CN113866308A - 一种药物制剂中猪脑神经节苷脂含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物成分检测分析领域，尤其涉及一种药物制剂中猪脑神经节苷脂含量的检测方法，包括待测品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件与系统适用性、色谱峰测定，测定记录色谱图，并按外标法以对照品峰面积计算待测品中GM1A与GM1B的含量之和，为药物制剂中单唾液酸四己糖神经节苷脂的含量，能全面检测药物制剂的内在质量，以保证临床用药的安全性和有效性。
Description
技术领域
本发明属于药物成分检测分析领域，尤其涉及一种药物制剂中猪脑神经节苷脂含量的检测方法。
背景技术
脑血管认知功能障碍，是由脑梗死、脑出血或者慢性脑缺血等脑血管病以及高血压、高血脂、心脏病等对脑部血管存在一定潜在危险的疾病，导致的从轻度认知障碍到老年痴呆综合征，这给患者带来巨大的经济和精神上的负担。但近年来在临床实践中发现，神经节苷脂类物质广泛被用于血管性外伤性中枢神经系统损伤、脑梗死、急性脊髓损伤、放射后脑损伤、缺血再灌注等，有良好的治疗和保护效果。药理研究表明，神经节苷脂广泛分布于人的组织和体液中，尤其在神经系统含量最丰富，其间接参与调控神经递质受体、调节神经细胞增殖分化、促进轴突生长和突触发生，还可促进神经元再生、恢复神经交感支配、改善脑部神经信号通路的传导，对人体受损脑细胞修补和再生功能起到非常关键的作用。
目前对于复方脑肽节苷脂注射液质量标准中含量测定多以单唾液酸四己糖神经节苷脂和次黄嘌呤含量计算。其中，由于药物制剂中的猪脑神经神经节苷脂提取物主要成分以单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)为主。现有药物质量标准中仅针对单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)进行鉴别，但因该有效物质成分的在亲水的寡糖链上带有不同数目唾液酸残基，根据唾液酸残基的位置和数量不同，可以区分神经节苷脂的种类。目前，分离鉴别的神经节苷脂一共可达数百种之多。因此可见其成分的复杂性，仅依靠单一的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)为质量控制指标是不够的，难以保证和控制猪脑神经节苷脂提取物的批间一致性，以确保产品质量的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种药物制剂中猪脑神经节苷脂含量的检测方法，该方法可同时测定药物制剂中的GM1A和GM1B指标成分的含量，能全面检测药物制剂的内在质量，以保证临床用药的安全性和有效性。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：
一种含有猪脑神经节苷脂药物制剂的含量检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
⑴、待测品溶液的制备：将待测药物制剂配制成一定浓度的溶液，优选溶剂为水；
⑵、对照品溶液的制备：将GM1对照品配制成一定浓度的溶液，优选溶剂为水；
⑶、色谱条件与系统适用性：色谱柱以C18为填充剂，流动相：缓冲盐溶液A-乙腈B，流动相洗脱比例为：0～60min，25～40％A，60～75％B；检测流速：0.9～1.4mL·min-1，检测波长：205nm，检测柱温：35～45℃；
⑷、色谱峰测定：将上述步骤⑴待测品溶液、步骤⑵对照品溶液，依次注入液相色谱仪，测定记录色谱图，并按外标法以对照品峰面积计算待测品中GM1A与GM1B的含量之和，为本品GM1的含量。
优选的，步骤(3)所述色谱柱型号为：WatersSymmetry RP。
优选的，步骤(3)中所述缓冲盐溶液A是由0.005mol/L磷酸二氢钾溶液和0.01wt％三乙胺溶液配制而成。
优选的，步骤(3)中所述缓冲盐溶液A的pH值为5.8-6.2。
优选的，步骤(3)中所述流动相洗脱比例为：0min，33～37％A，63～67％B。
优选的，所述检测方法若为指纹图谱检测方法，步骤(3)中所述流动相洗脱比例为：0min，40％A，60％B；40min，25％A，75％B；45min，40％A，60％B；60min，40％A，60％B。
优选的，所述检测方法为含量检测方法，步骤(3)中所述流动相洗脱比例为：0min，35％A，65％B；15min，35％A，65％B；20min，25％A，75％B；30min，25％A，75％B；30.01min，35％A，65％B；35min，35％A，65％B。
优选的，步骤(3)中所述检测柱温为：40℃。
优选的，步骤(3)中所述检测流速1.1～1.3mL·min-1。
本发明猪脑神经神经节苷脂提取液主要成分以单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)为主。现代药理研究证明，因其GM1对脑中风、老年痴呆、癫痫、脑瘫和帕金森疾病都有明显的疗效。因此，定量测定单唾液酸四己糖神经节苷脂的含量非常必要，测定项目设置合理。单唾液酸四己糖神经节苷脂为GM1A和GM1B两种物质的混合物，因此，将单唾液酸四己糖神经节苷脂色谱分析方法优化，使得GM1A和GM1B分离成单独的两个色谱峰，再进行含量计算，结果更可信。
因此，本发明选择以GM1A、GM1B为指标含量，对猪脑神经节苷脂提取液中的有效物质进行标定，从而控制其内质量，有效保障药物制剂的安全性和有效性。
本发明所述的GM1化学名称为单唾液酸四己糖神经节苷脂钠，其分子式为：C73H130N3O31Na。其中，GM1A、GM1B分子式结构相类似，GM1B化学结构比GM1A多一个亚甲基。
本发明具有以下积极有益效果：
(1)本发明建立药物制剂中猪脑神经节苷脂含量的检测方法，该检测方法在GM1在0.02756mg/ml～0.27560mg/ml浓度范围内与峰响应值成显著线性关系。精密度实验结果表明，用本发明方法测定药物制剂(复方脑肽节苷脂注射液、复方曲肽注射液、猪脑神经节苷脂提取液)各6份待测品，按外标法计算含量，三个品种各6份待测品含量RSD％均符合要求，该方法重复性良好。准确度实验结果表明，用本发明方法对药物制剂进行测定，各六个样品的平均回收率分别为101.45％(复方脑肽节苷脂注射液)、98.05％(复方曲肽注射液)、98.63％(猪脑神经节苷脂)，回收率的RSD％分别为：0.60％、1.28％、1.08％。因此本发明检测方法的准确度良好。溶液稳定性实验结果表明：本发明待测品溶液和对照溶液分别放置0、3、6、9、12、15、18、21、24小时进样，对照溶液在24h峰面积RSD为1.09％，复方脑肽节苷脂注射液待测品溶液在24h主峰面积RSD为0.71％，复方曲肽注射液待测品溶液在24h主峰面积RSD为0.31％，猪脑神经节苷脂提取液待测品溶液在24h主峰面积RSD为0.39％。对照品溶液和各待测品溶液在24h内，溶液稳定性良好。耐用性实验结果表明，通过改变分析方法中的柱温、流速、缓冲液pH值以及流动相洗脱比例等，以证明本发明检测方法耐用性良好。
(2)本发明的检测方法同时测定药物制剂中GM1A、GM1B，2个指标成分的含量，能全面检测药物制剂的内在质量，以保证该药物的安全性和有效性。
综上所述，本发明所建立的猪脑神经节苷脂含量检测方法高效准确，其专属性良好、精密度、重复性、回收率、耐用性良好，可用于药物制剂的内在质量控制，并可应用于含有脑神经节苷脂同类药物制剂生产质量检测中，有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。除非另作定义，本发明说明书以及权利要求书中使用的技术术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实验过程中参数筛选的部分实验如下：
①、缓冲液浓度的筛选选择
分别考察0.005mol/L、0.05mol/L、0.01mol/L三种缓冲盐浓度的流动相，采用梯度洗脱方法，以GM1A和GM1B色谱峰峰型变化为考察指标，见表1。
表1缓冲液浓度筛选
由上表试验结果可知：缓冲液浓度为0.005mol/L时，GM1A与GM1B峰的拖尾有所改善，峰型良好。
②、缓冲液pH值的筛选
在考察缓冲盐浓度的同时，考察缓冲盐pH值范围的变化对分离效果及峰型的影响。试验汇总结果如表2。
表2缓冲液浓度筛选
由上述表2试验结果可知：缓冲液浓度的pH为6.0时，GM1A与GM1B两峰均比同一条件下的其他pH值的拖尾因子更符合要求，峰型良好。
③、流动相比例以及洗脱程序优化
在确定缓冲盐浓度及pH值的基础上，对流动相比例及洗脱程序进行优化。主要筛选了以下几个比例及洗脱程序，见表3。
表3流动相比例优选结果比较
由上述表3试验结果可知：流动相比例以及梯度选择上表中编号(3)的洗脱程序时，GM1A峰与GM1B峰均与其前一杂质分离，最后一杂质也能检出，分离度好，方法稳定、重现，分析时间适中。方法(4)GM1A与GM1B两峰均不拖尾，分离度良好，方法稳定、重现，且GM1B峰理论塔板数大于5000，但分析时间较长，通过PDA全波长扫描发现未有不纯物。
④、缓冲液调节pH值溶液(峰型)选择
方法摸索过程中，通过数据汇总，得出用三乙胺调节和氢氧化钠溶液调节缓冲液，分别可能产生主峰为前拖尾与后拖尾两种结果，故用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0后加0.01％三乙胺溶液用以调节峰型。上述方法(3)和方法(4)通过0.01％三乙胺溶液调节峰型后，实验结果汇总如表4所述。
表4缓冲液调节pH值溶液(峰型)选择
表4实验结果可知：GM1A与GM1B两峰均不拖尾，分离度良好，方法稳定、重现，且GM1B峰理论塔板数大于5000。
⑤、柱温变化对测定结果的影响
按照单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法，适当改变柱温，考察GM1色谱峰是否符合要求，试验结果发现，柱温箱温度在35℃-45℃范围内变化，GM1色谱峰的分离度和拖尾因子均满足要求。
⑥、流速变化对测定结果的影响
按照单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法，适当改变流速，考察GM1色谱峰是否符合要求，试验结果发现，流速在1.1ml/min～1.3ml/min范围内变化，GM1色谱峰的分离度和拖尾因子均满足要求。
⑦、缓冲液pH值变化对测定结果的影响
按照单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法，适当改变缓冲液pH值，考察GM1色谱峰是否符合要求。试验结果发现，缓冲液pH值在5.8-6.2范围内变化，GM1色谱峰的分离度和拖尾因子均满足要求。
⑧、流动相起始比例变化对测定结果的影响
按照单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法，适当改变流动相起始比例，考察GM1色谱峰是否符合要求，验证结果：改变流动相起始比例，在33:67-37:63范围内变化，GM1色谱峰的分离度和拖尾因子均满足要求。
实施例1
本发明药物制剂含量测定方法的确定：
1.1含量分析方法建立
1.1.1色谱条件与系统适用性
采用WatersSymmetry RP C18色谱柱，检测波长为205nm；柱温为40℃；流速1.2ml/min；流动相以0.005mol/l磷酸二氢钾溶液(0.68g磷酸二氢钾→1L纯化水，用1mol/l氢氧化钠溶液调节pH值至6.0)加0.01％三乙胺溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；按下表进行梯度洗脱。
表5流动相洗脱比例
1.1.2含量测定法
取本品，加水溶解并制成每1ml中约含0.12mg的溶液，作为待测品溶液；取单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)对照品适量，精密称定，加水制成每1ml约含0.12mg的溶液，作为对照品溶液。精密量取上述对照溶液和待测品溶液各20μl，依次注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以对照品峰面积计算待测品中GM1A与GM1B含量之和即为本品GM1的含量。
1.1.3分析方法验证
1.1.3.1对照品溶液配制
GM1对照品溶液：精密称取GM1对照品约10mg，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液1ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
1.1.3.2待测品溶液的制备
精密量取复方脑肽节苷脂注射液5ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取复方曲肽节苷脂注射液5ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取猪脑神经节苷脂提取液1ml，至25ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，作为储备液；
精密量取待测品储备液(包括复方脑肽节苷脂注射液、复方曲肽节苷脂注射液、猪脑神经节苷脂提取液)1ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
待测品溶液中GM1a和GM1b的色谱峰保留情况如下表所示。
表6待测品溶液神经节苷脂色谱峰定位表
对照品溶液与市售的单唾液酸四己糖神经节苷脂注射液中GM1a和GM1b的色谱峰保留情况如下表所示。
表7待测品溶液神经节苷脂色谱峰定位表
验证结果：通过空白溶剂、对照品溶液、已知杂质定位、系统适用性试验证明单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法专属性良好。
1.1.3.4系统精密度
取GM1对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，考察系统精密度。
表8系统精密度峰面积统计表
表9系统精密度保留时间统计表
验证结果：峰面积以及保留时间的RSD值结果表明，该色谱条件下神经节苷脂含量分析方法的系统精密度良好。
1.1.3.5重复性
GM1对照品溶液：分别精密量取对照品储备液1ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备两份。
精密量取复方脑肽节苷脂注射液(190807)5ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备6份。
精密量取复方曲肽节苷脂注射液(190106)5ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备6份。
精密量取猪脑神经节苷脂提取液(SN200607)1ml，至25ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，作为储备液；精密量取待测品储备液1ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备6份。
分别精密吸取上述对照品溶液及待测品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按神经节苷脂含量分析方法进行测定，按外标法计算含量，及含量的RSD值。
表10重复性实验数据及结果
验证结果：单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法的重复性良好。
1.1.3.6中间精密度
对照品溶液：分别精密量取对照品储备液1ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备两份。
精密量取复方脑肽节苷脂注射液(190807)5ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备6份。
精密量取复方曲肽节苷脂注射液(190106)5ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备6份。
精密量取猪脑神经节苷脂提取液(SN200607)1ml，至25ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，作为储备液；精密量取待测品储备液1ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备6份。
分别精密吸取上述对照品溶液及待测品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按神经节苷脂含量分析方法进行测定，计算含量的RSD值，与重复性结果，计算12份待测品溶液含量的RSD值。
表11第二组重复性实验数据及结果
表12中间精密度实验数据及结果
验证结果：单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法的中间精密度良好。
1.1.3.7线性及范围
取对照品储备液，根据线性项下考察的浓度点，按照下表依次配制不同浓度的线性溶液。精密吸取系列线性溶液，按照单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法，进行试验。以测得的峰面积与对应的浓度作图，用最小二乘法进行线性回归，列出回归方程，作出线性图，并报告相关系数r，y轴截距和斜率。回归的相关系数(r)不得小于0.995，Y轴截距应在100％响应值25％以内。
表13线性溶液的配制
单唾液酸四己糖神经节苷脂是以30％为最低浓度点，分别考察0.02756mg/ml～0.2756mg/ml范围内7个浓度点的线性。结果表明，线性方程：Y＝6540571.9997X-11539.8013，GM1在0.02756mg/ml～0.2756mg/ml，浓度范围内与峰响应值成显著线性关系。
1.1.3.8准确度
对照品溶液：分别精密量取对照品储备液1ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得，同法制备两份。
空白待测品溶液
精密量取复方脑肽节苷脂注射液(190807)3ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取复方曲肽节苷脂注射液(190106)3ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取猪脑神经节苷脂提取液(SN200607)1ml，至25ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，作为储备液；精密量取待测品储备液0.6ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。
待测品溶液
准确移取上述对照品储备液(浓度：0.80750mg/ml)0.4ml，再精密量取复方脑肽节苷脂注射液(GM1浓度：0.24mg/ml)3ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，每个待测品溶液各配制6份样，摇匀，即得。
准确移取上述对照品储备液(浓度：0.80750mg/ml)0.4ml，再精密量取复方曲肽注射液(GM1浓度：0.30mg/ml)3ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，每个待测品溶液各配制6份样，摇匀，即得。
准确移取上述对照品储备液(浓度：0.80750mg/ml)0.4ml，再精密量取上述猪脑神经节苷脂提取液储备液(GM1浓度：1.2mg/ml)0.6ml，至10ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，每个待测品溶液各配制6份样，摇匀，即得。
表14准确度结果统计表
验证结果：以上数据证明，单唾液酸四己糖神经节苷脂含量分析方法准确度良好。
1.1.3.9溶液稳定性
按照含量分析方法配制待测品溶液，单唾液酸四己糖神经节苷脂对照品溶液。分别于0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h后进样，进样体积20μl，考察主峰总峰面积的变化情况。以各时间点样品和0时相比，考察色谱峰面积的变化，计算各时间点的主峰峰面积的RSD％。
表15溶液稳定性实验数据
验证结果：在色谱条件设定的条件下放置24小时内，对照品溶液在24h内峰面积无明显变化，RSD为1.09％，复方脑肽节苷脂注射液待测品溶液在24h主色谱峰面积无明显变化，RSD为0.71％，复方曲肽注射液待测品溶液在24h主色谱峰面积无明显变化，RSD为0.31％，猪脑神经节苷脂提取液待测品溶液在24h主色谱峰面积无明显变化，RSD为0.39％。
最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种含有猪脑神经节苷脂药物制剂的含量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
⑴、待测品溶液的制备：将待测药物制剂配制成一定浓度的溶液；
⑵、对照品溶液的制备：将单唾液酸四己糖神经节苷脂对照品配制成一定浓度的溶液；
⑶、色谱条件与系统适用性：色谱柱以C18为填充剂，流动相：缓冲盐溶液A-乙腈B，流动相洗脱比例为：0～60min，25～40％A，60～75％B；检测流速：0.9～1.4mL·min-1，检测波长：205nm，检测柱温：35～45℃；
⑷、色谱峰测定：将上述步骤⑴待测品溶液、步骤⑵对照品溶液，依次注入液相色谱仪，测定记录色谱图，并按外标法以对照品峰面积计算待测品中GM1A与GM1B的含量之和，为药物制剂中单唾液酸四己糖神经节苷脂的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中取待测药物制剂加水溶解制成0.12g\L的溶液，作为待测品溶液；步骤(2)中取单唾液酸四己糖神经节苷脂加水制成0.12g\L的溶液，作为对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)所述色谱柱型号为：WatersSymmetry RP。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述缓冲盐溶液A是由0.005mol/L磷酸二氢钾溶液和0.01wt％三乙胺溶液配制而成。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述缓冲盐溶液A的pH值为5.8-6.2。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述流动相洗脱起始比例为：0min，33～37％A，63～67％B。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法为含量检测方法，步骤(3)中所述流动相洗脱比例为：0min，35％A，65％B；15min，35％A，65％B；20min，25％A，75％B；30min，25％A，75％B；30.01min，35％A，65％B；35min，35％A，65％B。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述检测柱温为：40℃。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述检测流速1.1～1.3mL·min-1。
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