述CH3结构域衍生自任何同种型、类型或亚类、和在IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)类型的一些情况下的抗体的恒定区，如前述节中所述。
典型地，除了CH3结构域，所述MBM还包含其他抗体片段，如，本文所述的CH1结构域、CH2结构域、铰链结构域、一个或多个VH结构域、一个或多个VL结构域、一个或多个CDR、和/或抗原结合片段。在一些实施例中，所述两个杂多肽是形成双特异性或多特异性分子的两个重链。在CH3结构域处的两个不同的重链的异源二聚化产生了所希望的抗体或抗体样分子，而同一的重链的同型二聚化将降低所希望的抗体或分子的产生。在示例性实施例中，所述两条或更多条杂多肽链包含两条链，所述两条链包含CH3结构域并且形成了本披露以上所述的任何多特异性分子形式的分子。在实施例中，包含CH3结构域的所述两条杂多肽链包含有利于所述多肽的异二聚体缔合的修饰(相对于未修饰的链)。在下表4和7.4.1.5.1节至7.4.1.5.7节中提供了修饰策略的多种实例。
Figure BDA0003360067460000721
Figure BDA0003360067460000731
Figure BDA0003360067460000741
Figure BDA0003360067460000751
Figure BDA0003360067460000761
Figure BDA0003360067460000771
Figure BDA0003360067460000781
Figure BDA0003360067460000791
Figure BDA0003360067460000801
可以配对以形成Fc异二聚体并且可以包含在本披露的CD19结合分子中的示例性异源、非同一Fc序列对包括(i)SEQ ID NO:1106和SEQ ID NO:1107，和(ii)SEQ ID NO:1106和SEQ ID NO:1108。
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1106)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1107)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1108)
具有SEQ ID NO:1106-1108之一的氨基酸序列的Fc区可以被修饰以包括7.4.1节(包括其子节)中所述的一个或多个取代，例如包括对应于表3中所列出的消融变体的一个或多个取代。在一些实施例中，CD19结合分子包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332(EU编号)的1、2、3、4、5、6、或多于6处具有突变(例如7.4.1节(包括其子节)中所述的一个或多个突变)的SEQ ID NO:1106-1108之一的氨基酸序列的Fc区。例如，CD19结合分子可以包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332的1、2、3、4、5、6、或多于6处具有突变的SEQ ID NO:1106的氨基酸序列的Fc区和/或在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332的1、2、3、4、5、6、或多于6处具有突变的SEQ ID NO:1107的氨基酸序列的Fc区和/或在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332的1、2、3、4、5、6、或多于6处具有突变的SEQ ID NO:1108的氨基酸序列的Fc区。
7.4.1.5.1.空间变体
CD19结合分子可以包含一个或多个，例如，多个，对Fc结构域的一个或多个恒定结构域的修饰，例如，对CH3结构域的修饰。在一个实例中，本披露的CD19结合分子包含两个多肽，每个多肽包含抗体的重链恒定结构域，例如，CH2或CH3结构域。在实例中，两个重链恒定结构域，例如，CD19结合分子的CH2或CH3结构域包含一个或多个修饰，所述修饰允许两个链之间的异二聚体缔合。在一个方面，所述一个或多个修饰布置在两条重链的CH2结构域上。在一个方面，所述一个或多个修饰布置在所述CD19结合分子的至少两个多肽的CH3结构域上。
Fc异源二聚化的一个机制通常称为“杵臼(knobs and holes)”或“杵臼结构(knobs-into-holes)”。这些术语是指产生空间影响以有利于Fc异二聚体(相比于Fc同型二聚体)形成的氨基酸突变，如以下所描述，例如Ridgway等人,1996,Protein Engineering[蛋白质工程]9(7):617；Atwell等人,1997,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]270:26；美国专利号8,216,805。杵臼结构突变可以与其他策略组合以改善异源二聚化。
在一个方面，对包含重链恒定结构域的CD19结合分子的第一多肽的一个或多个修饰可以产生“杵”并且对CD19结合分子的第二多肽的一个或多个修饰产生了“臼”，使得包含重链恒定结构域的CD19结合分子的多肽的异源二聚化产生了“杵”以与“臼”界面接合(interface)(例如，相互作用，例如，第一多肽的CH2结构域与第二多肽的CH2结构域相互作用，或第一多肽的CH3结构域与第二多肽的CH3结构域相互作用)。所述杵从包含重链恒定结构域的CD19结合分子的第一多肽的界面上突出并且因此可定位于在与包含重链恒定结构域的CD19结合分子的第二多肽的界面中的互补性“臼”中以稳定异源多聚物，并且从而有利于异源多聚物形成(例如相对于同源多聚物)。所述杵可以存在于最初的界面中或可以合成引入(例如，通过改变编码所述界面的核酸)。用于形成杵的输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且可以选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。在一些情况下，选择了色氨酸和酪氨酸。在实施例中，用于形成突起的最初残基具有小侧链容积，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
“臼”包含至少一个氨基酸侧链，所述氨基酸侧链凹进包含重链恒定结构域的CD19结合分子的第二多肽的界面中并且因此容纳包含重链恒定结构域的CD19结合分子的第一多肽的相邻交界表面上的相应的杵。所述臼可以存在于最初的界面中或可以合成方式引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。用于形成臼的所述输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且在一些实施例中选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一个实施例中，所述氨基酸残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在另一个实施例中，用于形成臼的最初的残基具有大的侧链容积，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
在实施例中，在残基366、405或407处修饰第一CH3结构域以产生“杵”或“臼”(如上所述)，并且在以下处修饰与第一CH3结构域异源二聚体化的第二CH3结构域以产生与第一CH3结构域的“杵”或“臼”互补的“臼”或“杵”：残基407(如果修饰了在第一CH3结构域中的残基366)、残基394(如果修饰了在第一CH3结构域中的残基405)、或残基366(如果修饰了第一CH3结构域中的残基407)。
在另一个实施例中，在残基366处修饰第一CH3结构域，并且在残基366、368和/或407处修饰与第一CH3结构域异源二聚体化的第二CH3结构域，以产生与第一CH3结构域的“杵”或“臼”互补的“臼”或“杵”。在一个实施例中，对第一CH3结构域的修饰在位置366处引入了酪氨酸(Y)残基。在实施例中，对第一CH3的修饰是T366Y。在一个实施例中，对第一CH3结构域的修饰在位置366处引入色氨酸(W)残基。在实施例中，对第一CH3的修饰是T366W。在一些实施例中，对与第一CH3结构域(在位置366处进行了修饰(例如，具有在位置366处引入的酪氨酸(Y)或色氨酸(W)，例如，包含修饰T366Y或T366W))异源二聚体化的第二CH3结构域的修饰包含在位置366处的修饰、在位置368处的修饰和在位置407处的修饰。在一些实施例中，在位置366处的修饰引入了丝氨酸(S)残基，在位置368处的修饰引入了丙氨酸(A)，并且在位置407处的修饰引入了缬氨酸(V)。在一些实施例中，所述修饰包含T366S、L368A和Y407V。在一个实施例中，多特异性分子的第一CH3结构域包含修饰T366Y，并且与第一CH3结构域异源二聚体化的第二CH3结构域包含修饰T366S、L368A和Y407V，反之亦然。在一个实施例中，多特异性分子的第一CH3结构域包含修饰T366W，并且与第一CH3结构域异源二聚体化的第二CH3结构域包含修饰T366S、L368A和Y407V，反之亦然。
另外的空间或“偏移”(例如杵臼结构)修饰描述于PCT公开号WO 2014/145806(例如，WO 2014/145806的图3、图4和图12)、PCT公开号WO 2014/110601、和PCT公开号WO 2016/086186、WO 2016/086189、WO 2016/086196和WO 2016/182751中。KIH变体的实例包含含有L368D和K370S修饰的第一恒定链，其与包含S364K和E357Q修饰的第二恒定链配对。
适合用于任何本披露的CD19结合分子中的另外的杵臼结构修饰对进一步描述于例如，WO 1996/027011、和Merchant等人,1998,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],16:677-681中。
在进一步的实施例中，所述CH3结构域可以另外地经修饰以引入一对半胱氨酸残基。不受理论束缚，据信，引入能够形成二硫键的一对半胱氨酸残基向包含配对的CH3结构域的异源二聚体化的CD19结合分子(例如，MBM)提供了稳定性。在一些实施例中，所述第一CH3结构域包含在位置354处的半胱氨酸，并且与第一CH3结构域异源二聚体化的第二CH3结构域包含在位置349处的半胱氨酸。在一些实施例中，所述第一CH3结构域包含在位置354处的半胱氨酸(例如，包含修饰S354C)和在位置366处的酪氨酸(Y)(例如，包含修饰T366Y)，并且与第一CH3结构域异源二聚体化的第二CH3结构域包含在位置349处的半胱氨酸(例如，包含修饰Y349C)、在位置366处的丝氨酸(例如，包含修饰T366S)、在位置368处的丙氨酸(例如，包含修饰L368A)、和在位置407处的缬氨酸(例如，包含修饰Y407V)。在一些实施例中，所述第一CH3结构域包含在位置354处的半胱氨酸(例如，包含修饰S354C)和在位置366处的色氨酸(W)(例如，包含修饰T366W)，并且与第一CH3结构域异源二聚体化的第二CH3结构域包含在位置349处的半胱氨酸(例如，包含修饰Y349C)、在位置366处的丝氨酸(例如，包含修饰T366S)、在位置368处的丙氨酸(例如，包含修饰L368A)、和在位置407处的缬氨酸(例如，包含修饰Y407V)。
可用于产生异二聚体的另外的机制有时称为“静电导向”，如在以下中所述：Gunasekaran等人,2010,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]285(25):19637。这在本文中有时被称为“电荷对”。在这一实施例中，使用静电将形成向异源二聚化偏移。如技术人员将理解，这些变体还可以对pI具有作用，并且因此对纯化也有作用，并且因此可以在一些情况下被认为是pI变体。然而，鉴于产生了这些变体以促使异源二聚化并且这些不被用作纯化工具，它们被分类为“空间变体”。这些变体包括但不限于，与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E和与C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。
可以与其他的变体(任选地并且独立地以任意量)组合的另外的变体，例如本文所概述的pI变体或US 2012/0149876的图37中示出的其他空间变体。
在一些实施例中，本文所概述的空间变体可以任选地并独立地与任何pI变体(或其他的变体如Fc变体、FcRn变体)一起并入一个或两个Fc区中，并且可以独立地并且任选地被包括在本披露的CD19结合分子内或排除在本披露的CD19结合分子以外。
表5中可见一列合适的偏移变体，其示出在许多实施例中有具体应用的一些变体对。在许多实施例中有具体用途的是如下组的变体对，包括但不限于，S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；和K370S:S364K/E357Q。在命名方面，所述变体对“S364K/E357Q:L368D/K370S”意指Fc区之一具有双变体组S364K/E357Q并且其他的具有双变体组L368D/K370S。
Figure BDA0003360067460000851
Figure BDA0003360067460000861
Figure BDA0003360067460000871
Figure BDA0003360067460000881
Figure BDA0003360067460000891
Figure BDA0003360067460000901
在一些实施例中，CD19结合分子包含第一Fc区和第二Fc区。在一些实施例中，所述第一Fc区包含以下突变：L368D和K370S，并且所述第二Fc区包含以下突变：S364K和E357Q。在一些实施例中，所述第一Fc区包含以下突变：S364K和E357Q，并且所述第二Fc区包含以下突变：L368D和K370S。
7.4.1.5.2.可替代的杵臼(Knob and Hole)：IgG异源二聚化
可以通过在衍生自IgG1抗体类型的CH3结构域中引入一个或多个修饰来提高包含配对的CH3结构域的CD19结合分子的多肽链的异源二聚化。在实施例中，所述修饰包含对一个CH3结构域的K409R修饰，所述CH3结构域与第二CH3结构域中的F405L修饰配对。另外的修饰还可以，或可替代地，是在位置366、368、370、399、405、407、和409处。在一些情况下，包含此类修饰的多肽的异源二聚化在还原条件下，例如，在25-37℃，例如，25℃或37℃下，10-100mM 2-MEA(例如，25、50、或100mM 2-MEA)持续1-10，例如，1.5-5，例如，5小时实现。
本文所述的氨基酸置换可以使用熟知的技术引入CH3结构域中(参见例如McPherson,编辑,1991,Directed Mutagenesis:a Practical Approach[定向诱变：实用方法]；Adelman等人,1983,DNA,2:183)。
所述IgG异源二聚化策略进一步描述于例如，WO 2008/119353、WO 2011/131746、和WO 2013/060867中。
在本节中所述的任一实施例中，所述CH3结构域可以另外地经修饰以引入一对半胱氨酸残基，如7.4.1.3节所述。
7.4.1.5.3.pI(等电点)变体
一般来说，如技术人员将理解的，pI变体有两个一般类别：提高蛋白质pI(碱性改变)的那些和降低蛋白质pI的那些(酸性改变)。如本文所述，可以进行这些变体的所有组合：一个Fc区可以是野生型、或不会展示出与野生型显著不同的pI的变体，并且另一个的碱性或酸性程度可以更大。可替代地，改变每一个Fc区，其中一个碱性程度更大而另一个酸性程度更大。
pI变体的示例性组合示出于表6中。如本文所概述并且如表6所示，这些改变相对于IgG1示出，但是可以以该方式改变所有同种型、以及同种型杂交体。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，还可以使用R133E和R133Q。
Figure BDA0003360067460000921
在一个实施例中，例如在图1B-1W、图1Y-1AH、图2B-2L、和图2N-2V形式中，pI变体的组合具有包含208D/295E/384D/418E/421D变体(当相比于人IgG1时为N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一个Fc区(阴性Fab侧)和包含带正电的scFv接头，例如，L36(在7.4.3节中所述)的第二Fc区(阳性scFv侧)。然而，如技术人员将理解的，所述第一Fc区包括了包含位置208的CH1结构域。因此，在不包括CH1结构域的构建体中(例如针对不使用CH1结构域作为结构域之一的MBM，例如为在图2K中所描述的形式)，阴性pI变体Fc组可以包括295E/384D/418E/421D变体(当相对于人IgG1时，为Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
在一些实施例中，第一Fc区具有来自表6的一组取代并且第二Fc区连接至带电荷的接头(例如，选自7.4.3节中所述的那些)。
在一些实施例中，本披露的CD19结合分子包含第一Fc区和第二Fc区。在一些实施例中，所述第一Fc区包含以下突变：N208D、Q295E、N384D、Q418E、和N421D。在一些实施例中，所述第二Fc区包含以下突变：N208D、Q295E、N384D、Q418E、和N421D。
7.4.1.5.4.同位素变体
另外，本披露的许多实施例依赖于将在特定位置处的pI氨基酸从一个IgG同种型“输入”另一个中，从而减少或消除了不需要的免疫原性被引入变体的可能性。这些变体中的许多示出于美国公开号2014/0370013的图21中。即，IgG1是用于各种原因(包括高效应子功能)的治疗性抗体的共同同种型。然而，IgG1的重恒定区具有比IgG2更高的pI(8.10比7.31)。通过将在特定位置处的IgG2残基引入IgG1主链中，所得的Fc区的pI被降低(或提高)并且另外地表现出更长的血清半衰期。例如，IgG1在位置137处具有甘氨酸(pI 5.97)，并且IgG2具有谷氨酸(pI 3.22)；输入谷氨酸将影响所得的蛋白质的pI。如下所述，通常需要大量氨基酸取代以显著地影响变体抗体的pI。然而，如下文所讨论的，应当注意的是，甚至IgG2分子中的改变也允许血清半衰期提高。
在其他实施例中，产生了非同种型氨基酸变化以降低所得的蛋白质的整体电荷状态(例如，通过将更高pI氨基酸改变为更低pI氨基酸)，或以允许为了稳定性的结构调节，如下文进一步所述。
另外，通过pI工程化包含两个半抗体的CD19结合分子的重和轻恒定结构域，可以看见每个半抗体中的显著变化。使两个半抗体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱法或等电子聚焦、或对等电点敏感的其他的方法的分离。
7.4.1.5.5.计算pI
包含Fc区和ABM或ABM链的半抗体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和总半抗体(包括变体重链恒定结构域和ABM或ABM链)的pI。因此，在一些实施例中，使用美国公开2014/0370013的图19中的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI的变化。如本文所讨论的，工程化哪一个半抗体通常由半抗体的固有pI决定。可替代地，可以比对每个半抗体的pI。
7.4.1.5.6.还赋予更佳的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体降低Fc区的pI的情况下，其可以具有改善的体内血清潴留的附加益处。
pI变体Fc区据信为体内抗原结合分子提供了更长的半衰期，因为在pH 6在内体中结合至FcRn隔绝了Fc(Ghetie和Ward,1997,Immunol Today.[今日免疫学]18(12):592-598)。所述内体腔室然后使Fc再循环至细胞表面。一旦腔室打开至细胞外空间，更高的pH，约7.4，诱导Fc释放回血液中。在小鼠中，Dall’Acqua等人示出，在pH 6和pH 7.4具有提高的FcRn结合的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期(Dall’Acqua等人2002,J.Immunol.[免疫学杂志]169:5171-5180)。在pH 7.4Fc对FcRn的亲和力提高被认为可以防止Fc被释放回血液中。因此，将提高Fc的体内半衰期的所述Fc突变在更低pH下将理想地提高FcRn结合并且在更高pH下仍然允许Fc的释放。氨基酸组氨酸在6.0至7.4的pH范围中改变了其电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合物的重要位置处发现His残基并不令人惊讶。
已有人提出，具有可变区的抗体(具有更低的等电点)还可以具有更长的血清半衰期(Igawa等人,2010,PEDS.23(5):385-392)。然而，人们对这一发现的机制仍然知之甚少。此外，可变区在抗体之间是不同的。具有降低的pI和延长的半衰期的恒定区变体会提供更加模块化的方法以改善如本文所述的CD19结合分子的药代动力学特性。
7.4.1.5.7.极性桥
可以基于“极性桥”基本原理通过引入修饰来提高包含Fc结构域的CD19结合分子(例如，MBM)的多肽链的异源二聚化，所述基本原理是将在两条多肽链的结合界面处制造残基以与异二聚体构型中具有相似(或互补性)物理特性的残基相互作用，同时与同型二聚体构型中具有不同物理特性的残基相互作用。特别地，设计这些修饰从而在异二聚体形成中，极性残基与极性残基相互作用，而疏水残基与疏水残基相互作用。相比之下，在同型二聚体形成中，修饰残基，从而极性残基与疏水残基相互作用。异二聚体构型中有利的相互作用和同型二聚体构型中不利的相互作用一起作用使得Fc区形成异二聚体比形成同型二聚体的可能性更大。
在示例性实施例中，上述修饰在CH3结构域的残基364、368、399、405、409、和411中的一个或多个位置处产生。
在一些实施例中，将选自由S364L、T366V、L368Q、N399K、F405S、K409F和R411K组成的组的一个或多个修饰引入两个CH3结构域之一中。可以将选自由Y407F、K409Q和T411N组成的组的一个或多个修饰引入第二CH3结构域中。
在另一个实施例中，将选自由S364L、T366V、L368Q、D399K、F405S、K409F和T411K组成的组的一个或多个修饰引入到一个CH3结构域中，而将选自由Y407F、K409Q和T411D组成的组的一个或多个修饰引入到第二CH3结构域中。
在一个示例性实施例中，一个CH3结构域的位置366处的苏氨酸的最初残基被缬氨酸置换，而另一个CH3结构域的位置407处的酪氨酸的最初残基被苯丙氨酸置换。
在另一个示例性实施例中，一个CH3结构域的位置364处的丝氨酸的最初残基被亮氨酸置换，而在相同CH3结构域的位置368处的亮氨酸的最初残基被谷氨酰胺置换。
在又另一个示例性实施例中，一个CH3结构域的位置405处的苯丙氨酸的最初残基被丝氨酸置换并且这一CH3结构域的位置409处的赖氨酸的最初残基被苯丙氨酸置换，而另一CH3结构域的位置409处的赖氨酸的最初残基被谷氨酰胺置换。
在又另一个示例性实施例中，一个CH3结构域的位置399处的天冬氨酸的最初残基被赖氨酸置换，并且相同CH3结构域的位置411处的苏氨酸的最初残基被赖氨酸置换，而另一CH3结构域的位置411处的苏氨酸的最初残基被天冬氨酸置换。
本文所述的氨基酸置换可以使用熟知的技术引入CH3结构域中(参见例如McPherson,编辑,1991,Directed Mutagenesis:a Practical Approach[定向诱变：实用方法]；Adelman等人,1983,DNA,2:183)。所述极性桥策略描述于，例如，WO 2006/106905、WO2009/089004和Gunasekaran等人,2010,JBC 285:19637-19646中。
另外的极性桥修饰描述于，例如，PCT公开号WO 2014/145806(例如，WO 2014/145806的图6)，PCT公开号WO 2014/110601，和PCT公开号WO 2016/086186、WO 2016/086189、WO 2016/086196和WO 2016/182751中。极性桥变体的实例包含含有N208D、Q295E、N384D、Q418E和N421D修饰的恒定链。
在本文所述的任何实施例中，所述CH3结构域可以另外地经修饰以引入一对半胱氨酸残基，如7.4.1.3节所述。
用于增强异源二聚化的另外的策略描述于，例如，WO 2016/105450、WO 2016/086186、WO 2016/086189、WO 2016/086196、WO 2016/141378、和WO 2014/145806、和WO2014/110601中。在本文所述的CD19结合分子中可以使用这些策略中的任一个。
7.4.1.6.异源二聚化变体和其他Fc变体的组合
如技术人员将理解的，只要Fc结构域的Fc区保留它们二聚化的能力，全部所列举的异源二聚化变体(包括偏移和/或pI变体)可以任选地并独立地以任何方式组合。另外，所有这些变体可以与异源二聚化形式中的任一个组合。
在pI变体的情况下，当有具体用途的实施例在表6中示出时，根据改变Fc异二聚体中的两个Fc区之间的pI差异以促进纯化的基本原则，可以产生其他的组合。
另外，异源二聚化变体、偏移和pI中的任一个也独立地并且任选地与Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合，如本文中所通常概述的。
在一些实施例中，可用于本披露中的偏移和pI变体的具体组合是T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括桥接二硫键，T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，其中一个Fc区包含Q295E/N384D/Q418E/N481D并且另一个Fc区包含带正电的scFv接头(当所述形式包括scFv结构域时)。如技术人员将理解的，“杵臼结构”变体不改变pI，并且因此可以用在Fc异二聚体中的任一个Fc区上。
在一些实施例中，可用于本披露的第一和第二Fc区包括氨基酸取代S364K/E357Q:L368D/K370S，其中第一和/或第二Fc区包括消融变体取代233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第一和/或第二Fc区包含pI变体取代N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D(pl_(-)_等电_A)。
7.4.2.铰链区
所述CD19结合分子还可以包含铰链区，例如连接抗原结合结构域至Fc区上的铰链区。所述铰链区可以是天然的或经修饰的铰链区。铰链区典型地发现于Fc区的N-末端。
天然铰链区是在天然存在的抗体中的Fab和Fc结构域之间通常可发现的铰链区。经修饰的铰链区是与天然铰链区在长度和/或组成上有差异的任何铰链。此类铰链可以包括来自其他物种的铰链区，例如人、小鼠、大鼠、兔、鲨鱼、猪、仓鼠、骆驼、羊驼或山羊铰链区。其他经修饰的铰链区可以包含衍生自来自与所述重链Fc区不同类型或亚类的抗体的完整的铰链区。可替代地，所述经修饰的铰链区可以包含天然铰链或重复单元的部分，其中重复中的每个单元衍生自天然铰链区。在进一步的替代方案中，可以通过将一个或多个半胱氨酸或其他残基转化为中性残基，例如丝氨酸或丙氨酸，或通过将合适放置的残基转化为半胱氨酸残基来改变所述天然铰链区。通过此类方式，可以提高或降低铰链区中半胱氨酸残基的数量。该方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变铰链区中半胱氨酸残基的数量可以例如，促进轻链和重链的装配，或者提高或降低CD19结合分子的稳定性。其他经修饰的铰链区可以完全是合成的并且可以被设计以具有所希望的特性如长度、半胱氨酸组成和柔性。
以下文献中描述了许多经修饰的铰链区：例如，于美国专利号5,677,425、WO9915549、WO 2005003170、WO 2005003169、WO 2005003170、WO 9825971和WO 2005003171中。
合适的铰链序列的实例示出于表7中。
Figure BDA0003360067460000981
在一个实施例中，所述重链Fc区在其N-末端处具有完整的铰链区。
在一个实施例中，所述重链Fc区和铰链区衍生自IgG4并且所述铰链区包含经修饰的序列CPPC(SEQ ID NO:55)。与含有序列CPPC(SEQ ID NO:55)的IgG1相比，人IgG4的核心铰链区含有序列CPSC(SEQ ID NO:65)。存在于IgG4序列中的丝氨酸残基导致在这一区域中的柔性提高，并且因此一部分分子在相同蛋白质链中形成二硫键(链内二硫键)而不是桥接至IgG分子中的其他重链上以形成链间二硫键。(Angel等人,1993,Mol lmmunol[分子免疫学]30(1):105-108)。将丝氨酸残基改变为脯氨酸以给出与IgG1相同的核心序列允许链间二硫键在IgG4铰链区中完全形成，因此降低了纯化的产物中的异质性。这一改变的同种型被命名为IgG4P。
7.4.3.ABM接头
在某些方面，本披露提供了CD19结合分子，其中ABM的两个或更多个组分(例如，scFv的VH和VL)、两个或更多个ABM、或ABM和非ABM结构域(例如，二聚化结构域，如Fc区)通过肽接头互相连接。此类接头在本文中被称为“ABM接头”，与如在例如7.12.2节中所述的用于附接药物至CD19结合分子的ADC接头不同。
肽接头的范围可以是2个氨基酸至60个或更多个氨基酸，并且在某些方面，肽接头的范围是3个氨基酸至50个氨基酸、4至30个氨基酸、5至25个氨基酸、10至25个氨基酸或12至20个氨基酸。在具体的实施例中，肽接头的长度是2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、20个氨基酸、21个氨基酸、22个氨基酸、23个氨基酸、24个氨基酸、25个氨基酸、26个氨基酸、27个氨基酸、28个氨基酸、29个氨基酸、30个氨基酸、31个氨基酸、32个氨基酸、33个氨基酸、34个氨基酸、35个氨基酸、36个氨基酸、37个氨基酸、38个氨基酸、39个氨基酸、40个氨基酸、41个氨基酸、42个氨基酸、43个氨基酸、44个氨基酸、45个氨基酸、46个氨基酸、47个氨基酸、48个氨基酸、49个氨基酸、或50个氨基酸。
可以使用带电荷的和/或柔性接头。
可以用于CD19结合分子的柔性ABM接头的实例包括如下中所披露的那些：Chen等人,2013,Adv Drug Deliv Rev.[先进药物递送综述]65(10):1357-1369和Klein等人,2014,Protein Engineering,Design&Selection[蛋白质工程化、设计和选择]27(10):325-330。特别有用的柔性接头是(GGGGS)n(也称为(G4S)n)(SEQ ID NO:78)。在一些实施例中，n是1和10之间的任何数字，即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、和10，或以上述数字中的任意两个为端点的任何范围，例如，1至5、2至5、3至6、2至4、1至4等。
可用于本披露的CD19结合分子中的合适的ABM接头的其他实例示出于下表8中：
Figure BDA0003360067460001001
Figure BDA0003360067460001011
Figure BDA0003360067460001021
在多个方面，本披露提供了CD19结合分子，所述CD19结合分子包含一个或多个ABM接头。ABM接头中的每一个的长度范围可以是2个氨基酸至60个氨基酸，例如，4至30个氨基酸，5至25个氨基酸，10至25个氨基酸或12至20个氨基酸，任选地选自上述表8。在具体的实施例中，所述CD19结合分子包含两个、三个、四个、五个或六个ABM接头。所述ABM接头可以位于CD19结合分子的一条、两条、三条、四条或甚至更多条多肽链上。
7.5.双特异性结合分子构型
示例性BBM构型示出于图1中。图1A示出了图1B-1AH中所示BBM构型的组分。scFv、Fab、scFab、基于非免疫球蛋白的ABM、和Fc结构域各自可以具有针对7.3节和7.4节中的这些组分所述的特征。图1示出的BBM构型的组分可以通过7.3节和7.4节中所述的任何方法(例如，通过直接键、ABM接头、二硫键、用杵臼结构相互作用修饰的Fc结构域等)彼此缔和。图1中示出的多种组分的方向和缔和仅仅为示例性的；如技术人员将理解的，其他的方向和缔合可以是合适的(例如，在7.3节和7.4节中所述)。
BBM不限于图1中示出的构型。可以使用的其他的构型是本领域技术人员已知的。参见例如，WO 2014/145806；WO 2017/124002；Liu等人,2017,Front Immunol.[免疫学前沿]8:38；Brinkmann&Kontermann,2017,mAbs 9:2,182-212；US 2016/0355600；Klein等人,2016,MAbs 8(6):1010-20；和US 2017/0145116。
7.5.1.示例性二价BBM
所述BBM可以是二价的，即，它们具有两个抗原结合结构域，其中一个结合CD19(ABM1)并且其中一个结合第二靶抗原(ABM2)，例如，TCR复合物的组分。
示例性二价BBM构型示出于图1B-1F中。
如图1B-1D中所描绘，BBM可以包含两个半抗体，其中一个包含一个ABM并且另一个包含一个ABM，所述两个半抗体通过Fc结构域配对。
在图1B的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1C的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1D的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
如图1E-1F所描述，二价BBM可以包含附接至Fc结构域的一个Fc区的两个ABM。
在图1E的实施例中，所述BBM包含Fab、scFv和Fc结构域，其中所述scFv位于Fab和Fc结构域之间。
在图1F的实施例中，(“一臂scFv-mAb”构型)BBM包含Fab、scFv和Fc结构域，其中Fab位于scFv和Fc结构域之间。
在图1B-1F所示的构型中，X和Y中的每一个代表ABM1或ABM2，其条件是所述BBM包含一个ABM1和一个ABM2。因此，本披露提供了如图1B至1F中任一个所示的二价BBM，其中X是ABM1并且Y是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“B1”)。本披露还提供了如图1B至1F中任一个所示的二价BBM，其中X是ABM2并且Y是ABM1(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“B2”)。
7.5.2.示例性三价BBM
所述BBM可以是三价的，即，它们具有三个抗原结合结构域，其中一个或两个结合CD19(ABM1)并且其中一个或两个结合第二靶抗原(ABM2)，例如，TCR复合物的组分。
示例性三价BBM构型示出于图1G-1Z中。
如图1G-1N、1Q-1W、1Y-1Z中所描绘，BBM可以包含两个半抗体，其中一个包含两个ABM并且另一个包含一个ABM，所述两个半抗体通过Fc结构域配对。
在图1G的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1H的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1I的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含两个Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1J的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含两个Fav和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1K的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含两个scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1L的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1M的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1N的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含双体抗体类型结合结构域和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1Q的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1R的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1S的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、Fc区、和第二scFv。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1T的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv、Fc区、和Fab，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1U的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含两个Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含基于非免疫球蛋白的ABM和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1V的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、scFv、和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含基于非免疫球蛋白的ABM和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1W的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、基于非免疫球蛋白的ABM、和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1Y的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1Z的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和scFab，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
可替代地，如图1O和1P所描述，三价BBM可以包含两个半抗体，其中每个包含一个完整的ABM(图1O和1P中的Fab)和另一个ABM的一部分(一个是VH，另一个是VL)。所述两个半抗体通过Fc结构域配对，因此VH和VL缔和以形成完整的抗原结合Fv结构域。
所述BBM可以是单链，如图1X所示。图1X的BBM包含通过接头连接的三个scFv结构域。
在图1G-1Z所示的构型中，X、Y和A中的每一个代表ABM1或ABM2，其条件是所述BBM包含至少ABM1和至少一个ABM2。因此，所述三价MBM将包括一个或两个ABM1和一个或两个ABM2。在一些实施例中，三价BBM包含两个ABM1和一个ABM2。在其他实施例中，本披露的三价BBM包含一个ABM1和两个ABM2。
因此，在本披露中提供了如图1G至1Z中任一个所示的三价BBM，其中X是ABM1，Y是ABM1并且A是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T1”)。
本披露进一步提供了如图1G至1Z中任一个所示的三价BBM，其中X是ABM1，Y是ABM2并且A是ABM1(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T2”)。
本披露进一步提供了如图1G至1Z中任一个所示的三价BBM，其中X是ABM2，Y是ABM1并且A是ABM1(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T3”)。
本披露进一步提供了如图1G至1Z中任一个所示的三价BBM，其中X是ABM1，Y是ABM2并且A是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T4”)。
本披露进一步提供了如图1G至1Z中任一个所示的三价BBM，其中X是ABM2，Y是ABM1并且A是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T5”)。
本披露进一步提供了如图1G至1Z中任一个所示的三价BBM，其中X是ABM2，Y是ABM2并且A是ABM1(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T6”)。
7.5.3.示例性四价BBM
所述BBM可以是四价的，即，它们具有四个抗原结合结构域，其中一个、两个或三个结合CD19(ABM1)并且其中一个、两个或三个结合第二靶抗原(ABM2)，例如，TCR复合物的组分。
示例性四价BBM构型示出于图1AA-1AH中。
如图1AA-1AH所描绘的，四价BBM可以包含两个半抗体，其中每个包含两个完整的ABM，所述两个半抗体通过Fc结构域配对。
在图1AA的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1AB的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1AC的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv、Fab、和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1AD的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和第二Fab，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、Fc区、和第二Fab。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1AE的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv、第二scFv、和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、第二scFv、和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1AF的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1AG的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、Fc区、和Fab。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1AH的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv、Fc区、和Fab，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、Fc区、和Fab。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图1AA-1AH所示的构型中，X、Y、A、和B中的每一个代表ABM1或ABM2(尽管不必须以这样的顺序)，并且其条件是所述BBM包含至少一个ABM1和至少一个ABM2。因此，所述四价ABM将包括一个、两个或三个ABM1和一个、两个、或三个ABM2。在一些实施例中，四价BBM包含三个ABM1和一个ABM2。在其他实施例中，四价BBM包含两个ABM1和两个ABM2。在又其他实施例中，四价BBM包含一个ABM1和三个ABM2。
因此，在本披露中提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中X是ABM1并且Y、A、和B中的每一个是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 1”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中Y是ABM1并且X、A、和B中的每一个是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 2”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中A是ABM1并且X、Y、和B中的每一个是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 3”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中B是ABM1并且X、Y、和A中的每一个是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 4”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中X和Y均是ABM1并且A和B均是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 5”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中X和A均是ABM1并且Y和B均是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 6”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中X和B均是ABM1并且Y和A均是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 7”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中Y和A均是ABM1并且X和B均是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 8”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中Y和B均是ABM1并且X和A均是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 9”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中的任一个所示的四价BBM，其中A和B均是ABM1并且X和Y均是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 10”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中任一个所示的四价BBM，其中X、Y、和A中的每一个是ABM1并且B是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 11”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中任一个所示的四价BBM，其中X、Y、和B中的每一个是ABM1并且A是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 12”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中任一个所示的四价BBM，其中X、A、和B中的每一个是ABM1并且Y是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 13”)。
本披露进一步提供了如图1AA-1AH中任一个所示的四价BBM，其中Y、A、和B中的每一个是ABM1并且X是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“Tv 14”)。
7.6.三特异性结合分子构型
示例性TBM构型示出于图2中。图2A示出了图2B-1V中所示TBM构型的组分。scFv、Fab、基于非免疫球蛋白的ABM、和Fc各自可以具有针对7.3节和7.4节中的这些组分所述的特征。图2示出的TBM构型的组分可以通过7.3节和7.4节中所述的任何方法(例如，通过直接键、ABM接头、二硫键、用杵臼结构相互作用修饰的Fc结构域等)彼此缔和。图2中示出的多种组分的方向和缔和仅仅为示例性的；如技术人员将理解的，其他的方向和缔合可以是合适的(例如，在7.3节和7.4节中所述)。
TBM不限于图2中示出的构型。可以使用的其他构型是本领域技术人员已知的。参见例如，WO 2014/145806；WO 2017/124002；Liu等人,2017,Front Immunol.[免疫学前沿]8:38；Brinkmann&Kontermann,2017,mAbs 9:2,182-212；US 2016/0355600；Klein等人,2016,MAbs 8(6):1010-20；和US 2017/0145116。
7.6.1.示例性三价TBM
本披露的TBM可以是三价的，即，它们具有三个抗原结合结构域，其中一个结合CD19，其中一个结合TCR复合物的组分，并且其中一个结合CD2或TAA。
示例性三价TBM构型示出于图2B至2P中。
如图2B-2K和2N-2P中所描绘，TBM可以包含两个半抗体，其中一个包含两个ABM并且另一个包含一个ABM，所述两个半抗体通过Fc结构域配对。
在图2B的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2C的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含两个Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2D的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2E的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含两个Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2F的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv、Fc区、和Fab，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2G的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、Fc区、和scFV。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2H的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含两个Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含基于非免疫球蛋白的ABM和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2I的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、scFv、和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含基于非免疫球蛋白的ABM和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2J的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、基于非免疫球蛋白的ABM和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2K的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、Fc区、和第二scFv。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2N的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2O的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和scFab，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2P的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、基于非免疫球蛋白的ABM、和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
可替代地，如图2L所描述，三价TBM可以包含两个半抗体，其中每个包含一个完整的ABM和另一个ABM的一部分(一个是VH，另一个是VL)。所述两个半抗体通过Fc结构域配对，因此VH和VL缔和以形成完整的抗原结合Fv结构域。
所述TBM可以是单链，如图2M所示。图2M的TBM包含通过接头连接的三个scFv结构域。
在图2B-2P所示的每种构型中，被指定为X、Y和Z的每个结构域代表ABM1、ABM2、或ABM3，尽管不一定按该顺序。换句话说，X可以是ABM1、ABM2、或ABM3，Y可以是ABM1、ABM2、或ABM3，并且Z可以是ABM1、ABM2、或ABM3，只要TBM包含一个ABM1、一个ABM2、和一个ABM3。
因此，在本披露中提供了如图2B至2P中任一个所示的三价TBM，其中X是ABM1，Y是ABM3并且Z是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T1”)。
本披露还提供了如图2B至2P中任一个所示的三价TBM，其中X是ABM1，Y是ABM2并且Z是ABM3(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T2”)。
本披露进一步提供了如图2B至2P中任一个所示的三价TBM，其中X是ABM3，Y是ABM1并且Z是ABM2(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T3”)。
本披露又进一步提供了如图2B至2P中任一个所示的三价TBM，其中X是ABM3，Y是ABM2并且Z是ABM1(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T4”)。
本披露又进一步提供了如图2B至2P中任一个所示的三价TBM，其中X是ABM2，Y是ABM1并且Z是ABM3(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T5”)。
本披露又进一步提供了如图2B至2P中任一个所示的三价TBM，其中X是ABM2，Y是ABM3并且Z是ABM1(为了方便起见，ABM的这一构型被指定为“T6”)。
7.6.2.示例性四价TBM
本披露的TBM可以是四价的，即，它们具有四个抗原结合结构域，其中一个或两个结合CD19，其中一个或两个结合TCR复合物的组分，并且其中一个或两个结合CD2或TAA。
示例性四价TBM构型示出于图2Q-2S中。
如图2Q-2S所描绘的，四价TBM可以包含两个半抗体，其中每个包含两个完整的ABM，所述两个半抗体通过Fc结构域配对。
在图2Q的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和第二Fab，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、Fc区、和第二Fab。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2R的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2S的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv，并且所述第二(或右)半抗体包含scFv、Fc区、和Fab。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2Q-2S所示的构型中，X、Y、Z、和A中的每一个代表ABM1、ABM2、或ABM3(尽管不必须以这样的顺序)，并且其条件是所述TBM包含至少一个ABM1、至少一个ABM2、和至少一个ABM3。因此，所述四价ABM将包括针对CD19、TCR复合物的组分、和CD2或TAA之一的两个ABM。在一些情况下，四价TBM具有两个CD19 ABM。
因此，本披露提供了如图2Q-2S中任一个所示的四价TBM，其中X、Y、Z、和A是针对CD19、TCR复合物的组分和CD2或TAA的ABM，如表9所示。
Figure BDA0003360067460001141
7.6.3.示例性五价TBM
本披露的TBM可以是五价的，即，它们具有五个抗原结合结构域，其中一个、两个、或三个结合CD19，其中一个、两个、或三个结合TCR复合物的组分，并且其中一个、两个或三个结合CD2或TAA。
示例性五价TBM构型示出于图2T中。
如图2T中所描绘，五价TBM可以包含两个半抗体，其中一个包含两个完整的ABM并且另一个包含一个完整的ABM，所述两个半抗体通过Fc结构域配对。
在图2T的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、scFv和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、Fc区、和scFv。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2T所示的构型中，X、Y、Z、A、和B中的每一个代表ABM1、ABM2、或ABM3(尽管不必须以这样的顺序)，并且其条件是所述TBM包含至少一个ABM1、一个ABM2、和一个ABM3。因此，所述五价TBM可以包括针对CD19、TCR复合物的组分、和CD2或TAA中两个的两个ABM，或针对CD19、TCR复合物的组分、和CD2或TAA中之一的三个ABM。在一些情况下，五价TBM具有两个或三个CD19 ABM。在一些实施例中，五价TBM具有三个ABM1、一个ABM2和一个ABM3。
因此，在本披露中提供了如图2T所示的五价TBM，其中X、Y、Z、A、和B是针对CD19、TCR复合物的组分、和CD2或TAA的ABM，如表10所示。
Figure BDA0003360067460001151
Figure BDA0003360067460001161
Figure BDA0003360067460001171
Figure BDA0003360067460001181
7.6.4.示例性六价TBM
本披露的TBM可以是六价的，即，它们具有六个抗原结合结构域，其中一个、两个、三个、或四个结合CD19，其中一个、两个、三个、或四个结合TCR复合物的组分，并且其中一个、两个、三个或四个结合CD2或TAA。
示例性六价TBM构型示出于图2U-2V中。
如图2U-2V中所描绘，五价TBM可以包含两个半抗体，其中一个包含两个完整的ABM并且另一个包含一个完整的ABM，所述两个半抗体通过Fc结构域配对。
在图2U的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含Fab、第二Fab、Fc区、和scFv，并且所述第二(或右)半抗体包含Fab、第二Fab、Fc区、和scFv。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2V的实施例中，所述第一(或左)半抗体包含第一Fv、第二Fv、第三Fv、和Fc区，并且所述第二(或右)半抗体包含第一Fv、第二Fv、第三Fv、和Fc区。所述第一和第二半抗体通过形成Fc结构域的Fc区缔和。
在图2U-2V所示的构型中，X、Y、Z、A、B、和C中的每一个代表ABM1、ABM2、或ABM3(尽管不必须以这样的顺序)，并且其条件是所述TBM包含至少一个ABM1、一个ABM2、和一个ABM3。因此，所述六价TBM可以包括(i)针对CD19、TCR复合物的组分、和CD2或TAA中每一个的两个ABM，(ii)针对CD19、TCR复合物的组分、和CD2或TAA中之一的三个ABM，或(iii)针对CD19、TCR复合物的组分、和CD2或TAA中之一的四个ABM。例如，六价ABM可以包括针对CD19的三个ABM、针对CD2或TAA的两个ABM以及针对TCR复合物的组分的一个ABM。又如，六价ABM可以包括针对CD19的三个ABM、针对TCR复合物的组分的两个ABM以及针对CD2或TAA的一个ABM。在一些情况下，六价TBM具有两个、三个、或四个CD19ABM。在一些实施例中，六价TBM具有三个CD19 ABM。在其他实施例中，六价TBM具有四个CD19 ABM。
因此，在本披露中提供了如图2U-2V中任一个所示的六价TBM，其中X、Y、Z、A、B、和C是针对CD19、TCR复合物的组分、和CD2或TAA的ABM，如表11所示。
Figure BDA0003360067460001191
Figure BDA0003360067460001201
Figure BDA0003360067460001211
Figure BDA0003360067460001221
Figure BDA0003360067460001231
Figure BDA0003360067460001241
Figure BDA0003360067460001251
Figure BDA0003360067460001261
Figure BDA0003360067460001271
Figure BDA0003360067460001281
Figure BDA0003360067460001291
Figure BDA0003360067460001301
7.7.TCR ABM
本披露的MBM含有特异性结合至CD19的ABM和对不同抗原具有特异性的ABM2。在本披露的BBM、1型TBM和2型TBM中，ABM2可以结合至TCR复合物的组分。所述TCR是二硫键连接的膜锚定异二聚体蛋白，其通常由作为与不变CD3链分子的复合物的部分表达的高可变α和β链组成。表达这一受体的T细胞被称为α:β(或αβ)T细胞，尽管少数T细胞(称为γδT细胞)表达替代的受体(由可变γ和δ链形成)。
在实施例中，MBM含有特异性结合至CD3的ABM。
7.7.1.CD3 ABM
所述MBM可以含有特异性结合至CD3的ABM。所述术语“CD3”是指T细胞受体的分化簇3共受体(或共受体复合物、或共受体复合物的多肽链)。NCBI登录P04234、P07766和P09693中提供了人CD3的多肽链的氨基酸序列。CD3蛋白质还可以包括变体。CD3蛋白质还可以包括片段。CD3蛋白质还包括CD3氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于N-连接的和O-连接的糖基化。
在一些实施例中，MBM可以包含ABM，所述ABM是抗CD3抗体(例如，如在US 2016/0355600、WO 2014/110601、和WO 2014/145806中所述的)或其抗原结合结构域。表12A中提供了可以在MBM中使用的示例性抗CD3 VH、VL、和scFV序列。
Figure BDA0003360067460001311
Figure BDA0003360067460001321
Figure BDA0003360067460001331
Figure BDA0003360067460001341
Figure BDA0003360067460001351
Figure BDA0003360067460001361
Figure BDA0003360067460001371
Figure BDA0003360067460001381
如由卡巴特编号方案(卡巴特等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学重要性的蛋白质序列],第5版,公共卫生事业部,美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达市)、乔西亚编号方案(Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol[分子生物学杂志]273:927-948)，以及卡巴特和乔西亚编号的组合定义的许多CD3结合物的CDR序列分别在表12B-12D中提供。
Figure BDA0003360067460001382
Figure BDA0003360067460001391
Figure BDA0003360067460001401
Figure BDA0003360067460001411
Figure BDA0003360067460001421
Figure BDA0003360067460001431
Figure BDA0003360067460001441
Figure BDA0003360067460001451
Figure BDA0003360067460001461
Figure BDA0003360067460001471
Figure BDA0003360067460001481
Figure BDA0003360067460001491
Figure BDA0003360067460001501
Figure BDA0003360067460001511
Figure BDA0003360067460001521
Figure BDA0003360067460001531
Figure BDA0003360067460001541
Figure BDA0003360067460001542
Figure BDA0003360067460001551
Figure BDA0003360067460001552
Figure BDA0003360067460001561
Figure BDA0003360067460001571
Figure BDA0003360067460001581
在一些实施例中，MBM可以包含CD3 ABM，所述CD3 ABM包含如由卡巴特编号定义的CD3-1至CD3-130中任一项的CDR(例如，如在表12B中所列出)。在其他实施例中，MBM可以包含CD3 ABM，所述CD3 ABM包含如由乔西亚编号定义的CD3-1至CD3-130中任一项的CDR(例如，如在表12C中所列出)。在又其他实施例中，MBM可以包含CD3 ABM，所述CD3 ABM包含如由卡巴特和乔西亚编号的组合定义的CD3-1至CD3-130中任一项的CDR(例如，如在表12D中所列出)。
在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-1的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-2的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-3的CDR序列。在一些实施例中，CD3ABM包含CD3-4的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-5的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-6的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-7的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-8的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-9的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-10的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-11的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-12的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-13的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-14的CDR序列。在一些实施例中，CD3ABM包含CD3-15的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-16的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-17的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-18的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-19的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-20的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-21的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-22的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-23的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-24的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-25的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-26的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-27的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-28的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-29的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-30的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-31的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-32的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-33的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-34的CDR序列。在一些实施例中，CD3ABM包含CD3-35的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-36的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-37的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-38的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-39的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-40的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-41的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-42的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-43的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-44的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-45的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-46的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-47的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-48的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-49的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-50的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-51的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-52的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-53的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-54的CDR序列。在一些实施例中，CD3ABM包含CD3-55的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-56的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-57的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-58的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-59的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-60的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-61的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-62的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-63的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-64的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-65的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-66的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-67的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-68的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-69的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-70的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-71的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-72的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-73的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-74的CDR序列。在一些实施例中，CD3ABM包含CD3-75的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-76的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-77的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-78的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-79的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-80的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-81的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-82的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-83的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-84的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-85的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-86的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-87的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-88的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-89的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-90的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-91的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-92的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-93的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-94的CDR序列。在一些实施例中，CD3ABM包含CD3-95的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-96的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-97的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-98的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-99的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-100的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-101的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-102的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-103的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-104的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-105的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-106的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-107的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-108的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-109的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-110的CDR序列。在一些实施例中，CD3ABM包含CD3-111的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-112的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-113的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-114的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-115的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-116的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-117的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-118的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-119的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-120的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-121的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-122的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-123的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-124的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-125的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-126的CDR序列。在一些实施例中，CD3ABM包含CD3-127的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-126的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-127的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-128的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-129的CDR序列。在一些实施例中，CD3 ABM包含CD3-130的CDR序列。
MBM可以包含CD3-1至CD3-130中任一项的完整重和轻可以变序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-1的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-1的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-2的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-3的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3ABM，其包含CD3-4的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-5的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-6的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-7的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-8的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-9的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-10的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-11的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-12的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-13的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-14的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-15的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-16的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-17的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3ABM，其包含CD3-18的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-19的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-20的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-21的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-22的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-23的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-24的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-25的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-26的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-27的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-28的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-129的VH和VL序列。在一些实施例中，MBM包含CD3 ABM，其包含CD3-130的VH和VL序列。
除了表12B-12D中所述的CDR组(即，针对CD3-1至CD3-130中每个的六个CDR的组)，本披露提供了变体CDR组。在一个实施例中，只要所述CD3 ABM仍然能够结合至所述靶抗原，一组6个CDR与表12B-12D中所述的CDR组可以具有1、2、3、4或5个氨基酸变化，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物膜层干涉技术，例如，Octet测定)测定中的至少一种所测量的。
除了披露于表12A中的可变重和可变轻结构域(其形成了针对CD3的ABM)，本披露提供了变体VH和VL结构域。在一个实施例中，只要所述ABM仍然能够结合至靶抗原，则变体VH和VL结构域各自与表12A中所列出的VH和VL结构域可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的变化，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物膜层干涉技术，例如，Octet测定)测定中的至少一种所测量的。在另一个实施例中，只要所述ABM仍然能够结合至所述靶抗原，则变体VH和VL与披露于表12A中的各个VH或VL是至少90％、95％、97％、98％或99％同一的，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物膜层干涉技术，例如，Octet测定)测定中的至少一种所测量的。
在一些实施例中，MBM可以包含ABM，所述ABM是如在WO 2020/052692中所述的CD3结合分子或其抗原结合结构域。表AA至表AJ-2(统称为“表A”)列出了可以包括在CD3结合ABM中的CD3结合序列的序列。
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表AA中的组C1 CDR序列是基于CD3结合分子NOV292、NOV589、NOV567和在结合物名称中包括“sp11a”的CD3结合分子的卡巴特CDR序列、乔西亚CDR序列、IMGT CDR序列、及其组合。表AB中的组C2 CDR序列是基于CD3结合分子NOV453、NOV229、NOV580、NOV221和在结合物名称中包括“sp9a”的CD3结合分子的卡巴特CDR序列、乔西亚CDR序列、IMGT CDR序列、及其组合。表AC中的组C3 CDR序列是基于CD3结合分子NOV123、sp10b、NOV110、和NOV832的卡巴特CDR序列、乔西亚CDR序列、IMGT CDR序列、及其组合。
WO 2020/052692的实例中所述的CD3结合分子的具体CDR序列列于表AB-1至表AH-2中。WO 2020/052692中所述的VH和VL序列分别列于表AJ-1和表AJ-2中。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含具有表AA、表AB、或表AC中列出的任一CDR共有序列的氨基酸序列的重链CDR。在具体的实施例中，CD3 ABM可以包含(或可替代地，由以下组成：)选自表AA、表AB、或表AC中所述的重链CDR中的一个、两个、三个、或更多个重链CDR。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含具有表AA、表AB、或表AC中列出的任一CDR共有序列的氨基酸序列的轻链CDR。在具体的实施例中，CD3 ABM可以包含(或可替代地，由以下组成：)选自表AA、表AB、或表AC中所述的轻链CDR中的一个、两个、三个、或更多个轻链CDR。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AA中所列出的CDR-H1序列、CDR-H2序列、CDR-H3序列、CDR-L1序列、CDR-L2序列和CDR-L3序列。
在一些实施例中，在表AA中指定为X1的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AA中指定为X1的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AA中指定为X2的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X2的氨基酸是R。在一些实施例中，在表AA中指定为X3的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AA中指定为X3的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AA中指定为X3的氨基酸是Q。在一些实施例中，在表AA中指定为X4的氨基酸是H。在一些实施例中，在表AA中指定为X4的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X5的氨基酸是M。在一些实施例中，在表AA中指定为X5的氨基酸是L。在一些实施例中，在表AA中指定为X6的氨基酸是K。在一些实施例中，在表AA中指定为X6的氨基酸是R。在一些实施例中，在表AA中指定为X7的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X7的氨基酸是K。在一些实施例中，在表AA中指定为X55的氨基酸是F。在一些实施例中，在表AA中指定为X55的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AA中指定为X55的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X8的氨基酸是W。在一些实施例中，在表AA中指定为X8的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AA中指定为X8的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X8的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AA中指定为X9的氨基酸是W。在一些实施例中，在表AA中指定为X9的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AA中指定为X9的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X9的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AA中指定为X10的氨基酸是H。在一些实施例中，在表AA中指定为X10的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AA中指定为X11的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X11的氨基酸是G。在一些实施例中，在表AA中指定为X12的氨基酸是I。在一些实施例中，在表AA中指定为X12的氨基酸是L。在一些实施例中，在表AA中指定为X13的氨基酸是V。在一些实施例中，在表AA中指定为X13的氨基酸是G。在一些实施例中，在表AA中指定为X14的氨基酸是R。在一些实施例中，在表AA中指定为X14的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AA中指定为X15的氨基酸是D。在一些实施例中，在表AA中指定为X15的氨基酸是E。在一些实施例中，在表AA中指定为X15的氨基酸是L。在一些实施例中，在表AA中指定为X16的氨基酸是G。在一些实施例中，在表AA中指定为X16的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AA中指定为X16的氨基酸是E。在一些实施例中，在表AA中指定为X17的氨基酸是R。在一些实施例中，在表AA中指定为X17的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X18的氨基酸是V。在一些实施例中，在表AA中指定为X18的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AA中指定为X19的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AA中指定为X19的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AA中指定为X20的氨基酸是R。在一些实施例中，在表AA中指定为X20的氨基酸是L。在一些实施例中，在表AA中指定为X21的氨基酸是F。在一些实施例中，在表AA中指定为X21的氨基酸是E。在一些实施例中，在表AA中指定为X22的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X22的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AA中指定为X23的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X23的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AA中指定为X24的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AA中指定为X24的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AA中指定为X25的氨基酸是H。在一些实施例中，在表AA中指定为X25的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AA中指定为X26的氨基酸是F。在一些实施例中，在表AA中指定为X26的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AA中指定为X27的氨基酸是W。在一些实施例中，在表AA中指定为X27的氨基酸是Y。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C1-1。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C1-2。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C1-3。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C1-4。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C1-5。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C1-6。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C1-7。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H3序列C1-8。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H3序列C1-9。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H3序列C1-10。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H3序列C1-11。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C1-12。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C1-13。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C1-14。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C1-15。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C1-16。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C1-17。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L2序列C1-18。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L2序列C1-19。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L3序列C1-20。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L3序列C1-21。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L3序列C1-22。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L3序列C1-23。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AB中所列出的CDR-H1序列、CDR-H2序列、CDR-H3序列、CDR-L1序列、CDR-L2序列和CDR-L3序列。
在一些实施例中，在表AB中指定为X28的氨基酸是V。在一些实施例中，在表AB中指定为X28的氨基酸是I。在一些实施例中，在表AB中指定为X29的氨基酸是F。在一些实施例中，在表AB中指定为X29的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AB中指定为X30的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AB中指定为X30的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AB中指定为X31的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AB中指定为X31的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AB中指定为X32的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AB中指定为X32的氨基酸是K。在一些实施例中，在表AB中指定为X33的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AB中指定为X33的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AB中指定为X34的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AB中指定为X34的氨基酸是R。在一些实施例中，在表AB中指定为X35的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AB中指定为X35的氨基酸是G。在一些实施例中，在表AB中指定为X36的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AB中指定为X36的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AB中指定为X37的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AB中指定为X37的氨基酸是T。在一些实施例中，在表AB中指定为X37的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AB中指定为X38的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AB中指定为X38的氨基酸是D。在一些实施例中，在表AB中指定为X39的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AB中指定为X39的氨基酸是K。在一些实施例中，在表AB中指定为X40的氨基酸是D。在一些实施例中，在表AB中指定为X40的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AB中指定为X41的氨基酸是H。在一些实施例中，在表AB中指定为X41的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AB中指定为X42的氨基酸是Q。在一些实施例中，在表AB中指定为X42的氨基酸是E。在一些实施例中，在表AB中指定为X43的氨基酸是R。在一些实施例中，在表AB中指定为X43的氨基酸是S。在一些实施例中，在表AB中指定为X43的氨基酸是G。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C2-1。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C2-2。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C2-3。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C2-4。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C2-5。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C2-6。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C2-7。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H3序列C2-8。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H3序列C2-9。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C2-10。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C2-11。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C2-12。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L2序列C2-13。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L2序列C2-14。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L2序列C2-15。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L3序列C2-16。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L3序列C2-17。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AC中所列出的CDR-H1序列、CDR-H2序列、CDR-H3序列、CDR-L1序列、CDR-L2序列和CDR-L3序列。
在一些实施例中，在表AC中指定为X44的氨基酸是G。在一些实施例中，在表AC中指定为X44的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AC中指定为X45的氨基酸是H。在一些实施例中，在表AC中指定为X45的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AC中指定为X46的氨基酸是D。在一些实施例中，在表AC中指定为X46的氨基酸是G。在一些实施例中，在表AC中指定为X47的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AC中指定为X47的氨基酸是G。在一些实施例中，在表AC中指定为X48的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AC中指定为X48的氨基酸是K。在一些实施例中，在表AC中指定为X49的氨基酸是V。在一些实施例中，在表AC中指定为X49的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AC中指定为X50的氨基酸是N。在一些实施例中，在表AC中指定为X50的氨基酸是V。在一些实施例中，在表AC中指定为X51的氨基酸是A。在一些实施例中，在表AC中指定为X51的氨基酸是V。在一些实施例中，在表AC中指定为X52的氨基酸是Y。在一些实施例中，在表AC中指定为X52的氨基酸是F。在一些实施例中，在表AC中指定为X53的氨基酸是I。在一些实施例中，在表AC中指定为X53的氨基酸是V。在一些实施例中，在表AC中指定为X54的氨基酸是I。在一些实施例中，在表AC中指定为X54的氨基酸是H。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C3-1。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C3-2。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C3-3。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H1序列C3-4。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C3-5。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C3-6。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H2序列C3-7。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H3序列C3-8。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-H3序列C3-9。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C3-10。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C3-11。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L1序列C3-12。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L2序列C3-13。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L2序列C3-14。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L3序列C3-15。在一些实施例中，CD3 ABM可以包含CDR-L3序列C3-16。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AD-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及表AD-2中所列出的对应CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AE-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及表AE-2中所列出的对应CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AF-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及表AF-2中所列出的对应CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AG-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及表AG-2中所列出的对应CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AH-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及表AH-2中所列出的对应CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含表AI-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及表AI-2中所列出的对应CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含具有表AB-1、表AC-1、表AD-1、表AE-1、表AF-1、表AG-1、表AH-1、或表AI-1中列出的任一CDR的氨基酸序列的重链CDR。在具体的实施例中，CD3 ABM可以包含(或可替代地，由以下组成：)选自表AB-1、表AC-1、表AD-1、表AE-1、表AF-1、表AG-1、表AH-1、和表AI-1中所述的重链CDR中的一个、两个、三个、或更多个重链CDR。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含具有表AB-2、表AC-2、表AD-2、表AE-2、表AF-2、表AG-2、表AH-2、或表AI-2中列出的任一CDR的氨基酸序列的轻链CDR。在具体的实施例中，CD3 ABM可以包含(或可替代地，由以下组成：)选自表AB-2、表AC-2、表AD-2、表AE-2、表AF-2、表AG-2、表AH-2、和表AI-2中所述的轻链CDR中的一个、两个、三个、或更多个轻链CDR。
其他CD3 ABM包括已突变的氨基酸，但其CDR区与表A中所述的CDR序列仍然具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些实施例中，此类CD3 ABM包括突变型氨基酸序列，其中当与表A中所述的CDR序列相比时，CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已突变。
在一些实施例中，CD3 ABM可以包含具有表A中所述的任何VH和/或VL结构域的氨基酸序列的VH和/或VL结构域。其他CD3 ABM包括VH和/或VL结构域，所述结构域包含与表A中所述的VH和/或VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CD3 ABM包括VH和/或VL结构域，其中当与表A中所述的序列中所描述的VH和/或VL结构域相比时，不超过1、2、3、4或5个氨基酸已突变，同时保留了基本上相同的治疗活性。
VH和VL序列(氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列)可以“混合并匹配”以产生其他的CD3 ABM。可以使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA测定法)测试这种“混合且匹配的”CD3 ABM。当链被混合且匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列应当用结构上相似的VH序列置换。来自特定VH/VL配对的VL序列应当用结构上相似的VL序列置换。
因此，在一个实施例中，CD3 ABM包含：重链可变区(VH)，其包含选自表A-J1中所述的任一VH序列的氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含表A-J2中所述的氨基酸序列。
在一些实施例中，特异性结合至人CD3的所述抗原结合结构域是基于非免疫球蛋白的并且相反地，衍生自非抗体支架蛋白，例如在7.3.2节中所述的非抗体支架蛋白之一。在实施例中，特异性结合至人CD3的抗原结合结构域包含WO 2017/013136中所述的Affilin-144160。Affilin-144160具有以下氨基酸序列：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQWLWFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLKLWLVDKAAMQIFVYTRTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIALESGLHLVLRLRAA(SEQ ID NO:305)。
7.7.2.TCR-α/βABM
MBM可以含有特异性结合至TCR-α链、TCR-β链、或TCR-αβ二聚体的ABM。示例性抗TCR-α/β抗体是已知的(参见例如，US 2012/0034221；Borst等人,1990,Hum Immunol.[人类免疫学]29(3):175-88(描述了抗体BMA031))。表13中提供了抗体BMA031的VH、VL、和卡巴特CDR序列。
Figure BDA0003360067460002601
Figure BDA0003360067460002611
在实施例中，TCR ABM可以包含抗体BMA031的CDR序列。在其他实施例中，TCR ABM可以包含抗体BMA031的VH和VL序列。
7.7.3.TCR-γ/δABM
MBM可以含有特异性结合至TCR-γ链、TCR-δ链、或TCR-γδ二聚体的ABM。示例性抗TCR-γ/δ抗体是已知的(参见例如，美国专利号5,980,892(描述了δTCS1，其通过以登录号HB 9578保藏于ATCC的杂交瘤产生))。
7.8.CD2 ABM
7.8.1.基于免疫球蛋白的CD2 ABM
1型TBM可以包含为抗CD2抗体或其抗原结合结构域的ABM。示例性抗CD2抗体是已知的(参见例如，US 6,849,258、CN 102827281 A、US 2003/0139579 A1、和US 5,795,572)。表14提供了可以包含在抗CD2抗体或其抗原结合片段中的示例性CDR、VH、和VL序列，以用于本披露的MBM。
Figure BDA0003360067460002621
Figure BDA0003360067460002631
在一些实施例中，CD2 ABM包含CD2-1的CDR序列(SEQ ID NO:312-317)。在一些实施例中，CD2 ABM包含CD2-1的重链和轻链可变序列(分别为SEQ ID NO:318和319)。在一些实施例中，CD2 ABM包含hu1CD2-1的重链和轻链可变序列(分别为SEQ ID NO:320和321)。在一些实施例中，CD2 ABM包含hu2CD2-1的重链和轻链可变序列(分别为SEQ ID NO:318和321)。
在其他实施例中，CD2 ABM可以包含由杂交瘤产生的抗体9D1的CDR序列，所述杂交瘤于2012年5月16日保藏于中国培养物保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC6132，并且其描述于CN 102827281 A中。在其他实施例中，CD2 ABM可以包含由杂交瘤产生的抗体LO-CD2b的CDR序列，所述杂交瘤于1999年6月22日保藏于美国模式培养物保藏所，其保藏号为PTA-802，并且其描述于US 2003/0139579 A1中。在又其他实施例中，CD2 ABM可以包含由在重组大肠杆菌中表达克隆的构建体产生的CD2 SFv-Ig的CDR序列，所述重组大肠杆菌于1993年4月9日保藏于ATCC，其保藏号为69277，并且其描述于US 5,795,572中。
在其他实施例中，CD2 ABM可以包含抗体9D1的VH和VL序列。在其他实施例中，CD2ABM可以包含抗体LO-CD2b的VH和VL序列。在又其他实施例中，CD2 ABM可以包含由在重组大肠杆菌中表达克隆的构建体产生的CD2 SFv-Ig的VH和VL序列，所述重组大肠杆菌具有ATCC保藏号69277。
7.8.2.基于CD58的CD2 ABM
在某些方面，本披露提供了1型TBM，其包含作为配体的CD2ABM。所述CD2 ABM特异性结合至人CD2，其天然配体是CD58，也称为LFA-3。CD58/LFA-3蛋白是在多种细胞类型表面上表达(Dustin等人,1991,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度综述]9:27)并在以抗原依赖性和抗原非依赖性两种方式介导T细胞与APC的相互作用中发挥作用(Wallner等人,1987,J.Exp.Med.[实验医学杂志]166:923)的糖蛋白。因此，在某些方面，所述CD2 ABM是CD58部分。如本文所用，CD58部分包含与CD58的CD2结合部分具有至少70％序列同一性(例如，与CD58的CD2结合部分具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的氨基酸序列。人CD58的序列具有Uniprot标识符P19256(www.uniprot.org/uniprot/P19256)。已经确定，含有全长CD58的氨基酸残基30-123(即，在下表15中指定为CD58-6的序列)的CD58片段足以结合至CD2。Wan等人,1999,Cell[细胞]97:791-803。因此，在某些方面，CD58部分包含与CD58的氨基酸30-123具有至少70％序列同一性(例如，与指定为CD58-6的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的氨基酸序列。
CD58与CD2之间的相互作用已经通过x射线结晶学和分子模型绘制出来。残基E25、K29、K30、K32、D33、K34、E37、D84和K87的取代(其中编号是指成熟多肽中的)减少了与CD2的结合。Ikemizu等人,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]96:4289-94。因此，在一些实施例中，所述CD58部分保留E25、K29、K30、K32、D33、K34、E37、D84和K87处的野生型残基。
相比之下，下列取代(其中编号是指全长多肽)不影响与CD2的结合：F29S；V37K；V49Q；V86K；T113S；和L121G。因此，CD58部分可以包括一个、两个、三个、四个、五个或所有六个前述取代。
在一些实施例中，所述CD58部分被工程化以包括一对半胱氨酸取代基，其在重组表达时产生二硫桥。可以被半胱氨酸取代以在表达时形成二硫桥的示例性氨基酸对(其中编号是指全长多肽)是(a)V45C取代和M105C取代；(b)V54C取代和G88C取代；(c)V45C取代和M114C取代；以及(d)W56C取代和L90C取代。
示例性CD58部分提供在以下表15中：
Figure BDA0003360067460002651
Figure BDA0003360067460002661
7.8.3.基于CD48的CD2 ABM
在某些方面，本披露提供了MBM，其包含作为CD48部分的CD2ABM。如本文所用，CD48部分包含与CD48的CD2结合部分具有至少70％序列同一性(例如，与CD48的CD2结合部分具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的氨基酸序列。人CD48的序列具有Uniprot标识符P09326(www.uniprot.org/uniprot/P09326)，其包括信号肽(氨基酸1-26)和GPI锚(氨基酸221-243)。在某些方面，CD48部分包含与由具有Uniprot标识符P09326的氨基酸27-220组成的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的氨基酸序列。人CD48具有Ig样C2 I型结构域(具有Uniprot标识符P09326的氨基酸29-127)和Ig样C2 2型结构域(具有Uniprot标识符P09326的氨基酸132-212)。因此，在一些实施例中，CD48部分包含与由具有Uniprot标识符P09326的氨基酸29-212组成的氨基酸序列、与C2 I型结构域(具有Uniprot标识符P09326的氨基酸29-127)和/或与Ig样C2 2型结构域(具有Uniprot标识符P09326的氨基酸132-212)具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD48部分可以相对于具有Uniprot标识符P09326的序列包含一种或多种天然变体。例如，CD48部分可以包括E102Q取代。又如，CD48部分可以包含对应于CD-48同种型或其CD2结合部分(例如，具有Uniprot标识符P09326-2的同种型或其CD2结合部分)的氨基酸序列。
7.9.肿瘤相关抗原ABM
2型TBM可以包含特异性结合至肿瘤相关抗原(TAA)的ABM。在一些实施例中，所述TAA是人TAA。所述抗原可能存在或不存在于正常细胞上。在某些实施例中，与正常细胞相比，所述TAA在肿瘤细胞上优先表达或上调。在其他实施例中，所述TAA是谱系标记物。
在某些实施例中，与正常B细胞相比，所述TAA在癌性B细胞上表达或上调。在其他实施例中，所述TAA是B细胞谱系标记物。
预期任何类型的B细胞恶性肿瘤都可以被本披露的MBM靶向。可以被靶向的典型类型的B细胞恶性肿瘤包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、和多发性骨髓瘤。NHL的实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、纵隔灰区淋巴瘤(MGZL)、脾边缘区B细胞淋巴瘤、MALT的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、和原发性渗出性淋巴瘤。
除了CD19之外可以被MBM(例如，TBM)靶向的TAA的实例包括BCMA、CD20、CD22、CD123、CD33、CLL1、CD138(也称为Syndecan-1、SDC1)、CS1、CD38、CD133、FLT3、CD52、TNFRSF13C(TNF受体超家族成员13C，在本领域中也称为BAFFR：B细胞活化因子受体)、TNFRSF13B(TNF受体超家族成员13B，在本领域中也称为TACI：跨膜活化因子和CAML交互因子)、CXCR4(C-X-C基序趋化因子受体4)、PD-L1(程序性死亡配体1)、LY9(淋巴细胞抗原9，在本领域中也称为CD229)、CD200、FCGR2B(IgG受体IIb的Fc片段，在本领域中也称为CD32b)、CD21、CD23、CD24、CD40L、CD72、CD79a、和CD79b。在一些实施例中，所述TAA是BCMA。在一些实施例中，所述TAA是CD20。在一些实施例中，所述TAA是CD22。在一些实施例中，所述TAA是CD123。在一些实施例中，所述TAA是CD33。在一些实施例中，所述TAA是CLL1。在一些实施例中，所述TAA是CD138。在一些实施例中，所述TAA是CS1。在一些实施例中，所述TAA是CD38。在一些实施例中，所述TAA是CD133。在一些实施例中，所述TAA是FLT3。在一些实施例中，所述TAA是CD52。在一些实施例中，所述TAA是TNFRSF13C。在一些实施例中，所述TAA是TNFRSF13B。在一些实施例中，所述TAA是CXCR4。在一些实施例中，所述TAA是PD-L1。在一些实施例中，所述TAA是LY9。在一些实施例中，所述TAA是CD200。在一些实施例中，所述TAA是CD21。在一些实施例中，所述TAA是CD23。在一些实施例中，所述TAA是CD24。在一些实施例中，所述TAA是CD40L。在一些实施例中，所述TAA是CD72。在一些实施例中，所述TAA是CD79a。在一些实施例中，所述TAA是CD79b。
TAA结合ABM可以包含例如抗TAA抗体或其抗原结合片段。所述抗TAA抗体或抗原结合片段可以包含例如表16中所列出抗体的CDR序列。在一些实施例中，所述抗TAA抗体或其抗原结合结构域具有表16中所列出抗体的重链和轻链可变区序列。
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在某些实施例中，所述TAA选自BCMA和CD20。在一些实施例中，所述TAA是BCMA。“BCMA”是指B细胞成熟抗原。BCMA(也称为TNFRSF17、BCM或CD269)是肿瘤坏死受体(TNFR)家族的成员，并且主要在终末分化的B细胞(例如记忆B细胞和浆细胞)上表达。其配体包括B细胞活化因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。蛋白质BCMA由基因TNFRSF17编码。示例性BCMA序列可获得于Uniprot数据库，登录号为Q02223。
在某些方面，2型TBM包含特异性结合至BCMA的ABM3，例如抗BCMA抗体或其抗原结合结构域。所述抗BCMA抗体或其抗原结合结构域可以包含例如表17A-17G中所列出的CDR、VH、VL、或scFV序列。
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在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-1的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-2的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-3的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-4的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-5的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-6的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-7的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-8的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-9的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-10的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-11的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-12的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-13的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-14的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-15的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-16的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-17的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-18的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-19的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-20的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-21的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-22的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-23的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-24的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-25的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-26的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-27的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-28的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-29的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-30的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-31的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-32的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-33的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-34的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-35的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-36的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-37的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-38的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-39的CDR序列。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-40的CDR序列。
在一些实施例中，所述CDR由卡巴特编号定义，如在表17B和17E中所列出。在其他实施例中，所述CDR由乔西亚编号定义，如在表17C和17F中所列出。在又其他实施例中，所述CDR由卡巴特和乔西亚编号的组合定义，如在表17D和17G中所列出。
在一些实施例中，其中ABM3与BCMA结合的2型TBM可以包含BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和轻链可以变序列。
在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-1的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-2的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-3的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-4的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-5的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-6的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-7的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-8的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-9的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-10的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-11的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-12的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-13的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-14的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-15的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-16的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-17的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-18的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-19的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-20的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-21的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-22的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-23的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-24的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-25的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-26的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-27的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-28的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-29的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-30的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-31的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-32的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-33的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-34的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-35的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-36的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-37的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-38的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-39的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。在一些实施例中，所述ABM包含BCMA-40的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
7.10.核酸和宿主细胞
在另一方面，本披露提供了编码本披露的CD19结合分子的核酸(即，多核苷酸)。在一些实施例中，所述CD19结合分子由单个核酸编码。在其他实施例中，所述CD19结合分子由多个(例如两个、三个、四个或更多个)核酸编码。
单个核酸可以编码包含单一多肽链的CD19结合分子、包含两条或更多条多肽链的CD19结合分子、或包含多于两条多肽链的CD19结合分子的一部分(例如，单个核酸可以编码包含三条、四条或更多条多肽链CD19结合分子的两条多肽链，或包含四条或更多条多肽链CD19结合分子的三条多肽链)。对于表达的单独控制，编码两条或更多条多肽链的可以读框可以在单独的转录调节元件(例如，启动子和/或增强子)的控制下。编码两个或更多个多肽的可以读框还可以通过相同的转录调节元件控制，并且通过内部核糖体进入位点(IRES)序列分离，以允许翻译进不同多肽中。
在一些实施例中，包含两条或更多条多肽链的CD19结合分子由两种或更多种核酸编码。编码CD19结合分子的核酸的数量可以等于或小于CD19结合分子中的多肽链的数量(例如，当多于一条多肽链被单个核酸编码时)。
所述核酸可以是DNA或RNA(例如，mRNA)。
在另一方面，本披露提供了宿主细胞和含有本披露的核酸的载体。所述核酸可以存在于单一载体或不同载体中，所述载体存在于相同宿主细胞或不同宿主细胞中，如下文中更详细地所述的。
7.10.1.载体
本披露提供了包含核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列编码本文所述的CD19结合分子或CD19结合分子组分。在一个实施例中，所述载体包含编码本文所述的基于免疫球蛋白的ABM的核苷酸。在一个实施例中，所述载体包含编码本文所述的Fc结构域的核苷酸。在一个实施例中，所述载体包含编码本文所述的基于重组非免疫球蛋白的ABM的核苷酸。载体可以编码一个或多个ABM、一个或多个Fc结构域、一个或多个基于非免疫球蛋白的ABM、或其任何组合(例如，当多种组分或子组分被编码为单一多肽链时)。在一个实施例中，载体包含本文所述的核苷酸序列。所述载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
可以使用多种载体系统。例如，一类载体利用衍生自动物病毒的DNA元件，例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录酶病毒(劳氏肉瘤病毒、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另一类载体利用衍生自RNA病毒的RNA元件，例如塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、东部马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalitis virus)和黄病毒。
另外，将DNA稳定地整合进其染色体中的细胞可以通过引入一个或多个标记物(其允许对转染的宿主细胞进行选择)进行选择。所述标记物可以向例如营养缺陷型宿主提供质子移变，可以提供杀微生物剂抗性(例如，抗生素)、或对重金属如铜等的抗性。所述可以选择的标记物基因可以直接连接至待表达的DNA序列，或通过共转化引入相同的细胞。mRNA的最佳合成也可能需要另外的元件。这些元件可以包括拼接信号，以及转录启动子、增强子、和终止信号。
一旦含有构建体的表达载体或DNA序列被制备用于表达，所述表达载体可以被转染或引入适宜的宿主细胞中。可以使用多种技术，例如像，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他的常规技术，来实现这一目标。用于培养所得的转染细胞和回收表达的多肽的方法和条件是本领域技术人员已知的，并且可以根据基于本说明书中所用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞进行改变或优化。
7.10.2.细胞
本披露还提供了包含本披露的核酸的宿主细胞。
在一个实施例中，所述宿主细胞被基因工程化以包含本文所述的一个或多个核酸。
在一个实施例中，通过使用表达盒使宿主细胞基因工程化。短语“表达盒”是指核苷酸序列，其能够影响在与此类序列相容的宿主中的基因的表达。此类盒可以包括启动子，具有或不具有内含子的可以读框和终止信号。还可以使用在实现表达中必需或有帮助的其他因子，例如诱导型启动子。
本披露还提供了包含本文所述的载体的宿主细胞。
所述细胞可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞、或人细胞。合适的真核细胞包括，但不限于Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括，但不限于Sf9细胞。
7.11.具有延长的体内半衰期的CD19结合分子
可以修饰本披露的CD19结合分子以具有延长的体内半衰期。
可以使用多种策略来延长本披露的CD19结合分子的半衰期。例如，通过与聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体和碳水化合物屏蔽的化学连接；通过与结合血清蛋白(如白蛋白、IgG、FcRn)的蛋白质的遗传融合和转移；通过与结合血清蛋白的其他结合部分(如纳米抗体、Fab、DARPin、avimer、亲合体和anticalin)偶联(遗传地或化学地)；通过与rPEG、白蛋白、白蛋白的结构域、白蛋白结合蛋白和Fc的遗传融合；或通过掺入纳米载体、缓释配制品或医疗装置中。
为了延长体内CD19结合分子的血清循环，可以通过PEG与包含CD19结合分子的多肽的N-末端或C-末端的位点特异性缀合或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基，将惰性聚合物分子(如高分子量PEG)附接至具有或不具有多功能接头的CD19结合分子。为了使CD19结合分子聚乙二醇化，在一个或多个PEG基团附接至所述CD19结合分子的条件下可以使所述分子与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以通过酰化反应或烷基化反应采用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)来进行。如本文所用的，所述术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一个实施例中，待聚乙二醇化的CD19结合分子是非糖基化抗体。将使用导致最小生物活性损失的直链或支链聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测缀合程度，以确保PEG分子与抗体的适当缀合。未反应的PEG可以通过尺寸排阻色谱法或通过离子交换色谱法与抗体-PEG缀合物分离。可以使用本领域技术人员熟知的方法，例如通过本文所述的免疫测定，测试PEG衍生化抗体的结合活性以及体内功效。使蛋白质聚乙二醇化的方法是已知的并且可以应用于本披露的CD19结合分子。参见例如，Nishimura等人的EP 0154316和Ishikawa等人的EP 0401384。
其他改良的聚乙二醇化技术包括重构化学正交定向工程技术(ReCODE PEG)，其经由包含tRNA合成酶和tRNA的重构系统将化学上指定的侧链掺入生物合成蛋白中。该技术能够将超过30个新氨基酸掺入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中的生物合成蛋白中。tRNA在琥珀密码子所定位的任何位置掺入规范性氨基酸，从而将琥珀从终止密码子转换成发出掺入化学上指定的氨基酸的信号的密码子。
重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可以用于血清半衰期延长。该技术一般包括将300-600个氨基酸非结构化蛋白质尾部与现有的药物蛋白质基因融合。因为这种非结构化蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大了约15倍，所以这种蛋白质的血清半衰期大大增加。与需要化学缀合和再纯化的传统PEG化相反，所述制备过程大大简化并且产物是均匀的。
聚唾液酸化是另一种技术，它利用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长活性寿命和提高治疗性肽和蛋白质的稳定性。PSA是唾液酸的聚合物(一种糖)。当用于蛋白质和治疗肽药物递送时，聚唾液酸对缀合提供保护性微环境。这增加治疗性蛋白在循环中的有效寿命并防止它被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体中。它被某些细菌采用，这些细菌已经进化了数百万年以用它来包被其细胞壁。这些天然聚唾液酸化的细菌则能够通过分子拟态挫败身体的防御系统。PSA-大自然的终极秘密技术，可以容易地大量产自这种细菌并具有预定的物理特征。即使与蛋白质偶联，细菌PSA也是完全非免疫原性的，因为它在化学上与人体中的PSA相同。
另一种技术包括使用与CD19结合分子连接的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是一种源自蜡质玉米淀粉的改性天然聚合物，并可以通过人体的酶代谢。通常给予HES溶液以替代缺乏的血液体积并改善血液的流变学特性。CD19结合分子的Hes化能够通过增加分子的稳定性以及通过降低肾清除率来延长循环半衰期，从而导致生物活性增加。通过改变不同的参数如HES的分子量，可以定制多种HES CD19结合分子缀合物。
还可以生成具有增加的体内半衰期的CD19结合分子，其将一个或多个氨基酸修饰(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域、或其FcRn结合片段(例如Fc或铰链Fc结构域片段)。参见例如，国际公开号WO 98/23289；国际公开号WO 97/34631；和美国专利号6,277,375。
此外，CD19结合分子可以缀合至白蛋白、白蛋白结构域、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合抗体或其抗体片段，以使分子在体内更稳定或具有更长的体内半衰期。这些技术是熟知的，参见例如，国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利号EP413,622。
本披露的CD19结合分子也可以与一个或多个人血清白蛋白(HSA)多肽或其部分融合。已经在WO 93/15199、WO 93/15200和EP 413 622中提出作为白蛋白融合蛋白的组分的白蛋白作为多种蛋白质的载体的用途。还已经提出使用HSA的N-末端片段用于与多肽融合(EP 399 666)。因此，通过将所述分子遗传地或化学地融合或缀合至白蛋白，可以稳定或延长保质期，和/或保留分子在溶液中、在体外和/或在体内的活性持续延长的时间段。涉及HSA融合的另外的方法可以在例如WO 2001077137和WO 200306007中找到。在实施例中，在哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞系)中进行融合蛋白的表达。
本披露的CD19结合分子还可以与结合至白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA))的抗体或其抗体片段融合。白蛋白结合抗体或其抗体片段可以是Fab、scFv、Fv、scFab、(Fab’)2、单结构域抗体、骆驼科动物VHH结构域、VH或VL结构域、或全长单克隆抗体(mAb)。
本披露的CD19结合分子还可以与脂肪酸融合以延长它们的半衰期。适用于连接生物分子的脂肪酸已在本领域中描述，例如在WO 2015/200078、WO 2015/191781、US 2013/0040884中。合适的半衰期延长性脂肪酸包括定义为C6-70烷基链、C6-70烯基链或C6-70炔基链的那些，其中每个被至少一个羧酸(例如1、2、3或4个CO2H)取代，并任选地进一步被羟基基团取代。例如，本文所述的CD19结合分子可以与具有以下式A1、A2或A3中任一个的脂肪酸连接：
Figure BDA0003360067460003061
R1是CO2H或H；
R2、R3和R4彼此独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或-C＝CH；
Ak是支链C6-C30亚烷基；
n、m和p彼此独立地是6和30之间的整数；或酰胺、酯或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，所述脂肪酸具有式A1，例如具有式A1的脂肪酸，其中n和m独立地为8至20，例如10至16。在另一个实施例中，所述脂肪酸部分具有式A1，并且其中R2和R3中的至少一个是CO2H。
在一些实施例中，所述脂肪酸选自下式：
Figure BDA0003360067460003071
其中Ak3、Ak4、Ak5、Ak6和Ak7独立地是(C8-20)亚烷基，R5和R6独立地是(C8-20)烷基。
在一些实施例中，所述脂肪酸选自下式：
Figure BDA0003360067460003081
在一些实施例中，所述脂肪酸选自下式：
Figure BDA0003360067460003082
在一些实施例中，所述脂肪酸具有式A2或A3。在具体的实施例中，所述缀合物包含式A2的脂肪酸部分(其中p是8至20)或式A3的脂肪酸部分(其中Ak是C8-20亚烷基)。
7.12.抗体-药物缀合物
本披露的CD19结合分子可以例如经由接头与药物部分缀合。尽管一种或多种ABM可能基于非免疫球蛋白支架，例如包含一种或多种基于非免疫球蛋白的ABM的MBM(如包含Affilin-144160的TCR ABM)，但为了方便起见此类缀合物在本文中被称为抗体-药物缀合物(或“ADC”)。
在某些方面，所述药物部分发挥细胞毒性或细胞抑制活性。在一个实施例中，所述药物部分选自美登木素生物碱、驱动蛋白样蛋白KIF11抑制剂、V-ATP酶(液泡型H+-ATP酶)抑制剂、促凋亡剂、Bcl2(B细胞淋巴瘤2)抑制剂、MCL1(髓细胞白血病1)抑制剂、HSP90(热休克蛋白90)抑制剂、IAP(细胞凋亡抑制剂)抑制剂、mTOR(雷帕霉素机制性靶标)抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、奥瑞斯他汀、多拉司他汀、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、CRM1(染色体维持1)抑制剂、DPPIV(二肽基肽酶IV)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2(细胞周期蛋白依赖性激酶2)抑制剂、CDK9(细胞周期蛋白依赖性激酶9)抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、或DHFR(二氢叶酸还原酶)抑制剂。在一些实施例中，所述药物部分是放射性金属离子，例如(如α-发射体，如213Bi)或用于将放射性金属离子(包括但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)与多肽缀合的大环螯合剂。在一个实施例中，所述大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)。
在一个实施例中，所述接头选自可切割接头、不可切割接头、亲水接头、原带电荷(procharged)接头、或基于二羧酸的接头。
在一些实施例中，所述ADC是根据结构式(I)的化合物：
[D-L-XY]n-Ab
或其盐，其中每个“D”彼此独立地代表细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(“药物”)；每个“L”彼此独立地代表接头；“Ab”代表本文所述的CD19结合分子；每个“XY”代表在接头上的官能团Rx和在抗体上的“互补性”官能团Ry之间形成的连接，并且n代表与ADC连接的药物的数量，或ADC的药物与抗体的比率(DAR)。
可以包含ADC的多种抗体(Ab)的一些实施例包括上述CD19结合分子的多种实施例。
在结构式(I)的ADC和/或盐的一些实施例中，每个D是相同的和/或每个L是相同的。
可以包含本披露的ADC的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(D)和接头(L)的一些实施例，以及与ADC连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的数量，在下面更详细地描述。
7.12.1.细胞毒性剂和/或细胞抑制剂
所述细胞毒性剂和/或细胞抑制剂可以是已知抑制细胞生长和/或细胞复制和/或杀死细胞的任何药剂，特别是癌和/或肿瘤细胞。许多具有细胞毒性和/或细胞抑制特性的药剂在文献中是已知的。多种类型的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的非限制性实例包括，例如但不限于，放射性核素、烷基化剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA嵌入剂(例如，沟结合剂，如小沟结合物)、RNA/DNA抗代谢物、细胞周期调节剂、激酶抑制剂、蛋白质合成抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、线粒体抑制剂、和抗有丝分裂剂。
以下提供这些多种类型中的某些内的药剂的具体非限制性实例。
烷基化剂：asaley((L-亮氨酸，N-[N-乙酰基-4-[双-(2-氯乙基)氨基]-DL-苯丙氨酰基]-，乙酯；NSC 167780；CAS注册号3577897))；AZQ((1,4-环己二烯-1,4-二氨基甲酸，2,5-双(1-氮丙啶基)-3,6-二氧代-，二乙酯；NSC 182986；CAS注册号57998682))；BCNU((N,N'-双(2-氯乙基)-N-亚硝基脲；NSC 409962；CAS注册号154938))；白消安(1,4-丁二醇二甲磺酸盐；NSC 750；CAS注册号55981)；(羧基邻苯二甲酸)铂(NSC 27164；CAS注册号65296813)；CBDCA((顺式-(1,1-环丁烷二羧根基)二氨铂(II))；NSC 241240；CAS注册号41575944))；CCNU((N-(2-氯乙基)-N'-环己基-N-亚硝基脲；NSC 79037；CAS注册号13010474))；CHIP(异丙铂；NSC 256927)；苯丁酸氮芥(NSC 3088；CAS注册号305033)；氯脲霉素((2-[[[(2-氯乙基)亚硝基氨基]羰基]氨基]-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖；NSC 178248；CAS注册号54749905))；顺式铂(顺铂；NSC 119875；CAS注册号15663271)；克罗米松(clomesone)(NSC 338947；CAS注册号88343720)；氰基吗啉代阿霉素(NCS 357704；CAS注册号88254073)；环代松(cyclodisone)(NSC 348948；CAS注册号99591738)；二去水卫矛醇(dianhydrogalactitol)(5,6-二环氧卫矛醇；NSC 132313；CAS注册号23261203)；氟代多巴((5-[(2-氯乙基)-(2-氟乙基)氨基]-6-甲基-尿嘧啶；NSC 73754；CAS注册号834913)；庚磺胺(NSC 329680；CAS注册号96892578)；海恩酮(NSC 142982；CAS注册号23255938)；美法仑(NSC 8806；CAS注册号3223072)；甲基CCNU((1-(2-氯乙基)-3-(反式-4-甲基环己烷)-1-亚硝基脲；NSC 95441；13909096)；丝裂霉素C(NSC 26980；CAS注册号50077)；米托唑酰胺(NSC353451；CAS注册号85622953)；氮芥((双(2-氯乙基)甲胺盐酸盐；NSC 762；CAS注册号55867)；PCNU((1-(2-氯乙基)-3-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-1-亚硝基脲；NSC 95466；CAS注册号13909029))；哌嗪烷基化剂((1-(2-氯乙基)-4-(3-氯丙基)-哌嗪二盐酸盐；NSC344007))；哌嗪二酮(NSC 135758；CAS注册号41109802)；哌泊溴烷(pipobroman)((N,N-双(3-溴丙酰)哌嗪；NSC 25154；CAS注册号54911))；甲基丝裂霉素(N-甲基丝裂霉素C；NSC56410；CAS注册号801525)；螺旋乙内酰脲芥(NSC 172112；CAS注册号：56605164)；替罗昔隆(异氰尿酸三缩水甘油酯；NSC 296934；CAS注册号2451629)、四氯环己铂(NSC 363812；CAS注册号62816982)；硫替派(thio-tepa)(N,N',N”-三-1,2-乙二亚甲基硫代磷酰胺；NSC6396；CAS注册号52244)；三亚乙基三聚氰胺(NSC 9706；CAS注册号51183)；尿嘧啶氮芥(去甲基多潘；NSC 34462；CAS注册号66751)；Yoshi-864((双(3-甲氧基甲氧丙基)胺盐酸盐；NSC 102627；CAS注册号3458228)。
拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱(NSC 94600；CAS注册号7689-03-4)；多种喜树碱衍生物和类似物(例如，NSC 100880、NSC 603071、NSC 107124、NSC 643833、NSC 629971、NSC295500、NSC 249910、NSC 606985、NSC 74028、NSC 176323、NSC 295501、NSC 606172、NSC606173、NSC 610458、NSC 618939、NSC 610457、NSC 610459、NSC 606499、NSC 610456、NSC364830、和NSC 606497)；morpholinisoxorubicin(NSC 354646；CAS注册号89196043)；SN-38(NSC 673596；CAS注册号86639-52-3)。
拓扑异构酶II抑制剂：阿霉素(NSC 123127；CAS注册号25316409)；氨萘非特(benzisoquinolinedione；NSC 308847；CAS注册号69408817)；m-AMSA((4'-(9-吖啶胺基)-3'-甲氧基甲烷磺酰苯胺；NSC 249992；CAS注册号51264143))；蒽吡唑类衍生物((NSC355644)；依托泊苷(VP-16；NSC 141540；CAS注册号33419420)；吡唑并吖啶((吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2(6H)-丙胺，9-甲氧基-N,N-二甲氧基-5-硝基-，单甲烷磺酸盐；NSC 366140；CAS注册号99009219)；盐酸比生群(bisantrene hydrochloride)(NSC 337766；CAS注册号71439684)；柔红霉素(NSC 821151；CAS注册号23541506)；脱氧阿霉素(NSC 267469；CAS注册号63950061)；米托蒽醌(NSC 301739；CAS注册号70476823)；美诺立尔(NSC 269148；CAS注册号71628961)；N,N-二卞基正定霉素(NSC 268242；CAS注册号70878512)；恶烷噻唑(oxanthrazole)(NSC 349174；CAS注册号105118125)；正定苯酰肼(rubidazone)(NSC164011；CAS注册号36508711)；替尼泊苷(VM-26；NSC 122819；CAS注册号29767202)。
DNA嵌入剂：安曲霉素(CAS注册号4803274)；抗霉素A(CAS注册号89675376)；托马霉素(tomaymycin)(CAS注册号35050556)；DC-81(CAS注册号81307246)；西伯利亚霉素(sibiromycin)(CAS注册号12684332)；吡咯并苯并二氮杂衍生物(CAS注册号945490095)；SGD-1882((S)-2-(4-氨基苯基)-7-甲氧基-8-(3-4(S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)--5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)丙氧-基)-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂卓-5(11aH)-酮)；SG2000(SJG-136；(11aS,11a'S)-8,8'-(丙烷-1,3-二基双(氧基))双(7-甲氧基-2-亚甲基-2,3--二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂卓-5(11aH)-酮)；NSC 694501；CAS注册号232931576)。
RNA/DNA抗代谢物：L-阿拉诺新(NSC 153353；CAS注册号59163416)；5-氮杂胞苷(NSC 102816；CAS注册号320672)；5-氟尿嘧啶(NSC 19893；CAS注册号51218)；阿西维辛(NSC 163501；CAS注册号42228922)；氨基蝶呤衍生物N-[2-氯-5-[[(2,4-二氨基-5-甲基-6-喹唑啉)甲基]氨基]苯甲酰基-]L-天冬氨酸(NSC 132483)；氨基蝶呤衍生物N-[4-[[(2,4-二氨基-5-乙基-6-喹唑啉)甲基]氨基]苯甲酰基]L-天冬氨酸(NSC 184692)；氨基蝶呤衍生物N-[2-氯-4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]L-天冬氨酸一水合物(NSC 134033)；叶酸拮抗剂(antifo)((Nα-(4-氨基-4-脱氧蝶酰基)-N7-半邻苯二甲酰基-L-鸟氨酸；NSC 623017))；贝克可溶性安替弗(Baker's soluble antifol)(NSC 139105；CAS注册号41191042)；二氯烯丙基甲花醌((2-(3,3-二氯烯丙基)-3-羟基-1,4-萘醌；NSC126771；CAS注册号36417160)；布奎那(brequinar)(NSC 368390；CAS注册号96201886)；喃氟啶尿嘧啶(ftorafur)((前体药物；5-氟-1-(四氢-2-呋喃基)-尿嘧啶；NSC 148958；CAS注册号37076689)；5,6-二氢-5-氮杂胞苷(NSC 264880；CAS注册号62402317)；甲氨蝶呤(NSC740；CAS注册号59052)；甲氨蝶呤衍生物(N-[[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]-1-萘基]羰基]L-谷氨酸；NSC 174121)；PALA((N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸酯；NSC224131；CAS注册号603425565)；吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)(NSC 143095；CAS注册号30868305)；三甲曲沙(trimetrexate)(NSC 352122；CAS注册号82952645)。
DNA抗代谢物：3-HP(NSC 95678；CAS注册号3814797)；2'-脱氧-5-氟尿嘧啶(NSC27640；CAS注册号50919)；5-HP(NSC 107392；CAS注册号19494894)；α-TGDR(α-2'-脱氧-6-硫鸟嘌呤；NSC 71851 CAS注册号2133815)；甘氨阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)(NSC 303812；CAS注册号92802822)；ara C(阿糖胞苷；NSC 63878；CAS注册号69749)；5-氮杂-2'-脱氧胞苷(NSC 127716；CAS注册号2353335)；β-TGDR(β-2'-脱氧-6-硫鸟嘌呤；NSC71261；CAS注册号789617)；环胞苷(NSC 145668；CAS注册号10212256)；胍唑(NSC 1895；CAS注册号1455772)；羟基脲(NSC 32065；CAS注册号127071)；肌苷二醛(inosineglycodialdehyde)(NSC 118994；CAS注册号23590990)；麦克菌素(macbecin)II(NSC330500；CAS注册号73341738)；吡唑啉咪唑(pyrazoloimidazole)(NSC 51143；CAS注册号6714290)；硫鸟嘌呤(NSC 752；CAS注册号154427)；硫嘌呤(NSC 755；CAS注册号50442)。
细胞周期调节剂：水飞蓟宾(CAS注册号22888-70-6)；表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG；CAS注册号989515)；原花青素衍生物(例如，原花青素A1[CAS注册号103883030]、原花青素B1[CAS注册号20315257]、原花青素B4[CAS注册号29106512]、槟榔鞣质(arecatannin)B1[CAS注册号79763283])；异黄酮类(例如，染料木素[4',5,7-三羟基异黄酮；CAS注册号446720]、大豆苷元[4',7-二羟基异黄酮，CAS注册号486668])；吲哚-3-甲醇(CAS注册号700061)；槲皮素(NSC 9219；CAS注册号117395)；雌莫司汀(NSC 89201；CAS注册号2998574)；诺考达唑(CAS注册号31430189)；鬼臼毒素(CAS注册号518285)；酒石酸长春瑞滨(NSC 608210；CAS注册号125317397)；念珠藻素(NSC 667642；CAS注册号124689652)。
激酶抑制剂：阿法替尼(CAS注册号850140726)；阿昔替尼(CAS注册号319460850)；ARRY-438162(比米替尼(binimetinib))(CAS注册号606143899)；博舒替尼(CAS注册号380843754)；卡博替尼(CAS注册号1140909483)；色瑞替尼(CAS注册号1032900256)；克唑替尼(CAS注册号877399525)；达拉菲尼(CAS注册号1195765457)；达沙替尼(NSC 732517；CAS注册号302962498)；埃罗替尼(NSC 718781；CAS注册号183319699)；依维莫司(NSC 733504；CAS登记号159351696)；福坦替尼(NSC 745942；CAS注册号901119355)；吉非替尼(NSC715055；CAS注册号184475352)；依鲁替尼(CAS注册号936563961)；伊马替尼(NSC 716051；CAS注册号220127571)；拉帕替尼(CAS注册号388082788)；乐伐替尼(CAS注册号857890392)；木利替尼(CAS 366017096)；尼罗替尼(CAS注册号923288953)；尼达尼布(CAS注册号656247175)；帕博西尼(CAS注册号571190302)；帕唑帕尼(NSC 737754；CAS注册号635702646)；哌加他尼(CAS注册号222716861)；帕纳替尼(CAS注册号1114544318)；雷帕霉素(NSC 226080；CAS注册号53123889)；瑞戈非尼(CAS注册号755037037)；AP 23573(地磷莫司)(CAS注册号572924540)；INCB018424(鲁索替尼)(CAS注册号1092939177)；ARRY-142886(司美替尼)(NSC 741078；CAS注册号606143-52-6)；西罗莫司(NSC 226080；CAS注册号53123889)；索拉非尼(NSC 724772；CAS注册号475207591)；舒尼替尼(NSC 736511；CAS登记号341031547)；托法替尼(CAS注册号477600752)；替西罗莫司(NSC 683864；CAS注册号163635043)；曲美替尼(CAS注册号871700173)；凡德他尼(CAS注册号443913733)；维莫非尼(CAS注册号918504651)；SU6656(CAS注册号330161870)；CEP-701(来沙替尼(lesaurtinib))(CAS注册号111358884)；XL019(CAS注册号945755566)；PD-325901(CAS登记号391210109)；PD-98059(CAS登记号167869218)；具有ATP竞争性的TORC1/TORC2抑制剂，包括PI-103(CAS注册号371935749)、PP242(CAS注册号1092351671)、PP30(CAS注册号1092788094)、Torin 1(CAS注册号1222998368)、LY294002(CAS注册号154447366)、XL-147(CAS注册号934526893)、CAL-120(CAS注册号870281348)、ETP-45658(CAS注册号1198357797)、PX 866(CAS注册号502632668)、GDC-0941(CAS注册号957054307)、BGT226(CAS注册号1245537681)、BEZ235(CAS注册号915019657)、XL-765(CAS注册号934493762)。
蛋白质合成抑制剂：吖啶黄素(acriflavine)(CAS注册号65589700)；阿米卡星(NSC 177001；CAS注册号39831555)；阿贝卡星(CAS注册号51025855)；阿司米星(CAS注册号55779061)；阿奇霉素(NSC 643732；CAS注册号83905015)；卡那霉素(CAS注册号4696768)；金霉素(NSC 13252；CAS注册号64722)；克拉霉素(NSC 643733；CAS注册号81103119)；克林霉素(CAS注册号18323449)；氯莫环素(CAS注册号1181540)；放线菌酮(cycloheximide)(CAS注册号66819)；放线菌素D(dactinomycin)(NSC 3053；CAS注册号50760)；达福普丁(CAS注册号112362502)；地美环素(CAS注册号127333)；地贝卡星(CAS注册号34493986)；二氢链霉素(dihydrostreptomycin)(CAS注册号128461)；地红霉素(CAS注册号62013041)；强力霉素(doxycycline)(CAS注册号17086281)；吐根碱(NSC 33669；CAS注册号483181)；红霉素(NSC 55929；CAS注册号114078)；氟红霉素(CAS注册号83664208)；弗氏菌丝素(framycetin)(新霉素B；CAS注册号119040)；庆大霉素(NSC 82261；CAS注册号1403663)；甘氨环素类，如替加环素(CAS注册号220620097)；潮霉素B(CAS注册号31282049)；异帕米星(CAS注册号67814760)；交沙霉素(NSC 122223；CAS注册号16846245)；卡那霉素(CAS注册号8063078)；酮内酯类，如泰利霉素(CAS注册号191114484)、喹红霉素(CAS注册号205110481)、和索利霉素(CAS注册号760981837)；洁霉素(CAS注册号154212)；赖甲环素(CAS注册号992212)；甲氯环素(NSC 78502；CAS注册号2013583)；美他环素(盐酸美他环素(rondomycin)；NSC 356463；CAS注册号914001)；麦迪霉素(CAS注册号35457808)；米诺环素(NSC 141993；CAS注册号10118908)；美欧卡霉素(CAS注册号55881077)；新霉素(CAS注册号119040)；奈替米星(CAS注册号56391561)；竹桃霉素(CAS注册号3922905)；恶唑烷酮类，如伊皮唑胺(CAS注册号165800044)、利奈唑胺(CAS注册号165800033)、泼斯唑来(CAS注册号252260029)、雷得唑来(CAS注册号869884786)、ranbezolid(CAS注册号392659380)、sutezolid(CAS注册号168828588)、特地唑胺(CAS注册号856867555)；氧四环素(NSC 9169；CAS注册号2058460)；巴龙霉素(CAS注册号7542372)；青哌环素(CAS注册号4599604)；肽基转移酶抑制剂，例如，氯霉素(NSC 3069；CAS注册号56757)和衍生物，如叠氮氯霉素(CAS注册号13838089)、氟苯尼考(CAS注册号73231342)、和甲砜霉素(CAS注册号15318453)，以及截短侧耳素(pleuromutilins)如瑞他帕林(CAS注册号224452668)、泰妙菌素(CAS注册号55297955)、沃尼妙林(CAS注册号101312929)；吡利霉素(CAS注册号79548735)；嘌呤霉素(NSC 3055；CAS注册号53792)；奎奴普丁(CAS注册号120138503)；核糖霉素(CAS注册号53797356)；罗他霉素(CAS注册号74014510)；罗利霉素(CAS注册号751973)；罗红霉素(CAS注册号80214831)；西索米星(CAS注册号32385118)；奇霉素(spectinomycin)(CAS注册号1695778)；螺旋霉素(CAS注册号8025818)；链阳菌素，如普那霉素(CAS注册号270076603)、奎奴普丁/达福普丁(CAS注册号126602899)、和维及霉素(CAS注册号11006761)；链霉素(CAS注册号57921)；四环素(NSC 108579；CAS注册号60548)；妥布霉素(CAS注册号32986564)；醋竹桃霉素(CAS注册号2751099)；泰乐菌素(CAS注册号1401690)；威大霉素(CAS注册号49863481)。
组蛋白脱乙酰酶抑制剂：abexinostat(CAS注册号783355602)；贝利司他(NSC726630；CAS注册号414864009)；西达本胺(CAS注册号743420022)；恩替诺特(CAS注册号209783802)；givinostat(CAS注册号732302997)；mocetinostat(CAS注册号726169739)；帕比司他(CAS注册号404950807)；奎西诺司他(quisinostat)(CAS注册号875320299)；resminostat(CAS注册号864814880)；罗米地辛(CAS注册号128517077)；萝卜硫素(CAS注册号4478937)；thioureidobutyronitrile(KevetrinTM；CAS注册号6659890)；丙戊酸(NSC93819；CAS注册号99661)；伏立诺他(NSC 701852；CAS注册号149647789)；ACY-1215(rocilinostat；CAS注册号1316214524)；CUDC-101(CAS注册号1012054599)；CHR-2845(特诺司他(tefinostat)；CAS注册号914382608)；CHR-3996(CAS注册号1235859138)；4SC-202(CAS注册号910462430)；CG200745(CAS注册号936221339)；SB939(pracinostat；CAS注册号929016966)。
线粒体抑制剂：水鬼蕉碱(pancratistatin)(NSC 349156；CAS注册号96281311)；罗丹明-123(CAS注册号63669709)；依地福新(NSC 324368；CAS注册号70641519)；d-α-生育酚琥珀酸酯(NSC 173849；CAS注册号4345033)；化合物11β(CAS注册号865070377)；阿司匹林(NSC 406186；CAS注册号50782)；玫瑰树碱(CAS注册号519233)；小檗碱(CAS注册号633658)；浅蓝菌素(CAS注册号17397896)；GX015-070(
Figure BDA0003360067460003181
1H-吲哚，2-(2-((3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基)-3-甲氧基-2H-吡咯-5-基)-；NSC 729280；CAS注册号803712676)；南蛇藤醇(雷公藤红素；CAS注册号34157830)；二甲双胍(NSC 91485；CAS注册号1115704)；亮绿(NSC 5011；CAS注册号633034)；ME-344(CAS注册号1374524556)。
抗有丝分裂剂：别秋水仙碱(NSC 406042)；奥瑞斯他汀，如MMAE(单甲基奥瑞斯他汀E；CAS注册号474645-27-7)和MMAF(单甲基奥瑞斯他汀F；CAS注册号745017-94-1；软海绵素B(NSC 609395)；秋水仙碱(NSC 757；CAS注册号64868)；秋水仙碱衍生物(N-苯甲酰基-脱乙酰基苯甲酰胺；NSC 33410；CAS注册号63989753)；尾海兔素10(NSC 376128；CAS注册号110417-88-4)；美登素(NSC 153858；CAS注册号35846-53-8)；根瘤菌素(rhozoxin)(NSC332598；CAS注册号90996546)；紫杉醇(NSC 125973；CAS注册号33069624)；紫杉醇衍生物((2'-N-[3-(二甲氨基)丙基]戊二酸紫杉醇；NSC 608832)；硫代秋水仙碱(3-去甲基硫代秋水仙碱；NSC 361792)；三苯甲基半胱氨酸(NSC 49842；CAS注册号2799077)；硫酸长春碱(NSC 49842；CAS注册号143679)；硫酸长春新碱(NSC 67574；CAS注册号2068782)。
包括或可以被修饰以包括与CD19结合分子的附接位点的任何这些药剂可以包括在本文披露的ADC中。
在一些实施例中，所述细胞毒性剂和/或细胞抑制剂是抗有丝分裂剂。
在一些实施例中，所述细胞毒性剂和/或细胞抑制剂是奥瑞斯他汀，例如，单甲基奥瑞斯他汀E(“MMAE:)或单甲基奥瑞斯他汀F(“MMAF”)。
7.12.2.ADC接头
在本披露的ADC中，所述细胞毒性剂和/或细胞抑制剂通过ADC接头的方式与CD19结合分子连接。将细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与ADC的CD19结合分子连接的ADC接头可以是短的、长的、疏水的、亲水的、柔性的或刚性的，或者可以由各自独立地具有上述提及特性中的一种或多种的片段组成，使得所述接头可以包括具有不同特性的片段。接头可以是多价的，使得它们将多于一种药剂共价连接至CD19结合分子上的单个位点，或者接头可以是单价的，使得它们将单一药剂共价连接至CD19结合分子上的单个位点。
如技术人员将理解的，所述ADC接头通过在一个位置与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂形成共价连接并在另一个位置与CD19结合分子形成共价连接将细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与CD19结合分子连接。通过ADC接头上的官能团与药剂和CD19结合分子上的官能团之间的反应形成共价连接。如本文所用，所述表达“ADC接头”旨在包括(i)ADC接头的非缀合形式，其包括能够将ADC接头共价连接至细胞毒性和/或细胞抑制剂的官能团和能够将ADC接头共价连接至CD19结合分子的官能团；(ii)ADC接头的部分缀合形式，其包括能够将ADC接头共价连接至CD19结合分子并且共价连接至细胞毒性和/或细胞抑制剂的官能团，或反之亦然；和(iii)ADC接头的完全缀合形式，其共价连接至细胞毒性和/或细胞抑制剂和CD19结合分子两者。在本披露的ADC接头和ADC，以及用于将接头-药剂与CD19结合分子缀合的合成子的一些实施例中，包含ADC接头上的官能团的部分和在ADC接头与CD19结合分子之间形成的共价连接具体地分别表示为Rx和XY。
所述ADC接头可以(但不必)对细胞外的条件具有化学稳定性，并且可以设计成在细胞内裂解、死亡和/或以其他方式特异性降解。可替代地，可以使用不被设计为在细胞内特异性切割或降解的ADC接头。选择稳定或不稳定的ADC接头可以取决于细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的毒性。对于对正常细胞有毒的药剂，可以使用稳定的接头。可以使用选择性或靶向的且对正常细胞具有较低毒性的药剂，ADC接头对细胞外环境的化学稳定性不太重要。多种用于在ADC的上下文中将药物与CD19结合分子连接的ADC接头是已知的。这些ADC接头中以及其他ADC接头的任一个可以用于将细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与本披露的ADC的CD19结合分子连接。
可以用于将许多细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与单个CD19结合分子连接的示例性多价ADC接头描述于例如WO 2009/073445；WO 2010/068795；WO 2010/138719；WO 2011/120053；WO 2011/171020；WO 2013/096901；WO 2014/008375；WO 2014/093379；WO 2014/093394；WO 2014/093640中。例如，Mersana等人开发的Fleximer接头技术具有使具有良好的物理化学特性的高DAR ADC成为可能的潜力。如下所示，Mersana技术基于经由一系列酯键将药物分子掺入增溶的聚乙缩醛主链中。所述方法可提供高负载的ADC(DAR高达20)，同时保持良好的物理化学特性。
树突型接头的另外的实例可以在以下文献中找到：US 2006/116422；US 2005/271615；de Groot等人,2003,Angew.Chem.Int.Ed.[应用化学-国际版]42:4490-4494；Amir等人,2003,Angew.Chem.Int.Ed.[应用化学-国际版]42:4494-4499；Shamis等人,2004,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]126:1726-1731；Sun等人,2002,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters[生物有机化学与药物化学通讯]12:2213-2215；Sun等人,2003,Bioorganic&Medicinal Chemistry[生物有机化学和药物化学快报]11:1761-1768；King等人,2002,Tetrahedron Letters[四面体快报]43:1987-1990。
可以使用的示例性单价ADC接头描述于，例如，Nolting,2013,Antibody-DrugConjugates[抗体-药物缀合物],Methods in Molecular Biology[分子生物学中的方法]1045:71-100；Kitson等人,2013,CROs—MOs--Chemica—ggi--Chemistry Today[CROs—MOs--Chemica—ggi--今日化学]31(4):30-38；Ducry等人,2010,Bioconjugate Chem.[生物缀合化学]21:5-13；Zhao等人,2011,J.Med.Chem.[药物化学杂志]54:3606-3623；美国专利号7,223,837；美国专利号8,568,728；美国专利号8,535,678；和WO 2004010957。
通过举例但不限制的方式，可以包括在ADC中的一些可切割和不可切割的接头描述如下。
7.12.2.1.可切割的ADC接头
在某些实施例中，所述选择的ADC接头在体内是可切割的。可切割的ADC接头可以包括化学或酶促不稳定的或者可以降解的连接。可切割的ADC接头通常依赖于细胞内的过程来释放药物，例如细胞质的减少、暴露于溶酶体中的酸性条件、或通过细胞内特定蛋白酶或其他酶的切割。可切割的ADC接头通常掺入一个或多个化学键，所述化学键是可化学切割的或可酶切的，而ADC接头的其余部分是不可切割的。在某些实施例中，ADC接头包含化学不稳定基团，例如腙和/或二硫化物基团。包含化学不稳定基团的接头利用血浆和一些细胞质区室之间的差异特性。促进含有腙的ADC接头的药物释放的细胞内条件是内体和溶酶体的酸性环境，而含有二硫化物的ADC接头在含有高硫醇浓度的细胞溶质中还原，例如谷胱甘肽。在某些实施例中，通过使用化学不稳定基团附近的取代基引入空间位阻，可以增加包含化学不稳定基团的ADC接头的血浆稳定性。
酸性不稳定基团，例如腙，在血液中性pH环境(pH 7.3-7.5)的全身循环过程中保持完整，并且一旦ADC内化为细胞的轻度酸性内体的区室(pH 5.0-6.5)和溶酶体的隔室(pH4.5-5.0)则进行水解并释放药物。这种pH依赖性释放机制与药物的非特异性释放有关。为了增加ADC接头的腙基团的稳定性，可以通过化学修饰(例如取代)改变ADC接头，允许调节以在溶酶体中实现更有效的释放，同时使循环损失最小化。
含腙的ADC接头可以含有另外的切割位点，例如另外的酸不稳定切割位点和/或酶促不稳定切割位点。包括示例性含腙的ADC接头的ADC包括以下结构：
Figure BDA0003360067460003221
其中D和Ab分别代表细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(药物)和Ab，并且n代表与CD19结合分子连接的药物-ADC接头的数量。在某些ADC接头如接头(Ig)中，所述ADC接头包含两个可切割的基团-二硫化物和腙部分。对于此类ADC接头，未经修饰的游离药物的有效释放需要酸性pH或二硫化物还原和酸性pH。例如(Ih)和(Ii)的接头已经显示出对单个腙切割位点有效。
当ADC内化到酸性细胞区室中时，在体循环期间保持完整并经历水解并释放药物的另外的ADC接头包括碳酸盐。此类ADC接头可以用于细胞毒性剂和/或细胞抑制剂可以通过氧共价附接的情况。
可以包括在ADC接头中的其他酸不稳定基团包括含有顺式-乌头酰基的ADC接头。顺式-乌头酰基化学物质使用与酰胺键并置的羧酸以加速酰胺在酸性条件下的水解。
可切割的ADC接头也可以包括二硫化物基团。二硫化物在生理pH下是热力学稳定的并且被设计成在细胞内内化时释放药物，其中与细胞外环境相比细胞质提供显著更多的还原环境。二硫键的断裂通常需要细胞质硫醇辅因子的存在，例如(还原的)谷胱甘肽(GSH)，使得含二硫化物的ADC接头在循环中相当稳定，选择性地释放细胞溶质中的药物。细胞内酶蛋白二硫化物异构酶或能够切割二硫键的类似酶也可以促进细胞内二硫键的优先切割。据报道，相比于在大约5种肿瘤细胞的循环中的GSH或半胱氨酸(最丰富的低分子量硫醇)的显著更低浓度，GSH以范围为0.5-10mM的浓度存在于细胞中，其中不规律的血流导致缺氧状态，导致还原酶的活性增强，并且因此导致甚至更高的谷胱甘肽浓度。在某些实施例中，含有二硫化物的ADC接头的体内稳定性可以通过ADC接头的化学修饰来增强，例如，使用与二硫键相邻的空间位阻。
包括含有二硫化物的示例性ADC接头的ADC包括以下结构：
Figure BDA0003360067460003241
其中D和Ab分别代表药物和CD19结合分子，n代表与CD19结合分子连接的药物-ADC接头的数目，并且R在每次出现时独立地选自例如氢或烷基。在某些实施例中，增加与二硫键相邻的空间位阻增加了ADC接头的稳定性。当一个或多个R基团选自低级烷基如甲基时，例如(Ij)和(Il)的结构显示出增加的体内稳定性。
可以使用的另一种类型的可切割ADC接头是ADC接头，其被酶特异性切割。此类ADC接头通常是基于肽的或包括充当酶的底物的肽区域。与化学不稳定的ADC接头相比，基于肽的ADC接头在血浆和细胞外环境中往往更稳定。肽键通常具有良好的血清稳定性，因为溶酶体蛋白水解酶由于内源性抑制剂而在血液中具有非常低的活性，并且具有与溶酶体相比不利的高血液pH值。从CD19结合分子释放药物特别是由于溶酶体蛋白酶(例如组织蛋白酶和纤溶酶)的作用而发生。这些蛋白酶可以在某些肿瘤细胞中以升高的水平存在。
在示例性实施例中，所述可切割的肽选自四肽，如Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:755)、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:756)；或二肽，如Val-Cit、Val-Ala、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、Phe-Lys、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp 5、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Me3Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、AM Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、AW Met-(D)Lys、和Asn-(D)Lys。在某些实施例中，由于较长肽的疏水性，可以在较长的多肽上选择二肽。
已经描述了多种基于二肽的可切割ADC接头，其用于将如多柔比星、丝裂霉素、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、他利霉素和奥瑞斯他汀/奥瑞斯他汀家族成员的药物与CD19结合分子连接(参见，Dubowchik等人,1998,J.Org.Chem.[生物缀合化学]67:1866-1872；Dubowchik等人,1998,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]8(21):3341-3346；Walker等人,2002,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]12:217-219；Walker等人,2004,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]14:4323-4327；Sutherland等人,2013,Blood[血液]122:1455-1463；和Francisco等人,2003,Blood[血液]102:1458-1465)。所有这些二肽ADC接头或这些二肽ADC接头的修饰形式都可以用于本披露的ADC中。可以使用的其他二肽ADC接头包括在ADC中发现的那些，例如西雅图遗传学公司(Seattle Genetics)的本妥昔单抗SGN-35(AdcetrisTM)、西雅图遗传学公司SGN-75(抗CD-70、Val-Cit-单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF))、西雅图遗传学公司SGN-CD33A(抗CD-33、Val-Ala-(SGD-1882))、塞德斯医疗公司(Celldex Therapeutics)格仑妥木单抗(CDX-011)(抗NMB、Val-Cit-单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE))、和细胞分裂素PSMA-ADC(PSMA-ADC-1301)(抗PSMA，Val-Cit-MMAE)。
可以酶切的ADC接头可以包括自杀式间隔子，以在空间上将药物与酶切位点分开。药物与肽ADC接头的直接附接可以导致药物的氨基酸加合物的蛋白水解释放，从而损害其活性。使用自杀式间隔子允许在酰胺键水解时消除完全活性的未经化学修饰的药物。
一种自杀式间隔子是双功能的对氨基苄醇基团，其通过氨基基团与肽连接，形成酰胺键，而含胺的药物可以通过氨基甲酸酯官能团附接至ADC接头的苄羟基基团(PABC)。所得的前药在蛋白酶介导的切割后被活化，导致1,6-消除反应，释放未修饰的药物、二氧化碳和ADC接头基团的残余物。以下方案描述了对氨基苄基醚的片段化和药物的释放：
Figure BDA0003360067460003261
其中X-D代表未修饰的药物。
还描述了这种自杀式基团的杂环变体。参见例如，美国专利号7,989,434。
在一些实施例中，所述可酶切的ADC接头是基于β-葡糖醛酸的ADC接头。通过溶酶体酶β-葡糖醛酸糖苷酶切割β-葡糖苷酸糖苷键可以实现药物的简单释放。该酶大量存在于溶酶体内，并且在一些肿瘤类型中过表达，而细胞外的酶活性低。基于β-葡萄糖醛酸的ADC接头可以用于避免由于β-葡糖苷酸的亲水性而导致ADC发生聚集的趋势。在一些实施例中，基于β-葡萄糖醛酸的ADC接头可以用作与疏水性药物连接的ADC的ADC接头。以下方案描述了从含有基于β-葡萄糖醛酸的ADC接头的ADC释放药物：
Figure BDA0003360067460003271
已经描述了多种基于β-葡萄糖醛酸的可切割的ADC接头，其用于将如奥瑞斯他汀、喜树碱和多柔比星类似物、CBI小沟结合物、和psymberin等药物连接至CD19结合分子(参见Nolting,第5章“Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates,[抗体-药物缀合物中的接头技术]”于：Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]中,第1045卷,第71-100页,Laurent Ducry(编辑),斯普林格科学与商业医学公司(Springer Science&Business Medica,LLC,2013；Jeffrey等人,2006,Bioconjug.Chem.[生物缀合化学]17:831-840；Jeffrey等人,2007,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]17:2278-2280；和Jiang等人,2005,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]127:11254-11255)。所有这些基于β-葡萄糖醛酸的ADC接头均可以用于本披露的ADC中。
另外，含有苯酚基团的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂可以通过苯酚氧与ADC接头共价键合。WO 2007/089149中描述的一种此类ADC接头依赖于如下方法，其中二氨基-乙烷“SpaceLink”与传统的基于“PABO”自杀式基团一起使用以递送苯酚。下文示意性地描述了ADC接头的切割，其中D代表具有苯酚羟基基团的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂。
Figure BDA0003360067460003281
可切割的ADC接头可以包括不可切割的部分或区段，和/或可切割的区段或部分可以包括在另外的不可切割的ADC接头中以使其可切割。仅举例来说，聚乙二醇(PEG)和相关聚合物可以包括聚合物主链中的可切割的基团。例如，聚乙二醇或聚合物ADC接头可以包括一个或多个可切割的基团，例如二硫化物、腙或二肽。
其他可以包括在ADC接头中的可以降解连接包括通过PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中此类酯基通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。可水解降解的连接包括但不限于碳酸酯连接；由胺和醛反应得到的亚胺键；通过醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键；作为醛和醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸酯和醇的反应产物的原酸酯键；以及由亚磷酰胺基团形成的寡核苷酸键，包括但不限于位于聚合物末端和寡核苷酸的5'羟基基团。
在某些实施例中，所述ADC接头包含可酶切肽部分，例如，包含结构式(IVa)或(IVb)的ADC接头：
Figure BDA0003360067460003291
或其盐，其中：肽代表可被溶酶体酶切割的肽(图示为C→N且未显示羧基和氨基“末端”)；T代表包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或其组合的聚合物；Ra选自氢、烷基、磺酸盐和甲基磺酸盐；P是从0至5的范围内的整数；q是0或1；x是0或1；y是0或1；
Figure BDA0003360067460003292
代表ADC接头与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的附接点；以及*代表与ADC接头的其余部分的附接点。
在某些实施例中，所述肽选自三肽或二肽。在具体的实施例中，所述二肽选自：Val-Cit；Cit-Val；Ala-Ala；Ala-Cit；Cit-Ala；Asn-Cit；Cit-Asn；Cit-Cit；Val-Glu；Glu-Val；Ser-Cit；Cit-Ser；Lys-Cit；Cit-Lys；Asp-Cit；Cit-Asp；Ala-Val；Val-Ala；Phe-Lys；Val-Lys；Ala-Lys；Phe-Cit；Leu-Cit；Ile-Cit；Phe-Arg；和Trp-Cit。在某些实施例中，所述二肽选自：Cit-Val；和Ala-Val。
可以包括在ADC中的根据结构式(IVa)的ADC接头的具体示例性实施例包括下面所示的ADC接头(如图所示，所述ADC接头包括适合于将ADC接头与CD19结合分子共价连接的基团)：
Figure BDA0003360067460003301
Figure BDA0003360067460003311
可以包括在ADC中的根据结构式(IVb)的ADC接头的具体示例性实施例包括下面所示的ADC接头(如图所示，所述ADC接头包括适合于将ADC接头与CD19结合分子共价连接的基团)：
Figure BDA0003360067460003312
Figure BDA0003360067460003321
Figure BDA0003360067460003331
Figure BDA0003360067460003341
Figure BDA0003360067460003351
在某些实施例中，所述ADC接头包含可酶切肽部分，例如，包含结构式(IVc)或(IVd)的ADC接头：
Figure BDA0003360067460003352
或其盐，其中：肽代表可被溶酶体酶切割的肽(图示为C→N且未显示羧基和氨基“末端”)；T代表包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或其组合的聚合物；Ra选自氢、烷基、磺酸盐和甲基磺酸盐；P是从0至5的范围内的整数；q是0或1；x是0或1；y是0或1；x
Figure BDA0003360067460003353
代表ADC接头与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的附接点；以及*代表与ADC接头的其余部分的附接点。
可以包括在ADC中的根据结构式(IVc)的ADC接头的具体示例性实施例包括下面所示的ADC接头(如图所示，所述ADC接头包括适合于将ADC接头与CD19结合分子共价连接的基团)：
Figure BDA0003360067460003354
Figure BDA0003360067460003361
可以包括在ADC中的根据结构式(IVd)的ADC接头的具体示例性实施例包括下面所示的ADC接头(如图所示，所述ADC接头包括适合于将ADC接头与CD19结合分子共价连接的基团)：
Figure BDA0003360067460003362
Figure BDA0003360067460003371
在某些实施例中，包含结构式(IVa)、(IVb)、(IVc)、或(IVd)的ADC接头进一步包含通过暴露于酸性介质而可切割的碳酸酯部分。在具体的实施例中，所述ADC接头通过氧附接至细胞毒性剂和/或细胞抑制剂。
7.12.2.2.不可切割的接头
虽然可切割的ADC接头可以提供某些优势，但是包含ADC的ADC接头不需要是可切割的。对于不可切割的ADC接头，药物的释放不依赖于血浆和一些细胞质区室之间的差异特性。假定药物的释放在ADC经由抗原介导的胞吞作用内化并递送至溶酶体区室后发生，其中所述CD19结合分子通过细胞内蛋白水解降解而降解至氨基酸水平。该过程释放药物衍生物，所述药物衍生物由药物、ADC接头和与ADC接头共价附接的氨基酸残基形成。来自具有不可切割的ADC接头的缀合物的氨基酸药物代谢物更亲水并且通常膜可渗透性更低，这导致更少的旁邻效应(bystander effects)和更少的非特异性毒性(与具有可切割的ADC接头的缀合物相比)。通常，具有不可切割ADC接头的ADC在循环中具有比具有可切割ADC接头的ADC更高的稳定性。不可切割的ADC接头可以是亚烷基链，或者本质上可以是聚合的，例如像基于聚亚烷基二醇聚合物、酰胺聚合物，或可以包括亚烷基链、聚亚烷基二醇和/或酰胺聚合物的区段。
已经描述了用于将药物与CD19结合分子连接的多种不可切割的ADC接头。参见，Jeffrey等人,2006,Bioconjug.Chem.[生物缀合化学]17；831-840；Jeffrey等人,2007,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]17:2278-2280；和Jiang等人,2005,J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]127:11254-11255。所有这些ADC接头可以包括在本披露的ADC中。
在某些实施例中，所述ADC接头在体内是不可切割的，例如根据结构式(VIa)、(VIb)、(VIc)或(VId)的ADC接头(如图所示，所述ADC接头包括适合于将ADC接头与CD19结合分子共价连接的基团：
Figure BDA0003360067460003391
或其盐，其中：Ra选自氢、烷基、磺酸盐和甲基磺酸盐；Rx是包含能够将ADC接头与CD19结合分子共价连接的官能团的部分；以及
Figure BDA0003360067460003392
代表ADC接头与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的附接点)。
可以包括在ADC中的根据结构式(VIa)-(VId)的ADC接头的具体示例性实施例包括下面所示的ADC接头(如图所示，所述ADC接头包括适合于将ADC接头与CD19结合分子共价连接的基团，并且
Figure BDA0003360067460003393
代表与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的附接点)：
Figure BDA0003360067460003394
Figure BDA0003360067460003401
7.12.2.3.用于将接头附接到CD19结合分子的基团
可以使用多种基团将ADC接头-药物合成子附接至CD19结合分子以产生ADC。附接基团本质上可以是亲电子的，并且包括：马来酰亚胺基团、活化的二硫化物、活性酯(例如NHS酯和HOBt酯)、卤代甲酸酯、酰基卤、烷基和苄基卤化物(例如卤代乙酰胺)。如下所讨论的，还存在与“自稳定性”马来酰亚胺和“桥接二硫化物”相关的新兴技术，其可以根据本披露使用。使用的具体基团将部分取决于与CD19结合分子的附接位点。
在下面的示意图中描绘了在CD19结合分子缀合条件下自发水解以给出具有改善的稳定性的ADC物质的“自稳定性”马来酰亚胺基团的一个实例。参见US 20130309256 A1；还参见Lyon等人,Nature Biotech published online[网上出版的自然生物科技],doi:10.1038/nbt.2968。
Figure BDA0003360067460003402
Figure BDA0003360067460003411
Polytherics公司披露了一种桥接一对巯基基团的方法，所述基团衍生自天然铰链二硫键的还原。参见，Badescu等人,2014,Bioconjugate Chem.[生物缀合化学]25:1124-1136。所述反应描述于下面的示意图中。该方法的一个优点是能够通过完全还原IgG(以给出4对巯基)然后与4当量的烷基化剂反应来合成富集的DAR4 ADC。含有“桥连二硫化物”的ADC具有增加的稳定性。
Figure BDA0003360067460003421
类似地，如下所述，已经开发了能够桥接一对巯基基团的马来酰亚胺衍生物(下面的1)。参见WO 2013/085925。
Figure BDA0003360067460003431
7.12.2.4.ADC接头选择考虑
如本领域技术人员所知，为特定ADC选择的ADC接头可以受多种因素影响，包括但不限于与CD19结合分子的附接位点(例如，lys、cys或其他氨基酸残基)、药物药效团的结构限制和药物的亲脂性。为ADC选择的具体ADC接头应寻求平衡针对特定CD19结合分子/药物组合的这些不同因子。关于受ADC中ADC接头选择影响的因素的综述，参见Nolting,第5章“Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates,[抗体-药物缀合物中的接头技]”于：Antibody-Drug Conjugates:Methods in Molecular Biology[抗体-药物偶联物：分子生物学方法]中,第1045卷,第71-100页,Laurent Ducry(编辑),斯普林格科学与商业医学公司(Springer Science&Business Medica,LLC),2013。
例如，已观察到ADC影响对存在于抗原阳性肿瘤细胞附近的旁邻抗原阴性细胞的杀伤。ADC对旁邻细胞的杀伤机制表明，在ADC的细胞内加工过程中形成的代谢产物可以发挥作用。通过抗原阳性细胞中的ADC代谢产生的中性细胞毒性代谢物似乎在旁邻细胞杀伤中起作用，同时可以防止带电荷的代谢物穿过膜扩散进入介质，因此不会影响旁邻杀伤。在某些实施例中，选择ADC接头以减弱由ADC的细胞代谢物引起的旁邻杀伤效应。在某些实施例中，选择ADC接头以增加旁邻杀伤效应。
ADC接头的特性还可以在使用和/或存储条件下影响ADC的聚集。通常，文献中报道的ADC含有不超过3-4个药物分子/抗体分子(参见例如，Chari,2008,Acc Chem Res[化学研究报告]41:98-107)。由于ADC的聚集，尝试获得更高的药物-抗体比(“DAR”)通常是失败的，特别是如果药物和ADC接头都是疏水的(King等人,2002,J Med Chem[药物化学杂志]45:4336-4343；Hollander等人,2008,Bioconjugate Chem[生物缀合化学]19:358-361；Burke等人,2009Bioconjugate Chem[生物缀合化学]20:1242-1250)。在许多情况下，高于3-4的DAR作为增加效力的手段可以是有益的。在细胞毒性剂和/或细胞抑制剂本质上是疏水性的的情况下，可能希望选择相对亲水的ADC接头作为减少ADC聚集的手段，尤其是在希望大于3-4的DARS的情况下。因此，在某些实施例中，ADC接头掺入化学部分，所述化学部分在储存和/或使用期间减少ADC的聚集。ADC接头可以掺入极性或亲水基团，例如带电荷基团或在生理pH下变为带电荷的基团，以减少ADC的聚集。例如，ADC接头可以掺入带电荷的基团，例如在生理pH下使例如羧酸盐或质子化物(例如胺)去质子化的盐或基团。
已报道可以产生高达20的DAR、可以用于将多种细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与CD19结合分子连接的示例性多价ADC接头描述于WO 2009/073445；WO 2010/068795；WO2010/138719；WO 2011/120053；WO 2011/171020；WO 2013/096901；WO 2014/008375；WO2014/093379；WO 2014/093394；WO 2014/093640中。
在具体的实施例中，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定，ADC在储存或使用期间的聚集小于约10％。在具体的实施例中，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定的，ADC在储存或使用期间的聚集小于10％，例如小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、小于约0.1％、或甚至更低。
7.12.3.制造ADC的方法
可以使用熟知的化学物质合成ADC。所选择的化学物质将尤其取决于一种或多种细胞毒性剂和/或细胞抑制剂、ADC接头和用于将ADC接头附接到CD19结合分子的基团的特性。通常，根据式(I)的ADC可以根据以下方案制备：
D-L-Rx+Ab-Ry→[D-L-XY]n-Ab(I)
其中D、L、Ab、XY和n是如前所定义的，并且Rx和Ry代表能够彼此形成共价连接的互补基团，如上所讨论的。
基团Rx和Ry的特性将取决于用于将合成子D-L-Rx与CD19结合分子连接的化学物质。通常，所用的化学物质不应改变CD19结合分子的完整性，例如其结合其靶标的能力。在一些情况下，缀合抗体的结合特性将与未缀合的CD19结合分子的结合特性非常相似。用于将分子与生物分子(特别是免疫球蛋白，其组分通常是本披露的CD19结合分子的结构单元)缀合的多种化学物质和技术是熟知的。参见例如，Amon等人,“Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy[癌症疗法中用于药物免疫靶向的单克隆抗体]”于：Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法]中,Reisfeld等人编辑,艾伦利斯出版公司(Alan R.Liss,Inc.),1985；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery[用于药物递送的抗体]”于：Controlled Drug Delivery[药物控制递送]中,Robinson等人编辑,马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.),第2版1987；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview,[癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述]”于：Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications[单克隆抗体'84：生物和临床应用]中,Pinchera等人编辑,1985；“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Useof Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,[放射标记的抗体在癌症疗法中的治疗用途的分析、结果和未来前景]”于：Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy[用于癌症检测和治疗的单克隆抗体]中,Baldwin等人编辑,学术出版社公司(Academic Press),1985；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.[免疫学综述]62:119-58；PCT公开WO 89/12624。这些化学物质中的任何一种都可以用于将合成子与CD19结合分子连接。
用于将合成子连接到可接近的赖氨酸残基上的许多官能团Rx和化学物质是已知的，并且包括例如但不限于NHS-酯和异硫氰酸酯。
用于将合成子连接到半胱氨酸残基的可接近的游离巯基上的许多官能团Rx和化学物质是已知的，并且包括例如但不限于卤代乙酰基和马来酰亚胺。
然而，缀合化学物质不限于可用的侧链基团。通过将适当的小分子与胺连接，可以将例如胺的侧链转化为其他有用的基团，例如羟基。该策略可以用于通过将多功能小分子与CD19结合分子的可以接近的氨基酸残基的侧链缀合来增加抗体上可以用的连接位点的数量。然后将适合于将合成子共价连接到这些“转化的”官能团的官能团Rx包括在合成子中。
还可以将CD19结合分子工程化以包括用于缀合的氨基酸残基。用于工程化BBM以包括可用于在ADC的上下文中缀合药物的非遗传编码的氨基酸残基的方法描述于Axup等人,2012,Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]109(40):16101-16106中，用于将合成子连接到非编码氨基酸的化学物质和官能团也是如此。
通常，合成子与CD19结合分子的氨基酸残基的侧链连接，包括例如可接近的赖氨酸残基的伯氨基基团或可接近的半胱氨酸残基的巯基基团。通过还原链间二硫键可以获得游离的巯基基团。
对于其中Ry是巯基基团的连接(例如，当Rx是马来酰亚胺时)，所述CD19结合分子通常首先完全或部分被还原以破坏半胱氨酸残基之间的链间二硫桥。
不参与二硫桥的半胱氨酸残基可以通过修饰一个或多个密码子而工程化成CD19结合分子。还原这些未配对的半胱氨酸产生适于缀合的巯基基团。在一些实施例中，CD19结合分子经工程化以引入一个或多个半胱氨酸残基作为与药物部分缀合的位点(参见，Junutula等人,2008,Nat Biotechnol[自然生物技术],26:925-932)。
可以在恒定区中选择半胱氨酸取代的位点以提供稳定且均一的缀合物。CD19结合分子可以具有，例如，两个或更多个半胱氨酸取代，并且这些取代可以与如本文所述的其他修饰和缀合方法组合使用。用于在抗体的特定位置处插入半胱氨酸的方法是已知的，参见例如Lyons等人,1990,Protein Eng.[蛋白质工程],3:703-708、WO 2011/005481、WO 2014/124316、WO 2015/138615。在某些实施例中，CD19结合分子包含用在选自重链的以下位置的恒定区上的半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，其中所述位置是根据EU系统编号的。在一些实施例中，CD19结合分子包含用在选自轻链的以下位置的恒定区上的半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199、和203，其中所述位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是人κ轻链。在某些实施例中，CD19结合分子包含用在恒定区上的半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代的组合，其中所述组合包含在重链的位置375处、重链的位置152处、重链的位置360处、或轻链的位置107处的取代，并且其中所述位置是根据EU系统编号的。在某些实施例中，CD19结合分子包含用在恒定区上的半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中所述取代在重链的位置375处、重链的位置152处、重链的位置360处、轻链的位置107处、轻链的位置165处、或轻链的位置159处，并且其中所述位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。
在具体的实施例中，CD19结合分子包含用在恒定区上的半胱氨酸对两个氨基酸的取代的组合，其中所述CD19结合分子在重链的位置152和375处包含半胱氨酸，其中所述位置是根据EU系统编号的。
在其他具体的实施例中，CD19结合分子包含在重链的位置360处用半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中所述位置是根据EU系统编号的。
在其他具体的实施例中，CD19结合分子包含在轻链的位置107处用半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中所述位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。
用于掺入工程化半胱氨酸的其他位置可以包括，例如但不限于：人IgG1重链上的位置S112C、S113C、A114C、S115C、A176C、5180C、S252C、V286C、V292C、S357C、A359C、S398C、S428C(卡巴特编号)和人Igκ轻链上的位置V110C、S114C、S121C、S127C、S168C、V205C(卡巴特编号)(参见例如，美国专利号7,521,541、美国专利号7,855,275和美国专利号8,455,622)。
可以另外地或可替代地修饰可以用于本文披露的ADC中的CD19结合分子以引入一种或多种其他反应性氨基酸(除半胱氨酸外)，包括Pcl、吡咯赖氨酸、肽标签(如S6、A1和ybbR标签)、和非天然氨基酸，代替天然序列的至少一个氨基酸，因此在所述CD19结合分子上提供反应位点用于与药物部分缀合。例如，CD19结合分子可以被修饰以掺入Pcl或吡咯赖氨酸(W.Ou等人,2011,PNAS[美国国家科学院院刊],108(26):10437-10442；WO2014124258)或非天然氨基酸(Axup等人,2012,PNAS[美国国家科学院院刊],109:16101-16106；审查参见C.C.Liu和P.G.Schultz,2010,Annu Rev Biochem[生物化学年鉴]79:413-444；Kim等人,2013,Curr Opin Chem Biol.[化学生物学研究现状]17:412-419)作为与药物缀合的位点。类似地，可以将用于酶促缀合方法的肽标签引入CD19结合分子中(参见，Strop等人2013,Chem Biol.[化学生物学]20(2):161-7；Rabuka,2010,Curr Opin ChemBiol.[化学生物学研究现状]14(6):790-6；Rabuka等人,2012,Nat Protoc.[自然实验手册]7(6):1052-67)。另一个实例是使用4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)用于辅酶A类似物的缀合(WO 2013184514)。根据已知方法，此类经修饰或工程化的MBM可以与有效负载或接头-有效负载组合缀合。
如本领域技术人员所理解的，与CD19结合分子连接的药剂(例如，细胞毒性剂和/或细胞抑制剂)的数量可以变化，使得ADC的集合在本质上可以是异质的，其中一些CD19结合分子含有一种连接的药剂，一些含有两种连接的药剂，一些含有三种连接的药剂等(并且有些不含连接的药剂)。异质性程度尤其取决于用于连接细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的化学物质。例如，其中所述CD19结合分子被还原以产生用于附接的巯基基团的情况下，通常产生每分子具有0、2、4、6或8种连接的药剂的CD19结合分子的异质混合物。此外，通过限制附接化合物的摩尔比，通常产生每分子具有0、1、2、3、4、5、6、7或8种连接的药剂的CD19结合分子。因此，应理解，根据上下文，所述药物CD19结合分子比(DTR)可以是CD19结合分子的集合的平均值。例如，“DTR4”可以指未进行纯化分离特定DTR峰的ADC制剂，并且可以包含具有不同数量的附接的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂/CD19结合分子的ADC分子的异质混合物(例如，0、2、4、6、8种试剂/CD19结合分子)，但平均药物与CD19结合分子比为4。类似地，在一些实施例中，“DTR2”是指异质ADC制剂，其中平均药物与CD19结合分子比为2。
当希望富集的制剂时，可以经由纯化异质混合物，例如经由柱色谱法，例如疏水相互作用色谱法，获得具有确定数量的连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的CD19结合分子。
纯度可以通过多种已知方法评估。作为具体实例，可以经由HPLC或其他色谱法分析ADC制剂，并通过分析所得峰的曲线下面积来评估纯度。
7.13.缀合至可检测剂的CD19结合分子
本披露的CD19结合分子可以缀合至诊断剂或可以检测剂。此类分子可以用于监测或预后疾病或障碍的发作、发展、进展和/或严重性作为临床测试程序，诸如确定特定疗法的功效的一部分。这种诊断和检测可以通过将CD19结合分子与可以检测物质偶联来实现，所述可以检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，诸如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如但不限于鲁米诺(luminol)；生物发光材料，诸如但不限于萤光素酶、萤光素和水母素；放射性物质，诸如，但不限于，碘(131I、125I、123I、和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；以及使用多种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
7.14.附接至固体支持物的CD19结合分子
所述CD19结合分子也可以附接在固体支持物上，这对于一种或多种靶抗原的免疫测定或纯化特别有用。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
7.15.药物组合物
本披露的CD19结合分子(以及它们的缀合物；除非上下文另有说明，否则本披露中对CD19结合分子的引用也指包含CD19结合分子的缀合物，如ADC)可以配制为包含所述CD19结合分子的药物组合物，例如含有一种或多种药学上可以接受的赋形剂或载体。为了制备包含本披露的CD19结合分子的药物或无菌组合物，可以将CD19结合分子制剂与一种或多种药学上可以接受的赋形剂或载体组合。
例如，CD19结合分子的配制品可以通过将CD19结合分子与生理上可以接受的载体、赋形剂、或稳定剂以例如冻干粉剂、浆液、水溶液、洗剂或悬浮液的形式混合来制备(参见例如，Hardman等人,2001,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础],McGraw-Hill(麦格劳-希尔集团),纽约,纽约州；Gennaro,2000,Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams,andWilkins),纽约,纽约州；Avis等人(编辑),1993,Pharmaceutical Dosage Forms:GeneralMedications[药物剂型：一般药物],马塞尔·德克尔公司,纽约；Lieberman等人(编辑),1990,Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets[药物剂型：片剂],马塞尔·德克尔公司,纽约；Lieberman等人(编辑),1990,Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems[药物剂型：分散系统],马塞尔·德克尔公司,纽约；Weiner和Kotkoskie,2000,ExcipientToxicity and Safety[赋形剂毒性和安全性],马塞尔·德克尔公司,纽约市,纽约)。
为CD19结合分子选择给予方案取决于几种因素，包括CD19结合分子的血清或组织周转速率、症状水平、CD19结合分子的免疫原性和靶细胞可及性。在某些实施例中，给予方案使递送至受试者的CD19结合分子的量最大化，与可接受水平的副作用一致。因此，递送的CD19结合分子的量部分取决于具体CD19结合分子和正在治疗的病症的严重性。选择适当剂量的抗体和小分子的指南是可获得的(参见例如，Wawrzynczak,1996,Antibody Therapy[抗体疗法],Bios Scientific Pub.Ltd(Bios科学出版社有限公司),牛津郡,英国；Kresina(编辑),1991,Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis[单克隆抗体、细胞因子和关节炎],马塞尔·德克尔公司,纽约市,纽约；Bach(编辑),1993,MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases[自身免疫性疾病中的单克隆抗体和肽疗法],马塞尔·德克尔公司,纽约市,纽约；Baert等人,2003,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:601-608；Milgrom等人,1999,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]341:1966-1973；Slamon等人,2001,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]344:783-792；Beniaminovitz等人,2000,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]342:613-619；Ghosh等人,2003,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:24-32；Lipsky等人,2000,NewEngl.J.Med.[新英格兰医学杂志]343:1594-1602)。
由临床医生，例如，使用本领域中已知或怀疑影响治疗或预计影响治疗的参数或因素确定适当的剂量。通常，剂量始于略小于最佳剂量的量并此后将其以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所希望的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可以改变本披露药物组合物中CD19结合分子的实际剂量水平，以便获得一定量的CD19结合分子，所述CD19结合分子的量有效地实现对于特定的受试者、组合物和给予方式的所希望的治疗响应，而对所述受试者没有毒性。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括特定CD19结合分子的活性，给予途径，给予时间，所使用的特定CD19结合分子的排泄速率，治疗持续时间，与所使用的特定CD19结合分子组合的其他药剂(例如活性药剂，如治疗药物或化合物和/或作为载体的惰性材料)，所治疗受试者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史，以及医学领域中已知的类似因素。
包含CD19结合分子的组合物可以通过连续输注，或以一天、一周的间隔或每周1-7次按剂量提供。可以通过静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、经直肠、肌肉内、脑内或通过吸入来提供剂量。特定剂量方案是涉及避免明显不希望的副作用的最大剂量或给药频率的方案。
特定受试者的有效量可能根据如下因素而变化，如所治疗的病症、受试者的整体健康状况、给予的方法途径和剂量以及副作用的严重性(参见例如，Maynard等人,(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice[良好临床实践的SOP手册],InterpharmPress[Interpharm出版社],Boca Raton[博卡拉顿],Fla.[佛罗里达州]；Dent(2001)GoodLaboratory and Good Clinical Practice[良好实验和良好临床实践],Urch Publ.[厄奇出版社],英国伦敦)。
给予途径可以是通过例如局部或皮肤应用，通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊内、病灶内进行的注射或输注，或通过缓释系统或植入物(参见例如，Sidman等人,1983,Biopolymers[生物聚合物]22:547-556；Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.[外科研究杂志]15:167-277；Langer,1982,Chem.Tech.[化学技术]12:98-105；Epstein等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:3688-3692；Hwang等人,1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4030-4034；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，组合物也可以包含增溶剂和用于减轻注射部位疼痛的局部麻醉药如利多卡因。此外，也可以采用经肺施用，例如通过使用吸入器或雾化器以及具有雾化剂的配制品。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903。
本披露的组合物还可以使用多种已知方法中的一种或多种经由一种或多种给予途径给予。如技术人员将理解的，给予途经和/或方式将随所希望的结果而变化。选择的CD19结合分子的给予途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他一般给予途径，例如通过注射或输注。一般给予可以代表除了肠道和局部给予之外的给予方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。可替代地，本披露的组合物可以经由非一般途径给予，例如局部、表皮或粘膜给予途径，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给予。在一个实施例中，所述CD19结合分子通过输注给予。在另一个实施例中，所述CD19结合分子皮下给予。
如果CD19结合分子以控释或缓释系统给予，则可以使用泵以实现控释或缓释(参见Langer,同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.[CRC在生物医学工程中的参考评论]14:20；Buchwald等人,1980,Surgery[外科手术]88:507；Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]321:574)。聚合物材料可以用于实现本披露治疗剂的控释或缓释(参见例如，Medical Applications of Controlled Release[控释药物的医学应用],Langer和Wise(编辑),CRC Pres.[CRC出版社],Boca Raton,Fla.[佛罗里达州波卡拉顿](1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance[受控的药物生物利用率，药物产物设计以及性能],Smolen和Ball(编辑),威利出版公司(Wiley),纽约(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.[高分子科学杂志-高分子化学评论]23:61；还参见Levy等人,1985,Science[科学]228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.[神经病学记事]25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.[神经外科杂志]71:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；以及PCT公开号WO 99/20253)。用于缓释配制品中的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)以及聚原酸酯。在一个实施例中，用于缓释配制品的聚合物是惰性的，不含可浸出的杂质，在储存时稳定，无菌并且可生物降解。可以将控释或缓释系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,于Medical Applications of Controlled Release[控释的医学应用],同上,第2卷,第115-138页(1984))。
控释系统在Langer的综述中讨论(1990,Science[科学]249:1527-1533)。可以使用本领域的普通技术人员已知的任何技术来生产包含一种或多种本披露的CD19结合分子的缓释配制品。参见例如，美国专利号4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning等人,1996,Radiotherapy&Oncology[放射疗法和肿瘤学]39:179-189；Song等人,1995,PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology[PDA药学科学与技术]50:372-397；Cleek等人,1997,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.[控释生物活性材料国际研讨会学报]24:853-854；和Lam等人,1997,Proc.Int'l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.[控释生物活性材料国际研讨会学报]24:759-760。
如果局部给予CD19结合分子，则它们可以以软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳油剂或本领域技术人员熟知的其他形式配制。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to PharmaceuticalDosage Forms[雷明顿制药科学和药物剂型简介],第19版,Mack Pub.Co.(马克出版公司),伊斯顿,宾夕法尼亚州(1995)。对于不可喷雾的局部剂型，通常使用粘性至半固体或固体形式，其包含载剂或一种或多种与局部施用相容并且具有动态粘度的赋形剂，在一些情况下，其具有大于水的动态粘度。合适的配制品包括但不限于溶液、悬浮液、乳油剂、乳膏剂、软膏剂、粉剂、搽剂、油膏剂等，如果希望，可以是灭菌的或与辅助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲液、或盐)混合，用于影响多种特性，例如渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，在一些情况下，与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物(例如，气态推进剂，如氟利昂)混合包装，或包装于一个挤压瓶中。如果希望，还可以将保湿剂或湿润剂添加到药物组合物和剂型中。此类另外的成分的实例是熟知的。
如果鼻内给予包含CD19结合分子的组合物，则可以将CD19结合分子配制成气溶胶形式、喷雾、薄雾或滴剂形式。特别地，用于根据本披露使用的预防剂和治疗剂可以使用一种合适的推进剂(如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以从加压式包装或喷雾器的气溶胶喷雾展现的形式方便地进行递送。在增压式气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(由例如，明胶构成)可以被配制成含有CD19结合分子与适合的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本披露的CD19结合分子可以以组合疗法方案给予，如下文中的7.17节中所述。
在某些实施例中，可以配制CD19结合分子以确保在体内适当的分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为确保本披露的治疗性化合物穿过BBB(如果希望)，可以将它们以例如脂质体配制。对于制备脂质体的方法，参见例如，美国专利号4,522,811、5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包括被选择性运输至特定细胞或器官中，由此增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如，Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.[临床药理学杂志]29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,1988,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]153:1038)；抗体(Bloeman等人,1995,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]357:140；Owais等人,1995,Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]39:180)；表面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等人,1995,Am.J.Physiol.[美国生理学杂志]1233:134)；p 120(Schreier等人,1994,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269:9090)；还参见Keinanen和Laukkanen,1994,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]346:123；Killion和Fidler,1994,Immunomethods[免疫方法]4:273。
当用于组合疗法时，例如，如下文中的7.17节中所述，可以将CD19结合分子和一种或多种另外的药剂以相同药物组合物向受试者给予。可替代地，组合疗法的CD19结合分子和一种或多种另外的药剂可以以单独的药物组合物并行给予至受试者。
本文所述的治疗方法可以进一步包括进行“伴随诊断”测试，由此测试来自作为CD19结合分子疗法候选者的受试者的样品的CD19表达。伴随诊断测试可以在CD19结合分子疗法启动之前和/或在CD19结合分子治疗方案期间进行，以监测受试者对CD19结合分子疗法的持续适用性。伴随诊断中使用的药剂可以是CD19结合分子本身或另一种诊断剂，例如针对CD19的标记的单特异性抗体或用于检测CD19 RNA的核酸探针。可以在伴随诊断测定中测试的样品可以是其中可以存在CD19结合分子靶向的细胞的任何样品，例如肿瘤(例如，实体瘤)活组织切片、淋巴、粪便、尿液、血液或任何其他可能含有循环肿瘤细胞的体液。
7.16.治疗适应症
本披露的CD19结合分子可以用于治疗与CD19表达相关的任何疾病。短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与CD19表达相关的疾病或与表达CD19的细胞相关的病症，包括例如，增殖性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应症。在一个方面，与CD19表达相关的癌症是血液学癌症。在一个方面，血液学癌症症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与CD19表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于：例如一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与CD19表达相关的其他癌症或血液学病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液学病症的多样化集合)等。此外，与CD19表达相关的疾病包括但不限于例如，与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病。与CD19表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如，自身免疫性疾病(例如，狼疮)、炎性障碍(过敏和哮喘)和移植。
例如，CD19结合分子可以用于治疗经历过与CD19表达升高相关的疾病的治疗的受试者，其中经历过针对升高水平的CD19治疗的受试者表现出与升高水平的CD19相关的疾病。
在一个方面，本披露提供抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与CD19结合分子接触，从而抑制肿瘤细胞的生长。
在一个方面，本披露提供了治疗和/或预防免疫受损个体中出现的疾病的方法，所述方法包括给予CD19结合分子。特别地，本文披露了治疗与CD19表达相关的疾病、障碍和病症的方法，包括给予CD19结合分子。
在某些方面，本文披露了治疗处于患有与CD19表达相关的疾病、障碍和病症风险的患者的方法，所述方法包括给予CD19结合分子。
因此，本披露提供了用于治疗或预防与CD19表达相关的疾病、障碍和病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的CD19结合分子。
本披露还提供了用于预防、治疗和/或控制与表达CD19的细胞相关的疾病(例如，表达CD19的血液癌症或非典型癌症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予CD19结合分子。在一个方面，受试者是人。与表达CD19的细胞相关的障碍的非限制性实例包括病毒或真菌感染，以及与粘膜免疫相关的障碍。
7.16.1.癌症以及癌症相关疾病和障碍
在一个方面，本披露提供了一种治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者给予CD19结合分子，从而治疗受试者的癌症。可通过CD19靶向药剂治疗的癌症的实例是与CD19表达相关的癌症。
在一个方面，本披露提供了用于治疗癌症的方法，其中部分肿瘤对CD19是阴性的，并且部分肿瘤对CD19是阳性的。
在一个方面，本披露提供通过使用本披露的CD19结合分子治疗癌症的方法，其中CD19在正常细胞和癌细胞上表达，但在正常细胞上以较低水平表达。在一个实施例中，所述方法进一步包括选择以一定亲和力结合的CD19结合分子：所述亲和力允许CD19结合分子结合并杀伤表达CD19的癌细胞，但杀伤小于30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的表达CD19的正常细胞，例如如通过本文所述的测定所确定的。例如，可以使用杀伤测定，如基于Cr51 CTL的流式细胞术。在一个实施例中，所述CD19结合分子具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域对于CD19具有10-4M至10-8M，例如10-5M至10-7M，例如10-6M或10-7M的结合亲和力KD。
在一个方面，本文披露了治疗增殖性疾病(例如癌症或恶性肿瘤或癌前病症(例如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期))的方法，所述包括给予CD19结合分子。在一个方面，所述癌症是血液学癌症。血液学癌症病症是影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症类型，如白血病和恶性淋巴组织增生病症。在一个方面，所述血液学癌症是白血病。与CD19相关的疾病或障碍的实例是多发性骨髓瘤(也称为MM)(参见Claudio等人,Blood.[血液]2002,100(6):2175-86；和Novak等人,Blood.[血液]2004,103(2):689-94)。多发性骨髓瘤，也称为浆细胞骨髓瘤或卡勒氏病(Kahler’s disease)，是以骨髓中异常或恶性血浆B细胞积聚为特征的癌症。通常，癌细胞侵入邻近的骨骼，破坏骨骼结构并导致骨痛和骨折。大多数骨髓瘤病例的特征还在于副蛋白(也称为M蛋白或骨髓瘤蛋白)的产生，所述副蛋白是恶性浆细胞的克隆增殖过量而产生的异常免疫球蛋白。根据国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group,IMWG)的诊断标准，血清副蛋白水平超过30g/L即诊断为多发性骨髓瘤(参见Kyle等人,(2009),Leukemia.[白血病]23:3-9)。多发性骨髓瘤的其他症状或体征包括肾功能减退或肾功能衰竭、骨病变、贫血、高钙血症和神经症状。
可以通过本文所述的组合物和方法治疗的其他浆细胞增殖性障碍包括但不限于无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。
与CD19相关的疾病或障碍的另一个实例是霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(参见Chiu等人,Blood.[血液]2007,109(2):729-39；He等人,JImmunol.[免疫学杂志]2004,172(5):3268-79)。
霍奇金淋巴瘤(HL)也称为霍奇金病，是起源于白细胞或淋巴细胞的淋巴系统癌症。构成淋巴瘤的异常细胞称为里德-斯德伯格(Reed-Sternberg)细胞。在霍奇金淋巴瘤中，癌症从一个淋巴结组扩散到另一个淋巴结组。根据里德-斯德伯格细胞形态和里德-斯德伯格细胞周围的细胞组成(通过淋巴结活检确定)，霍奇金淋巴瘤可以细分为四种病理亚型：结节性硬化HL、混合细胞亚型、淋巴细胞富集或淋巴细胞优势、淋巴细胞耗减。一些霍奇金淋巴瘤也可以是结节性淋巴细胞优势型霍奇金淋巴瘤，或者可以是未指明的。霍奇金淋巴瘤的症状和体征包括颈部、腋窝或腹股沟的淋巴结无痛性肿胀、发烧、盗汗、体重减轻、疲劳、瘙痒或腹痛。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括多种血癌，其包括除霍奇金淋巴瘤之外的任何类型的淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤的亚型主要通过细胞形态学、染色体畸变和表面标记物来分类。NHL亚型(或NHL相关癌症)包括B细胞淋巴瘤，如但不限于伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病(B-PLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，血管内大B细胞淋巴瘤和原发性纵隔B细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤(例如，滤泡中心淋巴瘤、滤泡性小分裂细胞)、毛细胞白血病、高级B细胞淋巴瘤(伯基特样)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(例如，淋巴结外边缘区B细胞淋巴瘤或粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、和脾边缘区B细胞淋巴瘤)、浆细胞瘤/骨髓瘤、前体B淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(PB-LBL/L)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)；和T细胞淋巴瘤，如但不限于间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(例如，闷烧、慢性、急性和淋巴瘤)、血管中心性淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(例如，蕈样肉芽肿、Sézary综合征等)、淋巴结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤(鼻型)、肠病型肠T细胞淋巴瘤、大颗粒淋巴细胞性白血病、前体T淋巴细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/L)、T细胞慢性淋巴细胞性白血病/幼淋巴细胞白血病(T-CLL/PLL)、和未指明的外周T细胞淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤的症状和体征包括颈部、腋窝或腹股沟的淋巴结无痛性肿胀、发烧、盗汗、体重减轻、疲劳、瘙痒、腹痛、咳嗽或胸痛。
CD19表达也与瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)(也称为淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL))相关联。(参见Elsawa等人,Blood.[血液]2006,107(7):2882-8)。瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症先前被认为与多发性骨髓瘤相关联，但最近被归类为非霍奇金淋巴瘤的亚型。WM的特征在于不受控制的B细胞淋巴细胞增殖，导致贫血并产生过量的副蛋白或免疫球蛋白M(IgM)，所述副蛋白使血液变稠并导致高粘滞综合征。WM的其他症状或体征包括发烧、盗汗、疲劳、贫血、体重减轻、淋巴结病变或脾肿大、视力模糊、头晕、鼻出血、牙龈出血、不常见的瘀伤、肾功能损伤或衰竭、淀粉样变性或周围神经病变。
与CD19表达相关的疾病或障碍的另一个实例是脑癌。具体地，CD19的表达与星形细胞瘤或胶质母细胞瘤有关(参见Deshayes等人,Oncogene.[癌基因]2004,23(17):3005-12,Pelekanou等人.,PLoS One.[公共科学图书馆：综合]2013,8(12):e83250)。星形细胞瘤是由星形胶质细胞产生的肿瘤，星形胶质细胞是脑中的一种神经胶质细胞类型。胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤或GBM)是星形细胞瘤的最恶性形式，并且被认为是脑癌的最晚期(IV期)。胶质母细胞瘤有两种变体：巨细胞胶质母细胞瘤和神经胶质肉瘤。其他星形细胞瘤包括幼年毛细胞星形细胞瘤(JPA)、纤维性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤(PXA)、胚胎发育不良性神经上皮瘤(DNET)和退行性星形细胞瘤(AA)。
与胶质母细胞瘤或星形细胞瘤相关的症状或体征包括脑部压力增加、头痛、癫痫发作、记忆丧失、行为改变、身体一侧运动或感觉丧失、语言功能障碍、认知缺损、视力缺损、恶心、呕吐以及手臂或腿部虚弱。
手术移除肿瘤(或切除)是尽可能多地除去神经胶质瘤而不损伤或对正常周围脑损伤最小的标准治疗。通常在手术后使用放疗和/或化疗来抑制和减缓来自任何其余癌细胞或卫星病灶的复发疾病。放射治疗包括全脑放疗(常规体外束辐射)、靶向三维适形放射治疗和靶向放射性核素。通常用于治疗胶质母细胞瘤的化疗剂包括替莫唑胺(temozolomide)、吉非替尼或厄洛替尼和顺铂。血管生成抑制剂(如贝伐单抗(Bevacizumab)
Figure BDA0003360067460003621
)通常也与化疗和/或放疗组合使用。
支持性治疗经常也用于缓解神经症状和改善神经功能，并且与本文所述的任何癌症疗法组合给予。主要支持性药剂包括抗惊厥药和皮质类固醇。因此，本披露的组合物和方法可以与任何标准或支持性治疗组合使用，以治疗胶质母细胞瘤或星形细胞瘤。
本披露提供用于治疗癌症的组合物和方法。在一个方面，所述癌症是血液癌症，包括但不限于白血病或淋巴瘤。在一个方面，本文披露了治疗癌症和恶性肿瘤的方法，所述癌症和恶性肿瘤包括但不限于，例如，急性白血病，其包括但不限于，例如B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，其包括但不限于例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；另外的血液癌或血液病症，包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合)等。此外，与CD19表达相关的疾病包括但不限于例如表达CD19的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增殖性疾病。
在一些实施例中，CD19结合分子可以用于治疗疾病，包括但不限于浆细胞增殖性障碍(例如，无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤))、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。
在一些实施例中，CD19结合分子可以用于治疗疾病，包括但不限于癌症，例如本文所述的癌症，例如前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、胰腺癌、肺癌。
本披露还提供了用于抑制表达CD19的细胞群的增殖或减少表达CD19的细胞群的方法，所述方法包括使包含表达BMCA的细胞群与CD19结合分子接触。在具体方面，本披露提供了用于抑制表达CD19的癌细胞群的增殖或减少表达CD19的癌细胞群的方法，所述方法包括使表达CD19的癌细胞群与CD19结合分子接触。在一个方面，本披露提供了用于抑制表达CD19的癌细胞群的增殖或减少表达CD19的癌细胞群的方法，所述方法包括使表达BMCA的癌细胞群与CD19结合分子接触。在某些方面，在患有骨髓性白血病或与表达CD19的细胞相关的另一种癌症的受试者中、或者在骨髓性白血病或与表达CD19的细胞相关的另一种癌症的动物模型中，相对于阴性对照，所述方法将细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、或至少99％。在一个方面，受试者是人。
本披露提供了用于预防与表达CD19的细胞相关的癌症复发的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予CD19结合分子。
7.16.2.非癌症相关疾病和障碍
与CD19表达相关的非癌症相关疾病和障碍(例如免疫病症)也可以通过本文披露的组合物和方法治疗。此类免疫病症的特征可能在于免疫细胞的不适当活化，并且典型地分为四种类型：过敏反应、细胞毒性(细胞溶解)反应、免疫复合物反应、或细胞介导的免疫(CMI)反应(也称为迟发型超敏反应(DTH)反应)。(参见例如，Fundamental Immunology[基础免疫学],William E.Paul编辑,乌鸦出版社,纽约,第3版1993。)
此类免疫性疾病的具体实例包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、内分泌眼病、葡萄膜视网膜炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯病(Grave's disease)、肾小球肾炎、自身免疫性肝病、自身免疫性炎症性肠病、过敏反应、变态反应、干燥综合征、幼年发病型(I型)糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、纤维肌痛、炎性肠病、多发性肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特综合征(Schmidt's syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、爱迪生氏病(Addison's disease)、肾上腺炎、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮样肝炎、动脉粥样硬化、早老性痴呆、脱髓鞘疾病、亚急性皮肤型红斑狼疮、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒综合征(Dressler's syndrome)、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、脱发、类天疱疮、硬皮病、进行性系统性硬化症、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏现象(Raynaud'sphenomenon)、食管运动功能障碍、指端硬化、和毛细管扩张)、成人发病型糖尿病(II型糖尿病)、男性和女性自身免疫性不育症、强直性脊椎炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn'sdisease)、混合性结蒂组织病、结节性多动脉炎(polyarteritis nedosa)、系统性坏死性血管炎、幼年发病型类风湿性关节炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、肺出血肾炎综合症(Goodpasture's syndrome)、恰加斯氏病(Chagas'disease)、结节病、风湿热、哮喘、复发性流产、抗磷脂综合征、农民肺、多形性红斑、心脏切开术后综合征、库欣综合征(Cushing'ssyndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、养鸟人肺(bird-fancier's lung)、过敏性脑脊髓炎、中毒性表皮坏死松解症、阿尔波特综合征(Alport's syndrome)、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维性肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、锥虫病、多发性大动脉炎(Takayasu's arteritis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉病、Sampter综合征、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、白塞氏病(Behcet's disease)、卡普兰综合征(Caplan's syndrome)、川崎病(Kawasaki'sdisease)、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心肌内膜纤维变性、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、牛皮癣、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼综合征(Shulman's syndrome)、费尔蒂综合征(Felty's syndrome)、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、Fuch睫状体炎、IgA肾病、过敏性紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、移植物抗宿主病、移植排斥、人免疫缺陷病毒感染、埃可病毒感染(echovirusinfection)、心肌病、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、细小病毒感染、风疹病毒感染、接种后综合征、先天性风疹感染、Eaton-Lambert综合征、复发性多软骨炎、冷球蛋白血症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、EB病毒感染、流行性腮腺炎、Evans综合征、和自身免疫性性腺衰竭。
因此，本文所述的方法涵盖治疗以下的障碍：B淋巴细胞(例如，系统性红斑狼疮、肺出血肾炎综合症、类风湿性关节炎、和I型糖尿病)、Th1-淋巴细胞(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化、牛皮癣、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳氏肉芽肿病、结核病、或移植物抗宿主病)、或Th2-淋巴细胞(例如，特应性皮炎、系统性红斑狼疮、特应性哮喘、鼻结膜炎、过敏性鼻炎、或慢性移植物抗宿主病)。通常，涉及树突细胞的障碍包括Th1-淋巴细胞或Th2-淋巴细胞的障碍。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗自身免疫性疾病，例如至少部分由B细胞介导的自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的实例包括急性坏死性出血性脑白质炎；爱迪生氏病；丙种球蛋白缺乏症；过敏性哮喘；过敏性鼻炎；斑秃；淀粉样变性；强直性脊椎炎；抗GBM/抗TBM肾炎；抗磷脂综合征；自身免疫性再生障碍性贫血；自身免疫性家族性植物神经失调综合征(Autoimmune dysautonomia)；自身免疫性肝炎；自身免疫性高脂血症；自身免疫性免疫缺陷；自身免疫性内耳病；自身免疫性心肌炎；自身免疫性血小板减少性紫癜；轴突和神经元神经病；巴洛病(Balo disease)；白塞氏病；大疱性类天疱疮；心肌病；Castleman病；口炎性腹泻(非热带性)；恰加斯氏病；慢性疲劳综合征；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病；变应性肉芽肿综合征(Churg-Strauss syndrome)；瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮；克罗恩病；柯根氏综合症(Cogans syndrome)；冷凝集素病；先天性心脏传导阻滞；柯萨基病毒性心肌炎(Coxsackie myocarditis)；CREST病；原发性混合型冷球蛋白血症；脱髓鞘性神经病(Demyelinating neuropathies)；皮肤肌炎；德维克氏病、盘状狼疮；德雷斯勒综合征；子宫内膜异位；嗜酸性细胞性筋膜炎(Eosinophilic fasciitis)；结节性红斑；实验性变应性脑脊髓炎；Evans综合征；纤维肌痛；纤维性肺泡炎；巨细胞动脉炎(颞动脉炎)；肺出血肾炎综合症；格雷夫斯病；格林-巴利综合征；桥本氏病(Hashimoto'sdisease)；溶血性贫血；过敏性紫癜；妊娠疱疹；低丙球蛋白血症；特发性血小板减少性紫癜；IgA肾病；免疫调节性脂蛋白；包涵体肌炎；胰岛素依赖型糖尿病病(1型)；间质性膀胱炎；幼年型关节炎；幼年型糖尿病；川崎病；Lambert-Eaton综合征；白细胞碎裂性血管炎；扁平苔癣；硬化性苔癣；木样结膜炎；线性IgA疾病(LAD)；狼疮(SLE)、莱姆病(Lyme disease)；美尼尔氏病(Meniere's disease)、显微镜下多血管炎；混合性结蒂组织病；蚕蚀性角膜溃疡(Mooren's ulcer)；穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)；多发性硬化；重症肌无力；肌炎；发作性睡病；中性粒细胞减少症；眼瘢痕性类天疱疫；骨关节炎；复发性风湿症；副肿瘤性小脑变性；阵发性睡眠性血红蛋白尿症；帕-罗二氏综合征(Parsonnage-Turnersyndrome)；睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)；天疱疮；周围神经病；静脉周围性脑脊髓炎；恶性贫血；POEMS综合征；结节性多动脉炎；I、II和III型自身免疫性多腺性综合征；风湿性多肌痛；多肌炎；心肌梗死后综合征；心包切开术后综合征；黄体酮皮炎；原发胆汁性月干硬化(primary biliary cirrhosis)、原发性胆汁性肝硬化；牛皮癣；牛皮癣关节炎；特发性肺纤维化；坏疽性脓皮病；纯红细胞再生障碍；雷诺氏现象；反射交感性营养不良；莱特尔氏综合征(Reiter's syndrome)；复发性多软骨炎；多动腿综合征(Restless legs syndrome)；风湿热；类风湿性关节炎；结节病；施密特综合征(Schmidt syndrome)；巩膜炎；硬皮病；干燥综合症；精子和睾丸自身免疫病；僵人综合征(Stiff person syndrome)、亚急性细菌性心内膜炎；交感性眼炎；多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎；血小板减少性紫癜；自身免疫性甲状腺疾病；Tolosa-Hunt综合征；横贯性脊髓炎和坏死性脊髓病；溃疡性结肠炎；未分化结缔组织病；葡萄膜炎；血管炎；水疱性皮肤病；白癜风；和韦格纳氏肉芽肿病。特别感兴趣的更常见的自身免疫性疾病包括(a)结缔组织疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬皮病(硬皮病)、干燥综合征，(b)神经肌肉疾病，如多发性硬化、重症肌无力、格林-巴利综合征，(c)内分泌疾病，如桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、胰岛素依赖型(1型)糖尿病，和(d)胃肠疾病，如炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)，和(e)其他疾病，如血管炎综合征、血液自身免疫性疾病、和自身免疫性皮肤病。
自身免疫性疾病的特征可能在于存在自身抗体。自身抗体可以特异性结合至宿主靶或抗原，例如类风湿性因子(例如，在类风湿性关节炎中)；拓扑异构酶(例如，在硬皮病中)；髓鞘碱性蛋白(例如，在多发性硬化中)；基底膜ⅳ型胶原蛋白(例如，在肺出血肾炎综合症中)；神经节苷脂(例如，在格林-巴利综合征中)；血小板(例如，慢性特发性血小板减少症)；平滑肌肌动蛋白(例如，在自身免疫性肝炎中)；大疱性类天疱疮抗原1和2；也称为半桥粒抗原(例如，在大疱性类天疱疮中)；转谷氨酰胺酶(例如，在腹腔疾病中)；桥粒芯糖蛋白3(例如，在寻常型天疱疮中)；p62或sp100或线粒体(m2)抗原(例如，在原发性胆汁性肝硬化中)；中性粒细胞胞质c-ANCA(例如，在韦格纳氏肉芽肿病中)；中性粒细胞核周p-ANCA(例如，结节性多动脉炎、显微镜下多血管炎、变应性肉芽肿综合征、系统性血管炎(非特异性))；双链DNA(例如，在系统性红斑狼疮中)；外来体复合物(例如，在硬化性肌炎中)；Ro或La抗原(例如，在系统性红斑狼疮和新生儿心脏传导阻滞、或原发性干燥综合征中)；史密斯抗原(例如，在系统性红斑狼疮中)；磷脂抗原(例如，在抗磷脂综合征中)；SSA或SSB抗原(例如，在干燥综合征中)；着丝粒(例如，在CREST综合征中；线粒体(例如，在原发性胆汁性肝硬化中)；烟碱型乙酰胆碱激动剂(例如，在重症肌无力中)；电压门控钙通道(例如，在Lambert-Eaton综合征中)；甲状腺过氧化物酶(例如，在桥本氏甲状腺炎中)；TSH受体(例如，在格雷夫斯病中)；Hu抗原(例如，在副肿瘤性小脑综合征(paraneoplastic cerebellarsyndrome)中)；电压门控钾通道(例如，在边缘性脑炎和N-甲基-D-天冬氨酸受体中(例如，在脑炎中)。多于一种类型的自身抗体可能与免疫障碍相关或反之亦然，并且这份清单并不详尽。例如，已在类风湿性关节炎中鉴定的自身抗原包括关节相关蛋白，如II型胶原、人软骨细胞糖蛋白39、和蛋白多糖；以及热休克蛋白、瓜氨酸化丝聚蛋白、免疫球蛋白、葡萄糖-6-磷酸异构酶、p205、和BiP。
可以用本披露的CD19结合分子治疗的自身免疫性障碍包括系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征、硬皮病、类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎、移植物抗宿主病、皮肌炎、I型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、爱迪生氏病、乳糜泻、与黏膜免疫相关的病症、肠易激综合征(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)、恶性贫血、寻常型天疱疮、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、巨细胞动脉炎、重症肌无力、多发性硬化症(MS)(例如，复发缓解型多发性硬化症(RRMS))、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、大疱性类天疱疮、溃疡性结肠炎、格巴二氏综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、抗磷脂综合征、发作性睡病、结节病、和韦格纳氏肉芽肿病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗干燥综合征。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗硬皮病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗类风湿性关节炎(RA)。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗幼年特发性关节炎。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗移植物抗宿主病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗皮肌炎。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗I型糖尿病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗桥本氏甲状腺炎。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗格雷夫斯病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗爱迪生氏病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗乳糜泻。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗克罗恩病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗恶性贫血。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗寻常型天疱疮。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗白癜风。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗自身免疫性溶血性贫血。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗特发性血小板减少性紫癜。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗巨细胞动脉炎。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗重症肌无力。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗多发性硬化症(MS)。在一些实施例中，所述MS是复发缓解型多发性硬化症(RRMS)。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗肾小球肾炎。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗肺出血肾炎综合征。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗大疱性类天疱疮。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗溃疡性结肠炎。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗格巴二氏综合征。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗抗磷脂综合征。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗发作性睡病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗结节病。
在一些实施例中，所述CD19结合分子用于治疗韦格纳氏肉芽肿病。
与CD19表达相关的其他非癌症相关疾病和障碍的实例包括但不限于：病毒，例如HIV、感染和真菌，例如新隐球菌、感染。
7.17.组合疗法
本披露的CD19结合分子可以与其他已知的药剂和疗法组合使用。例如，所述CD19结合分子可以用于治疗方案，所述治疗方案与手术、化疗、抗体、辐射、肽疫苗、类固醇、细胞毒素、蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物(例如IMiD)、BH3模拟物、细胞因子疗法、干细胞移植或其任何组合进行组合。
为了方便起见，与CD19结合分子组合使用的药剂在本文中被称为“另外的”药剂。
如本文所用的，“组合”给予意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有障碍后并且在所述障碍被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，第一治疗的递送在第二治疗的递送开始时仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。例如，可以将每种疗法在相同的时间或以任何顺序依序在不同的时间点给予至受试者；然而，如果不在相同的时间给予，则它们应当在时间上充分接近地给予，从而以提供所希望的治疗效果。
CD19结合分子和一种或多种另外的药剂可以以相同或分开的组合物同时或依序给予。对于依序给予，可以首先给予CD19结合分子并且可以其次给予另外的药剂，或者可以颠倒给予顺序。
所述CD19结合分子和一种或多种另外的药剂可以以任何适当的形式和通过任何合适的途径给予至受试者。在一些实施例中，所述给予途径是相同的。在其他实施例中，所述给予途径是不同的。
在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。
在每一种情况的一些实施例中，治疗因组合施用而更有效。例如，与不存在第一治疗的条件下给予第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如使用更少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗将症状减少更大的程度，或者观察到对第一治疗而言类似的情况。在一些实施例中，与一种治疗不存在的情况下递送另一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与所述障碍相关的有他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可以检测的。
所述CD19结合分子和/或另外的药剂可以在活性障碍期间，或在缓解或活性较低的疾病期间给予。CD19结合分子可以在用一种或多种另外的药剂治疗之前给予，与用一种或多种另外的药剂治疗并行给予，在用一种或多种另外的药剂治疗后给予，或在障碍缓解期间给予。
当组合给予时，可以将CD19结合分子和/或一种或多种另外的药剂以比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量给予。
本披露的组合疗法的一种或多种另外的药剂可以并行给予至受试者。所述术语“并行”不限于在完全相同的时间给予疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是意指将包含CD19结合分子的药物组合物以一种顺序并在一定时间间隔内向受试者给予，使得本披露的分子可以与一种或多种另外的疗法一起发挥作用，以提供增加的益处(与如果以其他方式给予它们时相比)。例如，可以将每种疗法在相同的时间或以任何顺序依序在不同的时间点给予至受试者；然而，如果不在相同的时间施用，则应当在时间上充分接近地施用所述疗法，以提供所希望的治疗或预防作用。可以将每种疗法以任何适当的形式并且通过任何合适的途径分别施用至受试者。
所述CD19结合分子和一种或多种另外的药剂可以通过相同或不同给予途径给予至受试者。
可以循环给予所述CD19结合分子和一种或多种另外的药剂。循环疗法涉及给予第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，然后给予第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间，任选地，然后给予第三疗法(例如，预防剂或治疗剂)一段时间等，并重复这种依序给予，即循环，以减少对所述疗法之一的抗性的发展，以避免或减少所述疗法之一的副作用，和/或以改善所述疗法的功效。
在某些情况下，所述一种或多种另外的药剂是其他抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或抗呕剂)、镇痛药、细胞保护剂及其组合。
在一个实施例中，CD19结合分子可以与抗癌剂(例如，化学治疗剂)组合使用。示例性化疗剂包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑珠单抗、吉妥单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、奥比妥珠单抗、奥法木单抗、达雷妥木单抗、依洛妥珠单抗)、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调制剂如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。
考虑用于组合疗法的一般化疗药剂包括阿那曲唑
Figure BDA0003360067460003731
比卡鲁胺
Figure BDA0003360067460003732
硫酸博莱霉素
Figure BDA0003360067460003733
白消安
Figure BDA0003360067460003734
白消安注射液
Figure BDA0003360067460003735
卡培他滨
Figure BDA0003360067460003736
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0003360067460003737
卡莫司汀
Figure BDA0003360067460003738
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003360067460003739
顺铂
Figure BDA00033600674600037310
克拉屈滨
Figure BDA00033600674600037311
环磷酰胺(
Figure BDA00033600674600037312
或
Figure BDA00033600674600037313
)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷
Figure BDA00033600674600037314
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA00033600674600037315
达卡巴嗪
Figure BDA00033600674600037316
更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA00033600674600037317
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
Figure BDA00033600674600037318
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00033600674600037319
盐酸多柔比星
Figure BDA00033600674600037320
Figure BDA00033600674600037321
依托泊苷
Figure BDA00033600674600037322
磷酸氟达拉滨
Figure BDA00033600674600037323
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00033600674600037324
氟他胺
Figure BDA00033600674600037325
tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲
Figure BDA00033600674600037326
伊达比星
Figure BDA00033600674600037327
异环磷酰胺
Figure BDA00033600674600037328
伊立替康
Figure BDA00033600674600037329
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00033600674600037330
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure BDA00033600674600037331
6-巯基嘌呤
Figure BDA00033600674600037332
甲氨蝶呤
Figure BDA00033600674600037333
米托蒽醌(mitoxantrone)
Figure BDA00033600674600037334
吉妥单抗(mylotarg)、紫杉醇
Figure BDA00033600674600037335
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、polifeprosan 20共卡莫司汀植入物
Figure BDA00033600674600037336
柠檬酸它莫西芬
Figure BDA00033600674600037337
替尼泊苷
Figure BDA00033600674600037338
6-硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)
Figure BDA00033600674600037339
注射用托泊替康盐酸盐
Figure BDA00033600674600037340
长春花碱
Figure BDA00033600674600037341
长春新碱
Figure BDA00033600674600037342
和长春瑞滨
Figure BDA00033600674600037343
用于与本披露的CD19结合分子组合的特别感兴趣的抗癌剂包括：蒽环霉素；烷基化剂；抗代谢物；抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶或p70S6激酶FK506)或抑制p70S6激酶的药物；mTOR抑制剂；免疫调节剂；蒽环霉素；长春花生物碱；蛋白酶体抑制剂；GITR激动剂(例如，GWN323)；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；CDK4激酶抑制剂；BTK抑制剂；MKN激酶抑制剂；DGK激酶抑制剂；溶瘤病毒；BH3模拟物；和细胞因子疗法。
示例性的烷化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀(Aminouracil
Figure BDA0003360067460003741
Figure BDA0003360067460003742
Figure BDA0003360067460003743
Figure BDA0003360067460003744
)、氮芥(chlormethine)
Figure BDA0003360067460003745
环磷酰胺(
Figure BDA0003360067460003746
Figure BDA0003360067460003747
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA0003360067460003748
美法仑
Figure BDA0003360067460003749
苯丁酸氮芥
Figure BDA00033600674600037410
哌泊溴烷
Figure BDA00033600674600037411
三乙烯蜜胺
Figure BDA00033600674600037412
三乙烯硫代磷酰胺、替莫唑胺
Figure BDA00033600674600037413
噻替派
Figure BDA00033600674600037414
白消安
Figure BDA00033600674600037415
Figure BDA00033600674600037416
卡莫司汀
Figure BDA00033600674600037417
洛莫司汀
Figure BDA00033600674600037418
链脲佐菌素
Figure BDA00033600674600037419
和达卡巴嗪
Figure BDA00033600674600037420
另外的示例性烷基化剂包括但不限于奥沙利铂
Figure BDA00033600674600037421
替莫唑胺(
Figure BDA00033600674600037422
和
Figure BDA00033600674600037423
)；放线菌素D(也称为放线菌素-D，
Figure BDA00033600674600037424
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素、和苯丙氨酸氮芥，
Figure BDA00033600674600037425
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00033600674600037426
)；卡莫司汀
Figure BDA00033600674600037427
苯达莫司汀
Figure BDA00033600674600037428
白消安(
Figure BDA00033600674600037429
和
Figure BDA00033600674600037430
)；卡铂
Figure BDA00033600674600037431
洛莫司汀(也称为CCNU，
Figure BDA00033600674600037432
)；顺铂(也称为CDDP，
Figure BDA00033600674600037433
和
Figure BDA00033600674600037434
-AQ)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00033600674600037435
环磷酰胺(
Figure BDA00033600674600037436
和
Figure BDA00033600674600037437
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺，
Figure BDA00033600674600037438
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00033600674600037439
)；异环磷酰胺
Figure BDA00033600674600037440
泼尼氮芥(Prednumustine)；甲苄肼
Figure BDA00033600674600037441
氮芥(Mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和盐酸氮芥，
Figure BDA00033600674600037442
)；链脲霉素
Figure BDA00033600674600037443
噻替哌(也称为硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、TESPA和TSPA，
Figure BDA00033600674600037444
)；环磷酰胺
Figure BDA00033600674600037445
Figure BDA0003360067460003751
和盐酸盐酸苯达莫司汀
Figure BDA0003360067460003752
示例性mTOR抑制剂包含例如坦罗莫司；地磷莫司(正式称为地弗罗莫司(deferolimus)，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氮杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且描述于PCT公开号WO 03/064383中)；依维莫司(
Figure BDA0003360067460003753
或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，
Figure BDA0003360067460003754
)；塞马莫德(simapimod)(CAS 164301-51-3)；西罗莫司(emsirolimus)，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:757)，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)、XL765。
示例性免疫调节剂包括，例如，阿夫土珠(afutuzumab)(可从
Figure BDA0003360067460003755
获得)；乙二醇化非格司亭
Figure BDA0003360067460003756
来那度胺(CC-5013，
Figure BDA0003360067460003757
)；IMID(如沙利度胺
Figure BDA0003360067460003758
来那度胺、泊马度胺、和阿普斯特)、actimid(CC4047)；和IRX-2(人细胞因子的混合物，包括白细胞介素1、白细胞介素2、和干扰素γ，CAS 951209-71-5，可从IRXTherapeutics公司获得)。
示例性蒽环类药物包括，例如，阿霉素(
Figure BDA0003360067460003759
和
Figure BDA00033600674600037510
)；博莱霉素
Figure BDA00033600674600037511
柔红霉素(盐酸柔红霉素、正定霉素、和盐酸红比霉素，
Figure BDA00033600674600037512
)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，
Figure BDA00033600674600037513
)；米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00033600674600037514
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星
Figure BDA00033600674600037515
丝裂霉素C
Figure BDA00033600674600037516
格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)；和去乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)。
示例性长春花生物碱包括，例如，酒石酸长春瑞滨
Figure BDA0003360067460003761
长春新碱
Figure BDA0003360067460003762
和长春地辛
Figure BDA0003360067460003763
长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB，
Figure BDA0003360067460003764
和
Figure BDA0003360067460003765
)；和长春瑞滨
Figure BDA0003360067460003766
示例性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米
Figure BDA0003360067460003767
卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；柠檬酸伊沙佐米(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
示例性BH3模拟物包括维尼托克莱克斯(venetoclax)(ABT-737，4-{4-[(4’-氯-2-二苯基基)甲基]-1-哌嗪基}-N-[(4-{[(2R)-4-(二甲基氨基)-1-(苯基硫烷基)-2-丁基]氨基}-3-硝基苯基)磺酰基]苯甲酰胺和那维托克莱克斯(navitoclax)(以前称为ABT-263)。
示例性细胞因子疗法包括白介素2(IL-2)和干扰素-α(IFN-α)。
在某些方面，不同的化学治疗剂的“混合物”作为一种或多种另外的药剂给予。
在一些实施例中，CD19结合分子可以与沙利度胺类化合物的成员组合使用。沙利度胺类别化合物的成员包括，但不限于，来那度胺(CC-5013)、泊马度胺(CC-4047或ACTIMID)、沙利度胺及其盐和衍生物。在一些实施例中，所述CD19结合分子与沙利度胺类化合物的一、二、三、或更多个成员组合使用。沙利度胺类似物和沙利度胺类似物的免疫调节剂特性描述于Bodera和Stankiewicz,Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov.[内分泌最新专利代谢免疫药物发现]2011年9月；5(3):192-6。沙利度胺类似物和E3泛素的结构复合物描述于Gandhi等人,Br J Haematol.[英国血液病杂志]2014年3月；164(6):811-21中。通过利度胺类似物调节E3泛素连接酶描述于Fischer等人,Nature.[自然]2014年8月7日；512(7512):49-53中。
在一些实施例中，所述沙利度胺类化合物的成员包含具有式(I)的化合物：
Figure BDA0003360067460003771
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、或互变异构体，其中：
X是O或S；
R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、碳环基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤素、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基、和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤素、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、碳环基、杂环基、芳基、和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基、或杂芳基，其中每个芳基和杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤素、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
N是0、1、2、3或4；以及
x是0、1、或2。
在一些实施例中，X是O。
在一些实施例中，R1是杂环基。在一些实施例中，R1是6元杂环基、或5元杂环基。在一些实施例中，R1是含氮杂环基。在一些实施例中，R1是哌啶基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。
在一些实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在一些实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。
在一些实施例中，R3是C1-C6杂烷基、-N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA。在一些实施例中，R3是C1-C6杂烷基(例如，CH2NHC(O)CH2-苯基-叔丁基)、-N(RC)(RD)(例如，NH2)、或-N(RC)C(O)RA(例如，NHC(O)CH3)。
在实施例中，X是O。在实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在实施例中，n是1。在实施例中，R3是-N(RC)(RD)(例如，-NH2)。在实施例中，所述化合物包含来那度胺，例如，3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮，或其药学上可接受的盐。在实施例中，所述化合物是来那度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0003360067460003781
在实施例中，X是O。在实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶基-2,6-二酮基)。在一些实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。在实施例中，n是1。在实施例中，R3是-N(RC)(RD)(例如，-NH2)。在实施例中，所述化合物包含泊马度胺，例如，4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮，或其药学上可接受的盐。在实施例中，所述化合物是泊马度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0003360067460003791
在实施例中，X是O。在实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶基-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。在实施例中，n是0。在实施例中，所述化合物包含沙利度胺，例如，2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮，或其药学上可接受的盐。在实施例中，所述产物是沙利度胺，例如，根据下式：
Figure BDA0003360067460003792
在实施例中，X是O。在实施例中，R1是杂环基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。在实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在实施例中，n是1。在实施例中，R3是C1-C6杂烷基(例如，CH2NHC(O)CH2-苯基-叔丁基)。在实施例中，所述化合物包含2-(4-(叔丁基)苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)乙酰胺，或其药学上可接受的盐。在实施例中，所述化合物具有如下式所示的结构：
Figure BDA0003360067460003793
在一些实施例中，所述化合物是具有式(I-a)的化合物：
Figure BDA0003360067460003794
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、或互变异构体，其中：
环A是碳环基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个任选地被一个或多个R4取代；
M不存在、是C1-C6烷基、是C2-C6烯基、是C2-C6炔基、或是C1-C6杂烷基，其中每个烷基、烯基、炔基、和杂烷基任选地被一个或多个R4取代；
R2a和R2b中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；或R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团或硫代羰基基团；
R3a是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤素、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基、和杂烷基任选地被一个或多个R6取代；
每个R3独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤素、氰基、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、-S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、或-N(RC)S(O)xRE，其中每个烷基、烯基、炔基、和杂烷基独立地且任选地被一个或多个R6取代；
每个R4独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、卤代、氰基、氧代、-C(O)RA、-C(O)ORB、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、S(O)xRE、-S(O)xN(RC)(RD)、-N(RC)S(O)xRE、碳环基、杂环基、芳基、或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基、或杂芳基独立地且任选地被一个或多个R7取代；
RA、RB、RC、RD、和RE中的每个独立地是氢或C1-C6烷基；
每个R6独立地是C1-C6烷基、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、-N(RC)C(O)RA、芳基、或杂芳基，其中每个芳基或杂芳基独立地且任选地被一个或多个R8取代；
每个R7独立地是卤素、氧代、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
每个R8独立地是C1-C6烷基、氰基、-ORB、-N(RC)(RD)、-C(O)N(RC)(RD)、或-N(RC)C(O)RA；
N是0、1、2、或3；
O是0、1、2、3、4、或5；以及
x是0、1、或2。
在一些实施例中，X是O。
在一些实施例中，M不存在。
在一些实施例中，环A是杂环基。在一些实施例中，环A是杂环基，例如，6元杂环基、或5元杂环基。在一些实施例中，环A是含氮杂环基。在一些实施例中，环A是哌啶基(例如，哌啶-2,6-二酮基)。
在一些实施例中，M不存在且环A是杂环基(例如，哌啶基，例如，哌啶-2,6-二酮基)。
在一些实施例中，R2a和R2b中的每个独立地是氢。在一些实施例中，R2a和R2b连同与它们所附接的碳原子形成羰基基团。
在一些实施例中，R3a是氢、-N(RC)(RD)或-N(RC)C(O)RA。在一些实施例中，R3a是氢。在一些实施例中，R3a是-N(RC)(RD)(例如，-NH2)。在一些实施例中，R3a是-N(RC)C(O)RA(例如，NHC(O)CH3)。
在一些实施例中，R3是C1-C6杂烷基(例如，CH2NHC(O)CH2-苯基-叔丁基)。在一些实施例中，n是0或1。在一些实施例中，n是0。在一些实施例中，n是1。
所述化合物可以包含一种或多种手性中心或作为一种或多种立体异构体存在。在一些实施例中，所述化合物包含单一手性中心且是立体异构体(例如，R立体异构体和S立体异构体)的混合物。在一些实施例中，所述混合物包含一定比率的R立体异构体与S立体异构体，例如，R立体异构体与S立体异构体的比率为约1:1(即，外消旋混合物)。在一些实施例中，所述混合物包含R立体异构体与S立体异构体，其比例为约51:49、约52:48、约53:47、约54:46、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、或约99:1。在一些实施例中，所述混合物包含S立体异构体与R立体异构体，其比率为约51:49、约52:48、约53:47、约54:46、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、或约99:1。在一些实施例中，所述化合物是具有式(I)或式(I-a)的单一立体异构体，例如，单一R立体异构体或单一S立体异构体。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与激酶抑制剂组合给予。在一个实施例中，所述激酶抑制剂是PI3-激酶抑制剂，例如，CLR457、BGT226、或BYL719。在一个实施例中，所述激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如本文所述的CDK4抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，例如像6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮,盐酸盐(也称为帕柏西利或PD0332991)。在一个实施例中，所述激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如本文描述的BTK抑制剂，例如像依鲁替尼。在一个实施例中，所述激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如本文描述的mTOR抑制剂，例如像雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。所述mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文描述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施例中，所述激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如本文描述的MNK抑制剂，例如像4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。所述MNK抑制剂可以是例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。在一个实施例中，所述激酶抑制剂是本文所述的双PI3K/mTOR抑制剂，例如像PF-04695102。在一个实施例中，所述激酶抑制剂是DGK抑制剂，例如本文所述的DGK抑制剂，例如像DGKinh1(D5919)或DGKinh2(D5794)。
在一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在实施例中，所述BTK抑制剂不会降低或抑制白细胞介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834、RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一个实施例中，所述激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如依鲁替尼(PCI-32765)。在一些实施例中，将CD19结合分子与BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)组合给予至受试者。在实施例中，将CD19结合分子与依鲁替尼(也称为PCI-32765)组合给予至受试者(例如，给予至患有CLL、套细胞淋巴瘤(MCL)、或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)的受试者)。例如，受试者可以在染色体17的短臂中具有缺失(例如白血病细胞中的del(17p))。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在一些实施例中，受试者患有复发CLL或SLL，例如受试者此前已给予癌症疗法(例如此前已给予一次、两次、三次、或四次先前癌症疗法)。在一些实施例中，受试者患有难治性CLL或SLL。在其他实施例中，受试者患有滤泡性淋巴瘤，例如复发或难治性滤泡性淋巴瘤。在一些实施例中，将依鲁替尼以约300-600mg/天(例如约300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、或550-600mg/天，例如约420mg/天或约560mg/天)的剂量例如口服给予。在一些实施例中，依鲁替尼以每天约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量给予一段时间，例如每天给予达21天周期，或每天给予达28天周期。在一个实施例中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。在一些实施例中，将依鲁替尼与利妥昔单抗组合给予。参见例如，Burger等人,2013.Ibrutinib In Combination WithRituximab(iR)Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable RemissionsIn Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia(CLL):New,UpdatedResults Of a Phase II Trial In 40Patients[与利妥昔单抗(iR)组合的依鲁替尼耐受良好并且在高风险慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者中诱导高比率的持久缓解：40名患者的II期试验的新的更新结果],文摘675,55th ASH Annual Meeting and Exposition,NewOrleans,LA 7-10 Dec[12月7-10日路易斯安娜州新奥尔良第55届ASH年会和博览会上的演讲]。不受理论的束缚，据认为添加依鲁替尼增强了T细胞增殖响应，并且可以使T细胞从T-辅助性-2(Th2)转变为T-辅助性-1(Th1)表型。Th1和Th2是辅助性T细胞的表型，其中Th1相比Th2指导不同的免疫响应途径。Th1表型与促炎响应相关，例如用于杀伤细胞(如细胞内病原体/病毒或癌细胞)，或使自身免疫响应永久化。Th2表型与嗜酸性粒细胞积累和抗炎症响应相关。
在一些实施例中，将CD19结合分子与表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂组合给予。
在一些实施例中，EGFR抑制剂是(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰)氮杂环庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基异烟酰胺(化合物A40)或在PCT公开号WO 2013/184757中披露的化合物。
在一些实施例中，所述EGFR抑制剂，例如，(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰)氮杂环庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基异烟酰胺(化合物A40)、或在PCT公开号WO 2013/184757中披露的化合物，以例如每天150-250mg的剂量给予。在一些实施例中，所述EGFR抑制剂，例如，(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰)氮杂环庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基异烟酰胺(化合物A40)、或在PCT公开号WO2013/184757中披露的化合物，以约150、200、或250mg，或约150-200或200-250mg的剂量给予。
在一些实施例中，所述EGFR抑制剂(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰)氮杂环庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基异烟酰胺(化合物A40)、或在PCT公开号WO 2013/184757中披露的化合物，是共价的、不可逆的酪氨酸激酶抑制剂。在某些实施例中，所述EGFR抑制剂，(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰)氮杂环庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基异烟酰胺(化合物A40)、或在PCT公开号WO 2013/184757中披露的化合物，抑制活化性EGFR突变(L858R，ex19del)。在其他实施例中，所述EGFR抑制剂，(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰)氮杂环庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基异烟酰胺(化合物A40)、或在PCT公开号WO 2013/184757中披露的化合物，不抑制、或不实质上抑制野生型(wt)EGFR。化合物A40在EGFR突变NSCLC患者中显示出功效。在一些实施例中，所述EGFR抑制剂(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰)氮杂环庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基异烟酰胺(化合物A40)、或在PCT公开号WO 2013/184757中披露的化合物还抑制TEC家族激酶中的一种或多种激酶。Tec家族激酶包括，例如，ITK、BMX、TEC、RLK、和BTK，并且在T-细胞受体传播和趋化因子受体信号传导中是最重要的(Schwartzberg等人(2005)Nat.Rev.Immunol.[免疫学综述]第284-95页)。例如，化合物A40可以抑制ITK，其中生化IC50为1.3nM。ITK是Th2细胞存活的关键酶，其抑制作用导致Th2和Th1细胞之间平衡的转变。
在一些实施例中，EGFR抑制剂选自厄洛替尼、吉非替尼、塞妥昔单抗、帕尼妥木单抗、奈西妥木单抗、PF-00299804、尼莫妥珠单抗、或RO5083945之一。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与腺苷A2A受体(A2AR)拮抗剂组合给予。示例性A2AR拮抗剂包括，例如，PBF509(帕罗生物制药公司/诺华公司(Palobiofarma/Novartis))、CPI444/V81444(卡沃斯公司/基因泰克公司(Corvus/Genentech))、AZD4635/HTL-1071(阿斯利康公司/海普泰公司(AstraZeneca/Heptares))、维帕迪南(Redox/Juno公司)、GBV-2034(Globavir公司)、AB928(阿克斯生物科学公司(Arcus Biosciences))、茶碱、伊曲茶碱(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo))、托扎迪南/SYN-115(Acorda公司)、KW-6356(协和发酵工业株式会社)、ST-4206(理地安生物科学公司(LeadiantBiosciences))、普瑞迪南/SCH 420814(默克公司/谢林公司(Merck/Schering))、和NIR178(诺华公司)。
在某些实施例中，A2AR拮抗剂是PBF509。PBF509和其他A2AR拮抗剂披露于US 8,796,284和WO 2017/025918中。在某些实施例中，所述A2AR拮抗剂是5-溴-2,6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺。在某些实施例中，A2AR拮抗剂具有以下结构：
Figure BDA0003360067460003861
在某些实施例中，A2AR拮抗剂是CPI444/V81444。CPI-444和其他A2AR拮抗剂披露于WO 2009/156737中。在某些实施例中，A2AR拮抗剂是(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(((四氢呋喃-3-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺。在某些实施例中，A2AR拮抗剂是(R)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(((四氢呋喃-3-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺，或其外消旋体。在某些实施例中，A2AR拮抗剂是7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(((四氢呋喃-3-基)氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺。在某些实施例中，A2AR拮抗剂具有以下结构：
Figure BDA0003360067460003862
在某些实施例中，A2AR拮抗剂是AZD4635/HTL-1071。A2AR拮抗剂披露于WO 2011/095625中。在某些实施例中，A2AR拮抗剂是6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1,2,4-三嗪-3-胺。在某些实施例中，A2AR拮抗剂具有以下结构：
Figure BDA0003360067460003863
在某些实施例中，A2AR拮抗剂是ST-4206(理地安生物科学公司)。在某些实施例中，所述A2AR拮抗剂是描述于US 9,133,197中的A2AR拮抗剂。在某些实施例中，A2AR拮抗剂具有以下结构：
Figure BDA0003360067460003871
在某些实施例中，所述A2AR拮抗剂是描述于US 8114845、US 9029393、US20170015758、或US 20160129108中的A2AR拮抗剂。
在某些实施例中，A2AR拮抗剂是伊曲茶碱(CAS注册号：155270-99-8)。伊曲茶碱也称为KW-6002或8-[(E)-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙烯基]-1,3-二乙基-7-甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮。例如，在LeWitt等人,(2008)Annals of Neurology[神经病学年鉴]63(3):295-302)中披露了伊曲茶碱。
在某些实施例中，A2aR拮抗剂是托扎迪南(Biotie公司)。托扎迪南也称为SYN115或4-羟基-N-(4-甲氧基-7-吗啉-4-基-1,3-苯并噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺。托扎迪南阻断在A2a受体上的内源性腺苷的作用，导致多巴胺对D2受体的作用增强，并抑制mGluR5受体上的谷氨酸的作用。在一些实施例中，A2aR拮抗剂是普瑞迪南(CAS登记号：377727-87-2)。普瑞迪南也称为SCH 420814或2-(2-呋喃基)-7-[2-[4-[4-(2-甲氧基乙氧基)苯基]-1-哌嗪基]乙基]7H-吡唑并[4,3-e][1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-5-胺。普瑞迪南被开发为一种药物，可作为腺苷A2A受体的有效和选择性拮抗剂。
在某些实施例中，A2aR拮抗剂是维帕迪南。维帕迪南也称为BIIB014、V2006、或3-[(4-氨基-3-甲基苯基)甲基]-7-(呋喃-2-基)三唑并[4,5-d]嘧啶-5-胺。
其他示例性A2aR拮抗剂包括例如，ATL-444、MSX-3、SCH-58261、SCH-412,348、SCH-442,416、VER-6623、VER-6947、VER-7835、CGS-15943、或ZM-241,385。
在一些实施例中，A2aR拮抗剂是A2aR途径拮抗剂(例如，CD-73抑制剂，例如抗CD73抗体)是MEDI9447。MEDI9447是对CD73具有特异性的单克隆抗体。通过CD73靶向腺苷的细胞外产生可以降低腺苷的免疫抑制作用。MEDI9447报道为具有一系列活性，例如，抑制CD73外核苷酸酶活性、减轻AMP介导的淋巴细胞抑制、以及抑制同基因肿瘤生长。MEDI9447可以驱动肿瘤微环境中骨髓和淋巴浸润白细胞群体两者的变化。这些变化包括例如CD8效应细胞和活化的巨噬细胞的增加，以及骨髓源性抑制细胞(MDSC)和调节性T淋巴细胞的比例的降低。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与CD20抑制剂组合给予。
在一个实施例中，所述CD20抑制剂是抗CD20抗体或其片段。在实施例中，所述抗体是单特异性抗体，并且在另一个实施例中，抗体是双特异性抗体。在实施例中，所述CD20抑制剂是嵌合小鼠/人单克隆抗体，例如利妥昔单抗。在实施例中，所述CD20抑制剂是人单克隆抗体，如奥法木单抗。在实施例中，所述CD20抑制剂是人源化抗体，如奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)或PRO131921(基因泰克公司)。在实施例中，所述CD20抑制剂是融合蛋白，所述融合蛋白包含抗CD20抗体的一部分，如TRU-015(特鲁比昂药品公司(TrubionPharmaceuticals))。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与CD22抑制剂组合给予。在一些实施例中，所述CD22抑制剂是小分子或抗CD22抗体分子。在一些实施例中，所述抗体是单特异性抗体，任选地缀合至第二药剂(例如化学治疗剂)。例如，在实施例中，所述抗体是抗CD22单克隆抗体-MMAE缀合物(例如，DCDT2980S)。在实施例中，所述抗体是抗CD22抗体的scFv，例如抗体RFB4的scFv。该scFv可以与假单胞菌外毒素-A的全部或片段融合(例如，BL22)。在实施例中，所述抗体是人源化抗CD22单克隆抗体(例如，依帕珠单抗(epratuzumab))。在实施例中，所述抗体或其片段包括抗CD22抗体的Fv部分，所述Fv部分任选地与假单胞菌外毒素-A的全部或片段(例如，38KDa片段)共价融合(例如，帕舒托-莫塞妥莫单抗(moxetumomabpasudotox))。在实施例中，所述抗CD22抗体是抗CD19/CD22双特异性抗体，任选地缀合至毒素。例如，在一个实施例中，所述抗CD22抗体包含任选地与白喉毒素(DT)的全部或一部分(例如，白喉毒素(DT)的前389个氨基酸，DT 390)连接的抗CD19/CD22双特异性部分(例如，识别人CD19和CD22的两种scFv配体)，例如配体定向毒素，如DT2219ARL)。在另一个实施例中，所述双特异性部分(例如，抗CD19/抗CD22)与毒素如去糖基化的蓖麻毒蛋白A链(例如，Combotox)连接。
在一些实施例中，所述CD22抑制剂是多特异性抗体分子，例如双特异性抗体分子，例如结合CD20和CD3的双特异性抗体分子。结合CD20和CD3的示例性双特异性抗体分子披露于WO 2016086189和WO 2016182751中。在一些实施例中，所述结合CD20和CD3的双特异性抗体分子是如披露于WO 2016086189的图74以及SEQ ID NO:323、324和325中的XENP13676。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与FCRL2或FCRL5抑制剂组合给予。在一些实施例中，所述FCRL2或FCRL5抑制剂是抗FCRL2抗体分子，例如双特异性抗体分子，例如结合FCRL2和CD3的双特异性抗体。在一些实施例中，所述FCRL2或FCRL5抑制剂是抗FCRL5抗体分子，例如双特异性抗体分子，例如结合FCRL5和CD3的双特异性抗体。
示例性抗FCRL5抗体分子披露于US 20150098900、US 20160368985、WO2017096120中(例如，披露于WO 2017096120中的抗体ET200-001、ET200-002、ET200-003、ET200-006、ET200-007、ET200-008、ET200-009、ET200-010、ET200-011、ET200-012、ET200-013、ET200-014、ET200-015、ET200-016、ET200-017、ET200-018、ET200-019、ET200-020、ET200-021、ET200-022、ET200-023、ET200-024、ET200-025、ET200-026、ET200-027、ET200-028、ET200-029、ET200-030、ET200-031、ET200-032、ET200-033、ET200-034、ET200-035、ET200-037、ET200-038、ET200-039、ET200-040、ET200-041、ET200-042、ET200-043、ET200-044、ET200-045、ET200-069、ET200-078、ET200-079、ET200-081、ET200-097、ET200-098、ET200-099、ET200-100、ET200-101、ET200-102、ET200-103、ET200-104、ET200-105、ET200-106、ET200-107、ET200-108、ET200-109、ET200-110、ET200-111、ET200-112、ET200-113、ET200-114、ET200-115、ET200-116、ET200-117、ET200-118、ET200-119、ET200-120、ET200-121、ET200-122、ET200-123、ET200-125、ET200-005和ET200-124)。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与IL15/IL-15Ra复合物组合给予。在一些实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物选自NIZ985(诺华公司)、ATL-803(亚拉斯托公司(Altor))或CYP0150(Cytune公司)。
在一些实施例中，所述IL-15/IL-15Ra复合物包含人IL-15，其与人IL-15Ra的可溶形式复合。该复合物可以包含共价或非共价连接至IL-15Ra的可以溶性形式的IL-15。在具体的实施例中，人IL-15非共价地与可溶形式的IL-15Ra结合。在具体的实施例中，所述组合物的人IL-15包含WO 2014/066527中所述的氨基酸序列，并且所述人IL-15Ra的可溶形式包含WO 2014/066527中所述的氨基酸序列。本文所述的分子可以通过载体、宿主细胞、和在WO2007/084342中描述的方法制得。
在一些实施例中，所述IL-15/IL-15Ra复合物是ALT-803，IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白(IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc可溶性复合物)。ALT-803披露于WO 2008/143794中。
在一些实施例中，所述IL-15/IL-15Ra复合物包含与IL-15Ra的sushi结构域融合的IL-15(CYP0150，Cytune公司)。IL-15Ra的sushi结构域是指在IL-15Ra的信号肽之后的第一半胱氨酸残基处开始并且在所述信号肽之后的第四个半胱氨酸残基处结束的结构域。与IL-15Ra的sushi结构域融合的IL-15的复合物披露在WO 2007/04606和WO 2012/175222中。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与PD-1抑制剂组合给予。在一些实施例中，所述PD-1抑制剂选自PDR001(诺华公司)、纳武单抗(百时美施贵宝公司)、兰洛利珠单抗(默克公司(Merck&Co))、匹地利珠单抗(CureTech公司)、MEDI0680(英商梅迪缪思有限公司(Medimmune))、REGN2810(再生元公司(Regeneron))、TSR-042(Tesaro公司)、PF-06801591(辉瑞制药公司(Pfizer))、BGB-A317(百济神州公司(Beigene))、BGB-108(百济神州公司)、INCSHR1210(因赛特公司(Incyte))、或AMP-224(Amplimmune公司)。在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子。在一个实施例中，所述PD-1抑制剂是如描述于US 2015/0210769中的抗PD-1抗体分子。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是纳武单抗(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))，也称为MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558、或
Figure BDA0003360067460003911
纳武单抗(克隆5C4)和其他抗PD-1抗体披露在US 8,008,449和WO 2006/121168中。在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：纳武单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是派姆单抗(默克公司(Merck&Co))，也称为兰罗利珠单抗(Lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475、或
Figure BDA0003360067460003912
派姆单抗和其他抗PD-1抗体披露于Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志]369(2):134-44、US 8,354,509和WO 2009/114335中。在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：兰洛利珠单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是匹地利珠单抗(治疗科技公司(CureTech))，也称为CT-011。匹地利珠单抗和其他抗PD-1抗体披露于Rosenblatt,J.等人,(2011)JImmunotherapy[免疫疗法杂志]34(5):409-18；US 7,695,715；US 7,332,582；和US 8,686,119中。在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：匹地利珠单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗PD-1抗体分子是MEDI0680(英商梅迪缪思有限公司)，也称为AMP-514。MEDI0680和其他抗PD-1抗体披露于US 9,205,148和WO 2012/145493中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：MEDI0680的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是REGN2810(再生元公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：REGN2810的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是PF-06801591(辉瑞公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：PF-06801591的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是BGB-A317或BGB-108(百济神州公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：BGB-A317、或BGB-108的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是INCSHR1210(因赛特公司)，也称为INCSHR01210或SHR-1210。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：INCSHR1210的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是TSR-042(泰萨罗公司)，也称为ANB011。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一种或多种：TSR-042的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗PD-1抗体包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/112800、WO2016/092419、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/209804、WO2015/200119、US 8,735,553、US 7,488,802、US 8,927,697、US 8,993,731、和US 9,102,727。
在一个实施例中，抗PD-1抗体是与本文所述的抗PD-1抗体之一竞争与PD-1上的相同表位结合和/或结合PD-1上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，所述PD-1抑制剂是例如如美国8,907,053中所述抑制PD-1信号传导途径的肽。在一个实施例中，所述PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一个实施例中，所述PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg(安普利公司(Amplimmun))，例如披露于WO 2010/027827和WO 2011/066342中)。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与PD-L1抑制剂组合给予。在一些实施例中，所述PD-L1抑制剂选自FAZ053(诺华公司)；阿特利珠单抗(基因泰克公司/罗氏公司)；阿维鲁单抗(默克雪兰诺公司(Merck Serono)和辉瑞制药公司)；度伐鲁单抗(英商梅迪缪思有限公司/阿斯利康公司)；或BMS-936559(百时美施贵宝)。
在一个实施例中，所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体分子。在一个实施例中，所述PD-L1抑制剂是如披露于US 2016/0108123中的抗PD-L1抗体分子。
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子是阿特利珠单抗(基因泰克公司/罗氏公司)，也称为MPDL3280A、RG7446、RO5541267、YW243.55.S70、或TECENTRIQTM。阿特利珠单抗和其他抗PD-L1抗体披露于US 8,217,149中。在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子包含以下中的一个或多个：阿特利珠单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子是阿维鲁单抗(默克雪兰诺公司和辉瑞公司)，也称为MSB0010718C。阿维鲁单抗和其他抗PD-L1抗体披露于WO 2013/079174中。在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子包含以下中的一个或多个：阿维鲁单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子是度伐鲁单抗(英商梅迪缪思有限公司/阿斯利康公司)，也称为MEDI4736。度伐鲁单抗和其他抗PD-L1抗体披露于US 8,779,108中。在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子包含以下中的一个或多个：度伐鲁单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子是BMS-936559(百时美施贵宝公司)，也称为MDX-1105或12A4。BMS-936559和其他抗PD-L1抗体披露于US 7,943,743和WO 2015/081158中。在一个实施例中，所述抗PD-L1抗体分子包含以下中的一个或多个：BMS-936559的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗PD-L1抗体包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/181342、WO2014/100079、WO 2016/000619、WO 2014/022758、WO 2014/055897、WO 2015/061668、WO2013/079174、WO 2012/145493、WO 2015/112805、WO 2015/109124、WO 2015/195163、US 8,168,179、US 8,552,154、US 8,460,927、和US 9,175,082。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与LAG-3抑制剂组合给予。在一些实施例中，所述LAG-3抑制剂选自LAG525(诺华公司)、BMS-986016(百时美施贵宝公司)、或TSR-033(Tesaro公司)。
在一个实施例中，所述LAG-3抑制剂是抗LAG-3抗体分子。在一个实施例中，所述LAG-3抑制剂是如披露于US 2015/0259420中的抗LAG-3抗体分子。
在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子是BMS-986016(百时美施贵宝公司)，也称为BMS986016。BMS-986016和其他抗LAG-3抗体披露于WO 2015/116539和US 9,505,839中。在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含以下的一种或多种：BMS-986016的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子是TSR-033(泰萨罗公司)。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下的一种或多种：TSR-033的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子是IMP731或GSK2831781(GSK公司和普瑞马生物医药公司)。IMP731和其他抗LAG-3抗体披露于WO 2008/132601和US 9,244,059中。在一个实施例中，所述抗LAG-3抗体分子包含以下的一种或多种：IMP731的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下中的一种或多种：GSK2831781的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗LAG-3抗体包括例如WO 2008/132601、WO 2010/019570、WO 2014/140180、WO 2015/116539、WO 2015/200119、WO 2016/028672、US 9,244,059、US 9,505,839中描述的那些。
在一个实施例中，所述抗LAG-3抑制剂是可溶性LAG-3蛋白质，例如，IMP321(普瑞马生物医药公司)，例如，如披露于WO 2009/044273中。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与TIM-3抑制剂组合给予。在一些实施例中，所述TIM-3抑制剂是MBG453(诺华公司)或TSR-022(泰萨罗公司(Tesaro))。
在一个实施例中，所述TIM-3抑制剂是抗TIM-3抗体分子。在一个实施例中，所述TIM-3抑制剂是如披露于US 2015/0218274中的抗TIM-3抗体分子。
在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子是TSR-022(安奈普泰斯生物有限公司(AnaptysBio)/泰萨罗公司)。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：TSR-022的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含以下的一种或多种：APE5137或APE5121的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。APE5137、APE5121、和其他抗TIM-3抗体披露于WO 2016/161270中。
在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子是抗体克隆F38-2E2。在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体分子包含以下中的一种或多种：F38-2E2的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗TIM-3抗体包括例如，在WO 2016/111947、WO 2016/071448、WO2016/144803、US 8,552,156、US 8,841,418、和US 9,163,087中描述的那些。
在一个实施例中，所述抗TIM-3抗体是与本文所述的抗TIM-3抗体之一竞争与TIM-3上的相同表位结合和/或结合至TIM-3上的相同表位的抗体。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与转化生长因子β(TGF-β)抑制剂组合给予。在一些实施例中，TGF-β抑制剂是夫苏木单抗(CAS注册号：948564-73-6)。夫苏木单抗也称为GC1008。夫苏木单抗是结合和抑制TGF-β同种型1、2和3的人单克隆抗体。例如，在WO2006/086469、US 8,383,780、和US 8,591,901中披露了夫苏木单抗。
在一些实施例中，TGF-β抑制剂是XOMA 089。XOMA 089也称为XPA.42.089。XOMA089是完全人单克隆抗体，其结合并中和TGF-β1和2配体，并披露于PCT公开号WO 2012/167143中。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与抗CD73抗体分子组合给予。在一个实施例中，抗CD73抗体分子是完全抗体分子或其抗原结合片段。在某些实施例中，所述抗CD73抗体分子结合CD73蛋白质并减少例如，抑制或拮抗CD73(例如，人CD73)的活性。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO 2016/075099中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是MEDI 9447，例如，如披露于WO 2016/075099中。MEDI 9447的可替代的名称包括克隆10.3或73combo3。MEDI 9447是IgG1抗体，其抑制例如，拮抗CD73的活性。MEDI 9447和其他抗CD73抗体分子还披露于WO 2016/075176和US2016/0129108中。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含MEDI 9477的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO 2016/081748中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是11F11，例如，如披露于WO 2016/081748中。11F11是IgG2抗体，其抑制例如，拮抗CD73的活性。衍生自11F11的抗体，例如，CD73.4和CD73.10；11F11的克隆，例如，11F11-1和11F11-2；和其他抗CD73抗体分子披露于WO 2016/081748和US 9,605,080中。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含11F11-1或11F11-2的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于例如US 9,605,080中的抗CD73抗体。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是CD73.4，例如，如披露于US 9,605,080中。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含CD73.4的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是CD73.10，例如，如披露于US 9,605,080中。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含CD73.10的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO2009/0203538中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是067-213，例如，如披露于WO 2009/0203538中。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含067-213的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于US 9,090,697中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是TY/23，例如，如披露于US 9,090,697中。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含TY/23的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO 2016/055609中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在WO 2016/055609中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO 2016/146818中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在WO 2016/146818中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO 2004/079013中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在WO 2004/079013中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO 2012/125850中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在WO 2012/125850中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO 2015/004400中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在WO 2015/004400中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于WO 2007/146968中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在WO 2007146968中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于US 2007/0042392中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在US 2007/0042392中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是披露于US 2009/0138977中的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在US 2009/0138977中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是在Flocke等人,Eur J Cell Biol.[欧洲细胞生物学杂志]1992年6月；58(1):62-70中披露的抗CD73抗体。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在Flocke等人,Eur J Cell Biol.[欧洲细胞生物学杂志]1992年6月；58(1):62-70中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子是在Stagg等人,PNAS.[美国国家科学院院刊]2010年1月107(4):1547-1552中披露的抗CD73抗体。在一些实施例中，所述抗CD73抗体分子是TY/23或TY11.8，如披露于Stagg等人中。在一个实施例中，所述抗CD73抗体分子包含在Stagg等人中披露的抗CD73抗体的重链可变结构域、轻链可变结构域、或两者。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与白介素-17(IL-17)抑制剂组合给予。
在一些实施例中，所述IL-17抑制剂是苏金单抗(CAS登记号：875356-43-7(重链)和875356-44-8(轻链))。苏金单抗还被称为AIN457和
Figure BDA0003360067460003991
苏金单抗是特异性结合至IL-17A的重组人单克隆IgG1/κ抗体。其表达于重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中。苏金单抗描述于，例如，WO 2006/013107、US 7,807,155、US 8,119,131、US 8,617,552、和EP1776142中。
在一些实施例中，所述IL-17抑制剂是CJM112。CJM112还被称为XAB4。CJM112是靶向IL-17A的(例如，IgG1/κ同种型的)完全人单克隆抗体。CJM112披露于，例如，WO 2014/122613中。
CJM112可以与人、食蟹猴、小鼠和大鼠IL-17A结合并在体外和体内中和这些细胞因子的生物活性。IL-17A作为IL-17家族的成员，是一种主要的促炎细胞因子，已被证明在许多免疫介导的病症，如牛皮癣和癌症中发挥重要作用(Witowski等人(2004)CellMol.Life Sci.[细胞分子生命科学]第567-79页；Miossec和Kolls(2012)Nat.Rev.DrugDiscov.[自然综述：药物发现]第763-76页)。
在一些实施例中，所述IL-17抑制剂是艾塞吉珠单抗(CAS注册号：1143503-69-8)。艾塞吉珠单抗还被称为LY2439821。艾塞吉珠单抗是靶向IL-17A的人源化IgG4单克隆抗体。艾塞吉珠单抗描述于，例如，WO 2007/070750、US 7,838,638、和US 8,110,191中。
在一些实施例中，所述IL-17抑制剂是布洛鲁单抗(CAS注册号：1174395-19-7)。布洛鲁单抗还被称为AMG 827或AM-14。布洛鲁单抗结合至白介素-17受体A(IL-17RA)并阻止IL-17活化受体。布洛鲁单抗披露于，例如，WO 2008/054603、US 7,767,206、US 7,786,284、US 7,833,527、US 7,939,070、US 8,435,518、US 8,545,842、US 8,790,648、和US 9,073,999中。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与白介素-1β(IL-1β)抑制剂组合给予。
在一些实施例中，该IL-1β抑制剂是卡那单抗。卡那单抗也称为ACZ885或
Figure BDA0003360067460004001
卡那单抗是人单克隆IgG1/κ抗体，其中和人IL-1β的生物活性。卡那吉努单抗披露于，例如，WO 2002/16436、US 7,446,175、和EP 1313769中。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与CD32B抑制剂组合给予。在一些实施例中，所述CD32B抑制剂是抗CD32B抗体分子。示例性抗CD32B抗体分子披露于US 8187593、US8778339、US 8802089、US 20060073142、US 20170198040、和US 20130251706中。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与表18中列出的化合物之一组合给予。
Figure BDA0003360067460004011
Figure BDA0003360067460004021
Figure BDA0003360067460004031
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Figure BDA0003360067460004061
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Figure BDA0003360067460004151
Figure BDA0003360067460004161
在一些实施例中，CD19结合分子与NIZ985、GITR激动剂中的一种或多种组合给予，所述GITR激动剂如GWN323、PTK787、MBG453、mAb12425、CLR457、BGT226、BYL719、AMN107、ABL001、IDH305/LQS305、LJM716、MCS110、WNT974/LGK974、BLZ945、NIR178、QBM076、MBG453、CGS-20267、LHS534、LKG960、LDM099/SHP099、TNO155、LCL161、MAP855/LQN716、RAD001、LEJ511、LDK378、LOU064、LSZ102、LEQ506、RAF265/CHIR265、卡那吉努单抗、格沃吉珠单抗、阿那靳雷、利那西普、CGS-20267、PSC833、GGP-57148B、CGM097、HDM201、LBH589、PKC412、LHC165、MAK683、INC280、INC424、LJE704、LAG525、和NIS793。
在一些实施例中，所述CD19结合分子与标准治疗组合给予。
多发性骨髓瘤和相关疾病的标准治疗包括化疗、干细胞移植(自体或同种异体)、放疗和其他药物疗法。经常使用的抗骨髓瘤药物包括烷基化剂(例如，苯达莫司汀、环磷酰胺和美法仑)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、皮质类固醇(例如，地塞米松和泼尼松)和免疫调节剂(例如，沙利度胺和来那度胺或
Figure BDA0003360067460004171
)、或其任何组合。双膦酸盐药物也经常与标准抗MM治疗组合给予以预防骨质流失。年龄超过65-70岁的患者不太可能进行干细胞移植。在某些情况下，双自体干细胞移植是年龄不超过60岁且对第一次移植响应不佳的患者的选择。本披露的组合物和方法可以与多发性骨髓瘤的任何目前处方治疗组合给予。
霍奇金淋巴瘤通常用放疗、化疗、或造血干细胞移植来治疗。非霍奇金淋巴瘤最常见的疗法是R-CHOP，它由四种不同的化疗药物(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙)和利妥昔单抗
Figure BDA0003360067460004172
组成。通常用于治疗NHL的其他疗法包括其他化学治疗剂、放疗、干细胞移植(自体或同种异体骨髓移植)或生物疗法，如免疫疗法。生物治疗剂的其他实例包括但不限于利妥昔单抗
Figure BDA0003360067460004173
托西莫单抗
Figure BDA0003360067460004174
依帕珠单抗
Figure BDA0003360067460004175
和阿仑单抗(alemtuzumab)
Figure BDA0003360067460004176
本披露的组合物和方法可以与霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤的任何目前处方治疗组合给予。
WM的标准治疗包括化疗，特别是利妥昔单抗
Figure BDA0003360067460004181
其他化学治疗药物(如苯丁酸氮芥
Figure BDA0003360067460004182
环磷酰胺
Figure BDA0003360067460004183
氟达拉滨
Figure BDA0003360067460004184
克拉屈滨
Figure BDA0003360067460004185
长春新碱和/或沙利度胺)可以组合使用。皮质类固醇(如泼尼松)也可以与化疗组合给予。血浆去除术或血浆交换通常在患者的整个治疗过程中使用，以通过从血液中除去副蛋白来缓解一些症状。在某些情况下，干细胞移植是一些患者的选择。
本披露的CD19结合分子可以与减少或改善与给予此类结合分子(包括结合至CD19和CD3两者的MBM)相关的副作用的药剂组合给予。与给予结合至CD19和CD3两者的MBM相关的副作用可以包括但不限于细胞因子释放综合征(“CRS”)和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)(也称为巨噬细胞激活综合征(MAS))。CRS的症状可以包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。CRS可以包括临床体质上体征和症状，如发烧、疲劳、厌食、肌痛、眩晕、恶心、呕吐和头痛。CRS可以包括临床皮肤体征和症状，如皮疹。CRS可以包括临床胃肠道体征和症状，如恶心、呕吐和腹泻。CRS可以包括临床呼吸道体征和症状，如呼吸急促和低氧血症。CRS可以包括临床心血管体征和症状，如心动过速、脉压加宽、低血压、心输出量增加(早期)和潜在的心输出量减少(晚期)。CRS可以包括临床凝血体征和症状，如升高的d-二聚体、伴有或不伴有出血的低纤维蛋白原血症。CRS可以包括临床肾体征和症状，如氮血症。CRS可以包括临床肝体征和症状，如转氨酶升高(transaminitis)和高胆红素血症。CRS可以包括临床神经的体征和症状，如头痛、精神状态改变、精神错乱、发狂、唤词困难或明显失语、幻觉、震颤、辨距不良、步态改变、和癫痫发作。
因此，本文所述的方法可以包括向受试者给予结合至CD19和CD3两者的MBM，并且进一步给予一种或多种药剂以控制由用所述MBM治疗引起的可以溶性因子水平升高。在一个实施例中，所述受试者体内升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6中的一种或多种。在一个实施例中，所述受试者体内升高的因子是IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和分形趋化分子(fraktalkine)中的一种或多种。因此，施用以治疗此副作用的药剂可以是中和这些可以溶性因子中的一种或多种的药剂。在一个实施例中，中和这些可溶性形式中的一种或多种的所述药剂是抗体或其抗原结合片段。此类药剂的实例包括但不限于类固醇(例如，皮质类固醇)、TNFα抑制剂、IL-1R抑制剂和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的实例是抗TNFα抗体分子如英夫利昔单抗、阿达木单抗、塞妥珠单抗、和戈利木单抗。TNFα抑制剂的另一个实例是融合蛋白，如依那西普(entanercept)。TNFα的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如，己酮可可碱)和安非他酮。IL-6抑制剂的实例是抗IL-6抗体分子，如托珠单抗(toc)、萨瑞鲁单抗(sarilumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301和FM101。在一个实施例中，所述抗IL-6抗体分子是托珠单抗。基于IL-1R的抑制剂的实例是阿那白滞素。
在一些实施例中，向受试者给予皮质类固醇，例如像甲基泼尼松龙、氢化可的松等。在一些实施例中，在给予CD19结合分子(例如，结合CD19和CD3的MBM)之前，向所述受试者给予与苯那君和泰诺组合的皮质类固醇(例如甲基强的松龙、氢化可的松)。
在一些实施例中，向受试者给予血管加压剂，例如像去甲肾上腺素、多巴胺、苯肾上腺素、肾上腺素、血管加压素、或其任何组合。
在实施例中，可以向受试者给予解热剂。在实施例中，可以向受试者给予镇痛剂。
8.实例
以下实例涉及结合至人CD19并与食蟹猴(cyno)CD19交叉反应的新CD19结合物，NEG218和NEG258的鉴定，它们掺入接合CD3(并且在TSP的情况下，CD2)的双特异性(BSP)和三特异性(TSP)结合分子，以及BSP和TSP的抗肿瘤和免疫刺激活性的广泛表征。
在功能测定中，与相应的BSP相比，所述TSP，特别是CD3hi TSP1，表现出增强的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化和增殖，尽管CD3hi TSP1和CD3med TSP1两者均表现出对荷瘤小鼠中已建立的肿瘤的有效抗肿瘤响应，但由CD3hi TSP1活化的T细胞在富集具有更年轻和更功能性表型的T细胞方面特别有效。另外，CD3hi TSP1在活化CD28阴性CD8-T细胞(耗尽/终末分化的细胞毒性T细胞)方面特别有效。此外，CD3hi TSP1处理的T细胞在反复攻击时更好地保持杀死靶细胞的能力。
总之，本文提供的证据表明，使用CD2共刺激，特别是经由CD58部分，产生CD19结合分子，所述CD19结合分子能够以能够实现最佳T细胞活化和防止衰竭的方式接合T细胞，潜在地导致更有效和持久的抗肿瘤响应。
所述TSP，特别是CD3hi TSP1，针对多种因素的组合进行了优化，这些因素包括与食蟹猴CD19交叉反应的新CD19结合结构域、CD2结合部分的内含物、T细胞结合部分的性质和亲和力(CD58相对于抗CD2抗体，CD3结合部分的相对“高”或“中等”亲和力)，以及分子中结合部分的构型(例如，在N-末端处的CD19)，所有这些因素都各自赋予了有利的特性，预期这些特性将产生优越的CD19治疗。
以下实例1A和2至15分别对应于美国临时申请号62/850,901和62/854,695(“优先权申请”)的实例1-15。以下实例2至11中讨论的图4-13对应于优先权申请的图4-13。图4-13中所示的数据是用优先权申请的实例1中所述的和以下实例1A中所述的双特异性和三特异性构建体产生的。在本披露中，优先权申请的图4-13中所示的原始命名法已经被简化命名法代替。原始命名法与简化命名法之间的对应关系示出于表B中。
Figure BDA0003360067460004201
Figure BDA0003360067460004211
Figure BDA0003360067460004221
8.1.实例1：呈杵臼结构形式的抗CD3-抗CD19 IgG1双特异性和三特异性结合分子的产生
8.1.1.实例1A：初始BBM和TBM构建体
具有CD3 ABM和CD19 ABM的BBM(示意性地示出于图3A中)，以及具有CD3 ABM、CD19ABM、和CD2 ABM的TBM(示意性地示出于图3B中)以杵臼结构(KIH)形式产生。该实例的每个BBM和TBM包含第一半抗体(示意性地示出为图3A-3B中所示的每个构建体的左半部分)和第二半抗体(示意性地示出为图3A-3B中所示的每个构建体的右半部分)。
8.1.1.1.材料和方法
8.1.1.1.1.编码BBM和TBM的质粒
合成所有构建体的质粒，并针对哺乳动物细胞中的表达进行密码子优化。
对于每种双特异性构建体，合成了三种质粒。编码抗CD19重链的第一质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)(i)抗CD19 VH结构域和(ii)恒定的hIgG1结构域，其含有用于臼的T366S、L368A、和Y407V突变，以促进异源二聚化和沉默突变。编码轻链的第二质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)(i)抗CD19VL结构域和(ii)恒定的人κ序列。由第一和第二质粒编码的蛋白质形成第一半抗体。编码第二半抗体的第三质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)(i)抗CD3单链可变片段(具有抗CD3抗体的被指定为CD3hi的VH和VL结构域(如以下段落中所定义))，(ii)接头，和(iii)恒定的hIgG1结构域，其含有用于杵的T366W突变，以促进异源二聚化和沉默突变。
对于每种三特异性构建体，合成了三种质粒。编码抗CD19重链的第一质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)(i)融合至恒定的hIgG1 CH1结构域的抗CD19VH结构域，(ii)接头，(iii)具有抗CD3抗体的VH和VL结构域的抗CD3 scFv，所述抗CD3抗体对CD3具有高、中、或低亲和力(相对而言)，并且在本文中被称为CD3hi、CD3med或CD3lo(来自对CD3分别具有16nM、30nM、或48nm亲和力的抗CD3抗体，如通过Biacore测量)，(iv)第二接头，和(v)hIgG1Fc结构域，其含有用于臼的T366S、L368A、和Y407V突变，以促进异源二聚化和沉默突变。应当理解，关于构建体名称中所提及的Biacore亲和力值和相关术语，这些仅用于鉴定目的，并不旨在表示绝对亲和力值。编码轻链的第二质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)(i)抗CD19 VL结构域和(ii)恒定的人κ序列。由第一和第二质粒编码的蛋白质形成第一半抗体。编码第二半抗体的第三质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)(i)CD58(CD58-6)的IgV结构域和(ii)恒定的hIgG1结构域，其含有用于杵的T366W突变，以促进异二聚化和沉默突变。
产生了对应于CD3hi TSP1(其最初被称为CD19_NEG258_CD3_16nM-CD58或CD19_NEG258_CD3_16nM-CD58三特异性并具有基于NEG258的CD19结合臂)和CD3hi TSP2(其最初被称为CD19_NEG218_CD3_16nM-CD58或CD19_NEG218_CD3_16nM-CD58三特异性并具有基于NEG218的CD19结合臂)三特异性构建体的对照构建体，其中用抗鸡卵溶菌酶的Vhh置换了CD2 ABM(此类对照构建体最初分别被称为CD19_NEG258_CD3_16nM-溶菌酶三特异性和CD19_NEG218_CD3_16nM-溶菌酶三特异性，并且分别具有简化名称CD3hi TSP1L和CD3hiTSP2L)。
构建体组分的氨基酸序列示出于表19A-1(没有Fc序列)和表19A-2(具有Fc序列)中。
Figure BDA0003360067460004241
Figure BDA0003360067460004251
Figure BDA0003360067460004261
Figure BDA0003360067460004271
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Figure BDA0003360067460004291
Figure BDA0003360067460004301
下表19A-2示出了表19A-1中所示构建体的全长氨基酸序列(使用简化的构建体名称)，包括Fc序列。
Figure BDA0003360067460004302
Figure BDA0003360067460004311
Figure BDA0003360067460004321
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Figure BDA0003360067460004341
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Figure BDA0003360067460004361
Figure BDA0003360067460004371
Figure BDA0003360067460004381
8.1.1.1.2.表达与纯化
通过共转染HEK293细胞中的相应链，瞬时表达了BBM和TBM。简而言之，使用PEI作为转染试剂用重链和轻链质粒转染细胞，其中最终DNA:PEI比率为1:3。每升培养物使用1mg质粒转染具有200万个细胞/mL血清介质的培养物。在表达5天后，经由离心和过滤通过使介质澄清来收获BBM和TBM。使用1ml树脂/100mL上清液，经由抗CH1亲和力批量结合(CaptureSelect IgG-CH1亲和力基质，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科技公司(Thermo-Fisher Scientific,Waltham,MA,USA))或蛋白A(rProteinA Sepharose，快速流动，瑞典乌普萨拉的GE医疗公司(GE Healthcare,Uppsala,Sweden))批量结合进行纯化。在温和混合的情况下，使蛋白质结合至少2小时，并将上清液装载到重力过滤柱上。用20-50个CV的PBS洗涤树脂。将BBM和TBM用20个CV的50mM柠檬酸盐，90mM NaCl pH 3.2 50mM蔗糖洗脱。将洗脱的BBM和TBM级分用1M柠檬酸钠50mM蔗糖调节至pH 5.5。当存在聚集体时，使用HiLoad 16/60Superdex 200级柱(瑞典乌普萨拉的GE医疗生命科学公司集团(GE HealthcareLife Sciences,Uppsala,Sweden))进行制备型尺寸排阻色谱法作为最终的精修步骤。为了确认所表达的BBM和TBM的蛋白质的同一性与初级氨基酸序列的预测质量相匹配，通过高效液相色谱结合质谱分析蛋白质。
8.1.1.1.3.CD3亲和力测量
使用Biacore T200系统在25℃下测定CD3hi、CD3med、和CD3lo mAb对CD3的亲和力。简而言之，将抗hFc IgG1固定在CM5芯片上。在捕获CD3-Fc(在HBS-EP+缓冲液中为1μg/ml，流速为50μl/min，注射时间为30秒)后，通过随后在HBS-EP+缓冲液中注射不同抗体的1:2稀释系列获取动力学数据。
使用Biacore T200评价软件1.0版评价数据。对原始数据进行双重参考，即，用参考流动池的响应校正测量流动池的响应，并且在第二步骤中减去空白注射液的响应。最后，通过应用1:1结合模型拟合传感图，以计算动力学速率常数和离解平衡常数。将Rmax设置在本地。每次运行都单独地处理数据。
8.1.2.实例1B：另外的BBM和TBM构建体
产生了具有CD3 ABM和CD19 ABM(CD3hi BSP1，示意性地示出于图3C中)的单臂BBM和对应于CD3hi TSP1但具有溶菌酶结合臂代替CD19结合臂(CD3hi TSP1C)的TBM。CD3hiBSP1和CD3hi TSP1C构建体的氨基酸序列示出于表19B中。
Figure BDA0003360067460004401
Figure BDA0003360067460004411
另外，CD3hi TSP1、CD3med TSP1、CD3hi BSP1、和CD3hi TSP1C构建体均以第二种形式产生，其第二半抗体序列与表19A-2(在CD3med TSP1和CD3hi TSP1的情况下)或表19B(在CD3hi BSP1和CD3hi TSP1C的情况下)中所列出构建体的第二半抗体序列在Fc序列中相差一个氨基酸。具体地，表19A-2和表19B中的第二半抗体序列具有精氨酸残基，其中第二种形式具有组氨酸残基。精氨酸残基包含在构建体中，以便于经由蛋白A结合进行纯化。表19A-2和表19B中所列出的构建体的形式在本文中被称为“R变体”，并且下表19C中所列出的构建体的形式在本文中被称为“H变体”。据信，构建体的R变体的功能活性与其H变体的功能活性没有显著差异。编码CD3hi TSP1、CD3med TSP1、CD3hi BSP1和CD3hi TSP1C的H变体的核苷酸序列示出于表19D中。
Figure BDA0003360067460004421
Figure BDA0003360067460004431
Figure BDA0003360067460004441
Figure BDA0003360067460004451
Figure BDA0003360067460004452
Figure BDA0003360067460004461
Figure BDA0003360067460004471
Figure BDA0003360067460004481
Figure BDA0003360067460004491
Figure BDA0003360067460004501
Figure BDA0003360067460004511
Figure BDA0003360067460004521
Figure BDA0003360067460004531
Figure BDA0003360067460004541
Figure BDA0003360067460004551
Figure BDA0003360067460004561
8.2.实例2：BBM引发针对CD19+靶细胞的重定向T细胞毒性活性(RTCC)的能力。
8.2.1.材料和方法
用实例1A的BBM进行RTCC测定，以测量BBM引发RTCC对抗CD19+Nalm6-luc和Karpas422-luc细胞的能力。Nalm-6是人B细胞前体白血病细胞系，并且Karpas422是人B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系。简而言之，在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中培养被工程化以表达萤火虫荧光素酶报告基因的Nalm6和Karpas422细胞。将10,000个具有系列稀释的BBM或gH同种型抗体对照(αgH-CD3hi)的靶细胞接种在384孔平底微量滴定板上。从冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)中分离原代人T细胞，并使用抗CD3和抗CD28磁珠(赛默飞世尔公司，目录号11131D)扩增，并且随后冷冻保存。将扩增的T细胞解冻并等分到板上，以实现效应细胞(即T细胞)与靶细胞(即癌细胞)比率(E:T比率)为3:1。将板在具有5％CO2的37℃培养箱中孵育过夜。在共孵育后，将亮Glo(普洛麦格公司(Promega)，目录号E2620)添加到所有孔中，并且随后在Envision(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))上测量发光信号。具有亮Glo的靶细胞作为最大信号。使用以下公式计算靶细胞的RTCC百分比：[100-(样品/最大信号)*100％]。
8.2.2.结果
结果示出于图4A-4B中。基于NEG258和NEG218两者的BBM介导了针对Nalm6-Luc和Karpas422-luc细胞的RTCC活性，而gH同种型抗体(对照)没有如预期的活性。
8.3.实例3：BBM引发T细胞增殖的能力。
8.3.1.材料和方法
实例1A中所述的含有NEG258和NEG218的可变区的BBM，在与表达CD19的靶细胞共培养时，评价其诱导T细胞增殖的能力。简而言之，在测定当天将稳定表达萤火虫荧光素酶的Karpas422和Nalm-6靶细胞进行照射，并且以每孔60,000个细胞的密度接种在Costar 96孔板(康宁公司(Corning)，目录号3904)中，所述Costar 96孔板在T细胞介质(TCM)[RPMI-1640(赛默飞世尔科技公司，目录号11875-085)、10％FBS(Seradigm公司，目录号1500-500)、1％L-谷氨酰胺(赛默飞世尔科技公司，目录号25830-081)、1％非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司，目录号11140-050)、1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔科技公司，目录号15070063)、1％HEPES(赛默飞世尔科技公司，目录号15630080)、丙酮酸钠(赛默飞世尔科技公司，目录号11360-070)、0.1％β-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司，目录号21985-023)]中。解冻先前从白细胞单采术供体(Hemacare公司)中分离并冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)，并按照制造商的方案，使用人泛T细胞分离试剂盒[美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec)，目录号130-096-535]通过阴性选择分离泛T细胞。按照制造商的方案，将分离的T细胞用5μM细胞示踪紫(CTV)(赛默飞世尔科技公司，目录号C34557)标记，并将60,000个CTV标记的T细胞与60,000个靶细胞共培养以实现1:1的E:T比率。将范围为16pM-10,000pM的基于NEG258和NEG218的BBM和对照结合分子(αgH-CD3hi)的稀释系列添加到细胞中，并将板在5％CO2、37℃的培养箱中孵育96小时。在孵育后，收获细胞，按照制造商的说明用人TruStain FcX(Fc Block)[博奇公司，目录号422302]处理，并且然后通过在4C孵育30分钟，用可固定活力染料eFlour 780(赛默飞世尔科技公司，目录号65-0865-14)染色。然后使用FACS缓冲液将细胞洗涤两次，并通过在4℃孵育30分钟用PerCP-Cy5.5缀合的抗人CD3 mAb(博奇公司，目录号317336)染色。然后将样品在BD LSR Fortessa上运行，并使用FlowJo分析以测定基于细胞示踪紫染料的CD3染色和稀释的％增殖的CD3+T细胞。
8.3.2.结果
基于NEG258和NEG218两者的BBM在与两种不同的表达CD19的靶细胞系共培养时诱导T细胞的增殖(图5A-5B)。T细胞增殖效应是剂量依赖性的，并且基于NEG258的BBM显示出比基于NEG218的BBM更强的活性。对照抗体没有诱导任何T细胞增殖，表明CD19靶特异性接合是T细胞增殖所需的。
8.4.实例4：TBM引发CD2依赖性T细胞活化的能力。
8.4.1.材料与方法
使用稳定表达由NFAT启动子驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞系(JNL，一种永生化的人T细胞系)来测量T细胞活化。通过流式细胞术证实了JNL细胞中CD2表达的水平(图6A)。为了通过CRISPR(聚集的规则间隔的短回文重复序列)产生CD2敲除(KO)细胞，用CD2 Cas9核糖核蛋白复合物电穿孔JNL细胞。随后分选CD2-细胞以富集为均匀的CD2-群体(图6B)。然后用CD2+和CD2-JNL细胞进行JNL报告基因测定，以测量双特异性或三特异性构建体依赖性T细胞活化。简单地说，将10,000个具有实例1A的系列稀释的BBM或TBM(即，R变体)的Nalm6或Karpas422细胞接种在384孔平底微量滴定板上。然后将JNL细胞添加到板中，以实现3:1的效应细胞与靶细胞比率。将板在具有5％CO2的37℃培养箱中孵育过夜。在共孵育后，将亮Glo(普洛麦格公司，目录号E2620)添加到所有孔中，并且随后在Envision(珀金埃尔默公司)上测量发光信号。
8.4.2.结果
当与CD2 WT JNL细胞一起孵育时，BBM和TBM两者都诱导发光的剂量依赖性增加，并且TBM的响应水平更高(图6C-6F)。当CD2-KO JNL细胞用作效应物时，与对应的BBM相比，用TBM观察到T细胞活化减少，从而表明TBM的优势依赖于T细胞上的CD2表达。
8.5.实例5：基于NEG258和NEG218的TBM与食蟹猴B细胞的结合
8.5.1.材料和方法
使用MACS阳性选择(美天旎公司编号130-092-012)耗尽食蟹猴(cyno)PBMC(iQ生物科学公司(iQ Biosciences)编号IQB-MnPB102)的CD3+细胞。将剩余的细胞群重悬于FACS缓冲液中。将每孔100,000个细胞接种在V形底96孔板中，并以1ug/mL与实例1A的TBM(即，R变体)在冰上孵育1小时。在用FACS缓冲液洗涤两次后，将细胞与Alexa-647标记的抗人Fc二抗(杰克逊免疫公司(Jackson Immuno)编号109-605-098)和食蟹猴交叉反应性FITC小鼠抗人CD20抗体(BD Pharmingen公司编号556632)在冰上孵育1小时。在用FACS缓冲液洗涤两次后，将细胞重悬于100μL缓冲液中，并在贝克曼库尔特细胞分析仪上(Beckman CoulterCytoflex)收集数据。使用CytExper v2.3分析细胞，并通过CD20阳性群体进行门控。
8.5.2.结果
由于食蟹猴与人类的近缘进化关系，因此它们是分析抗体疗法的治疗效果和潜在毒性的最适当的临床前模型，并且因此抗体在临床开发中结合其人类靶标的食蟹猴同源物是有用的。如图7A-7B所示，NEG258-和NEG-218TBM两者都结合至食蟹猴B细胞，从而表明CD19结合臂识别食蟹猴CD19。
8.6.实例6：PBMC中的食蟹猴B细胞耗尽后，TBM诱导T细胞活化的能力
8.6.1.材料与方法
进行离体食蟹猴B细胞耗尽测定，以测量实例1的基于NEG258的TBM在PBMC(外周血单核细胞)中裂解CD20阳性B细胞的能力。简单地说，使用聚蔗糖梯度离心从食蟹猴(cyno)全血(BioIVT)中分离出PBMC。将分离的PBMC和实例1A的系列稀释TBM(即，R变体)接种在96孔平底微量滴定板上。将板在具有5％CO2的37℃培养箱中孵育过夜。在孵育24h后，收获样品并同时对CD3和CD20进行染色，以鉴定PBMC群体中的B细胞和T细胞。为了对细胞群进行定量分析，在通过流式细胞仪采集之前加入75,600个计数珠。对于每个样品，采集20,000个珠，以便确定B细胞的绝对数量。通过计算B细胞数量与珠数量之间的比率来确定B细胞耗尽的百分比。为了检测T细胞活化，将细胞用抗CD3、抗CD69和抗CD25(博奇公司和BD生物科学公司(BD Biosciences))染色。
8.6.2.结果
基于NEG258的TBM耗尽了食蟹猴B细胞(图8A)并诱导了CD3+T细胞的活化，这通过CD69和CD25表达的上调来证明(图8C-8H)。正如预期，在没有添加TBM的情况下，既不发生B细胞耗尽，也不发生T细胞活化。这些结果显示了基于NEG258的TBM诱导食蟹猴T细胞活化的能力以及活化的特异性。
8.7.实例7：由CD19 TBM重定向的T细胞的细胞毒性
分析了实例1A的基于NEG258和NEG218的TBM(即，R变体)(具有含抗CD3抗体的VH和VL结构域的CD3 ABM，所述抗CD3抗体对CD3具有16nM亲和力，如通过Biacore测量)在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的潜力。
8.7.1.材料和方法
在一项研究中，跨多个供体效应细胞比较了TBM。简而言之，将表达huCD19的Nalm6或Karpas422靶细胞工程化以过表达萤火虫荧光素酶。收获细胞，并将其重悬于含有10％FBS的RPMI介质(英杰公司(Invitrogen)编号11875-093)中。将每孔2,500个靶细胞接种在平底384孔板中。经由MACS阴性选择(美天旎生物技术有限公司编号130-096-535)从来自冷冻保存的PBMC(Cellular Technologies Limited公司编号CTL-UP1)的两个供体中分离人泛T效应细胞，然后添加到板中以获得3:1或5:1的最终E:T比率。将共培养的细胞与所有构建体和对照的系列稀释液一起孵育。为了归一化，平均最大发光是指与效应细胞(但没有任何测试构建体)共孵育的靶细胞。在37℃、5％CO2下孵育24、48、72或96小时后，将OneGlo荧光素酶底物(普洛麦格公司编号E6120)添加到板中。在10分钟孵育后，在Envision读板仪上测量发光。使用以下方程计算特异性裂解百分比：特异性裂解(％)＝(1-(样品发光/平均最大发光))*100
8.7.2.结果
如图9A-9P所示，TBM以多个时间点、E:T比率和效应子T细胞供体显示出对Nalm6靶细胞(图9A-9H)和Karpas422细胞(图9I-P)两者的细胞毒性活性。基于NEG258的TBM似乎比基于NEG218的TBM更有效。
8.8.实例8：由具有不同CD3亲和力的TBM重定向的T细胞的细胞毒性
分析了实例1A具有CD3 ABM(包含抗CD3抗体的VH和VL结构域，所述抗CD3抗体对CD3具有16nM、30nM和48nM亲和力，如通过Biacore测量)的基于NEG258的TBM(即，R变体)在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的潜力。
8.8.1.材料和方法
在一项研究中，跨多个供体效应细胞比较了TBM。简而言之，将表达huCD19的Nalm6和Karpas422靶细胞工程化以过表达萤火虫荧光素酶。收获细胞，并将其重悬于含有10％FBS的RPMI介质(英杰公司编号11875-093)中。将每孔2,500个靶细胞接种在平底384孔板中。经由MACS阴性选择(美天旎生物技术有限公司编号130-096-535)从来自冷冻保存的PBMC(Cellular Technologies Limited公司编号CTL-UP1)的两个供体中分离人泛T效应细胞，然后添加到板中以获得3:1或5:1的最终E:T比率。将共培养的细胞与TBM或对照的系列稀释液一起孵育。为了归一化，平均最大发光是指与效应细胞(但没有任何测试构建体)共孵育的靶细胞。在37℃、5％CO2下孵育24、48、72或96小时后，将OneGlo荧光素酶底物(普洛麦格公司编号E6120)添加到板中。在10分钟孵育后，在Envision读板仪上测量发光。使用以下方程计算特异性裂解百分比：特异性裂解(％)＝(1-(样品发光/平均最大发光))*100
8.8.2.结果
如图10A-10P所示，TBM以多个时间点、E:T比率和效应子T细胞供体显示出对Nalm6靶细胞(图10A-10H)和Karpas422(图10I-10P)两者的细胞毒性活性。
8.9.实例9：基于NEG258的TBM与不结合至CD2的BBM和TBM的RTCC活性
比较了实例1A含有CD2结合臂或对照溶菌酶结合臂的基于NEG258的TBM(即，R变体)在Nalm6或Karpas422靶细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的潜力。这项研究还包括了博纳吐单抗作为对照。博纳吐单抗是一种双特异性T细胞接合物，或BiTE，其结合至CD19和CD3两者，但缺乏Fc结构域(参见例如，美国专利号10,191,034)。
8.9.1.材料和方法
跨多个供体效应细胞比较了纯化的TBM。简而言之，将表达huCD19的Nalm6和Karpas422靶细胞工程化以过表达萤火虫荧光素酶。收获细胞，并将其重悬于含有10％FBS的RPMI介质(英杰公司编号11875-093)中。将每孔5,000个靶细胞接种在平底384孔板中。经由阴性选择(Stemcell Technologies公司编号17951)从来自冷冻保存的PBMC的两个供体中分离人泛T效应细胞，所述PBMC通过Ficoll密度梯度离心从白细胞单采术样品(Hemacare公司编号PB001F-1)中分离。然后将纯化的T细胞添加到板中，以获得3:1、1:1、1:3或1:5的最终E:T比率。将共培养的细胞与所有构建体和对照的系列稀释液一起孵育。为了归一化，平均最大发光是指与效应细胞(但没有任何测试构建体)共孵育的靶细胞。在37℃、5％CO2下孵育48、72或96小时后，将OneGlo荧光素酶底物(普洛麦格公司编号E6120)添加到板中。在10分钟孵育后，在Envision读板仪上测量发光。使用以下方程计算特异性裂解百分比：特异性裂解(％)＝(1-(样品发光/平均最大发光))*100
8.9.2.结果
如图11A-11L所示，两种类型的TBM均显示对Nalm6靶细胞(图11A-11H)和Karpas422细胞(图11I-11L)两者的细胞毒性活性。与具有溶菌酶结合臂的对照TBM以及与博纳吐单抗相比，含有CD2结合臂的TBM表现出优越的细胞毒性活性，特别是在较低的E:T比率下。
8.10.实例10：细胞因子释放测定
分析了实例1A的基于NEG258和NEG218的TBM(即，R变体)在肿瘤靶细胞存在下诱导T细胞介导的细胞因子从头分泌的能力。
8.10.1.材料和方法
简而言之，收获表达huCD19的Nalm6靶细胞，并将其重悬于含有10％FBS的RPMI介质中。将每孔20,000个靶细胞接种在平底96孔板中。经由MACS阴性选择从冷冻保存的PBMC中分离人泛T效应细胞，然后添加到板中以获得5:1的最终E:T比率。将共培养的细胞与所有构建体和对照的系列稀释液一起孵育。在37℃、5％CO2下孵育24小时后，通过以300x g离心5分钟收获上清液，用于随后的分析。
根据制造商的说明，使用V-PLEX Proinflammatory Panel 1试剂盒(MesoScaleDiscovery公司编号K15049D)进行多重ELISA。
8.10.2.结果
如图12A-12C所示，基于NEG258和NEG218的TBM两者在测量的所有剂量水平上都诱导T细胞显著的细胞因子分泌。这些图表明，它们可以在较低剂量下有效。
8.11.实例11：基于NEG258和NEG218的TBM与人和食蟹猴CD19的结合
8.11.1.材料和方法
将小鼠细胞系300.19工程化以过表达人CD19或食蟹猴CD19。将细胞在含有10％FBS和2-巯基乙醇的RPMI介质(英杰公司编号11875-093)中培养。收获细胞并将其重悬于FACS缓冲液(含有1％FBS的PBS)中。将每孔50,000个细胞接种在V形底96孔板中。将每个细胞系与实例1A的TBM(即，R变体)的系列稀释液在冰上孵育1小时。将细胞以400xg离心4分钟，并用FACS缓冲液洗涤。重复两次，并且然后将细胞与Alexa-647标记的抗人Fc二抗(杰克逊免疫公司编号109-605-098)在冰上孵育30分钟。将细胞洗涤两次，然后将其重悬于100μL的FACS缓冲液中。在贝克曼库尔特细胞分析仪上收集FACS数据，并使用CytExpert v2.3进行分析。
8.11.2.结果
如图13A-13B所示，基于NEG258和NEG218的TBM结合至被工程化以过表达人和食蟹猴CD19两者的细胞系。NEG258似乎同等地结合至人和食蟹猴CD19两者，而NEG218似乎对食蟹猴CD19具有比人CD19更大的亲和力。在这两者中，NEG258似乎对人CD19和食蟹猴CD19两者都具有更大的亲和力。
8.12.实例12：工程CD58以提高稳定性
8.12.1.背景技术
人CD58含有具有29个氨基酸的信号肽和两个Ig样结构域。被称为结构域1的最N-末端Ig样结构域是V型的，类似于抗体的可变区，并且被称为结构域2的第二个结构域是C型的，类似于抗体的恒定区。CD58结构域结构的示意图示出于图14中。
如实例1-11所示，CD58的与CD2相互作用的结构域1可以用于代替多特异性结合分子中的抗CD2抗体结合片段。如实例32所示，在缺乏靶细胞的情况下，使用CD58结合臂而不是抗CD2结合臂降低了非特异性免疫活化。然而，CD58表现出比免疫球蛋白更低的稳定性。
为了提高人CD58结构域1的稳定性，将蛋白质工程化以包含一对半胱氨酸，其在表达时形成二硫桥以稳定分子。
将四对不同的氨基酸工程化以被半胱氨酸置换：(1)V45和M105，(2)V45和M114，(3)V54和G88以及(4)W56和L90。
8.12.2.材料和方法
8.12.2.1.重组表达
为了评估结合和生物物理特征，从HEK293细胞连同CD2细胞外结构域中瞬时产生并纯化CD58二硫化物变体。所有质粒都针对哺乳动物表达进行了密码子优化。用C-末端Avi标签和N-末端8xhis标签(SEQ ID NO:769)随后是用于在纯化后切割his标签的EVNLYFQS序列(SEQ ID NO:770)产生人和食蟹猴CD2构建体。在表达过程中经由共转染编码BirA酶的质粒对CD2构建体进行位点选择性生物素化。用C-末端8xhis标签(SEQ ID NO:769)表达了CD58。用标准方法在HEK293F细胞中进行瞬时表达和纯化。所述序列示出于表20中。
Figure BDA0003360067460004661
对于表达，使用PEI作为转染试剂进行转染。对于小规模(<5L)转染，使细胞在加湿的培养箱(85％)中、在8％CO2下、在定轨振荡器(100rpm)上的摇瓶中生长。以1DNA:3PEI的比率进行转染。将1mg/L质粒培养物用于以200万个细胞/mL在Expi293介质中进行转染。在表达5天后，离心培养物并过滤。使用1ml树脂/100mL上清液，经由Nickel-NTA批量结合进行纯化。在温和混合的情况下，使蛋白质结合至少2小时，并将混合物装载到重力过滤柱上。用30个CV的PBS洗涤树脂。用咪唑洗脱蛋白质。将洗脱的蛋白质浓缩，并且经由制备型尺寸排阻色谱法(Hi Load 16/60Superdex 75级柱，瑞典乌普萨拉的GE医疗公司)进行最终纯化。为了确认所表达的蛋白质的同一性与初级氨基酸序列的预测质量相匹配，通过高效液相色谱结合质谱分析蛋白质。
8.12.2.2.稳定性
使用标准技术，使用差示扫描量热法(DSC)和差示扫描荧光分析法(DSF)两者评估二硫化物稳定的变体的改善的热稳定性。对于DSF，在96孔PCR板中，将1-3ug每种构建体以25ul总体积添加到1x Sypro Orange(赛默飞世尔公司)中。使用配备有C1000热循环仪的Bio-Rad CFX96 RT-PCR系统，以0.5℃/分钟将温度从25℃升至95℃，并监测荧光。将制造商提供的软件用于确定Tm。
对于DSC，将所有样品都透析到HEPES缓冲盐水(HBS)中，并稀释至0.5mg/mL的最终浓度。通过以1℃/分钟将温度从25℃升至100℃，过滤时间为2秒钟，并设置中等增益，使用MicroCal VP-Capillary DSC系统(马尔文公司(Malvern)测定Tm和Tonset。
8.12.2.3.结合亲和力
为了确保通过添加稳定的二硫化物变体保持结合亲和力不被破坏，对所得重组CD58蛋白进行等温量热法(ITC)以确定它们的表观KD和与重组人CD2的结合化学计量学(n)。
简而言之，将重组人CD2和重组人CD58变体透析到HEPES缓冲盐水(HBS)中。将CD2稀释至最终浓度为100μM，CD58变体稀释至10μM。经由多次注射将CD2滴定到10μM CD58变体中，并使用MicroCal VP-ITC等温滴定量热计(马尔文公司)测定ΔH(千卡/摩尔)。将CD2滴定到HBS中用作参考，并根据所得数据确定KD和n。
8.12.3.结果
构建体的DSF和DSC测量的结果示出于下表21中。
Figure BDA0003360067460004681
亲和力研究的结果示出于下表22中。添加稳定的二硫化物对亲和力或结合化学计量没有不利的影响。
Figure BDA0003360067460004682
8.13.实例13：呈杵臼结构形式的抗CD3-抗CD19-CD58 IgG1 TBM的产生
8.13.1.材料和方法
合成构建体，并针对哺乳动物细胞中的表达进行密码子优化。对于每种三特异性构建体，合成了三种质粒。编码抗CD19重链的第一质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)(i)融合至恒定的hIgG1 CH1结构域的VH结构域，(ii)接头，(iii)抗CD3scFv，(iv)第二接头，和(v)hIgG1 Fc结构域，其含有用于臼的突变，以促进异二聚化和沉默突变。编码轻链的第二质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)抗CD19 VL结构域和(ii)恒定的人κ序列。编码第二半抗体的第三质粒被合成为融合体，其包含(在N-末端至C-末端方向上)融合至恒定的hIgG1结构域的CD58二硫化物稳定的变体，所述恒定的hIgG1结构域含有用于杵的突变，以促进异二聚化和沉默突变。所述序列示出于表23中。
Figure BDA0003360067460004691
Figure BDA0003360067460004701
Figure BDA0003360067460004711
Figure BDA0003360067460004721
Figure BDA0003360067460004731
Figure BDA0003360067460004741
Figure BDA0003360067460004751
Figure BDA0003360067460004761
Figure BDA0003360067460004771
通过共转染HEK293细胞中的相应链，瞬时表达了三特异性结合分子。
简而言之，使用PEI作为转染试剂进行转染。对于小规模(<5L)转染，使细胞在加湿的培养箱(85％)中、在5％CO2下、在定轨振荡器(115rpm)上的摇瓶中生长。以1DNA:3PEI的最终比率将质粒与PEI组合。将1mg/L的质粒培养物用于按200万个细胞/mL血清介质进行转染。在表达5天后，经由离心和过滤通过使介质澄清来收获TBM。使用1ml树脂/100mL上清液，经由抗CH1亲和力批量结合(CaptureSelect IgG-CH1亲和力基质，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科技公司)或蛋白A(rProteinA Sepharose，快速流动，瑞典乌普萨拉的GE医疗公司)批量结合进行纯化。在温和混合的情况下，使蛋白质结合至少2小时，并将上清液装载到重力过滤柱上。用20-50个CV的PBS洗涤树脂。将TBM用20个CV的50mM柠檬酸盐，90mM NaCl pH 3.2 50mM蔗糖洗脱。将洗脱的TBM用1M柠檬酸钠50mM蔗糖调节至pH 5.5。当存在聚集体时，使用Hi Load 16/60Superdex 200级柱(瑞典乌普萨拉的GE医疗生命科学公司集团)进行制备型尺寸排阻色谱法作为最终的精修步骤。为了确认所表达的TBM的蛋白质的同一性与初级氨基酸序列的预测质量相匹配，通过高效液相色谱结合质谱分析蛋白质。
8.13.2.结果
如下表24所示，稳定二硫化物变体的加入对纯化后聚集物含量增加的总表达量没有不利影响。
Figure BDA0003360067460004781
Figure BDA0003360067460004791
8.14.实例14：用含有CD58变体的TBM重定向的T细胞的细胞毒性
分析实例13含有变体CD58结构域的TBM在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的潜力。
8.14.1.材料和方法
简而言之，将表达huCD19的Nalm6靶细胞工程化以过表达萤火虫荧光素酶。收获细胞，并将其重悬于含有10％FBS的RPMI介质(英杰公司编号11875-093)中。将每孔10,000个靶细胞接种在平底96孔板中。经由MACS阴性选择(美天旎生物技术有限公司编号130-096-535)从来自冷冻保存的PBMC(Cellular Technologies Limited公司编号CTL-UP1)的两个供体中分离人泛T效应细胞，然后添加到板中以获得5:1的最终E:T比率。将共培养的细胞与所有构建体和对照的系列稀释液一起孵育。为了归一化，平均最大发光是指与效应细胞(但没有任何测试构建体)共孵育的靶细胞。在37℃、5％CO2下孵育24或48小时后，将OneGlo荧光素酶底物(普洛麦格公司编号E6120)添加到板中。在10分钟孵育后，在Envision读板仪上测量发光。使用以下方程计算特异性裂解百分比：特异性裂解(％)＝(1-(样品发光/平均最大发光))*100
8.14.2.结果
如图15所示，含有变体CD58结构域的TBM显示出与具有野生型CD58的TBM相当的细胞毒性活性。
8.15.实例15：用含有CD58变体的TBM进行的T细胞活化
作为原发性T细胞活化的替代方案，使用Jurkat-NFAT报告细胞系来评价实例13含有变体CD58结构域的TBM的功能活性。
8.15.1.材料和方法
用NFAT萤光素酶报告基因构建体转染Jurkat T细胞系(E6-1)，并且基于在PMA和离子霉素刺激后NFAT报告基因的强诱导，选择具有NFAT-LUC报告基因的稳定的、克隆细胞系Jurkat细胞(JNL)用于进一步表征。
Jurkat报告细胞系用于测定NFAT的非特异性活化。
测试纯化的TBM在没有靶细胞的情况下诱导NFAT活化的潜力。
使具有NFAT-LUC报告基因的Jurkat细胞(JNL)在具有0.5μg/ml的嘌呤霉素的含有2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中生长。将每孔100,000个JNL细胞接种在平底96孔板中，并与TBM和对照的系列稀释液一起孵育。在37℃、5％CO2下孵育6小时后，将OneGlo荧光素酶底物(普洛麦格公司编号E6120)添加到板中。在10分钟孵育后，在Envision读板仪上测量发光。
8.15.2.结果
如图16所示，含有变体CD58结构域的TBM显示出与含有野生型CD58的TBM相当或更低的肿瘤非依赖性(即，非靶细胞特异性)活性水平。
8.16.实例16：CD19和CD58在多种细胞系上的表达
8.16.1.材料和方法
使用APC标记的抗CD19(博奇公司，目录号302212)和APC标记的抗CD58(博奇公司，目录号330918)以及各自的同种型对照抗体，通过流式细胞术在OCI-LY-19(人B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系)、Karpas-422(人B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系)、Toledo(人B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系)、和Nalm-6(B细胞前体白血病细胞系)细胞系上测定CD19和CD58的细胞表面表达。将样品在BD LSR Fortessa上运行，并使用FlowJo进行分析。
8.16.2.结果
所述细胞系具有不同水平的CD19和CD58表达(图17A-H)。细胞系中CD19表达的等级为OCI-LY-19>Karpas 422>Toledo＝Nalm-6。CD58表达的等级为OCI-LY-19>Nalm-6>Karpas＝Toledo。
8.17.实例17：基于NEG258的TBM与不结合至CD2的单臂BBM和不结合至CD19的TBM的RTCC和细胞因子分泌活性
比较CD3hi TSP1、CD3med TSP1、CD3 hi BSP1、和CD3hi TSP1C(H变体)在Karpas422靶细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的潜力。
8.17.1.材料和方法
根据实例9中所述的材料和方法，用表达huCD19的Karpas422靶细胞进行RTCC测定，但其中最终E:T比率为1:1并孵育96小时。
8.17.2.结果
如图18A-18B所示，CD3hi TSP1、CD3med TSP1、和CD3hi BSP1显示对Karpas422靶细胞的细胞毒性活性，其中CD3hi TSP1具有最高的细胞毒性活性。
8.18.实例18：细胞因子释放测定
分析CD3hi TSP1、CD3med TSP1、CD3 hi BSP1、和CD3hi TSP1C(H变体)在Karpas422细胞存在下诱导T细胞介导的细胞因子从头分泌的能力。
8.18.1.材料和方法
如实例10中那样进行细胞因子释放测定，但Karpas422细胞的最终E:T比率为1:1，并且孵育48小时。
8.18.2.结果
如图19A-19F所示，CD3hi TSP1、CD3med TSP1、和CD3hi BSP1诱导T细胞分泌细胞因子，其中CD3hi TSP1诱导最高水平的细胞因子分泌，随后是CD3med TSP1，其类似于CD3hiBSP1。
8.19.实例19：结合至T细胞的TBM和BBM
使用流式细胞术评价CD3hi TSP1、CD3med TSP1、CD3hi BSP1、和CD3hi TSP1C(H变体)与T细胞的结合。
8.19.1.材料和方法
解冻先前从2名白细胞单采术供体(Hemacare公司)中分离并冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)，并按照制造商的方案，使用人泛T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术有限公司，目录号130-096-535)通过阴性选择分离泛T细胞。将T细胞重悬于FACS缓冲液中，并将100,000个细胞添加到96孔圆形底板的每个孔中。将范围从33μg/ml-0.005μg/ml的CD3medTSP1、CD3hi TSP1、CD3hi BSP1、和CD3hi TSP1C的稀释系列添加到细胞中，并在冰上孵育1小时。将细胞洗涤两次，重悬于100μl抗人IgG二抗中，并在冰上孵育另一小时。在孵育后，将细胞洗涤两次，重悬于100μl可固定活力染料中，并在冰上孵育30分钟。再次洗涤两次后，将细胞重悬于120μl FACS缓冲液中。然后在BD LSR Fortessa上运行细胞，并使用FlowJo分析数据以确定抗人IgG二抗的MFI，并针对抗体浓度作图。
8.19.2.结果
所有抗体都显示出不同程度的与T细胞的结合(图20)。CD3hi TSP1是最强的结合物，随后是CD3med TSP1，其中BSP1是最弱的结合物。不受理论的约束，据信TBM结合的改善可能归因于CD2和CD3臂的共接合，从而增加对T细胞的结合亲合力。
8.20.实例20：TBM和BBM介导的T细胞增殖
评价CD3hi TSP1、CD3med TSP1、CD3hi BSP1、和CD3hi TSP1C(H变体)、以及博纳吐单抗在与表达CD19的OCI-LY-19、Karpas422、和Toledo靶细胞共培养时诱导T细胞增殖的能力。
8.20.1.材料和方法
简而言之，将稳定表达萤火虫荧光素酶的OCI-LY-19、Karpas422、和Toledo靶细胞接种在96孔板中，所述96孔板在T细胞介质(TCM)(RPMI-1640，赛默飞世尔科技公司，目录号11875-085)、10％FBS(Seradigm公司，目录号1500-500)、1％L-谷氨酰胺(赛默飞世尔科技公司，目录号25830-081)、1％非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司，目录号11140-050)、1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔科技公司，目录号15070063)、1％HEPES(赛默飞世尔科技公司，目录号15630080)、丙酮酸钠(赛默飞世尔科技公司，目录号11360-070)、0.1％β-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司，目录号21985-023)]中。解冻先前从2名白细胞单采术供体中分离并冷冻保存的PBMC，并分离泛T细胞(如前所述)。按照制造商的方案，将分离的T细胞用5μM细胞示踪紫(CTV)(赛默飞世尔科技公司，目录号C34557)标记，并按1:3的E:T比率与靶细胞共培养。将范围为2.5nM-0.0006nM的CD3med TSP1、CD3hi TSP1、CD3hi BSP1、CD3hi TSP1C、和博纳吐单抗的稀释系列添加到细胞中，并将板在5％CO2、37℃的培养箱中孵育96小时。在孵育后，收获细胞，用人TruStain FcX(Fc Block)(博奇公司，目录号422302)处理，并且用可固定活力染料eFlour 780(赛默飞世尔科技公司，目录号65-0865-14)染色，随后用PerCP-Cy5.5缀合的抗人CD3 mAb(博奇公司，目录号317336)染色。所有染色步骤均根据制造商的方案进行。使用BD LSR Fortessa和FlowJo软件进行流分析，以测定基于细胞示踪紫染料的CD3染色和稀释的％增殖的CD3+T细胞。
8.20.2.结果
所有CD19靶向抗体在与不同的表达CD19的靶细胞系共培养时诱导T细胞的增殖(图21A-21C)。T细胞增殖效应是剂量依赖性的，并且CD3hi TSP1显示出比CD3med TSP1和CD3hi BSP1更强的活性。对照抗体没有诱导任何T细胞增殖，表明CD19靶特异性接合是T细胞增殖所需的。在OCI-LY-19和Toledo细胞的存在下，博纳吐单抗介导了最有效的T细胞增殖。在Karpas420的存在下，CD3hi TSP1更有效地诱导T细胞增殖，如增殖的T细胞的最大百分比所示。
8.21.实例21：具有不同CD3亲和力的基于NEG258的TBM与BBM和博纳吐单抗的RTCC活性
比较含有具有不同亲和力的CD3结合臂的基于NEG258的TBM(CD3hi TSP1和CD3medTSP1(H变体))和BBM(CD3hi BSP1(H变体))在Karpas422靶细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的潜力。这项研究还包括了博纳吐单抗作为对照。
8.21.1.材料和方法
根据实例9中所述的材料和方法，用表达huCD19的Karpas422靶细胞进行RTCC测定，但其中最终E:T比率为1:1并孵育96小时。
8.21.2.结果
如图22A-22B所示，两种类型的TBM都显示出对Karpas422细胞的细胞毒性活性。与BBM相比，TBM表现出优越的细胞毒性活性。与博纳吐单抗相比，CD3hi TSP1显示出相似或更好的细胞毒性活性。
8.22.实例22：具有不同CD3亲和力的基于NEG258的TBM与不结合至CD19的BBM和TBM对多种B细胞淋巴瘤细胞系的RTCC活性
比较CD3hi TSP1、CD3med TSP1、CD3hi BSP1、和CD3hi TSP1C(H变体)在Oci-Ly19、Toledo、Nalm6、Nalm6 KO和K562靶细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的潜力。Oci-Ly19、Toledo、Nalm6细胞表达hCD19抗原。使用缺乏hCD19表达的Nalm6 KO和K562靶细胞来评估靶非依赖性杀伤。这项研究还包括了博纳吐单抗作为对照。
8.22.1.材料和方法
使用CRISPR-CAS9技术从Nalm6亲代细胞系产生Nalm6 KO，并证实其缺乏hCD19表达。将Oci-Ly19、Toledo、Nalm6、Nalm6 KO和K562靶细胞工程化以过表达萤火虫荧光素酶。根据实例9中所述的材料和方法，用不同细胞系进行RTCC测定，但其中最终E:T比率为1:1并孵育48小时。
8.22.2.结果
CD3hi TSP1和CD3med TSP1显示出对Oci-Ly19、Toledo和Nalm6的细胞毒性活性，但对抗原阴性的Nalm6 KO和K562显示出最小的活性(图23A-23J)。与BBM相比，TBM表现出优越的细胞毒性活性。CD3hi TSP1显示出与博纳吐单抗相当的细胞毒性活性。
8.23.实例23：具有不同CD3亲和力的基于NEG258的TBM与不结合至CD19的BBM和TBM对多种B细胞淋巴瘤细胞系的细胞因子释放测定
比较CD3hi TSP1、CD3med TSP1、CD3hi BSP1和CD3hi TSP1C(H变体)在Oci-Ly19、Toledo、Nalm6、Nalm6 KO和K562靶细胞中诱导T细胞介导的细胞因子从头分泌的潜力。Oci-Ly19、Toledo、Nalm6细胞表达hCD19抗原。使用缺乏hCD19表达的Nalm6 KO和K562靶细胞来评估靶非依赖性细胞因子释放。这项研究还包括了博纳吐单抗作为对照。
8.23.1.材料和方法
收获靶细胞，并将其重悬于含有10％FBS的RPMI介质(英杰公司编号11875-093)中。将每孔5,000个靶细胞接种在平底384孔板中。经由阴性选择(Stemcell Technologies公司编号17951)从来自冷冻保存的PBMC的两个供体中分离人泛T效应细胞，所述PBMC通过Ficoll密度梯度离心从白细胞单采术样品(Hemacare公司编号PB001F-1)中分离。然后将纯化的T细胞添加到板中，以获得1:1的最终E:T比率。在37℃、5％CO2下孵育48小时后，收获上清液，用于随后的分析。根据制造商的说明，使用人细胞因子定制3-plex 384 4-点试剂盒(MesoScale Discovery公司编号N31IB-1)进行多重ELISA。
8.23.2.结果
如图24A-24J所示，当与Oci-Ly19、Toledo和Nalm6细胞一起孵育时，两种基于NEG258的TBM都以剂量依赖性方式诱导T细胞显著的细胞因子分泌。当与抗原阴性的Nalm6KO和K562一起孵育时，检测到最少的细胞因子分泌。
8.24.实例24：用Karpas 422和OCI-LY-19细胞系再考验RTCC测定
使用剂量滴定再考验RTCC测定来确定靶细胞再考验对CD3hi TSP1(H变体)、CD3med TSP1(H变体)、CD3hi BSP1(H变体)、和博纳吐单抗处理的T细胞的杀伤活性的影响。
8.24.1.材料和方法
将稳定表达萤火虫荧光素酶的OCI-LY-19和Karpas422靶细胞接种在T细胞介质(TCM)中的Costar 6孔板中。解冻先前从2名白细胞单采术供体中分离并冷冻保存的PBMC，并分离泛T细胞(如前所述)。以1:1的E:T比率，连同CD3med TSP1、CD3hi TSP1、CD3hi BSP1、和博纳吐单抗的EC90浓度(对于OCI-LY-19为0.1nM，并且对于Karpas 422为0.5nM)，建立T细胞和OCI-LY-19或Karpas 422细胞的共培养物。对于OCI-LY-19将板孵育4天，并且对于Karpas 422细胞将板孵育5天。在孵育结束时，使用发光信号确定靶细胞的杀伤。还测定了每种抗体处理条件下的绝对T细胞计数。对于下一轮的再考验，确保在各种抗体条件下杀死靶细胞是等效的。将T细胞计数在不同抗体条件下进行归一化，并使用EC90浓度在1:1的E:T下进行另一轮单一浓度再考验，其中将两种靶细胞孵育4天。另外，使用来自不同抗体处理条件的T细胞，以1:1的E:T和2nM-0.000001nM的浓度范围建立剂量滴定RTCC，其中每种细胞系使用4天孵育。使用发光信号产生剂量响应曲线来确定靶细胞的杀伤。在考验结束时，对Karpas 422细胞再次重复上述过程，并且对OCI-LY-19细胞再重复两次。测定设置示出于图25A中。
8.24.2.结果
如可以从图25B-25H看出，与CD3med TSP1和CD3hi TSP1相比，CD3hi TSP1在用靶细胞反复考验后能够更好地保持杀伤能力。CD3med TSP1次之，其中CD3hi BSP1是所有抗体中活性最低的。当在分别对Karpas422和OCI-LY-19细胞进行的前2或3轮再考验中与博纳吐单抗相比时，CD3hi TSP1表现出相似的活性。在对OCI-LY-19的最后一次再考验中，CD3hiTSP1比博纳吐单抗介导更强的RTCC(在EC50和最大裂解两方面中)，而对于Karpas422，博纳吐单抗比CD3hi TSP1介导更高的最大裂解，尽管EC50相似。
8.25.实例25：用Karpas 422和OCI-LY-19细胞系再考验T细胞表型
使用单一浓度再考验测定来确定靶细胞再考验对CD3hi TSP1、CD3med TSP1、和CD3hi BSP1(H变体)处理的T细胞表型的影响。
8.25.1.材料和方法
将稳定表达萤火虫荧光素酶的OCI-LY-19和Karpas422靶细胞接种在T细胞介质(TCM)中的Costar 6孔板中。解冻先前从2名白细胞单采术供体中分离并冷冻保存的PBMC，并分离泛T细胞(如前所述)。以1:1的E:T比率建立T细胞和OCI-LY-19或Karpas 422细胞的共培养物，并加入1nM的CD3hi BSP1、CD3med TSP1、或CD3hi TSP1。对于OC-LY-19将板孵育4天，并且对于Karpas 422细胞将板孵育5天。在孵育结束时，测定靶细胞的杀伤和每种抗体处理条件下的绝对T细胞计数。将T细胞计数在不同抗体条件下进行归一化，并以与前一次考验相同的方式设置两轮额外的再考验，其中将两种靶细胞孵育4天，总共进行三次考验。在第三次考验后，在第2天从Karpas 422共培养物并且在第4天从OCI-LY-19共培养物中收获来自不同抗体处理条件的T细胞，并分成2个部分。在用抗人CD3(博奇公司，目录号317324)、CD4(博奇公司，目录号344608)、CD8(BD生物科学公司，目录号563795)、CD27(博奇公司，目录号356412)和CD62L mAb(博奇公司，目录号304814)的合剂染色之前，用蓝色可固定活力染料(赛默飞世尔科技公司，目录号L23105)染色一个部分。将第二部分在TCM中重悬至1e6/ml，并在37℃下用细胞刺激合剂(Cell Stimulation Cocktail)(Tonbo生物科学公司，目录号TNB4975)刺激4小时。此后，将细胞洗涤并依次用蓝色可固定活力染料(赛默飞世尔科技公司，目录号L23105)，抗人CD3(博奇公司，目录号317324)、CD4(博奇公司，目录号344608)、CD8(BD生物科学公司，目录号563795)的合剂染色，随后使用FoxP3转录因子染色装置(赛默飞世尔科技公司，目录号00-5523-00)渗透，并且用抗人IFNγmAb(博奇公司，目录号400134)和IL-2mAb(博奇公司，目录号400551)或各自的同种型对照进行最终染色。所有染色均根据制造商的方案进行。使用BD LSR Fortessa和FlowJo软件进行流动分析。
8.25.2.结果
如图26A-26H(Karpas 422模型)和图26I-26P(OCI-LY-19模型)所示，CD3hi TSP1比CD3med TSP1和CD3hi BSP1更好地促进了T细胞年轻表型的富集。与测试的其他CD19结合物相比，CD3hi TSP1还能够诱导T细胞更好地产生细胞因子。
8.26.实例26：CD3hi TSP1与CD3hi BSP1在CD19+靶细胞存在下引发T细胞增殖和细胞因子产生的能力。
在与表达CD19的Nalm6靶细胞共培养时，评价CD3hi TSP1和CD3hi BSP1(R变体)诱导T细胞增殖、细胞因子产生和T细胞表面标记物表达变化的能力。
8.26.1.材料和方法
在测定建立的当天，以50Gy照射稳定表达萤火虫荧光素酶的Nalm-6靶细胞。解冻先前从血沉棕黄层供体(伯尔尼医院(Bern Hospital))中分离并冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)，并按照制造商的方案，使用人泛T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术有限公司，目录号130-096-535)通过阴性选择分离总T细胞。以50Gy照射阳性部分(称为耗尽的PBMC-T细胞)，以便用作共培养的饲养层。从富含总T细胞的阴性部分，使用EasySepTM人CD8+T细胞富集试剂盒(Stem Cell公司，目录号19053)通过额外的阴性选择步骤分离CD8+T细胞。然后用抗CD28抗体(博奇公司，目录号302922)对未接触的CD8+细胞进行染色，并根据CD28表达用FACSAria(BD)进行分选：CD8+CD28+和CD8+CD28-。分选细胞的纯度>95％。
在分选后，按照制造商的方案，用2.5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，赛默科技公司，目录号C34554)标记T细胞。
将CFSE标记的T细胞的每个T细胞亚群(CD8+CD28+或CD8+CD28-)与Nalm6靶细胞共培养，接种50,000个T细胞和50,000个靶细胞，以实现1:1的效应物:靶(E:T)比率。稀释细胞并共接种以获得额外的1:3或1:6的最终E:T比率。
在需要存在经照射的PBMC-T细胞耗尽的共培养条件下，接种10,000个PBMC以获得效应T细胞:PBMC的5:1比率。
将T细胞-肿瘤细胞共培养物接种在Costar 96孔板(康宁公司，目录号3585)中，所述Costar 96孔板在T细胞介质[RPMI-1640(赛默飞世尔科技公司，目录号21875-034)；10％FBS胎牛血清(GE医疗公司，目录号SH30070.03)；1％非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司，目录号11140-050)；1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔科技公司，目录号15140122)；1％HEPES(龙沙公司(Lonza)，目录号17737E)；丙酮酸钠(赛默飞世尔科技公司，目录号11360-070)；50μMβ-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司，目录号31350)]中。
将稀释在T细胞介质中的CD3hi TSP1和CD3hi BSP1以不同浓度(1nM、0.1nM和0.01nM)添加到细胞中，并在5％CO2、37℃的培养箱中孵育72小时。为了能够检测细胞内细胞因子的产生，在与PMA(50ng/ml；西格玛公司(SIGMA)，目录号P1585)共培养的最后1.5小时孵育板。在孵育的最后1.5小时还添加离子霉素(500μg/ml；Calbiochem公司，目录号407950)；布雷菲德菌素(10μg/ml；Cell Signaling公司，目录号9972)。
在72小时结束时，收获细胞，并且然后通过在室温下孵育10分钟，用一种活力染料Zombie Aqua(博奇公司，目录号423102)染色。然后使用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并用抗表面标记物的抗体染色：抗CD2(博奇公司，目录号300214)、抗CD28(博奇公司，目录号302922)、抗CCR7(博奇公司，目录号353226)、和抗CD45RO(博奇公司，目录号304216)。通过以下检测细胞内IFN-g和颗粒酶B(GzB)：根据制造商的说明用BD cytofix cytoperm试剂盒(BD公司，目录号555028)处理T细胞，并用抗IFNg(博奇公司，目录号502509)和抗颗粒酶B抗体(BD公司，目录号560213)将其染色。将样品用FACS缓冲液洗涤，并在BD LSR Fortessa(BD公司)上采集。用FLOWJO软件(10.6.0版；Tree Star公司)进行分析。
8.26.2.结果
CD3hi TSP1和CD3hi BSP1两者在与表达CD19的靶细胞系Nalm6共培养时均诱导CD28+和CD28-T两种细胞的增殖(图27A-27D)。然而，与CD3hi BSP1相比，CD3hi TSP1在诱导两种T细胞亚群增殖方面更有效。在测试的两种浓度下以及在所使用的不同E:T比率下均观察到了这种影响。在存在或不存在经照射的PBMC的情况下，均观察到对T细胞增殖的影响。
在存在1nM的CD3hi BSP1的情况下，在产生IFN-g或颗粒酶B(GzB)的T细胞的百分比方面没有观察到重大差异；然而，在存在CD3hi TSP1的情况下，两种细胞因子的中值荧光强度(MFI)都有明显的变化，从而表明IFNg和GzB两者的表达都增加，特别是在存在照射的PBMC的情况下共培养时的CD28-T细胞中(图28A-28D)。CD3hi TSP1对产生细胞因子的T细胞的作用在0.1nM下甚至更加明显：在存在和不存在经照射的PBMC的两种情况下，CD28-和CD28+T细胞亚群中的GzB+T细胞和IFNg+T细胞两者都明显增加，如MFI(图28E-28H)。此外，CD28-T细胞IFNg+GzB+的比例(％)在CD3hiTSP1存在下也更显著(图28I-28L)。
CD45RO和CCR7表达谱的组合限定了不同T细胞群的分布：幼稚(CD45RO-CCR7+)、中枢记忆(CM)(CD45RO+CCR7+)、效应记忆(EM)(CD45RO+CCR7-)和终末分化(TEMRA)(CD45RO-CCR7-)。T细胞表面表型的变化示出于图29中。在分选后以及共培养72小时后观察到，CD3hi分子对CD28+细胞没有显著影响，所述CD28+细胞保持了不同T细胞群的均匀分布。相反，CD3hi TSP1对CD28-细胞具有影响：而在分选后CD28-细胞显示几乎完全为TEMRA表型，在用CD3hiTSP1处理72小时后，CD28-细胞重新获取了中枢记忆/效应记忆表型，其中伴随着具有更终末分化(TEMRA)特征的细胞比例的降低。
8.27.实例27：CD3hiTSP1与CD3hi BSP1分子引发针对CD19+靶细胞的重定向T细胞毒性活性(RTCC)的能力。
用CD19+Nalm6细胞建立RTCC测定，将其工程化以表达荧光素酶基因，并对CD8 T细胞群进行分选，以测量CD3hi TSP1和CD3hi BSP1(R变体)引发CD8 T细胞亚群细胞毒性活性的能力。
8.27.1.材料和方法
解冻先前从血沉棕黄层供体(伯尔尼医院)中分离并冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)，并按照制造商的方案，使用人泛T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术有限公司，目录号130-096-535)通过阴性选择分离总T细胞。以50Gy照射阳性部分(称为耗尽的PBMC-T细胞)，以便用作共培养中的饲养层。
从富含总T细胞的阴性部分，然后使用EasySepTM人CD8+T细胞富集试剂盒(StemCell公司，目录号19053)通过额外的阴性选择步骤分离CD8+T细胞。然后用抗CD28抗体(博奇公司，目录号302922)对未接触的CD8+细胞进行染色，并根据CD28表达用FACSAria(BD)进行分选：CD8+CD28+和CD8+CD28-。分选细胞的纯度>95％。
然后将每个T细胞亚群(CD8+CD28+或CD8+CD28-)在384孔平底微量滴定板(赛默飞世尔科技公司，目录号142761)中与等量的Nalm6靶细胞共培养，以实现1:1的效应物:靶(E:T)比率(3,000个T细胞和3,000个靶细胞)。在T细胞介质[RPMI-1640(赛默飞世尔科技公司，目录号21875-034)、10％FBS胎牛血清(GE医疗公司，目录号SH30070.03)、1％非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司，目录号11140-050)、1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔科技公司，目录号15140122)、1％HEPES(龙沙公司，目录号17737E)、丙酮酸钠(赛默飞世尔科技公司，目录号11360-070)、50μMβ-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司，目录号31350)]中建立共培养。稀释细胞并共接种以获得额外的1:3或1:6的最终E:T比率。在需要存在经照射的PBMC-T细胞耗尽的共培养条件下，接种600个PBMC以获得效应T细胞:PBMC的5:1比率。
将CD3hi TSP1、CD3hi BSP1和CD3hi TSP1C抗体对照以不同浓度(1nM、0.1nM和0.01nM)添加到细胞中。
将板在具有5％CO2的37℃培养箱中孵育72小时。在共孵育后，将One-Glo(普洛麦格公司，目录号E6110)添加到所有孔中，并且随后在ELISA读取器4.18 1(Biotek公司，Synergy H1)上测量发光信号。具有One-Glo的靶细胞作为最大信号。使用以下公式计算靶细胞的RTCC百分比：[100-(样品/最大信号)*100％]。
8.27.2.结果
结果示出于图30A-30D中。当与对照抗体CD3hi TSP1C相比时，CD3hi TSP1和CD3hiBSP1两者均介导了针对CD19+Nalm6-luc靶细胞的RTCC活性。当使用0.1nM或1nM的CD3hiTSP1时，与其他处理相比，在具有CD8+CD28-T细胞的环境中(在经照射的饲养层存在下)，观察到CD3hi TSP1介导的RTCC增加。
8.28.实例28：CD3hi TSP1和CD3med TSP1在NSG小鼠的OCI-LY-19弥漫性大B细胞淋巴瘤肿瘤模型的过继转移适应中的抗肿瘤活性
在NSG小鼠的OCI-LY-19弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)肿瘤模型中研究CD3hiTSP1和CD3med TSP1(H变体)的抗肿瘤活性。
8.28.1.材料和方法
在第0天，收获OCI-LY-19细胞，并按500x106个细胞/mL的浓度悬浮于汉克斯平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution，HBSS)中。在约6周龄的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(NSG小鼠)(杰克逊实验室(Jackson Laboratories)，缅因州)的右侧腹上以200μL皮下注射5x106个OCI-LY-19细胞。在肿瘤接种后7天，每只小鼠经由在侧尾静脉中IV注射以100μL接受15X106个外周血单核细胞(PBMC)的过继转移(AdT)。先前从人白细胞单采术样品(leukopak)中分离PBMC，冷冻并储存在气相液氮罐中的Cryostor10介质中直至使用。就在AdT之前，将PBMC解冻并按100X106个细胞/ml的浓度悬浮于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中。当经由机械卡尺测量的肿瘤负荷(TB)达到平均约200mm3体积时，用单次IV给予CD3hi TSP1或CD3med TSP1处理小鼠(n＝8/组)，其剂量水平为0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg或0.3mg/kg。将每种抗体的抗肿瘤活性与接受肿瘤植入和AdT但未接受处理(肿瘤+AdT)的未处理对照组进行比较(表25)。包括仅植入肿瘤的组以计量用未处理对照中观察到的同种异体响应。根据个体小鼠体重，按10mL/kg给予所有处理。通过肿瘤负荷的变化与未处理的对照中的变化的百分比(％ΔT/ΔC)或％消退来确定抗肿瘤活性。
每周记录两次肿瘤负荷和体重。使用生物发光成像系统(IVIS200，珀金埃尔默公司)通过生物发光信号强度(以p/s表示)测量肿瘤负荷。使用以下公式通过％ΔT/ΔC确定抗肿瘤活性：100XΔTB治疗，时间/ΔTB对照组，时间(如果ΔTB≥0)；或％消退：(-1X(100X(TB最终-TB初始/TB初始)(如果ΔTV<0)。TB初始是治疗开始当天的肿瘤负荷。％ΔT/ΔC值<42％被认为具有抗肿瘤活性。使用以下公式测定体重变化百分比：100X((BW时间-BW初始)/BW初始)。用Graphpad Prism软件(版本7.03)进行使用具有邓尼特多重比较测试的单向方差分析(One-way ANOVA)的统计分析。
在OCI-LY-19植入后第25天，来自未处理的对照组的所有动物由于肿瘤负荷而被执行安乐死。
8.28.2.结果
该研究具有最小同种异体响应(图31A-31B)。
以0.1mg/kg和0.3mg/kg用CD3hi TSP1进行抗体治疗导致显著的肿瘤消退，分别为72.41％和84.50％。以0.03mg/kg用CD3hi TSP1进行抗体治疗导致肿瘤消退为13.74％。以0.003mg/kg用CD3hi TSP1进行抗体治疗表现出显著的抗肿瘤活性，为1.38％ΔT/ΔC。以0.003mg/kg剂量水平用CD3hi TSP1进行抗体治疗在该模型中无活性(表25；图31A)。
不存在用CD3hi TSP1治疗的抗体相关的体重减轻。通过用CD3hi TSP1治疗观察到的体重变化很可能是由于移植物抗宿主病(GvHD)的发作。体重减轻是疾病负荷和GvHD发作两者的端点参数。在PBMC注射后35-42天(肿瘤植入后28-35天)，动物开始表现出由GvHD导致的体重减轻。具有高肿瘤负荷的动物还表现出与疾病负荷相关的体重减轻。在研究的过程中，体重相对于肿瘤植入当天的初始测量值有所增加(表25，图32A)。然而，在研究结束时，相对于峰值增加观察到的体重减轻指示GvHD和疾病负荷引起的体重减轻。
以0.1mg/kg(5.60％消退)和0.3mg/kg(36.33％消退)，用CD3med TSP1进行抗体治疗导致显著的抗肿瘤响应。用CD3med TSP1进行治疗导致显著的抗肿瘤响应，其中对于0.03mg/kg剂量水平，％ΔT/ΔC值为7.39％。以0.003和0.01mg/kg用CD3med TSP1进行抗体治疗在该模型中无活性(表26；图31B)。
不存在用CD3med TSP1治疗的抗体相关的体重减轻。在该研究结束时，针对该构建体，未观察到由于GvHD发作引起的体重减轻(表26，图32B)。
Figure BDA0003360067460004941
Figure BDA0003360067460004951
Figure BDA0003360067460004952
8.29.实例29：在huCD34+NSG小鼠的DLBCL皮下肿瘤模型的适应中，OCI-LY-19中多次给药CD3 TSP1、CD3hi BSP1和CD3med TSP1后的抗肿瘤活性
在huCD34+NSG小鼠的OCI-LY-19DLBCL皮下肿瘤模型中研究CD3 TSP1、CD3hiBSP1、和CD3med TSP1(H变体)的抗肿瘤活性。
8.29.1.材料和方法
该研究中使用的NGS小鼠的人源化过程示意性地示出于图33中。简而言之，约6周龄的雌性NSG小鼠(杰克逊实验室，缅因州)接受了预处理方案，以减少骨髓小生境。这是通过化学消融或X射线照射来完成的，以允许在每只NSG小鼠中重建人免疫系统。在预处理后24小时内，经由在侧尾静脉中IV注射以100μL引入从单脐带(龙沙公司，StemCell)分离的50,000个huCD34+干细胞(huCD34+SC)。每只小鼠接受来自单一供体的huCD34+SC。将huCD34+SC冷冻并储存在-200℃液氮罐中，直到使用。在接种前，立即从液氮罐中取出huCD34+SC小瓶，在37℃的珠浴中解冻，并以500,000个细胞/mL的最终浓度重悬于PBS中。在人源化后持续16周，每周监测小鼠的体重和身体状况。在第16周，小鼠经由尾部放血，并且通过荧光激活细胞分选(FACS)确定人免疫重建(人植入)。hCD45/总CD45≥25％的小鼠被认为是稳定植入的，并且符合研究招募的条件。
在植入评估后，小鼠皮下植入肿瘤细胞。在第0天，收获OCI-LY-19细胞并以10x107个细胞/mL的浓度悬浮于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中，并且然后用基质胶以1:1稀释，以得到5x107个细胞/mL的最终浓度。经由皮下(SQ)注射在右侧腹上对小鼠进行植入，其中每只小鼠5x106个细胞，体积为100μL。植入后15天，(经由卡尺测量的平均肿瘤体积约250-300mm3)，以两个参数将小鼠随机化：供体和肿瘤体积。这确保了供体在各组中的平均分布和相当的肿瘤体积。共有3个处理组，n＝8，和未处理的对照组，n＝5。经由IV给予每周用CD3hi TSP1(0.3mg/kg)、CD3med TSP1(1.0mg/kg)、或CD3hi BSP1(0.3mg/kg)治疗小鼠持续2-4周。将每种抗体的抗肿瘤活性与接受肿瘤植入物(肿瘤+CD34+)的未处理的huCD34+SC对照组进行比较(表27)。根据个体小鼠体重，按10mL/kg给予所有处理。抗肿瘤活性是通过处理组与未处理组的肿瘤体积变化百分比(％ΔT/ΔC)或％消退来确定的，并且通过监测％存活动物随时间的变化来评价响应的持久性。安乐死其TV、BW或BCS(身体状况评分)通过超过实验室动物使用协议(AUP)规定的限制达到终点标准的动物。
每周记录两次肿瘤负荷(TV)和体重。通过卡尺测量肿瘤负荷，捕捉长度和宽度，并使用公式(w2xL)/3.14计算肿瘤体积。通过量表测量体重。将这两个参数都输入到内部系统(INDIGO)中。使用以下公式通过％ΔT/ΔC确定抗肿瘤活性：100XΔTB治疗，时间/ΔTB对照组，时间(如果ΔTB≥0)；或％消退：(-1X(100X(TB最终-TB初始/TB初始)(如果ΔTV<0)。TB初始是治疗开始当天的肿瘤负荷。％ΔT/ΔC值<42％被认为具有抗肿瘤活性。使用以下公式测定体重变化百分比：100X((BW时间-BW初始)/BW初始)。用Graphpad Prism软件(版本7.03)进行使用具有邓尼特多重比较测试的单向方差分析(One-way ANOVA)的统计分析(植入后24天)。
此外，使用KAPLAN-Meyer生存图评价到达终点的时间，并使用Graphpad Prism软件(版本7.03)进行分析，并且比较到达终点的中位时间(TTE)的差异。将在肿瘤体积超过1200mm3时实现肿瘤终点的小鼠和因肿瘤体积之外的与疾病进展相关的原因(如溃疡、转移、体重减轻或身体状况不佳)而被安乐死的小鼠评分为死亡(“1”)。审查因肿瘤进展之外的原因(如不良药物事件)而被安乐死的动物(“0”)。进行对数秩(Mantel-Cox)生存分析，并使用Holm-Sidak方法进行所有成对多重比较程序，其中总显著性水平P<0.05(SigmaPlot13.0)。在Prism(GraphPad v7.03)中进行TTE的图形分析。还评价个体响应标准，并将其评分为完全响应(CR)，在最后一次测量时没有可检测的肿瘤；部分响应(PR)，在任何时间点肿瘤体积均小于基线测量值，随后再生长；或无响应(NR)，肿瘤在整个研究中持续增加超过基线测量值。所述研究的最后一天是在第39天。
在OCI-LY-19植入后第24天，来自未处理的对照组的所有动物由于肿瘤负荷而被执行安乐死。在第24天评价统计分析。
8.29.2.结果
与肿瘤+CD34+对照组相比，用所有三种抗体治疗显示出肿瘤活性的显著差异。0.3mg/kg的CD3hi TSP1导致47.4％的显著肿瘤消退，而CD3hi BSP1未实现消退(16.3％ΔT/ΔC)。用1.0mg/kg的CD3med TSP1治疗导致肿瘤消退64.5％(表27，图34A)。
仅在第一次给药后观察到与CD3hi TSP1、CD3med TSP1、和CD3hi BSP1治疗相关的体重减轻。体重减轻的严重性也受到供体的影响，其中不同的供体显示出可变的峰值体重减轻。不受理论的约束，将第一次给药后观察到的体重变化假设为靶介导的驱动，并因固有B细胞的耗尽而加剧。体重减轻是疾病负荷和治疗诱导的响应两者的端点参数。具有高肿瘤负荷的动物表现出与疾病负荷相关的体重减轻。在研究的过程中，观察到体重相对于肿瘤植入当天的初始测量值有所增加，但响应于疾病负荷进展而降低(表27，图34B)。
Figure BDA0003360067460004981
8.30.实例30：在huCD34+NSG小鼠的DLBCL皮下肿瘤模型中比较CD3hi TSP1和CD3med TSP1的单剂量、剂量范围发现研究的抗肿瘤活性
在huCD34+NSG小鼠的OCI-LY-19DLBCL皮下肿瘤模型中研究CD3 TSP1、CD3hiBSP1、和CD3med TSP1(H变体)的抗肿瘤活性。
8.30.1.材料和方法
雌性人源化CD34+NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(HuNSG小鼠)购自杰克逊实验室(加利福尼亚州萨克拉门托)。使用脐带血将小鼠人源化。
在装运之前确定hCD45+细胞的植入水平，并在研究开始之前在内部进行确认。在外周血中具有超过25％hCD45+细胞的HuNSG小鼠被认为是移植的和人源化的。将源自具有不同移植水平的不同供体的HuNSG随机分配到研究中的每个治疗组。
在植入评估后，小鼠皮下植入肿瘤细胞。在第0天，收获OCI-LY-19细胞并以10x107个细胞/mL的浓度悬浮于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中，并且然后用基质胶以1:1稀释，以得到5x107个细胞/mL的最终浓度。经由皮下(SQ)注射在右侧腹上对小鼠进行植入，其中每只小鼠5x106个细胞，体积为100μL。植入后9天，(经由卡尺测量的平均肿瘤体积约250-300mm3)以两个参数将小鼠随机化：供体和肿瘤体积。这确保了供体在各组中的平均分布和相当的肿瘤体积。共有11个组，其中n＝8个处理组和n＝5个未处理的对照组。在以下剂量范围1.0mg/kg、0.3mg/gk、0.1mg/kg和0.01mg/kg内，经由IV给予给小鼠给予单剂量的CD3hiTSP1或CD3med TSP1。将每种抗体的抗肿瘤活性与接受肿瘤植入物(肿瘤+CD34+)的未处理的huCD34+SC对照组进行比较(表28)。根据个体小鼠体重，按10mL/kg给予所有处理。抗肿瘤活性是通过处理组与未处理组的肿瘤体积变化百分比(％ΔT/ΔC)或％消退来确定的，并且通过监测％存活动物随时间的变化来评价响应的持久性。安乐死其TV、BW或BCS(身体状况评分)通过超过实验室动物使用协议(AUP)规定的限制达到终点标准的动物。
每周记录两次肿瘤负荷(TV)和体重。通过卡尺测量肿瘤负荷，捕捉长度和宽度，并使用公式(w2xL)/3.14计算肿瘤体积。通过量表测量体重。将这两个参数都输入到内部系统(INDIGO)中。使用以下公式通过％ΔT/ΔC确定抗肿瘤活性：100XΔTB治疗，时间/ΔTB对照组，时间(如果ΔTB≥0)；或％消退：(-1X(100X(TB最终-TB初始/TB初始)(如果ΔTV<0)。TB初始是治疗开始当天的肿瘤负荷。(％ΔT/ΔC值<42％被认为具有抗肿瘤活性)。使用以下公式测定体重变化百分比：100X((BW时间-BW初始)/BW初始)。用Graphpad Prism软件(版本7.03)进行使用具有邓尼特多重比较测试的单向方差分析(One-way ANOVA)的统计分析。此外，使用KAPLAN-Meyer生存图评价响应的持久性，并使用Graphpad Prism软件(版本7.03)进行分析。
在OCI-LY-19植入后第24天，来自未处理的对照组的所有动物由于肿瘤负荷而被执行安乐死。在第24天评价统计分析。
8.30.2.结果
与肿瘤+CD34+对照组相比，观察到用1.0mg/kg、0.3mg/kg和0.1mg/kg剂量的CD3hiTSP的肿瘤活性具有统计学显著差异。1.0mg/kg的CD3hi TSP1导致35.3％的显著肿瘤消退，而0.3mg/kg和0.1mg/kg的CD3hi TSP1显示出强大的显著的抗肿瘤活性，其ΔT/ΔC值分别为0.05％和19.5％。低于0.1mg/kg给予的剂量水平未实现抗肿瘤响应，其中0.03mg/kg剂量的CD3hi TSP1的ΔT/ΔC值为65.8％，并且0.01mg/kg剂量的ΔT/ΔC值为100％(表28，图35A)。
用CD3med TSP1进行抗体治疗导致显著的抗肿瘤活性。以1.0mg/kg给药的CD3medTSP1实现了显著的肿瘤响应，其ΔT/ΔC为0.05％。0.3mg/kg剂量水平的CD3med TSP1确实显示出抗肿瘤活性(ΔT/ΔC：26.9<42)，但与对照组相比不显著。低于0.3mg/kg的剂量未显示出显著的肿瘤活性，其0.1mg/kg、0.03mg/kg和0.01mg/kg剂量的ΔT/ΔC值分别为79.8％、90.3％、和100％(表28，图35C)。
在给予CD3hi TSP1和CD3med TSP1后，在多个剂量水平上观察到治疗相关的体重减轻。体重减轻的严重性是供体和剂量水平效应两者的组合，其中不同的供体显示出可变的峰值体重减轻。不受理论的约束，将给药后观察到的体重变化假设为靶介导的驱动，并因固有B细胞的耗尽而加剧。体重减轻是疾病负荷和治疗诱导的响应两者的端点参数。具有高肿瘤负荷的动物表现出与疾病负荷相关的体重减轻。在研究的过程中，观察到体重相对于肿瘤植入当天的初始测量值有所增加(表28，图35B和35D)，但响应于疾病负荷进展而降低。
Figure BDA0003360067460005011
Figure BDA0003360067460005021
8.31.实例31：CD3hi BSP1、CD3hi TSP1、和CD3med TSP1在NSG小鼠的Daudi-LucBurkitt淋巴瘤皮下肿瘤模型的过继转移适应中的抗肿瘤活性
在NSG小鼠的Daudi-Luc Burkitt淋巴瘤皮下肿瘤模型的过继转移适应中研究CD3hi BSP1、CD3hi TSP1、和CD3med TSP1(H变体)的抗肿瘤活性。
8.31.1.材料和方法
在第0天，收获Daudi-Luc细胞，并按50x106个细胞/mL的浓度悬浮于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)和基质胶的1:1混合物中。在约6周龄的雌性NSG小鼠(杰克逊实验室，缅因州)的右侧腹上以100μL皮下(SQ)注射5x106个Daudi-Luc细胞。在肿瘤接种后3天，每只小鼠经由在侧尾静脉中静脉内(IV)注射以100μL接受15x106个外周血单核细胞(PBMC)的过继转移(AdT)。先前从人白细胞单采术样品中分离PBMC，冷冻并储存在气相液氮罐中的Cryostor10介质中直至使用。就在AdT之前，将PBMC解冻并按150x106个细胞/ml的浓度悬浮于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中。当经由卡尺(植入后第10天)测量的肿瘤体积(TV)达到平均约250立方毫米(mm3)时，用单次IV给予CD3hi BSP1、CD3hi TSP1、或CD3med TSP1处理小鼠(n＝8/组)，其剂量水平为1.0mg/kg、0.3mg/kg、或0.1mg/kg。将每种抗体的抗肿瘤活性与接受肿瘤植入和AdT但未接受处理(肿瘤+AdT)的未处理对照组进行比较(表29)。包括仅植入肿瘤的组以计量用未处理对照中观察到的同种异体响应。根据个体小鼠体重，按10mL/kg给予所有处理。通过肿瘤体积的变化与未处理的对照中的变化的百分比(％ΔT/ΔC)或％消退来确定抗肿瘤活性。
每周两次记录肿瘤体积和体重。通过卡尺测量肿瘤体积。使用以下公式通过％ΔT/ΔC确定抗肿瘤活性：100XΔTV治疗，时间/ΔTV对照组，时间(如果ΔTV≥0)；或％消退：(-1X(100X(TV最终-TV初始/TV初始)(如果ΔTV<0)。TV初始是治疗开始当天的肿瘤体积。％ΔT/ΔC值<42％被认为具有抗肿瘤活性。使用以下公式测定体重变化百分比：100X((BW时间-BW初始)/BW初始)。用Graphpad Prism软件(版本7.03)进行使用具有邓尼特多重比较测试的单向方差分析(One-way ANOVA)的统计分析。
在Daudi-Luc植入后第36天，来自肿瘤+AdT对照组的动物中的25％由于肿瘤体积而被执行安乐死。
8.31.2.结果
该研究具有最小同种异体响应(图36A-36C)。
以1.0mg/kg和0.3mg/kg用CD3hi BSP1进行抗体治疗导致显著的肿瘤消退，分别为85.21％和73.26％。以0.1mg/kg用CD3hi BSP1进行抗体治疗表现出显著的抗肿瘤活性(20.89％ΔT/ΔC值)。用CD3med TSP1进行抗体治疗在所有三个剂量水平下均导致显著的抗肿瘤响应：1.0mg/kg(90.86％消退)、0.3mg/kg(85.13％消退)、和0.1mg/kg(13.51％消退)。用CD3hi TSP1进行抗体治疗在所有三个剂量水平下均导致显著的肿瘤消退：1.0mg/kg(90.08％消退)、0.3mg/kg(91.86％消退)、和0.1mg/kg(87.52％消退)。
不存在用所测试的三种构建体中的任一种治疗的抗体相关的体重减轻。不受理论的约束，在从基线的大约第35天时观察到的体重变化最可能是由于移植物抗宿主病(GvHD)的发作。体重减轻是GvHD发作的端点参数。在PBMC注射后32-39天(肿瘤植入后35-42天)，动物开始表现出由GvHD导致的体重减轻。在研究的过程中，体重相对于肿瘤植入当天的初始测量值有所增加(表29，图37A-37C)。然而，在研究结束时，相对于峰值增加观察到的体重减轻指示GvHD引起的体重减轻。
Figure BDA0003360067460005041
8.32.实例32：抗CD19 TBM不同CD2结合臂的比较
如图38A至38C所示，产生了用不同CD2结合臂结合至CD19、CD3和CD2的三特异性结合分子(TBM)。
在所有三种构建体中，所述“左”半抗体在N-至C-末端方向上包含CD19 FAB、短柔性接头、抗CD3 scFv、和Fc结构域，并且所述“右”半抗体在N-至C-末端方向上包含CD2结合结构域、短柔性接头、和Fc结构域。所述CD2结合部分是在图38A的构建体中的全长CD58部分、在图38B的构建体中包含CD58的IgV样结构域的截短的CD58部分，以及在图38C的构建体中对应于抗CD2抗体Medi 507的scFv。两种半抗体通过“杵臼结构”工程异二聚化(Ridgway等人,1999,Protein Eng.[蛋白质工程]9(7):617-21)。Fc序列是一种人lgG1 Fc序列，其含有使抗体依赖性细胞毒性沉默并促进异二聚体Fc多特异性结合分子纯化的修饰。
在用Nalm6靶细胞和人泛T效应细胞进行的重定向的T细胞毒性测定中，对TBM进行分析。观察到仅具有截短的CD58 IgV结构域的TBM(图38B)具有与具有全长CD58分子的TBM相似的细胞毒性活性(图38A)。与包含CD58部分的三特异性构建体相比，在该测定中观察到包含Medi 507scFv的TBM(图38C)具有更好的细胞毒性活性(数据未示出)。
在没有靶细胞作为非特异性T细胞活化的量度的情况下，还分析了TBM在Jurkat细胞中诱导活化的T细胞的核因子(NFAT)的潜力。与具有全长CD58分子的构建体相比，观察到仅具有截短的CD58 IgV结构域的TBM(图38B)诱导更少的NFAT活化(图38A)。与含有CD58作为CD2结合部分的三特异性结合分子相比，具有对应于抗CD2抗体Medi 507的scFv的构建体(图38C)显示出强得多的NFAT诱导，表明了更高的非特异性活化潜力(数据未示出)。因此，与使用抗CD2抗体相比，包含CD58作为CD2结合臂降低了非特异性T细胞活化的可能性。
这些结果表明，与经由抗CD2抗体结合至CD19、CD3和CD2的TBM相比，经由CD58结合至CD19、CD3和CD2的TBM将具有更好的安全性特征，包括降低细胞因子释放综合征(“CRS”)的风险。
8.33.实例33：不同抗CD19 TBM构型的比较
结合至CD19、CD3和CD2的TBM是用CD19、CD3和CD2结合结构域的五种不同构型产生的，如图39A至39E所示。
含有两种半抗体的所有五种TBM通过“杵臼结构”工程异二聚化(Ridgway等人,1999,Protein Eng.[蛋白质工程]9(7):617-21)。Fc序列是一种人lgG1 Fc序列，其含有使抗体依赖性细胞毒性沉默并促进异二聚体Fc多特异性结合分子纯化的修饰。
图39A中所示的TBM对应于来自实例32的具有CD58 IgV结构域的TBM(也在图38B中示出)。
图39B中所示的TBM的所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有CD58 IgV结构域、抗CD3 scFab和Fc结构域，并且所述TBM的所述“右”半抗体对于Fc结构域具有抗CD19Fab N-末端。
图39C中所示的TBM的所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有CD58 IgV结构域、抗CD3 scFv和Fc结构域，并且所述TBM的所述“右”半抗体对于Fc结构域具有抗CD19Fab N-末端。
图39D中所示的TBM的所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有抗CD3 scFv、CD58 IgV结构域和Fc结构域，并且所述TBM的所述“右”半抗体对于Fc结构域具有抗CD19Fab N-末端。
图39E中所示的TBM的所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有抗CD3 scFv、Fc结构域和CD58 IgV结构域，并且所述TBM的所述“右”半抗体对于Fc结构域具有抗CD19Fab N-末端。
在用Nalm6靶细胞和人泛T效应细胞进行的重定向的T细胞毒性测定中，对TBM进行分析。图39E中所示的TBM展示出与图39A中所示的TBM相似的细胞毒性活性。其他替代形式显示出较低活性(数据未示出)。
在没有靶细胞作为非特异性T细胞活化的量度的情况下，还分析了TBM在Jurkat细胞中诱导活化的T细胞的核因子(NFAT)的潜力。与其他构建体相比，图39E中所示的TBM展示出更强的NFAT诱导。图39A中所示的TBM显示出最低的NFAT诱导(数据未示出)。
这些结果表明，图39A的TBM形式比其他TBM形式具有更大的抗肿瘤活性和更低的非特异性活性，发明人相信与其他TBM构型相比，这将导致更大的治疗指数和降低的CRS风险。
8.34.实例34：抗CD19 TBM不同CD19结合臂构型的比较
结合至CD19、CD3和CD2的TBM是用CD19结合结构域的三种不同构型产生的，如图40A-40C所示。
含有两种半抗体的所有三种TBM通过“杵臼结构”工程异二聚化(Ridgway等人,1999,Protein Eng.[蛋白质工程]9(7):617-21)。Fc序列是一种人lgG1 Fc序列，其含有使抗体依赖性细胞毒性沉默并促进异二聚体Fc多特异性结合分子纯化的修饰。
图40A中所示的TBM对应于来自实例32的具有CD58 IgV结构域的TBM(也在图38B和图39A中示出)。
图40B中所示的TBM的所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有抗CD3 scFv、Fc结构域和CD19 scFv结构域，并且所述TBM的所述“右”半抗体对于Fc结构域具有CD58 IgV结构域N-末端。
图40C中所示的TBM的所述“左”半抗体在N-末端至C-末端方向上具有抗CD3 scFv、Fc结构域和CD19 Fab结构域，并且所述TBM的所述“右”半抗体对于Fc结构域具有CD58 IgV结构域N-末端。
在用Nalm6靶细胞和人泛T效应细胞进行的重定向的T细胞毒性测定中，对TBM进行分析。与在N-末端处具有CD19结合臂的形式相比，观察到在C-末端上具有CD19结合臂的TBM(如图40B和图40C所示)具有较少的细胞毒性活性(图40A)(数据未示出)。
在没有靶细胞作为非特异性T细胞活化的量度的情况下，还分析了TBM在Jurkat细胞中诱导活化的T细胞的核因子(NFAT)的潜力。与在N-末端处具有CD19结合臂的形式相比，观察到在C-末端上具有CD19结合臂的TBM(如图40B和图40C所示)具有较高的NFAT诱导(图40A)(数据未示出)。
这些结果表明，如图40A所示，与在C-末端处具有CD19结合部分的TBM相比，在N-末端处具有CD19结合部分的TBM具有更大的抗肿瘤活性和更低的非特异性活性。发明人相信，与其中CD19结合部分在C-末端处的TBM相比，在N-末端处具有CD19结合部分的TBM因此将具有更大的治疗指数和降低的CRS风险。
9.具体实施例、参考文献的引用
虽然已经说明和描述了多种具体的实施例，但应当理解，在不脱离一种或多种本披露的精神和范围的情况下，可以进行多种改变。本披露通过以下列出的编号的实施例来例证。
1.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、和SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
2.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
3.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
4.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
5.如实施例1至4中任一项所述的CD19结合分子，其包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH。
6.如实施例1至5中任一项所述的CD19结合分子，其包含具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL。
7.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、和SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、和SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
8.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、和SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
9.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、和SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、和SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
10.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、和SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
11.如实施例7至10中任一项所述的CD19结合分子，其包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH。
12.如实施例7至11中任一项所述的CD19结合分子，其包含具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL。
13.如实施例1至12中任一项所述的CD19结合分子，其包含抗体、抗体片段、scFv、dsFv、Fv、Fab、scFab、(Fab’)2、或单结构域抗体(SDAB)。
14.如实施例13所述的CD19结合分子，其包含抗体或其抗原结合结构域。
15.如实施例13所述的CD19结合分子，其包含scFv。
16.如实施例1至12中任一项所述的CD19结合分子，其是包含以下的多特异性结合分子(MBM)：
(a)特异性结合至CD19的抗原结合模块1(ABM1)；以及
(b)特异性结合至不同靶分子的抗原结合模块2(ABM2)，任选地其中所述靶分子是人T细胞受体(TCR)复合物的组分。
17.如实施例16所述的CD19结合分子，其中ABM1是抗体、抗体片段、scFv、dsFv、Fv、Fab、scFab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、或骆驼科动物VHH结构域。
18.如实施例17所述的CD19结合分子，其中ABM1是scFv。
19.如实施例17所述的CD19结合分子，其中ABM1是Fab。
20.如实施例17所述的CD19结合分子，其中所述Fab是Fab异二聚体。
21.如实施例17所述的CD19结合分子，其中ABM1是抗CD19抗体或其抗原结合结构域。
22.如实施例16至21中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2是基于非免疫球蛋白支架的ABM。
23.如实施例22所述的CD19结合分子，其中ABM2是Kunitz结构域、Adnexin、亲合体、DARPin、Avimer、Anticalin、脂质运载蛋白、Centyrin、Versabody、Knottin、Adnectin、Pronectin、Affitin/Nanofitin、Affilin、Atrimer/四连接素、二环肽、cys-knot、Fn3支架、Obody、Tn3、Affimer、BD、Adhiron、Duocalin、Alphabody、Armadillo重复蛋白质、Repebody、或Fynomer。
24.如实施例16至21中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2是基于免疫球蛋白支架的ABM。
25.如实施例24所述的CD19结合分子，其中ABM2是抗体、抗体片段、scFv、dsFv、Fv、Fab、scFab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、或骆驼科动物VHH结构域。
26.如实施例25所述的CD19结合分子，其中ABM2是抗体或其抗原结合结构域。
27.如实施例25所述的CD19结合分子，其中ABM2是scFv。
28.如实施例25所述的CD19结合分子，其中ABM2是Fab。
29.如实施例25所述的CD19结合分子，其中ABM2是Fab异二聚体。
30.如实施例16至29中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2特异性结合至人T细胞受体(TCR)复合物的组分。
31.如实施例30所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是CD3。
32.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-1的CDR序列。
33.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-2的CDR序列。
34.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-3的CDR序列。
35.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-4的CDR序列。
36.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-5的CDR序列。
37.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-6的CDR序列。
38.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-7的CDR序列。
39.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-8的CDR序列。
40.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-9的CDR序列。
41.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-10的CDR序列。
42.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-11的CDR序列。
43.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-12的CDR序列。
44.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-13的CDR序列。
45.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-14的CDR序列。
46.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-15的CDR序列。
47.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-16的CDR序列。
48.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-17的CDR序列。
49.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-18的CDR序列。
50.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-19的CDR序列。
51.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-20的CDR序列。
52.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-21的CDR序列。
53.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-22的CDR序列。
54.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-23的CDR序列。
55.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-24的CDR序列。
56.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-25的CDR序列。
57.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-26的CDR序列。
58.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-27的CDR序列。
59.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-28的CDR序列。
60.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-29的CDR序列。
61.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-30的CDR序列。
62.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-31的CDR序列。
63.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-32的CDR序列。
64.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-33的CDR序列。
65.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-34的CDR序列。
66.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-35的CDR序列。
67.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-36的CDR序列。
68.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-37的CDR序列。
69.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-38的CDR序列。
70.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-39的CDR序列。
71.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-40的CDR序列。
72.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-41的CDR序列。
73.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-42的CDR序列。
74.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-43的CDR序列。
75.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-44的CDR序列。
76.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-45的CDR序列。
77.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-46的CDR序列。
78.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-47的CDR序列。
79.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-48的CDR序列。
80.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-49的CDR序列。
81.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-50的CDR序列。
82.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-51的CDR序列。
83.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-52的CDR序列。
84.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-53的CDR序列。
85.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-54的CDR序列。
86.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-55的CDR序列。
87.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-56的CDR序列。
88.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-57的CDR序列。
89.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-58的CDR序列。
90.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-59的CDR序列。
91.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-60的CDR序列。
92.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-61的CDR序列。
93.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-62的CDR序列。
94.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-63的CDR序列。
95.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-64的CDR序列。
96.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-65的CDR序列。
97.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-66的CDR序列。
98.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-67的CDR序列。
99.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-68的CDR序列。
100.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-69的CDR序列。
101.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-70的CDR序列。
102.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-71的CDR序列。
103.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-72的CDR序列。
104.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-73的CDR序列。
105.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-74的CDR序列。
106.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-75的CDR序列。
107.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-76的CDR序列。
108.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-77的CDR序列。
109.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-78的CDR序列。
110.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-79的CDR序列。
111.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-80的CDR序列。
112.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-81的CDR序列。
113.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-82的CDR序列。
114.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-83的CDR序列。
115.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-84的CDR序列。
116.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-85的CDR序列。
117.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-86的CDR序列。
118.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-87的CDR序列。
119.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-88的CDR序列。
120.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-89的CDR序列。
121.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-90的CDR序列。
122.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-91的CDR序列。
123.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-92的CDR序列。
124.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-93的CDR序列。
125.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-94的CDR序列。
126.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-95的CDR序列。
127.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-96的CDR序列。
128.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-97的CDR序列。
129.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-98的CDR序列。
130.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-99的CDR序列。
131.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-100的CDR序列。
132.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-101的CDR序列。
133.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-102的CDR序列。
134.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-103的CDR序列。
135.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-104的CDR序列。
136.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-105的CDR序列。
137.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-106的CDR序列。
138.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-107的CDR序列。
139.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-108的CDR序列。
140.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-109的CDR序列。
141.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-110的CDR序列。
142.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-111的CDR序列。
143.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-112的CDR序列。
144.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-113的CDR序列。
145.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-114的CDR序列。
146.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-115的CDR序列。
147.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-116的CDR序列。
148.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-117的CDR序列。
149.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-118的CDR序列。
150.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-119的CDR序列。
151.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-120的CDR序列。
152.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-121的CDR序列。
153.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-122的CDR序列。
154.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-123的CDR序列。
155.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-124的CDR序列。
156.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-125的CDR序列。
157.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-126的CDR序列。
158.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-127的CDR序列。
159.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-128的CDR序列。
160.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-129的CDR序列。
161.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-130的CDR序列。
162.如实施例32至161中任一项所述的CD19结合分子，其中所述CDR由卡巴特编号所定义，如在表12B中所列出。
163.如实施例32至161中任一项所述的CD19结合分子，其中所述CDR由乔西亚编号所定义，如在表12C中所列出。
164.如实施例32至161中任一项所述的MBM，其中所述CDR由卡巴特编号和乔西亚编号的组合所定义，如在表12D中所列出。
165.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-1的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
166.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-2的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
167.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-3的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
168.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-4的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
169.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-5的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
170.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-6的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
171.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-7的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
172.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-8的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
173.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-9的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
174.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-10的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
175.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-11的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
176.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-12的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
177.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-13的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
178.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-14的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
179.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-15的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
180.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-16的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
181.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-17的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
182.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-18的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
183.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-19的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
184.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-20的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
185.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-21的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
186.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-22的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
187.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-23的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
188.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-24的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
189.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-25的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
190.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-26的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
191.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-27的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
192.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-28的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
193.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-129的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
194.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-130的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
195.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-12的scFv的氨基酸序列。
196.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-21的scFv的氨基酸序列。
197.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-22的scFv的氨基酸序列。
198.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-23的scFv的氨基酸序列。
199.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-24的scFv的氨基酸序列。
200.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-25的scFv的氨基酸序列。
201.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-26的scFv的氨基酸序列。
202.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-27的scFv的氨基酸序列。
203.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-28的scFv的氨基酸序列。
204.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-129的scFv的氨基酸序列。
205.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-130的scFv的氨基酸序列。
206.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AA、表AB、或表AC中所列出的CDR-H1序列、CDR-H2序列、CDR-H3序列、CDR-L1序列、CDR-L2序列、和CDR-L3序列。
207.如实施例206所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AA中所列出的CDR-H1序列、CDR-H2序列、CDR-H3序列、CDR-L1序列、CDR-L2序列、和CDR-L3序列。
208.如实施例207所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X1的氨基酸是T。
209.如实施例207所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X1的氨基酸是A。
210.如实施例207至209中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X2的氨基酸是S。
211.如实施例207至209中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X2的氨基酸是R。
212.如实施例207至211中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X3的氨基酸是N。
213.如实施例207至211中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X3的氨基酸是Y。
214.如实施例207至211中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X3的氨基酸是Q。
215.如实施例207至214中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X4的氨基酸是H。
216.如实施例207至214中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X4的氨基酸是S。
217.如实施例207至216中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X5的氨基酸是M。
218.如实施例207至216中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X5的氨基酸是L。
219.如实施例207至218中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X6的氨基酸是K。
220.如实施例207至218中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X6的氨基酸是R。
221.如实施例207至220中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X7的氨基酸是S。
222.如实施例207至220中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X7的氨基酸是K。
223.如实施例207至222中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X55的氨基酸是F。
224.如实施例207至222中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X55的氨基酸是Y。
225.如实施例207至222中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X55的氨基酸是S。
226.如实施例207至225中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X8的氨基酸是W。
227.如实施例207至225中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X8的氨基酸是Y。
228.如实施例207至225中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X8的氨基酸是S。
229.如实施例207至225中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X8的氨基酸是T。
230.如实施例207至229中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X9的氨基酸是W。
231.如实施例207至229中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X9的氨基酸是Y。
232.如实施例207至229中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X9的氨基酸是S。
233.如实施例207至229中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X9的氨基酸是T。
234.如实施例207至233中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X10的氨基酸是H。
235.如实施例207至233中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X10的氨基酸是Y。
236.如实施例207至235中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X11的氨基酸是S。
237.如实施例207至235中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X11的氨基酸是G。
238.如实施例207至237中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X12的氨基酸是I。
239.如实施例207至237中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X12的氨基酸是L。
240.如实施例207至239中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X13的氨基酸是V。
241.如实施例207至239中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X13的氨基酸是G。
242.如实施例207至241中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X14的氨基酸是R。
243.如实施例207至241中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X14的氨基酸是N。
244.如实施例207至243中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X15的氨基酸是D。
245.如实施例207至243中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X15的氨基酸是E。
246.如实施例207至243中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X15的氨基酸是L。
247.如实施例207至246中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X16的氨基酸是G。
248.如实施例207至246中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X16的氨基酸是N。
249.如实施例207至246中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X16的氨基酸是E。
250.如实施例207至249中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X17的氨基酸是R。
251.如实施例207至249中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X17的氨基酸是S。
252.如实施例207至251中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X18的氨基酸是V。
253.如实施例207至251中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X18的氨基酸是T。
254.如实施例207至253中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X19的氨基酸是N。
255.如实施例207至253中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X19的氨基酸是T。
256.如实施例207至255中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X20的氨基酸是R。
257.如实施例207至255中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X20的氨基酸是L。
258.如实施例207至257中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X21的氨基酸是F。
259.如实施例207至257中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X21的氨基酸是E。
260.如实施例207至259中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X22的氨基酸是S。
261.如实施例207至259中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X22的氨基酸是Y。
262.如实施例207至261中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X23的氨基酸是S。
263.如实施例207至261中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X23的氨基酸是Y。
264.如实施例207至263中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X24的氨基酸是S。
265.如实施例207至263中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X24的氨基酸是A。
266.如实施例207至265中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X25的氨基酸是H。
267.如实施例207至265中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X25的氨基酸是T。
268.如实施例207至267中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X26的氨基酸是F。
269.如实施例207至267中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X26的氨基酸是Y。
270.如实施例207至269中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X27的氨基酸是W。
271.如实施例207至269中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AA中指定为X27的氨基酸是Y。
272.如实施例207至271中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C1-1。
273.如实施例207至271中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C1-2。
274.如实施例207至271中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C1-3。
275.如实施例207至271中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C1-4。
276.如实施例207至275中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C1-5。
277.如实施例207至275中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C1-6。
278.如实施例207至275中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C1-7。
279.如实施例207至278中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H3序列C1-8。
280.如实施例207至278中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H3序列C1-9。
281.如实施例207至278中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H3序列C1-10。
282.如实施例207至278中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H3序列C1-11。
283.如实施例207至282中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C1-12。
284.如实施例207至282中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C1-13。
285.如实施例207至282中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C1-14。
286.如实施例207至282中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C1-15。
287.如实施例207至282中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C1-16。
288.如实施例207至282中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C1-17。
289.如实施例207至288中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L2序列C1-18。
290.如实施例207至288中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L2序列C1-19。
291.如实施例207至290中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L3序列C1-20。
292.如实施例207至290中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L3序列C1-21。
293.如实施例207至290中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L3序列C1-22。
294.如实施例207至290中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L3序列C1-23。
295.如实施例206所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AB中所列出的CDR-H1序列、CDR-H2序列、CDR-H3序列、CDR-L1序列、CDR-L2序列、和CDR-L3序列。
296.如实施例295所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X28的氨基酸是V。
297.如实施例295所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X28的氨基酸是I。
298.如实施例295至297中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X29的氨基酸是F。
299.如实施例295至297中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X29的氨基酸是Y。
300.如实施例295至299中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X30的氨基酸是N。
301.如实施例295至299中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X30的氨基酸是S。
302.如实施例295至301中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X31的氨基酸是A。
303.如实施例295至301中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X31的氨基酸是S。
304.如实施例295至303中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X32的氨基酸是T。
305.如实施例295至303中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X32的氨基酸是K。
306.如实施例295至305中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X33的氨基酸是T。
307.如实施例295至305中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X33的氨基酸是A。
308.如实施例295至307中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X34的氨基酸是S。
309.如实施例295至307中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X34的氨基酸是R。
310.如实施例295至309中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X35的氨基酸是N。
311.如实施例295至309中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X35的氨基酸是G。
312.如实施例295至311中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X36的氨基酸是S。
313.如实施例295至311中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X36的氨基酸是A。
314.如实施例295至313中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X37的氨基酸是A。
315.如实施例295至313中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X37的氨基酸是T。
316.如实施例295至313中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X37的氨基酸是S。
317.如实施例295至316中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X38的氨基酸是N。
318.如实施例295至316中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X38的氨基酸是D。
319.如实施例295至318中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X39的氨基酸是N。
320.如实施例295至318中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X39的氨基酸是K。
321.如实施例295至320中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X40的氨基酸是D。
322.如实施例295至320中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X40的氨基酸是N。
323.如实施例295至322中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X41的氨基酸是H。
324.如实施例295至322中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X41的氨基酸是N。
325.如实施例295至324中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X42的氨基酸是Q。
326.如实施例295至324中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X42的氨基酸是E。
327.如实施例295至326中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X43的氨基酸是R。
328.如实施例295至326中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X43的氨基酸是S。
329.如实施例295至326中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AB中指定为X43的氨基酸是G。
330.如实施例295至329中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C2-1。
331.如实施例295至329中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C2-2。
332.如实施例295至329中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C2-3。
333.如实施例295至329中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C2-4。
334.如实施例295至333中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C2-5。
335.如实施例295至333中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C2-6。
336.如实施例295至333中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C2-7。
337.如实施例295至336中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H3序列C2-8。
338.如实施例295至336中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H3序列C2-9。
339.如实施例295至338中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C2-10。
340.如实施例295至338中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C2-11。
341.如实施例295至338中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C2-12。
342.如实施例295至341中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L2序列C2-13。
343.如实施例295至341中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L2序列C2-14。
344.如实施例295至341中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L2序列C2-15。
345.如实施例295至344中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L3序列C2-16。
346.如实施例295至344中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L3序列C2-17。
347.如实施例206所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AC中所列出的CDR-H1序列、CDR-H2序列、CDR-H3序列、CDR-L1序列、CDR-L2序列、和CDR-L3序列。
348.如实施例347所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X44的氨基酸是G。
349.如实施例347所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X44的氨基酸是A。
350.如实施例347至349中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X45的氨基酸是H。
351.如实施例347至349中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X45的氨基酸是N。
352.如实施例347至351中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X46的氨基酸是D。
353.如实施例347至351中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X46的氨基酸是G。
354.如实施例347至353中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X47的氨基酸是A。
355.如实施例347至353中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X47的氨基酸是G。
356.如实施例347至355中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X48的氨基酸是N。
357.如实施例347至355中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X48的氨基酸是K。
358.如实施例347至357中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X49的氨基酸是V。
359.如实施例347至357中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X49的氨基酸是A。
360.如实施例347至359中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X50的氨基酸是N。
361.如实施例347至359中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X50的氨基酸是V。
362.如实施例347至361中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X51的氨基酸是A。
363.如实施例347至361中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X51的氨基酸是V。
364.如实施例347至363中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X52的氨基酸是Y。
365.如实施例347至363中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X52的氨基酸是F。
366.如实施例347至365中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X53的氨基酸是I。
367.如实施例347至365中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X53的氨基酸是V。
368.如实施例347至367中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X54的氨基酸是I。
369.如实施例347至367中任一项所述的CD19结合分子，其中在表AC中指定为X54的氨基酸是H。
370.如实施例347至369中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C3-1。
371.如实施例347至369中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C3-2。
372.如实施例347至369中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C3-3。
373.如实施例347至369中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H1序列C3-4。
374.如实施例347至373中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C3-5。
375.如实施例347至373中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C3-6。
376.如实施例347至373中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H2序列C3-7。
377.如实施例347至376中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H3序列C3-8。
378.如实施例347至376中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-H3序列C3-9。
379.如实施例347至378中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C3-10。
380.如实施例347至378中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C3-11。
381.如实施例347至378中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L1序列C3-12。
382.如实施例347至381中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L2序列C3-13。
383.如实施例347至381中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L2序列C3-14。
384.如实施例347至383中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L3序列C3-15。
385.如实施例347至383中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CDR-L3序列C3-16。
386.如实施例31所述的CD19结合分子，其中ABM2分别包含表AD-1、表AE-1、表AF-1、表AG-1、表AH-1、或表AI-1中所列出的CDR-H1 CDR-H2、和CDR-H3序列，以及表AD-2、表AE-2、表AF-2、表AG-2、表AH-2、或表AI-2中所列出的相应的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
387.如实施例386所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AD-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3序列以及表AD-2中所列出的相应的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
388.如实施例386所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AE-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3序列以及表AE-2中所列出的相应的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
389.如实施例386所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AF-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3序列以及表AF-2中所列出的相应的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
390.如实施例386所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AG-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3序列以及表AG-2中所列出的相应的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
391.如实施例386所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AH-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3序列以及表AH-2中所列出的相应的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
392.如实施例386所述的CD19结合分子，其中ABM2包含表AI-1中所列出的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3序列以及表AI-2中所列出的相应的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
393.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV292的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
394.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV123的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
395.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含Sp10b的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
396.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV453的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
397.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV229的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
398.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV110的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
399.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV832的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
400.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV589的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
401.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV580的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
402.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV567的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
403.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV221的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
404.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_bkm1的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
405.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11a_bkm2的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
406.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_hz0的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
407.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_HZ1的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
408.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_sansPTM_hz1的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
409.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_sansPTM_rat的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
410.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
411.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_SS的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
412.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_WS的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
413.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
414.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_TT的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
415.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_TW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
416.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_WT的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
417.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
418.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
419.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
420.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
421.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9aFW1_VL_VH_S56G的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
422.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP9AFW4_VL_VH_S56G的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
423.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9aFW1_VL_VH的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
424.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9aFW4_VLVH的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
425.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9arabtor_VHVL的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
426.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9arabtor_VLVH的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
427.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_SANSPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
428.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_SANSPTM_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
429.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_SANSPTM_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
430.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
431.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_s的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
432.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_SANSPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
433.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_SANSPTM_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
434.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_SANSPTM_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
435.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
436.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
437.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_SANSPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
438.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_SANSPTM_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
439.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_SANSPTM_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
440.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
441.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
442.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_SANSPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
443.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_SANSPTM_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
444.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_SANSPTM_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
445.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
446.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
447.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_SANSPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
448.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_SANSPTM_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
449.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_SANSPTM_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
450.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
451.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
452.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_SANSPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
453.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_SANSPTM_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
454.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_SANSPTM_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
455.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
456.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
457.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_SANSPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
458.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
459.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
460.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_Y_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
461.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_S_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
462.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_Y_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
463.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_S_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
464.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_Y_PTM_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
465.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_S_SWPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
466.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_SWPTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
467.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
468.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
469.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
470.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_Y_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
471.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_S_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
472.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_Y_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
473.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_S_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
474.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_Y_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
475.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_S_PTM_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
476.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
477.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_SW_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
478.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
479.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
480.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_Y_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
481.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_S_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
482.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_Y_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
483.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_S_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
484.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_Y_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
485.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_S_PTM_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
486.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1PTM_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
487.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
488.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_Y的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
489.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_S的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
490.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_Y_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
491.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_S_PTM的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
492.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_Y_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
493.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_S_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
494.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_Y_PTM_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
495.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_S_PTM_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
496.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_PTM_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
497.如实施例387至392中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_SW的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3序列。
498.如实施例386所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表AJ-1中列出的重链可变序列和在表AJ-2中列出的相应的轻链可变序列。
499.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV292的重链可变序列和轻链可变序列。
500.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV123的重链可变序列和轻链可变序列。
501.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含Sp10b的重链可变序列和轻链可变序列。
502.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV453的重链可变序列和轻链可变序列。
503.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV229的重链可变序列和轻链可变序列。
504.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV110的重链可变序列和轻链可变序列。
505.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV832的重链可变序列和轻链可变序列。
506.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV589的重链可变序列和轻链可变序列。
507.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV580的重链可变序列和轻链可变序列。
508.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV567的重链可变序列和轻链可变序列。
509.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含NOV221的重链可变序列和轻链可变序列。
510.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_bkm1的重链可变序列和轻链可变序列。
511.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11a_bkm2的重链可变序列和轻链可变序列。
512.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_hz0的重链可变序列和轻链可变序列。
513.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_HZ1的重链可变序列和轻链可变序列。
514.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_sansPTM_hz1的重链可变序列和轻链可变序列。
515.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_sansPTM_rat的重链可变序列和轻链可变序列。
516.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY的重链可变序列和轻链可变序列。
517.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_SS的重链可变序列和轻链可变序列。
518.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_WS的重链可变序列和轻链可变序列。
519.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
520.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_TT的重链可变序列和轻链可变序列。
521.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_TW的重链可变序列和轻链可变序列。
522.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VHVL_WT的重链可变序列和轻链可变序列。
523.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A VH3_VLK_3的重链可变序列和轻链可变序列。
524.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2的重链可变序列和轻链可变序列。
525.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1的重链可变序列和轻链可变序列。
526.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2的重链可变序列和轻链可变序列。
527.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9aFW1_VL_VH_S56G的重链可变序列和轻链可变序列。
528.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP9AFW4_VL_VH_S56G的重链可变序列和轻链可变序列。
529.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9aFW1_VL_VH的重链可变序列和轻链可变序列。
530.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9aFW4_VLVH的重链可变序列和轻链可变序列。
531.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9arabtor_VHVL的重链可变序列和轻链可变序列。
532.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp9arabtor_VLVH的重链可变序列和轻链可变序列。
533.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_SANSPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
534.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_SANSPTM_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
535.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_SANSPTM_S的重链可变序列和轻链可变序列。
536.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
537.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_YY_s的重链可变序列和轻链可变序列。
538.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_SANSPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
539.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_SANSPTM_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
540.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_SANSPTM_S的重链可变序列和轻链可变序列。
541.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
542.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_S的重链可变序列和轻链可变序列。
543.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SS_SANSPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
544.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_SANSPTM_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
545.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_SANSPTM_S的重链可变序列和轻链可变序列。
546.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
547.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_S的重链可变序列和轻链可变序列。
548.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_WS_SANSPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
549.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_SANSPTM_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
550.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_SANSPTM_S的重链可变序列和轻链可变序列。
551.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
552.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_S的重链可变序列和轻链可变序列。
553.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_SW_SANSPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
554.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_SANSPTM_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
555.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_SANSPTM_S的重链可变序列和轻链可变序列。
556.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
557.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_S的重链可变序列和轻链可变序列。
558.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TW_SANSPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
559.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_SANSPTM_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
560.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_SANSPTM_S的重链可变序列和轻链可变序列。
561.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
562.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_S的重链可变序列和轻链可变序列。
563.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VHVL_TT_SANSPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
564.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
565.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_S的重链可变序列和轻链可变序列。
566.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_Y_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
567.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_S_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
568.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_Y_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
569.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_S_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
570.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_Y_PTM_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
571.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_S_SWPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
572.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_SWPTM的重链可变序列和轻链可变序列。
573.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11AVH3_VLK_3_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
574.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
575.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_S的重链可变序列和轻链可变序列。
576.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_Y_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
577.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_S_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
578.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_Y_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
579.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_S_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
580.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_Y_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
581.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_S_PTM_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
582.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
583.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_sp11a_VH1_VK2_SW_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
584.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
585.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_S的重链可变序列和轻链可变序列。
586.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_Y_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
587.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_S_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
588.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_Y_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
589.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_S_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
590.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_Y_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
591.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_S_PTM_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
592.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1PTM_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
593.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH3_VLK1_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
594.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_Y的重链可变序列和轻链可变序列。
595.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_S的重链可变序列和轻链可变序列。
596.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_Y_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
597.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_S_PTM的重链可变序列和轻链可变序列。
598.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_Y_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
599.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_S_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
600.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_Y_PTM_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
601.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_S_PTM_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
602.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_PTM_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
603.如实施例498所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3_SP11A_VH5_VK2_SW的重链可变序列和轻链可变序列。
604.如实施例30所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-α、TCR-β、或TCR-α/β二聚体。
605.如实施例604所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-α。
606.如实施例604所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-β。
607.如实施例604所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-α/β二聚体。
608.如实施例604所述的CD19结合分子，其中ABM2包含BMA031的CDR序列。
609.如实施例608所述的CD19结合分子，其中所述CDR序列由卡巴特编号所定义。
610.如实施例608所述的CD19结合分子，其中所述CDR序列由乔西亚编号所定义。
611.如实施例608所述的CD19结合分子，其中所述CDR序列由卡巴特编号和乔西亚编号的组合所定义。
612.如实施例608所述的CD19结合分子，其中ABM2包含BMA031的重链和轻链可变序列。
613.如实施例30所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-γ、TCR-δ、或TCR-γ/δ二聚体。
614.如实施例613所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-γ。
615.如实施例613所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-δ。
616.如实施例613所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-γ/δ二聚体。
617.如实施例613所述的CD19结合分子，其中ABM2包含δTCS1的CDR序列。
618.如实施例617所述的CD19结合分子，其中所述CDR序列由卡巴特编号所定义。
619.如实施例617所述的CD19结合分子，其中所述CDR序列由乔西亚编号所定义。
620.如实施例617所述的CD19结合分子，其中所述CDR序列由卡巴特编号和乔西亚编号的组合所定义。
621.如实施例617所述的CD19结合分子，其中ABM2包含δTCS1的重链和轻链可变序列。
622.如实施例16至621中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM1能够在与ABM2结合至其靶分子的相同时间结合CD19。
623.如实施例16至622中任一项所述的CD19结合分子，其是双特异性结合分子(BBM)。
624.如实施例623所述的CD19结合分子，其是二价的。
625.如实施例624所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有在图1B-1F中描绘的构型中的任何一种。
626.如实施例625所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1B中所描述的构型。
627.如实施例625所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1C中所描述的构型。
628.如实施例625所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1D中所描述的构型。
629.如实施例625所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1E中所描述的构型。
630.如实施例625所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1F中所描述的构型。
631.如实施例625至630中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.1节中被称为B1的构型。
632.如实施例625至630中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.1节中被称为B2的构型。
633.如实施例623所述的CD19结合分子，其是三价的。
634.如实施例633所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有在图1G-1Z中描绘的构型中的任何一种。
635.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1G中所描述的构型。
636.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1H中所描述的构型。
637.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1I中所描述的构型。
638.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1J中所描述的构型。
639.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1K中所描述的构型。
640.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1L中所描述的构型。
641.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1M中所描述的构型。
642.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1N中所描述的构型。
643.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1O中所描述的构型。
644.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1P中所描述的构型。
645.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1Q中所描述的构型。
646.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1R中所描述的构型。
647.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1S中所描述的构型。
648.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1T中所描述的构型。
649.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1U中所描述的构型。
650.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1V中所描述的构型。
651.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1W中所描述的构型。
652.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1X中所描述的构型。
653.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1Y中所描述的构型。
654.如实施例634所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1Z中所描述的构型。
655.如实施例633至654中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T1的构型。
656.如实施例633至654中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T2的构型。
657.如实施例633至654中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T3的构型。
658.如实施例633至654中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T4的构型。
659.如实施例633至654中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T5的构型。
660.如实施例633至654中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T6的构型。
661.如实施例623所述的CD19结合分子，其是四价的。
662.如实施例661所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有在图1AA-1AH中描绘的构型中的任何一种。
663.如实施例662所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1AA中所描述的构型。
664.如实施例662所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1AB中所描述的构型。
665.如实施例662所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1AC中所描述的构型。
666.如实施例662所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1AD中所描述的构型。
667.如实施例662所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1AE中所描述的构型。
668.如实施例662所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1AF中所描述的构型。
669.如实施例662所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1AG中所描述的构型。
670.如实施例662所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图1AH中所描述的构型。
671.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv1的构型。
672.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv2的构型。
673.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv3的构型。
674.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv4的构型。
675.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv5的构型。
676.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv6的构型。
677.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv7的构型。
678.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv8的构型。
679.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv9的构型。
680.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv10的构型。
681.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv11的构型。
682.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv12的构型。
683.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv13的构型。
684.如实施例661至670中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv14的构型。
685.如实施例16至622中任一项所述的CD19结合分子，其是三特异性结合分子(TBM)，包含特异性结合至除了CD19之外的靶分子的抗原结合模块3(ABM3)。
686.如实施例685所述的CD19结合分子，其中ABM2特异性结合至人T细胞受体(TCR)复合物的组分，并且ABM3特异性结合至(i)人CD2或(ii)肿瘤相关抗原(TAA)。
687.如实施例685或实施例686所述的CD19结合分子，其是三价的。
688.如实施例687所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有在图2A-2P中描绘的构型中的任何一种。
689.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2A中所描述的构型。
690.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2B中所描述的构型。
691.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2C中所描述的构型。
692.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2D中所描述的构型。
693.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2E中所描述的构型。
694.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2F中所描述的构型。
695.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2G中所描述的构型。
696.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2H中所描述的构型。
697.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2I中所描述的构型。
698.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2J中所描述的构型。
699.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2K中所描述的构型。
700.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2L中所描述的构型。
701.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2M中所描述的构型。
702.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2N中所描述的构型。
703.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2O中所描述的构型。
704.如实施例688所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2P中所描述的构型。
705.如实施例688至704中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T1的构型。
706.如实施例688至704中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T2的构型。
707.如实施例688至704中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T3的构型。
708.如实施例688至704中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T4的构型。
709.如实施例688至704中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T5的构型。
710.如实施例688至704中任一项所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T6的构型。
711.如实施例685或实施例686所述的CD19结合分子，其是四价的。
712.如实施例711所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有在图2Q-2S中描绘的构型中的任何一种。
713.如实施例712所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2Q中所描述的构型。
714.如实施例712所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2R中所描述的构型。
715.如实施例712所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2S中所描述的构型。
716.如实施例711至715中任一项所述的CD19结合分子，其具有在表9中被称为Tv1至Tv24的构型中的任一种。
717.如实施例685或实施例686所述的CD19结合分子，其是五价的。
718.如实施例717所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2T中所描述的构型。
719.如实施例717或实施例718所述的CD19结合分子，其具有在表10中被称为Pv1至Pv100的构型中的任一种。
720.如实施例685或实施例686所述的CD19结合分子，其是六价的。
721.如实施例720所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有在图2U-2V中描绘的构型中的任何一种。
722.如实施例721所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2U中所描述的构型。
723.如实施例721所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2V中所描述的构型。
724.如实施例720至723中任一项所述的CD19结合分子，其具有在表11中被称为Hv1至Hv330的构型中的任一种。
725.如实施例685至724中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM1能够在与ABM3结合至其靶分子的相同时间结合CD19。
726.如实施例685至725中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3特异性结合至人CD2。
727.如实施例726所述的CD19结合分子，其中ABM3是基于非免疫球蛋白支架的ABM。
728.如实施例727所述的CD19结合分子，其中ABM3是Kunitz结构域、Adnexin、亲合体、DARPin、Avimer、Anticalin、脂质运载蛋白、Centyrin、Versabody、Knottin、Adnectin、Pronectin、Affitin/Nanofitin、Affilin、Atrimer/四连接素、二环肽、cys-knot、Fn3支架、Obody、Tn3、Affimer、BD、Adhiron、Duocalin、Alphabody、Armadillo重复蛋白质、Repebody、或Fynomer。
729.如实施例727所述的CD19结合分子，其中ABM3包含CD2配体的受体结合结构域。
730.如实施例726所述的CD19结合分子，其中ABM3是CD58部分。
731.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-1的氨基酸序列。
732.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-2的氨基酸序列。
733.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-3的氨基酸序列。
734.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-4的氨基酸序列。
735.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-5的氨基酸序列。
736.如实施例735所述的CD19结合分子，其中指定为B的氨基酸是苯基丙氨酸。
737.如实施例735所述的CD19结合分子，其中指定为B的氨基酸是丝氨酸。
738.如实施例735至737中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为J的氨基酸是缬氨酸。
739.如实施例735至737中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为J的氨基酸是赖氨酸。
740.如实施例735至739中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为O的氨基酸是缬氨酸。
741.如实施例735至739中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为O的氨基酸是谷氨酰胺。
742.如实施例735至741中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为U的氨基酸是缬氨酸。
743.如实施例735至741中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为U的氨基酸是赖氨酸。
744.如实施例735至743中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为X的氨基酸是苏氨酸。
745.如实施例735至743中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为X的氨基酸是丝氨酸。
746.如实施例735至745中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为Z的氨基酸是亮氨酸。
747.如实施例735至745中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为Z的氨基酸是甘氨酸。
748.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-6的氨基酸序列。
749.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-7的氨基酸序列。
750.如实施例749所述的CD19结合分子，其中指定为J的氨基酸是缬氨酸。
751.如实施例749所述的CD19结合分子，其中指定为J的氨基酸是赖氨酸。
752.如实施例749至751中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为O的氨基酸是缬氨酸。
753.如实施例749至751中任一项所述的CD19结合分子，其中指定为O的氨基酸是谷氨酰胺。
754.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-8的氨基酸序列。
755.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-9的氨基酸序列。
756.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-10的氨基酸序列。
757.如实施例730所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-11的氨基酸序列。
758.如实施例726所述的CD19结合分子，其中ABM3是CD48部分。
759.如实施例758所述的CD19结合分子，其中所述CD48部分与Uniprot标识符P09326的氨基酸序列的氨基酸27-220具有至少70％的序列同一性。
760.如实施例758所述的CD19结合分子，其中所述CD48部分与Uniprot标识符P09326的氨基酸序列的氨基酸27-220具有至少80％的序列同一性。
761.如实施例758所述的CD19结合分子，其中所述CD48部分与Uniprot标识符P09326的氨基酸序列的氨基酸27-220具有至少90％的序列同一性。
762.如实施例758所述的CD19结合分子，其中所述CD48部分与Uniprot标识符P09326的氨基酸序列的氨基酸27-220具有至少95％的序列同一性。
763.如实施例758所述的CD19结合分子，其中所述CD48部分与Uniprot标识符P09326的氨基酸序列的氨基酸27-220具有至少99％的序列同一性。
764.如实施例726所述的CD19结合分子，其中ABM3是基于免疫球蛋白支架的ABM。
765.如实施例764所述的CD19结合分子，其中ABM3是抗体、抗体片段、scFv、dsFv、Fv、Fab、scFab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、或骆驼科动物VHH结构域。
766.如实施例764所述的CD19结合分子，其中ABM3是抗CD2抗体或其抗原结合结构域。
767.如实施例765所述的CD19结合分子，其中ABM3是scFv。
768.如实施例765所述的CD19结合分子，其中ABM3是Fab。
769.如实施例768所述的CD19结合分子，其中ABM3是Fab异二聚体。
770.如实施例764至769中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含CD2-1的CDR序列。
771.如实施例770所述的CD19结合分子，其中ABM3包含CD2-1的重链和轻链可变序列。
772.如实施例770所述的CD19结合分子，其中ABM3包含hu1CD2-1的重链和轻链可变序列。
773.如实施例770所述的CD19结合分子，其中ABM3包含hu2CD2-1的重链和轻链可变序列。
774.如实施例770所述的CD19结合分子，其中ABM3包含Medi507的CDR序列。
775.如实施例774所述的CD19结合分子，其中ABM3包含Medi507的重链和轻链可变序列。
776.如实施例685至725中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3特异性结合至人TAA。
777.如实施例776所述的CD19结合分子，其中ABM3是基于非免疫球蛋白支架的ABM。
778.如实施例777所述的CD19结合分子，其中如果TAA是受体，则ABM3包含所述受体的配体的受体结合结构域，并且如果TAA是配体，则ABM3包含所述配体的受体的配体结合结构域。
779.如实施例777所述的CD19结合分子，其中ABM3是Kunitz结构域、Adnexin、亲合体、DARPin、Avimer、Anticalin、脂质运载蛋白、Centyrin、Versabody、Knottin、Adnectin、Pronectin、Affitin/Nanofitin、Affilin、Atrimer/四连接素、二环肽、cys-knot、Fn3支架、Obody、Tn3、Affimer、BD、Adhiron、Duocalin、Alphabody、Armadillo重复蛋白质、Repebody、或Fynomer。
780.如实施例776所述的CD19结合分子，其中ABM3是基于免疫球蛋白支架的ABM。
781.如实施例780所述的CD19结合分子，其中ABM3是抗体、抗体片段、scFv、dsFv、Fv、Fab、scFab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、或骆驼科动物VHH结构域。
782.如实施例781所述的CD19结合分子，其中ABM3是抗体或其抗原结合结构域。
783.如实施例781所述的CD19结合分子，其中ABM3是scFv。
784.如实施例781所述的CD19结合分子，其中ABM3是Fab。
785.如实施例784所述的CD19结合分子，其中ABM3是Fab异二聚体。
786.如实施例776至785中任一项所述的CD19结合分子，其中所述TAA是在作为B细胞来源浆细胞的癌性B细胞上表达的TAA。
787.如实施例776至786中任一项所述的CD19结合分子，其中所述TAA是在非浆细胞的癌性B细胞上表达的TAA。
788.如实施例776至787中任一项所述的CD19结合分子，其中所述TAA选自BCMA、CD20、CD22、CD123、CD33、CLL1、CD138、CS1、CD38、CD133、FLT3、CD52、TNFRSF13C、TNFRSF13B、CXCR4、PD-L1、LY9、CD200、FCGR2B、CD21、CD23、CD24、CD40L、CD72、CD79a、和CD79b。
789.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是BCMA。
790.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD20。
791.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD22。
792.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD123。
793.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD33。
794.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CLL1。
795.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD138。
796.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CS1。
797.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD38。
798.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD133。
799.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是FLT3。
800.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD52。
801.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是TNFRSF13C。
802.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是TNFRSF13B。
803.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CXCR4。
804.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是PD-L1。
805.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是LY9。
806.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD200。
807.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是FCGR2B。
808.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD21。
809.如实施例788所述的CD19结合分子，其中所述TAA是CD23。
810.如实施例788所述的CD19结合分子，其中ABM3包含在表16或表17中所列出的结合序列。
811.如实施例810所述的CD19结合分子，其具有如在表17A中所列出的BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和/或轻链可变区。
812.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-1的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
813.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-2的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
814.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-3的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
815.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-4的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
816.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-5的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
817.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-6的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
818.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-7的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
819.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-8的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
820.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-9的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
821.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-10的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
822.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-11的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
823.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-12的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
824.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-13的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
825.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-14的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
826.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-15的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
827.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-16的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
828.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-17的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
829.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-18的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
830.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-19的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
831.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-20的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
832.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-21的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
833.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-22的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
834.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-23的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
835.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-24的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
836.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-25的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
837.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-26的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
838.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-27的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
839.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-28的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
840.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-29的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
841.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-30的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
842.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-31的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
843.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-32的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
844.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-33的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
845.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-34的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
846.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-35的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
847.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-36的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
848.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-37的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
849.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-38的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
850.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-39的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
851.如实施例811所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-40的重链和轻链可变序列，如在表17A中所列出。
852.如实施例810所述的CD19结合分子，其具有如在表17B和17E中所列出的BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和/或轻链CDR序列(如由卡巴特定义)。
853.如实施例810所述的CD19结合分子，其具有如在表17C和17F中所列出的BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和/或轻链CDR序列(如由乔西亚定义)。
854.如实施例810所述的CD19结合分子，其具有如在表17D和17G中所列出的BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和/或轻链CDR序列(如由卡巴特和乔西亚序列的组合定义)。
855.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-1的CDR序列。
856.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-2的CDR序列。
857.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-3的CDR序列。
858.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-4的CDR序列。
859.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-5的CDR序列。
860.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-6的CDR序列。
861.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-7的CDR序列。
862.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-8的CDR序列。
863.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-9的CDR序列。
864.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-10的CDR序列。
865.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-11的CDR序列。
866.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-12的CDR序列。
867.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-13的CDR序列。
868.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-14的CDR序列。
869.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-15的CDR序列。
870.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-16的CDR序列。
871.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-17的CDR序列。
872.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-18的CDR序列。
873.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-19的CDR序列。
874.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-20的CDR序列。
875.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-21的CDR序列。
876.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-22的CDR序列。
877.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-23的CDR序列。
878.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-24的CDR序列。
879.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-25的CDR序列。
880.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-26的CDR序列。
881.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-27的CDR序列。
882.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-28的CDR序列。
883.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-29的CDR序列。
884.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-30的CDR序列。
885.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-31的CDR序列。
886.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-32的CDR序列。
887.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-33的CDR序列。
888.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-34的CDR序列。
889.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-35的CDR序列。
890.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-36的CDR序列。
891.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-37的CDR序列。
892.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-38的CDR序列。
893.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-39的CDR序列。
894.如实施例852至854中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含BCMA-40的CDR序列。
895.如实施例16至894中任一项所述的CD19结合分子，其包含一起形成Fc异二聚体的第一变体Fc区和第二变体Fc区。
896.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含氨基酸取代S364K/E357Q:L368D/K370S。
897.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含氨基酸取代L368D/K370S:S364K。
898.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含氨基酸取代L368E/K370S:S364K。
899.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含氨基酸取代T411T/E360E/Q362E:D401K。
900.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含氨基酸取代L368D 370S:S364/E357L。
901.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含氨基酸取代370S:S364K/E357Q。
902.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含在WO2014/110601的图4中列出的任何一种空间变体的氨基酸取代(转载于表4中)。
903.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含在WO2014/110601的图5中列出的任何一种变体的氨基酸取代(转载于表4中)。
904.如实施例895所述的CD19结合分子，其中所述第一和第二变体Fc区包含在WO2014/110601的图6中列出的任何一种变体的氨基酸取代(转载于表4中)。
905.如实施例895至904中任一项所述的CD19结合分子，其中至少一个Fc区包含消融变体修饰。
906.如实施例905所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰选自表3。
907.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含G236R。
908.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含S239G。
909.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含S239K。
910.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含S239Q。
911.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含S239R。
912.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含V266D。
913.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含S267K。
914.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含S267R。
915.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含H268K。
916.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含E269R。
917.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含299R。
918.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含299K。
919.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含K322A。
920.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含A327G。
921.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含A327L。
922.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含A327N。
923.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含A327Q。
924.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含L328E。
925.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含L328R。
926.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含P329A。
927.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含P329H。
928.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含P329K。
929.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含A330L。
930.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含A330S/P331S。
931.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含I332K。
932.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含I332R。
933.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含V266D/A327Q。
934.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含V266D/P329K。
935.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含G236R/L328R。
936.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含E233P/L234V/L235A/G236del/S239K。
937.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
938.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G。
939.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G。
940.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含E233P/L234V/L235A/G236del。
941.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含S239K/S267K。
942.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含267K/P329K。
943.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含D265A/N297A/P329A。
944.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含D265N/N297D/P329G。
945.如实施例906所述的CD19结合分子，其中所述消融变体修饰包含D265E/N297Q/P329S。
946.如实施例905至945中任一项所述的CD19结合分子，其中两个变体Fc区均包含所述消融变体修饰。
947.如实施例895至946中任一项所述的CD19结合分子，其中至少一个Fc区进一步包含pI变体取代。
948.如实施例947所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代选自表4。
949.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_ISO(-)中存在的取代。
950.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_(-)_等电_A中存在的取代。
951.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_(-)_等电_B中存在的取代。
952.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含Pl_ISO(+RR)中存在的取代。
953.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_ISO(+)中存在的取代。
954.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_(+)_等电_A中存在的取代。
955.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_(+)_等电_B中存在的取代。
956.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_(+)_等电_E269Q/E272Q中存在的取代。
957.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_(+)_等电_E269Q/E283Q中存在的取代。
958.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_(+)_等电_E2720/E283Q中存在的取代。
959.如实施例948所述的CD19结合分子，其中所述pI变体取代包含pl_(+)_等电_E269Q中存在的取代。
960.如实施例895至959中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含选自434A、434S、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、4361或V/434S、436V/428L、252Y、252Y/254T/256E、259I/308F/428L、236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、236R、328R、236R/328R、236N/267E、243L、298A和299T中的一个或多个氨基酸取代。
961.如实施例895至959中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代434A、434S或434V。
962.如实施例961所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代428L。
963.如实施例961至962中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代308F。
964.如实施例961至963中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代259I。
965.如实施例961至964中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代436I。
966.如实施例961至965中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代252Y。
967.如实施例961至966中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代254T。
968.如实施例961至967中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代256E。
969.如实施例961至968中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代239D或239E。
970.如实施例961至969中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代332E或332D。
971.如实施例961至970中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代267D或267E。
972.如实施例961至971中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代330L。
973.如实施例961至972中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代236R或236N。
974.如实施例961至973中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代328R。
975.如实施例961至974中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代243L。
976.如实施例961至975中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代298A。
977.如实施例961至976中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一和/或第二Fc区进一步包含氨基酸取代299T。
978.如实施例895所述的CD19结合分子，其中：
(a)所述第一和第二变体Fc区包含氨基酸取代S364K/E357Q:L368D/K370S；
(b)所述第一和/或第二变体Fc区包含所述消融变体修饰E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且
(c)所述第一和/或第二变体Fc区包含所述pI变体取代N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D(pl_(-)_等电_A)。
979.如实施例978所述的CD19结合分子，其中所述第一变体Fc区包含所述消融变体修饰E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
980.如实施例978至979中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第二变体Fc区包含所述消融变体修饰E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
981.如实施例978至980中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一变体Fc区包含所述pI变体取代N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D(pl_(-)_等电_A)。
982.如实施例978至981中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第二变体Fc区包含所述pI变体取代N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D(pl_(-)_等电_A)。
983.如实施例895至982中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含与SEQ ID NO:1106至少90％同一的氨基酸序列。
984.如实施例895至982中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含与SEQ ID NO:1106至少95％同一的氨基酸序列。
985.如实施例895至982中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含用实施例896至982中任一项所列举的取代修饰的SEQ ID NO:1106的氨基酸序列。
986.如实施例895至982中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332的1、2、3、4、5或6处具有取代的SEQ ID NO:1106的氨基酸序列，任选地其中所述取代中的一个或多个是如实施例896至982中任一项所列举的取代。
987.如实施例895至986中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含与SEQ ID NO:1107至少90％同一的氨基酸序列。
988.如实施例895至986中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含与SEQ ID NO:1107至少95％同一的氨基酸序列。
989.如实施例895至986中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含用实施例896至982中任一项所列举的取代修饰的SEQ ID NO:1107的氨基酸序列。
990.如实施例895至986中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332的1、2、3、4、5或6处具有取代的SEQ ID NO:1107的氨基酸序列，任选地其中所述取代中的一个或多个是如实施例896至982中任一项所列举的取代。
991.如实施例895至986中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含与SEQ ID NO:1108至少90％同一的氨基酸序列。
992.如实施例895至986中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含与SEQ ID NO:1108至少95％同一的氨基酸序列。
993.如实施例895至986中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含用实施例896至982中任一项所列举的取代修饰的SEQ ID NO:1108的氨基酸序列。
994.如实施例895至986中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332的1、2、3、4、5或6处具有取代的SEQ ID NO:1108的氨基酸序列，任选地其中所述取代中的一个或多个是如实施例896至982中任一项所列举的取代。
995.如实施例895至994中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含与SEQ ID NO:1109至少90％同一的氨基酸序列。
996.如实施例895至994中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含与SEQ ID NO:1109至少95％同一的氨基酸序列。
997.如实施例895至994中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含用实施例896至982中任一项所列举的取代修饰的SEQ ID NO:1109的氨基酸序列。
998.如实施例895至994中任一项所述的CD19结合分子，其中所述第一或第二变体Fc区包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332的1、2、3、4、5或6处具有取代的SEQ ID NO:1109的氨基酸序列，任选地其中所述取代中的一个或多个是如实施例896至982中任一项所列举的取代。
999.如实施例16至894中任一项所述的CD19结合分子，其包含Fc结构域。
1000.如实施例999所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域是Fc异二聚体。
1001.如实施例1000所述的CD19结合分子，其中所述Fc异二聚体包含在表4中列出的任何Fc修饰。
1002.如实施例1000所述的CD19结合分子，其中所述Fc异二聚体包含杵臼结构(“KIH”)修饰。
1003.如实施例1000至1002中任一项所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 1到Fc 150的Fc修饰中的至少一种。
1004.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 1到Fc 5的Fc修饰中的至少一种。
1005.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 6到Fc 10的Fc修饰中的至少一种。
1006.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 11到Fc 15的Fc修饰中的至少一种。
1007.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 16到Fc 20的Fc修饰中的至少一种。
1008.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 21到Fc 25的Fc修饰中的至少一种。
1009.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 26到Fc 30的Fc修饰中的至少一种。
1010.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 31到Fc 35的Fc修饰中的至少一种。
1011.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 36到Fc 40的Fc修饰中的至少一种。
1012.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 41到Fc 45的Fc修饰中的至少一种。
1013.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 46到Fc 50的Fc修饰中的至少一种。
1014.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 51到Fc 55的Fc修饰中的至少一种。
1015.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 56到Fc 60的Fc修饰中的至少一种。
1016.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 61到Fc 65的Fc修饰中的至少一种。
1017.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 66到Fc 70的Fc修饰中的至少一种。
1018.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 71到Fc 75的Fc修饰中的至少一种。
1019.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 76到Fc 80的Fc修饰中的至少一种。
1020.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 81到Fc 85的Fc修饰中的至少一种。
1021.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 86到Fc 90的Fc修饰中的至少一种。
1022.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 91到Fc 95的Fc修饰中的至少一种。
1023.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 96到Fc 100的Fc修饰中的至少一种。
1024.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 101到Fc 105的Fc修饰中的至少一种。
1025.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 106到Fc 110的Fc修饰中的至少一种。
1026.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 111到Fc 115的Fc修饰中的至少一种。
1027.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 116到Fc 120的Fc修饰中的至少一种。
1028.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 121到Fc 125的Fc修饰中的至少一种。
1029.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 126到Fc 130的Fc修饰中的至少一种。
1030.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 131到Fc 135的Fc修饰中的至少一种。
1031.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 136到Fc 140的Fc修饰中的至少一种。
1032.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 141到Fc 145的Fc修饰中的至少一种。
1033.如实施例1003所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 146到Fc 150的Fc修饰中的至少一种。
1034.如实施例999至1033中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域具有改变的效应子功能。
1035.如实施例1034所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域具有与一种或多种Fc受体的改变的结合。
1036.如实施例1035所述的CD19结合分子，其中所述一种或多种Fc受体包含FcRN。
1037.如实施例1035或实施例1036所述的CD19结合分子，其中所述一种或多种Fc受体包含白细胞受体。
1038.如实施例999至1037中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc具有经修饰的二硫键架构。
1039.如实施例999至1038中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc具有改变的糖基化模式。
1040.如实施例999至1039中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc包含铰链区。
1041.如实施例1040所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含在7.4.2节中所述的铰链区中的任一个。
1042.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H1的铰链区的氨基酸序列。
1043.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H2的铰链区的氨基酸序列。
1044.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H3的铰链区的氨基酸序列。
1045.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H4的铰链区的氨基酸序列。
1046.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H5的铰链区的氨基酸序列。
1047.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H6的铰链区的氨基酸序列。
1048.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H7的铰链区的氨基酸序列。
1049.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H8的铰链区的氨基酸序列。
1050.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H9的铰链区的氨基酸序列。
1051.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H10的铰链区的氨基酸序列。
1052.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H11的铰链区的氨基酸序列。
1053.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H12的铰链区的氨基酸序列。
1054.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H13的铰链区的氨基酸序列。
1055.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H14的铰链区的氨基酸序列。
1056.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H15的铰链区的氨基酸序列。
1057.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H16的铰链区的氨基酸序列。
1058.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H17的铰链区的氨基酸序列。
1059.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H18的铰链区的氨基酸序列。
1060.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H19的铰链区的氨基酸序列。
1061.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H20的铰链区的氨基酸序列。
1062.如实施例1041所述的CD19结合分子，其中所述铰链区包含指定为H21的铰链区的氨基酸序列。
1063.如实施例16至1062中任一项所述的CD19结合分子，其包含至少一个scFv结构域。
1064.如实施例1063所述的CD19结合分子，其中至少一个scFv包含连接所述VH和VL结构域的接头。
1065.如实施例1064所述的CD19结合分子，其中所述接头的长度为5至25个氨基酸。
1066.如实施例1065所述的CD19结合分子，其中所述接头的长度为12至20个氨基酸。
1067.如实施例1064至1066中任一项所述的CD19结合分子，其中所述接头是带电荷的接头和/或柔性接头。
1068.如实施例1064至1067中任一项所述的CD19结合分子，其中所述接头选自接头L1到L54中的任一个。
1069.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L1的接头的氨基酸序列。
1070.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L2的接头的氨基酸序列。
1071.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L3的接头的氨基酸序列。
1072.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L4的接头的氨基酸序列。
1073.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L5的接头的氨基酸序列。
1074.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L6的接头的氨基酸序列。
1075.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L7的接头的氨基酸序列。
1076.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L8的接头的氨基酸序列。
1077.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L9的接头的氨基酸序列。
1078.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L10的接头的氨基酸序列。
1079.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L11的接头的氨基酸序列。
1080.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L12的接头的氨基酸序列。
1081.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L13的接头的氨基酸序列。
1082.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L14的接头的氨基酸序列。
1083.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L15的接头的氨基酸序列。
1084.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L16的接头的氨基酸序列。
1085.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L17的接头的氨基酸序列。
1086.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L18的接头的氨基酸序列。
1087.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L19的接头的氨基酸序列。
1088.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L20的接头的氨基酸序列。
1089.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L21的接头的氨基酸序列。
1090.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L22的接头的氨基酸序列。
1091.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L23的接头的氨基酸序列。
1092.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L24的接头的氨基酸序列。
1093.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L25的接头的氨基酸序列。
1094.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L26的接头的氨基酸序列。
1095.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L27的接头的氨基酸序列。
1096.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L28的接头的氨基酸序列。
1097.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L29的接头的氨基酸序列。
1098.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L30的接头的氨基酸序列。
1099.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L31的接头的氨基酸序列。
1100.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L32的接头的氨基酸序列。
1101.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L33的接头的氨基酸序列。
1102.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L34的接头的氨基酸序列。
1103.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L35的接头的氨基酸序列。
1104.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L36的接头的氨基酸序列。
1105.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L37的接头的氨基酸序列。
1106.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L38的接头的氨基酸序列。
1107.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L39的接头的氨基酸序列。
1108.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L40的接头的氨基酸序列。
1109.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L41的接头的氨基酸序列。
1110.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L42的接头的氨基酸序列。
1111.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L43的接头的氨基酸序列。
1112.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L44的接头的氨基酸序列。
1113.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L45的接头的氨基酸序列。
1114.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L46的接头的氨基酸序列。
1115.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L47的接头的氨基酸序列。
1116.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L48的接头的氨基酸序列。
1117.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L49的接头的氨基酸序列。
1118.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L50的接头的氨基酸序列。
1119.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L51的接头的氨基酸序列。
1120.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L52的接头的氨基酸序列。
1121.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L53的接头的氨基酸序列。
1122.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L54的接头的氨基酸序列。
1123.如实施例16至1122中任一项所述的CD19结合分子，其包含至少一个Fab结构域。
1124.如实施例1123所述的CD19结合分子，其中至少一个Fab结构域包含在表2中列出的Fab异源二聚化修饰中的任一种。
1125.如实施例1124所述的CD19结合分子，其中至少一个Fab结构域包含指定为F1的Fab异源二聚化修饰。
1126.如实施例1124所述的CD19结合分子，其中至少一个Fab结构域包含指定为F2的Fab异源二聚化修饰。
1127.如实施例1124所述的CD19结合分子，其中至少一个Fab结构域包含指定为F3的Fab异源二聚化修饰。
1128.如实施例1124所述的CD19结合分子，其中至少一个Fab结构域包含指定为F4的Fab异源二聚化修饰。
1129.如实施例1124所述的CD19结合分子，其中至少一个Fab结构域包含指定为F5的Fab异源二聚化修饰。
1130.如实施例1124所述的CD19结合分子，其中至少一个Fab结构域包含指定为F6的Fab异源二聚化修饰。
1131.如实施例1124所述的CD19结合分子，其中至少一个Fab结构域包含指定为F7的Fab异源二聚化修饰。
1132.如实施例16至1131中任一项所述的CD19结合分子，其包含至少两个ABM：ABM和ABM链，或经由接头相互连接的两条ABM链。
1133.如实施例1132所述的CD19结合分子，其中所述接头的长度为5至25个氨基酸。
1134.如实施例1133所述的CD19结合分子，其中所述接头的长度为12至20个氨基酸。
1135.如实施例1132至1134中任一项所述的CD19结合分子，其中所述接头是带电荷的接头和/或柔性接头。
1136.如实施例1132至1135中任一项所述的CD19结合分子，其中所述接头选自接头L1到L54中的任一个。
1137.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L1的接头的氨基酸序列。
1138.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L2的接头的氨基酸序列。
1139.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L3的接头的氨基酸序列。
1140.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L4的接头的氨基酸序列。
1141.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L5的接头的氨基酸序列。
1142.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L6的接头的氨基酸序列。
1143.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L7的接头的氨基酸序列。
1144.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L8的接头的氨基酸序列。
1145.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L9的接头的氨基酸序列。
1146.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L10的接头的氨基酸序列。
1147.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L11的接头的氨基酸序列。
1148.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L12的接头的氨基酸序列。
1149.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L13的接头的氨基酸序列。
1150.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L14的接头的氨基酸序列。
1151.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L15的接头的氨基酸序列。
1152.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L16的接头的氨基酸序列。
1153.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L17的接头的氨基酸序列。
1154.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L18的接头的氨基酸序列。
1155.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L19的接头的氨基酸序列。
1156.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L20的接头的氨基酸序列。
1157.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L21的接头的氨基酸序列。
1158.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L22的接头的氨基酸序列。
1159.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L23的接头的氨基酸序列。
1160.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L24的接头的氨基酸序列。
1161.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L25的接头的氨基酸序列。
1162.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L26的接头的氨基酸序列。
1163.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L27的接头的氨基酸序列。
1164.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L28的接头的氨基酸序列。
1165.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L29的接头的氨基酸序列。
1166.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L30的接头的氨基酸序列。
1167.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L31的接头的氨基酸序列。
1168.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L32的接头的氨基酸序列。
1169.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L33的接头的氨基酸序列。
1170.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L34的接头的氨基酸序列。
1171.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L35的接头的氨基酸序列。
1172.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L36的接头的氨基酸序列。
1173.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L37的接头的氨基酸序列。
1174.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L38的接头的氨基酸序列。
1175.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L39的接头的氨基酸序列。
1176.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L40的接头的氨基酸序列。
1177.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L41的接头的氨基酸序列。
1178.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L42的接头的氨基酸序列。
1179.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L43的接头的氨基酸序列。
1180.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L44的接头的氨基酸序列。
1181.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L45的接头的氨基酸序列。
1182.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L46的接头的氨基酸序列。
1183.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L47的接头的氨基酸序列。
1184.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L48的接头的氨基酸序列。
1185.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L49的接头的氨基酸序列。
1186.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L50的接头的氨基酸序列。
1187.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L51的接头的氨基酸序列。
1188.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L52的接头的氨基酸序列。
1189.如实施例1068所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L53的接头的氨基酸序列。
1190.如实施例1136所述的CD19结合分子，其中所述接头区包含指定为L54的接头的氨基酸序列。
1191.一种缀合物，其包含(a)如实施例1至1190中任一项所述的CD19结合分子，以及(b)药剂。
1192.如实施例1191所述的缀合物，其中所述药剂是治疗剂、诊断剂、掩蔽部分、可裂解部分、稳定剂、或其任何组合。
1193.如实施例1191所述的缀合物，其中所述药剂是在7.11节中所述的任何药剂。
1194.如实施例1191所述的缀合物，其中所述药剂是在7.12节中所述的任何药剂。
1195.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至放射性核素。
1196.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至烷基化剂。
1197.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂任选地是拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂。
1198.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至DNA损伤剂。
1199.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至DNA嵌入剂，任选地是凹槽结合剂，如小凹槽结合剂。
1200.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至RNA/DNA抗代谢物。
1201.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至激酶抑制剂。
1202.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至蛋白质合成抑制剂。
1203.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
1204.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至线粒体抑制剂，所述线粒体抑制剂任选地是线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂。
1205.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至抗有丝分裂剂。
1206.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至美登木素生物碱。
1207.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至驱动蛋白抑制剂。
1208.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至驱动蛋白样蛋白质KIF11抑制剂。
1209.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至V-ATP酶(液泡型H+-ATP酶)抑制剂。
1210.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至促凋亡剂。
1211.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至Bcl2(B细胞淋巴瘤2)抑制剂。
1212.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至MCL1(骨髓细胞白血病1)抑制剂。
1213.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至HSP90(热休克蛋白90)抑制剂。
1214.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至IAP(细胞凋亡抑制剂)抑制剂。
1215.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至mTOR(雷帕霉素的机制靶标)抑制剂。
1216.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至微管稳定剂。
1217.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至微管去稳定剂。
1218.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至奥瑞斯他汀。
1219.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至多拉司他汀。
1220.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)。
1221.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至CRM1(染色体维持蛋白1)抑制剂。
1222.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至DPPIV(二肽基肽酶IV)抑制剂。
1223.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至蛋白酶体抑制剂。
1224.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至蛋白质合成抑制剂。
1225.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至CDK2(细胞周期蛋白依赖性激酶2)抑制剂。
1226.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至CDK9(细胞周期蛋白依赖性激酶9)抑制剂。
1227.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至RNA聚合酶抑制剂。
1228.如实施例1191至1194中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至DHFR(二氢叶酸还原酶)抑制剂。
1229.如实施例1191至1228中任一项所述的缀合物，其中将所述药剂用接头附接至所述TBM，所述接头任选地是可切割的接头或不可切割的接头，例如在7.12.2节中所述的接头。
1230.如实施例1191至1229中任一项所述的缀合物，其包含抗CD19结合分子。
1231.一种药物组合物，其包含(a)如实施例1至1190中任一项所述的CD19结合分子或如实施例1191至1230中任一项所述的缀合物，和(b)赋形剂。
1232.一种治疗患有CD19相关疾病或障碍的受试者的方法，其包括向所述受试者给予有效量的如实施例1至1190中任一项所述的CD19结合分子、如实施例1191至1230中任一项所述的缀合物、或如实施例1231所述的药物组合物。
1233.如实施例1232所述的方法，其中所述CD19相关疾病或障碍是癌症。
1234.如实施例1232所述的方法，其中所述疾病或障碍是浆细胞肿瘤。
1235.如实施例1232所述的方法，其中所述疾病或障碍是表达细胞表面CD19的B细胞恶性肿瘤。
1236.如实施例1232所述的方法，其中所述疾病或障碍是非霍奇金淋巴瘤。
1237.如实施例1232所述的方法，其中所述疾病或障碍是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
1238.如实施例1232所述的方法，其中所述疾病或障碍是伯基特淋巴瘤。
1239.如实施例1232所述的方法，其中所述CD19相关疾病或障碍是自身免疫或炎性障碍。
1240.如实施例1232至1239中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者给予至少一种其他药剂。
1241.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码如实施例1至1190中任一项所述的CD19结合分子。
1242.如实施例1241所述的一种或多种核酸，所述一种或多种核酸是DNA。
1243.如实施例1242所述的一种或多种核酸，所述一种或多种核酸呈一种或多种载体的形式，任选地为表达载体。
1244.如实施例1241所述的一种或多种核酸，所述一种或多种核酸是mRNA。
1245.一种细胞，所述细胞被工程化以表达如实施例1至1190中任一项所述的CD19结合分子。
1246.一种细胞，所述细胞在一种或多种启动子的控制下经一种或多种表达载体转染，所述表达载体包含一种或多种编码如实施例1至1190中任一项所述的CD19结合分子的核酸序列。
1247.如实施例1245或实施例1246所述的细胞，其中所述CD19结合分子的表达处于诱导型启动子的控制之下。
1248.如实施例1245至1247中任一项所述的细胞，其中所述CD19结合分子以可分泌的形式产生。
1249.一种产生CD19结合分子的方法，其包括：
(a)在所述CD19结合分子表达的条件下将如实施例1245至1248中任一项所述的细胞进行培养；以及
(b)从细胞培养物中回收所述CD19结合分子。
10.通过引用并入
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献出于所有目的通过引用以其全文并入本文中，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文献出于所有目的被单独指出以通过引用并入。在本文并入的一个或多个参考文献和本披露的教导之间存在任何不一致的情况下，预期的是本说明书的教导。
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Claims (203)

1.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、和SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
2.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、和SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
3.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
4.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
5.如权利要求1至4中任一项所述的CD19结合分子，其包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH。
6.如权利要求1至5中任一项所述的CD19结合分子，其包含具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL。
7.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、和SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、和SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
8.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、和SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
9.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、和SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、和SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
10.一种CD19结合分子，其特异性结合至人CD19并且包含具有SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、和SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
11.如权利要求7至10中任一项所述的CD19结合分子，其包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH。
12.如权利要求7至11中任一项所述的CD19结合分子，其包含具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL。
13.如权利要求1至12中任一项所述的CD19结合分子，其是包含以下的多特异性结合分子(MBM)：
(a)特异性结合至CD19的抗原结合模块1(ABM1)；以及
(b)特异性结合至不同靶分子的抗原结合模块2(ABM2)，任选地其中所述靶分子是人T细胞受体(TCR)复合物的组分。
14.如权利要求13所述的CD19结合分子，其中ABM2特异性结合至人T细胞受体(TCR)复合物的组分。
15.如权利要求13所述的CD19结合分子，其是双特异性结合分子(BBM)。
16.如权利要求15所述的CD19结合分子，其中ABM2特异性结合至人T细胞受体(TCR)复合物的组分。
17.如权利要求15或权利要求16所述的CD19结合分子，其是二价的。
18.如权利要求15或权利要求16所述的CD19结合分子，其是三价的。
19.如权利要求18所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T1的构型。
20.如权利要求18所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T2的构型。
21.如权利要求18所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T3的构型。
22.如权利要求18所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T4的构型。
23.如权利要求18所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T5的构型。
24.如权利要求18所述的CD19结合分子，其具有在7.5.2节中被称为T6的构型。
25.如权利要求15或权利要求16所述的CD19结合分子，其是四价的。
26.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv1的构型。
27.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv2的构型。
28.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv3的构型。
29.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv4的构型。
30.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv5的构型。
31.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv6的构型。
32.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv7的构型。
33.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv8的构型。
34.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv9的构型。
35.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv10的构型。
36.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv11的构型。
37.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv12的构型。
38.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv13的构型。
39.如权利要求25所述的CD19结合分子，其具有在7.5.3节中被称为Tv14的构型。
40.如权利要求13所述的CD19结合分子，其是包含以下的三特异性结合分子(TBM)：特异性结合至除了CD19之外的靶分子的抗原结合模块3(ABM3)。
41.如权利要求40所述的CD19结合分子，其中ABM2特异性结合至人T细胞受体(TCR)复合物的组分，并且ABM3特异性结合至(i)人CD2或(ii)肿瘤相关抗原(TAA)。
42.如权利要求40或权利要求41所述的CD19结合分子，其是三价的。
43.如权利要求42所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T1的构型。
44.如权利要求42所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T2的构型。
45.如权利要求42所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T3的构型。
46.如权利要求42所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T4的构型。
47.如权利要求42所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T5的构型。
48.如权利要求42所述的CD19结合分子，其具有在7.6.1节中被称为T6的构型。
49.如权利要求40或权利要求41所述的CD19结合分子，其是四价的。
50.如权利要求49所述的CD19结合分子，其具有在表9中被称为Tv1至Tv24的构型中的任一种。
51.如权利要求40或权利要求41所述的CD19结合分子，其是五价的。
52.如权利要求51所述的CD19结合分子，其具有在表10中被称为Pv1至Pv100的构型中的任一种。
53.如权利要求40或权利要求41所述的CD19结合分子，其是六价的。
54.如权利要求53所述的CD19结合分子，其具有在表11中被称为Hv1至Hv330的构型中的任一种。
55.如权利要求13至54中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM1能够在与ABM2结合至其靶分子的相同时间结合CD19。
56.如权利要求55所述的CD19结合分子，其中如果存在ABM3，ABM1能够在与ABM3结合至其靶分子的相同时间结合CD19。
57.如权利要求13至56中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM1是抗体、抗体片段、scFv、dsFv、Fv、Fab、scFab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、或骆驼科动物VHH结构域。
58.如权利要求57所述的CD19结合分子，其中ABM1是scFv。
59.如权利要求57所述的CD19结合分子，其中ABM1是Fab。
60.如权利要求57所述的CD19结合分子，其中所述Fab是Fab异二聚体。
61.如权利要求57所述的CD19结合分子，其中ABM1是抗CD19抗体或其抗原结合结构域。
62.如权利要求13至61中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM2是抗体、抗体片段、scFv、dsFv、Fv、Fab、scFab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、或骆驼科动物VHH结构域。
63.如权利要求62所述的CD19结合分子，其中ABM2是scFv。
64.如权利要求62所述的CD19结合分子，其中ABM2是Fab。
65.如权利要求13至64中任一项所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是CD3。
66.如权利要求65所述的CD19结合分子，其中ABM2是抗CD3抗体或其抗原结合结构域。
67.如权利要求66所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-1至CD3-130中任一项所述的CDR序列。
68.如权利要求13至64中任一项所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是TCR-α、TCR-β、或TCR-α/β二聚体。
69.如权利要求68所述的CD19结合分子，其中ABM2是抗体或其抗原结合结构域。
70.如权利要求68所述的CD19结合分子，其中ABM2是Fab。
71.如权利要求40至54和权利要求40至54的从属范围内的权利要求55至71中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3特异性结合至人CD2。
72.如权利要求71所述的CD19结合分子，其中ABM3是CD58部分。
73.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-1的氨基酸序列。
74.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-2的氨基酸序列。
75.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-3的氨基酸序列。
76.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-4的氨基酸序列。
77.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-5的氨基酸序列。
78.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-6的氨基酸序列。
79.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-7的氨基酸序列。
80.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-8的氨基酸序列。
81.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-9的氨基酸序列。
82.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-10的氨基酸序列。
83.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-11的氨基酸序列。
84.如权利要求72所述的CD19结合分子，其中所述CD58部分包含如在表15中所列出的CD58-12的氨基酸序列。
85.如权利要求71所述的CD19结合分子，其中ABM3是抗CD2抗体或其抗原结合结构域。
86.如权利要求40至54和权利要求40至54的从属范围内的权利要求55至71中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3特异性结合至人TAA。
87.如权利要求86所述的CD19结合分子，其中所述TAA是在作为B细胞来源浆细胞的癌性B细胞上表达的TAA。
88.如权利要求86或权利要求87所述的CD19结合分子，其中所述TAA是在非浆细胞的癌性B细胞上表达的TAA。
89.如权利要求86至88中任一项所述的CD19结合分子，其中所述TAA选自BCMA、CD20、CD22、CD123、CD33、CLL1、CD138、CS1、CD38、CD133、FLT3、CD52、TNFRSF13C、TNFRSF13B、CXCR4、PD-L1、LY9、CD200、FCGR2B、CD21、CD23、CD24、CD40L、CD72、CD79a、和CD79b。
90.如权利要求89所述的CD19结合分子，其中ABM3包含在表16或表17中所列出的结合序列。
91.如权利要求90所述的CD19结合分子，其具有如在表17A中所列出的BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和/或轻链可变区。
92.如权利要求90所述的CD19结合分子，其具有如在表17B和17E中所列出的BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和/或轻链CDR序列(如由卡巴特定义)。
93.如权利要求90所述的CD19结合分子，其具有如在表17C和17F中所列出的BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和/或轻链CDR序列(如由乔西亚定义)。
94.如权利要求90所述的CD19结合分子，其具有如在表17D和17G中所列出的BCMA-1至BCMA-40中任一个的重链和/或轻链CDR序列(如由卡巴特和乔西亚序列的组合定义)。
95.一种缀合物，其包含(a)如权利要求1至93中任一项所述的CD19结合分子，以及(b)药剂。
96.如权利要求95所述的缀合物，其中所述药剂是治疗剂、诊断剂、掩蔽部分、可裂解部分、稳定剂、或其任何组合。
97.如权利要求96所述的缀合物，其中所述药剂是在7.11节中所述的任何药剂。
98.如权利要求96所述的缀合物，其中所述药剂是在7.12节中所述的任何药剂。
99.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至放射性核素。
100.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至烷基化剂。
101.如权利要求95中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂任选地是拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂。
102.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至DNA损伤剂。
103.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至DNA嵌入剂，任选地是凹槽结合剂，如小凹槽结合剂。
104.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至RNA/DNA抗代谢物。
105.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至激酶抑制剂。
106.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至蛋白质合成抑制剂。
107.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
108.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至线粒体抑制剂，所述线粒体抑制剂任选地是线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂。
109.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至抗有丝分裂剂。
110.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至美登木素生物碱。
111.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至驱动蛋白抑制剂。
112.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至驱动蛋白样蛋白质KIF11抑制剂。
113.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至V-ATP酶(液泡型H+-ATP酶)抑制剂。
114.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至促凋亡剂。
115.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至Bcl2(B细胞淋巴瘤2)抑制剂。
116.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至MCL1(骨髓细胞白血病1)抑制剂。
117.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至HSP90(热休克蛋白90)抑制剂。
118.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至IAP(细胞凋亡抑制剂)抑制剂。
119.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至mTOR(雷帕霉素的机制靶标)抑制剂。
120.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至微管稳定剂。
121.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至微管去稳定剂。
122.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至奥瑞斯他汀。
123.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至多拉司他汀。
124.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)。
125.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至CRM1(染色体维持蛋白1)抑制剂。
126.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至DPPIV(二肽基肽酶IV)抑制剂。
127.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至蛋白酶体抑制剂。
128.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至蛋白质合成抑制剂。
129.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至CDK2(细胞周期蛋白依赖性激酶2)抑制剂。
130.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至CDK9(细胞周期蛋白依赖性激酶9)抑制剂。
131.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至RNA聚合酶抑制剂。
132.如权利要求95至98中任一项所述的缀合物，其中所述CD19结合分子缀合至DHFR(二氢叶酸还原酶)抑制剂。
133.如权利要求95至132中任一项所述的缀合物，其中用接头将所述药剂附接至TBM，所述接头任选地是可裂解的接头或不可裂解的接头。
134.如权利要求95至133中任一项所述的缀合物，其包含抗CD19结合分子。
135.一种药物组合物，其包含(a)如权利要求1至94中任一项所述的CD19结合分子或如权利要求95至134中任一项所述的缀合物，和(b)赋形剂。
136.一种治疗患有CD19相关疾病或障碍的受试者的方法，其包括向所述受试者给予有效量的如权利要求1至94中任一项所述的CD19结合分子、如权利要求95至134中任一项所述的缀合物、或如权利要求135所述的药物组合物。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述CD19相关疾病或障碍是癌症。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述疾病或障碍是浆细胞肿瘤。
139.如权利要求137所述的方法，其中所述疾病或障碍是表达细胞表面CD19的B细胞恶性肿瘤。
140.如权利要求136所述的方法，其中所述CD19相关疾病或障碍是自身免疫或炎性障碍。
141.如权利要求136至140中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者给予至少一种另外的药剂。
142.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码如权利要求1至94中任一项所述的CD19结合分子。
143.如权利要求142所述的一种或多种核酸，所述一种或多种核酸是DNA。
144.如权利要求143所述的一种或多种核酸，所述一种或多种核酸呈一种或多种载体的形式，任选地为表达载体。
145.如权利要求142所述的一种或多种核酸，所述一种或多种核酸是mRNA。
146.一种细胞，所述细胞被工程化以表达如权利要求1至94中任一项所述的CD19结合分子。
147.一种细胞，所述细胞在一种或多种启动子的控制下经一种或多种表达载体转染，所述表达载体包含一种或多种编码如权利要求1至94中任一项所述的CD19结合分子的核酸序列。
148.如权利要求146或权利要求147所述的细胞，其中所述CD19结合分子的表达受诱导型启动子的控制。
149.如权利要求146至148中任一项所述的细胞，其中所述CD19结合分子以可分泌形式产生。
150.一种产生CD19结合分子的方法，其包括：
(a)在所述CD19结合分子表达的条件下将如权利要求146至149中任一项所述的细胞进行培养；以及
(b)从细胞培养物中回收所述CD19结合分子。
151.一种CD19结合分子，其是包含以下的三特异性结合分子(TBM)：
(a)特异性结合至CD19并且包含具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ IDNO:19的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3的抗原结合模块1(ABM1)；
(b)特异性结合至人T细胞受体(TCR)复合物的组分的抗原结合模块2(ABM2)；以及
(c)特异性结合至人CD2的抗原结合模块3(ABM3)。
152.如权利要求151所述的CD19结合分子，其是三价的。
153.如权利要求151或权利要求152所述的CD19结合分子，其中ABM1是Fab。
154.如权利要求151至153中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fab包含具有SEQID NO:13的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL。
155.如权利要求151至154中任一项所述的CD19结合分子，其中所述TCR复合物的组分是CD3。
156.如权利要求155所述的CD19结合分子，其中ABM2是抗CD3抗体或其抗原结合结构域。
157.如权利要求156所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-21的CDR序列。
158.如权利要求156或权利要求157所述的CD19结合分子，其中ABM2包含CD3-21的重链和轻链可变序列，如在表12A中所列出。
159.如权利要求156至158中任一项所述的CD19结合分子，其中所述抗CD3抗体或其抗原结合结构域呈scFv的形式。
160.如权利要求159所述的CD19结合分子，其中ABM2包含在表12A中指定为CD3-21的scFv的氨基酸序列。
161.如权利要求151至160中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3是CD58部分。
162.如权利要求151至161中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM3包含如在表15中所列出的CD58-6的氨基酸序列。
163.如权利要求57、61、67、78中任一项以及权利要求151至162中任一项所述的CD19结合分子，其包含Fc结构域。
164.如权利要求57、61、67、78中任一项以及权利要求151至162中任一项所述的CD19结合分子，其包含一起形成Fc异二聚体的第一变体Fc区和第二变体Fc区。
165.一种CD19结合分子，其是包含以下的三特异性结合分子(TBM)：
(a)抗原结合模块1(ABM1)，其特异性结合至CD19并且是包含以下的Fab：(i)具有SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；或(ii)具有SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、和SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
(b)抗原结合模块2(ABM2)，其特异性结合至CD3并且包含在表12A中指定为CD3-21的scFv的氨基酸序列；
(c)抗原结合模块3(ABM3)，其特异性结合至人CD2并且包含如在表15中所列出的CD58-6的氨基酸序列；以及
(d)Fc结构域。
166.一种CD19结合分子，其是包含以下的三特异性结合分子(TBM)：
(a)抗原结合模块1(ABM1)，其特异性结合至CD19并且是包含以下的Fab：(i)具有SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；或(ii)具有SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、和SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
(b)抗原结合模块2(ABM2)，其特异性结合至CD3并且包含在表12A中指定为CD3-129的scFv的氨基酸序列；
(c)抗原结合模块3(ABM3)，其特异性结合至人CD2并且包含如在表15中所列出的CD58-6的氨基酸序列；以及
(d)Fc结构域。
167.如权利要求165或权利要求166所述的CD19结合分子，其中ABM1包含具有SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，以及具有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
168.如权利要求165至167中任一项所述的CD19结合分子，其中ABM1包含具有SEQ IDNO:13的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL。
169.如151至168中任一项所述的CD19结合分子，其中所述CD19结合分子具有图2I中所描述并且在7.6.1节中被称为T2的构型。
170.如权利要求151至163和165至169中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域是Fc异二聚体。
171.如权利要求164或权利要求170所述的CD19结合分子，其中所述Fc异二聚体包含杵臼结构(“KIH”)修饰。
172.如权利要求164、权利要求170或权利要求171所述的CD19结合分子，其包含指定为Fc 121至Fc 125的Fc修饰中的至少一种。
173.如权利要求163至172中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域具有改变的效应子功能。
174.如权利要求173所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域具有与一种或多种Fc受体的改变的结合。
175.如权利要求163至174中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域是包含D265A突变的沉默的IgG1。
176.如权利要求163至174中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域是包含D265A和P329A突变的沉默的IgG1。
177.如权利要求154至164或168至176中任一项所述的CD19结合分子，其中：
所述抗原结合模块1(ABM1)特异性结合至CD19，所述VH融合至恒定的人IgG1结构域CH1并且所述VL融合至恒定的人κ序列。
178.如权利要求163至177中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域是人IgG1Fc结构域，其包含：
(a)第一CH3结构域，其包含修饰T366W；以及
(b)第二CH3结构域，其与所述第一CH3结构域异二聚化并包含修饰T366S、L368A和Y407V。
179.如权利要求163至178中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域是人IgG1Fc结构域，其包含：
(a)第一CH3结构域，其包含修饰S354C以及
(b)第二CH3结构域，其包含修饰Y349C。
180.如权利要求163至179中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域包含在位置233、234、235、236、237、239、265、266、267、268、269、297、299、322、327、328、329、330、331和332(EU编号)的1、2、3、4、5或6个位置处具有突变的SEQ ID NO:1109的人IgG1序列。
181.如权利要求163至180中任一项所述的CD19结合分子，其中所述Fc结构域包含通过用丙氨酸残基取代位置265处的天冬氨酸残基、用丙氨酸残基取代位置297处的天冬酰胺残基，并且用丙氨酸残基取代位置329处的脯氨酸残基(D265A/N297A/P329A)修饰的人IgG1Fc结构域。
182.如权利要求154至164或168至181中任一项所述的CD19结合分子，其中a)所述VH融合至恒定的人IgG1 CH1结构域并且通过接头连接至b)特异性结合至CD3的抗原结合模块2(ABM2)，所述抗原结合模块2(ABM2)包含scFv。
183.如权利要求168至181中任一项所述的CD19结合分子，其中a)所述VH融合至恒定的人IgG1 CH1结构域并且通过接头连接至b)特异性结合至CD3的抗原结合模块2(ABM2)，所述抗原结合模块2(ABM2)包含scFv并且通过接头连接至d)Fc结构域。
184.如权利要求151至183中任一项所述的CD19结合分子，其中所述结合分子包含第一半抗体，所述第一半抗体包含a)特异性结合至CD19的抗原结合模块1(ABM1)，b)特异性结合至CD3并包含scFv的抗原结合模块2(ABM2)，和d)Fc区；和第二半抗体，所述第二半抗体包含特异性结合至人CD2并包含CD58 IgV结构域的抗原结合模块3(ABM3)和d)Fc区，其中所述第一半抗体中的Fc区和所述第二半抗体中的Fc区形成Fc异二聚体。
185.如权利要求184所述的CD19结合分子，其中所述结合分子包含第一半抗体，所述第一半抗体包含含有SEQ ID NO:758的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:759的氨基酸序列的轻链；以及第二半抗体，所述第二半抗体包含SEQ ID NO:760的氨基酸序列。
186.如权利要求184所述的CD19结合分子，其中所述结合分子包含第一半抗体，所述第一半抗体包含含有SEQ ID NO:1077的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:759的氨基酸序列的轻链；以及第二半抗体，所述第二半抗体包含SEQ ID NO:1078或SEQ ID NO:1086的氨基酸序列。
187.一种CD19结合分子，其包含：
(a)第一半抗体重链，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:758的氨基酸序列和Fc序列；
(b)第一半抗体轻链，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:759的氨基酸序列；
(c)第二半抗体，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:760的氨基酸序列和Fc序列。
188.一种CD19结合分子，其包含：
(a)第一多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:1077的氨基酸序列；
(b)第二多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:759的氨基酸序列；以及
(c)第三多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:1078或SEQ ID NO:1086的氨基酸序列。
189.一种CD19结合分子，其包含：
(a)第一多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:1079的氨基酸序列；
(b)第二多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:759的氨基酸序列；以及
(c)第三多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:1078或SEQ ID NO:1086的氨基酸序列。
190.一种CD19结合分子，其包含：
(a)第一多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:1077的氨基酸序列；
(b)第二多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:759的氨基酸序列；以及
(c)第三多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO:1086的氨基酸序列。
191.一种CD19结合分子，其包含表19-A1、19A-2、19-B、或19C，优选表19C中所示的构建体的序列。
192.一种组合，其包含如权利要求151至191中任一项所述的CD19结合分子和至少一种另外的治疗剂。
193.一种药物组合物，其包含(a)如权利要求151至191中任一项所述的CD19结合分子或如权利要求192所述的组合，以及(b)药学上可接受的赋形剂。
194.如权利要求151至191中任一项所述的CD19结合分子或如权利要求192所述的组合或如权利要求193所述的组合物，用作药物。
195.如权利要求151至191中任一项所述的CD19结合分子或如权利要求192所述的组合或如权利要求193所述的组合物，用于治疗CD19相关疾病或障碍。
196.如权利要求151至191中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求192所述的组合或如权利要求193所述的组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗CD19相关疾病或障碍。
197.一种治疗患有CD19相关疾病或障碍的受试者的方法，其包括向所述受试者给予有效量的如权利要求151至191中任一项所述的CD19结合分子或如权利要求192所述的组合或如权利要求193所述的组合物。
198.用于权利要求195、或用于权利要求196的CD19结合分子、组合或组合物，或如权利要求197所述的方法，其中所述CD19相关疾病或障碍是癌症。
199.用于权利要求195、或用于权利要求196的CD19结合分子、组合或组合物，或如权利要求197所述的方法，其中所述疾病或障碍是浆细胞肿瘤。
200.用于权利要求195、或用于权利要求196的CD19结合分子、组合或组合物，或如权利要求197所述的方法，其中所述疾病或障碍是表达细胞表面CD19的B细胞恶性肿瘤。
201.用于权利要求195、或用于权利要求196的CD19结合分子、组合或组合物，或如权利要求197所述的方法，其中所述CD19相关疾病或障碍是非霍奇金淋巴瘤。
202.用于权利要求195、或用于权利要求196的CD19结合分子、组合或组合物，或如权利要求197所述的方法，其中所述CD19相关疾病或障碍是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
203.用于权利要求195、或用于权利要求196的CD19结合分子、组合或组合物，或如权利要求197所述的方法，其中所述CD19相关疾病或障碍是伯基特淋巴瘤。
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