CN113855690A - 马度米星铵在制备抗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医疗领域，公开了马度米星铵在制备抗乳腺癌药物中的应用。本发明扩大了马度米星铵的应用范围，为马度米星铵在抗乳腺癌药物的制备上提供了支持，为临床应用其治疗乳腺癌提供有效工具。本发明试验表明马度米星铵在一定浓度范围内具有抑制人乳腺癌MDA‑MB‑231、4T1细胞和犬乳腺癌CMT‑U27细胞及临床来源犬原代乳腺癌细胞的体外增殖活性，马度米星铵可诱导乳腺癌细胞体外凋亡。马度米星铵能显著抑制4T1接种小鼠原位乳腺癌的生长。因此，马度米星铵可用于制备抗乳腺癌药物，特别是用于治疗三阴性乳腺癌。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及马度米星铵在制备抗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是最为常见的危害妇女及雌性动物健康的恶性肿瘤之一。而三阴性乳腺癌由于雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2表达均为阴性，肿瘤细胞非常容易扩散到肺、肝和中枢神经系统。近年来，随着对各种癌症的发生及其发展机制的不断深入剖析，具有独特作用机制的靶向治疗药物不断被发现。因此，从现有药物资源中挖掘出具有高效低毒的抗三阴性乳腺癌药物具有理论意义和实际价值。
近年来，一些聚醚类离子载体抗生素被发现具有抗癌活性，如盐霉素、南昌霉素等。马度米星又常被称作马杜霉素，它最初是由罗氏公司和美国氰胺公司在上世纪七、八十年代从马杜拉放线菌的发酵培养物中分离得到。马度米星铵是马度米星的铵盐形式。马度米星铵因具有广谱抗球虫效果、抗球虫效价高、不易诱导球虫产生耐药性等特点而被用于预防多种常见的鸡球虫病。马度米星铵作为一种高效的抗球虫药物，其作用是通过影响阳离子在细胞膜上的转运，导致细胞内Ca+、Na+和K+的代谢紊乱，引起水分子大量进入细胞内，从而导致细胞膜破裂，细胞最终走向死亡。尽管已有研究初步解析了马度米星铵对哺乳动物细胞的毒性作用机制，但未见马度米星铵在乳腺癌细胞毒性作用方面的报道。
发明内容
发明目的：根据上述现有技术，本发明提供了马度米星铵的作为抗癌新药的新用途，具体是马度米星铵在制备抗乳腺癌药物中的应用。
技术方案：本发明公开了马度米星铵在制备抗乳腺癌药物中的应用。
优选的，马度米星铵抗乳腺癌有效浓度为0.0625μM～1μM。
进一步的，马度米星铵诱导MDA-MB-231细胞、4T1细胞、CMT-U27细胞及犬原代乳腺癌细胞的死亡与凋亡，改变MDA-MB-231、4T1细胞的周期，将乳腺癌细胞阻滞在S期，抑制MDA-MB-231、4T1细胞集落形成能力，抑制MDA-MB-231、4T1细胞体外迁移速率及侵袭能力。
更进一步的，马度米星铵显著抑制MDA-MB-231、4T1细胞中MMP-2、MMP-9、Vimentin的表达，显著上调E-cadherin的表达水平。
优选的，马度米星铵使用剂量为0.35mg/kg～3.5mg/kg。
进一步的，马度米星铵还可以诱导4T1接种的原位乳腺癌细胞的体内凋亡，显著抑制乳腺癌细胞中MMP-2、MMP-9、Vimentin的表达，显著上调E-cadherin的表达水平。
本申请所述乳腺癌优选为三阴性乳腺癌。
有益效果：本发明表明马度米星铵在一定浓度范围内具有抑制乳腺癌MDA-MB-231、4T1细胞的体外增殖活性，增加犬乳腺癌细胞CMT-U27和犬原代乳腺癌细胞死亡率，马度米星铵可诱导乳腺癌细胞体外凋亡；改变细胞周期分布(将乳腺癌细胞阻滞在S期)；降低其体外转移及侵袭的能力；显著抑制MMP-2、MMP-9、Vimentin的表达，显著上调E-cadherin的表达水平。马度米星铵能显著抑制4T1接种小鼠原位乳腺癌的生长；诱导体内乳腺癌细胞凋亡；显著抑制肿瘤组织中MMP-2、MMP-9、Vimentin的表达，显著上调E-cadherin蛋白量的表达水平。因此，马度米星铵可以用于制备抗人乳腺癌药物和抗犬乳腺癌药物，特别是用于治疗三阴性乳腺癌。
本发明主要展示马度米星铵对人和犬乳腺癌细胞体外、体内的抗肿瘤效果，探讨马度米星铵的抗乳腺癌作用机制，为合理选择使用马度米星铵作为临床治疗乳腺癌药物提供重要的工具，为后续开展其临床抗癌研究提供新思路。
附图说明
图1为马度米星铵对MCF-10A、EpH4-Ev、MDA-MB-231、4T1、CMT-U27和犬原代乳腺癌细胞的毒性作用(n＝6,*P<0.05,**P<0.01)；
图2为马度米星铵处理MDA-MB-231细胞不同时间段形态学观察图(100×)；
图3为马度米星铵处理4T1细胞不同时间段形态学观察图(100×)；
图4为马度米星铵处理MDA-MB-231及4T1细胞48h后流式细胞仪检测细胞凋亡率(n＝3,*P<0.05,**P<0.01)；
图5为马度米星铵处理MDA-MB-231及4T1细胞48h后PI法检测细胞周期(n＝3)；
图6为马度米星铵对MDA-MB-231及4T1细胞集落形成的影响(n＝3,***P<0.001)；
图7为马度米星铵对MDA-MB-231及4T1细胞“划痕愈合”的影响(n＝3,*P<0.05,**P<0.01)；
图8为马度米星铵对MDA-MB-231及4T1细胞体外迁移及侵袭的影响(n＝3,**P<0.01)；
图9为马度米星铵对MDA-MB-231及4T1细胞内黏附与迁移蛋白表达能力的影响(n＝3,*P<0.05,**P<0.01)；
图10为马度米星铵对乳腺癌细胞异体成瘤能力的影响(n＝7,**P<0.01***P<0.001)；
图11马度米星铵对各组小鼠组织器官的病理组织学检查结果(100×,n＝5)；
图12为马度米星铵对各组小鼠肿瘤组织的影响(n＝5)；
图13为马度米星铵对肿瘤细胞凋亡的影响(n＝5,**P<0.01)；
图14为马度米星铵对肿瘤组织中MMP-2和MMP-9表达的影响(400×,n＝5,*P<0.05**P<0.01)；
图15为马度米星铵对肿瘤组织中Vimentin和E-cadherin表达的影响(400×,n＝5,*P<0.05**P<0.01)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
马度米星铵(批号：K0181304，纯度>92.3％)购自中国兽医药品检查所。
人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、小鼠正常乳腺上皮细胞EpH4-Ev、人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、和小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，犬乳腺癌细胞CMT-U27购自美国模式培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)，犬原代乳腺癌细胞由南京农业大学动物医学院分离培养纯化所得。
实验动物：BALB/c胸腺免疫缺陷裸鼠裸鼠购自扬州大学比较医学中心。
本发明分别以乳腺癌细胞、临床来源的犬原代乳腺癌细胞和裸鼠作为体外、体内研究模型，通过细胞活性检测、倒置相差光学显微镜、流式细胞术、免疫印迹、病理学组织检查等生物学手段，研究马度米星铵对乳腺癌细胞体外、体内的抗乳腺肿瘤效果。
实施例1
按照细胞传代中的方法分别用胰酶消化长势良好的MCF-10A、EpH4-Ev、MDA-MB-231、4T1、CMT-U27和犬原代乳腺癌细胞六种细胞，将上述细胞分别以5000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃细胞培养箱中培养。待每孔细胞长至80％左右用不同浓度(0μM、0.0625μM、0.0125μM、0.25μM、0.5μM、1μM)马度米星铵分别处理细胞24h、48h、72h，每组设计6个平行复孔，置于CO2培养箱中37℃继续培养。24h、48h、72h后每孔加入10μL CCK-8溶液，在培养箱内继续孵育1h。用酶标仪测定450nm波长处的OD值。
结果如图1所示：不同浓度的马度米星铵(0.0625μM～1μM)均可以抑制MDA-MB-231、4T1、CMT-U27和犬原代乳腺癌细胞四种细胞的活性，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用愈发明显，呈时间和浓度依赖性。对于正常乳腺上皮细胞MCF-10A和EpH4-Ev来说，无论浓度的升高还是时间的延长，马度米星铵均未显示出明显的毒性作用。
实施例2
选取生长良好的MDA-MB-231细胞和4T1细胞，消化离心传代，待细胞长到培养皿底面的80％左右，弃去原培养液，加入含有不同浓度(0μM、0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM)的马度米星铵无菌培养液10mL，继续置于含5％CO2的细胞培养箱中常规培养。选取用药后24h、48h、72h三个时间点将细胞置于显微镜下观察并拍照。
结果表明：如图2、3所示，MDA-MB-231细胞和4T1细胞经不同浓度的马度米星铵(0～1μM)分别处理24h、48h和72h，随着药物浓度和作用时间增加，乳腺癌细胞生长被抑制，活性逐渐降低，同时细胞逐渐变圆、萎缩，从培养皿上脱落并漂浮于培养液中，细胞间隙变大，贴壁细胞中有空泡出现，呈明显的时间和浓度相关性。而对照组细胞形成致密排列的单层细胞，随时间的延长也未见大量细胞漂浮。
实施例3
消化收集生长良好的MDA-MB-231细胞和4T1细胞，于六孔板中每孔接种1×105/个细胞，使细胞在板内均匀分布。将培养板置于37℃细胞培养箱中培养。次日，弃去原培养液，每孔加入含不同浓度(0μM、0.0625μM、0.25μM、1μM)的马度米星铵无菌培养液2mL，继续置于细胞培养箱中常规培养。药物作用细胞48h后，用胰蛋白酶消化液(不含EDTA)消化细胞，吹打成细胞悬液后移入5mL离心管中，置于离心机2000r/min转速离心5min后加入预冷PBS洗涤细胞沉淀两次，收集1-5×105个细胞，加入预冷的binding buffer 500μL，重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL propidium podide，混匀，避光室温下反应15min。1h内流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用Flowjo软件分析细胞凋亡率。
结果表明：如图4所示，0～1μM浓度的马度米星铵处理MDA-MB-231和4T1细胞48h后，药物处理组与对照组相比，细胞凋亡率随药物浓度的升高而增加。
实施例4
消化收集生长良好的MDA-MB-231细胞和4T1细胞，使细胞以1×105/孔数量接种于6孔板后置于37℃细胞培养箱中培养。次日，弃去原培养液，每孔加入含有不同浓度(0μM、0.0625μM、0.25μM、1μM)的马度米星铵无菌培养液2mL，继续置于细胞培养箱中常规培养。药物作用细胞48h后，用0.25％胰蛋白酶消化液消化细胞，并将其轻轻吹打成单细胞悬液后移入5mL离心管中，置于离心机2000r/min转速离心5min。用PBS洗涤细胞后再次以转速为2000r/min离心5min。最后收集细胞并其浓度调整至1×106/mL，随后加入1mL的70％乙醇置于-20℃固定过夜。隔天取出已固定的细胞，置于离心机上离心，随后洗涤细胞将乙醇除去，最后吹打细胞使之重悬于500μL Buffer A中。加入RNaseA(核糖核酸酶)5μL，37℃反应30min。最后加入PI染液5μL，避光常温下反应30min。1h内用流式细胞仪测定细胞内DNA的含量，并用Modifit软件分析各时相细胞的百分率。
结果表明，如图5所示，马度米星铵处理MDA-MB-231细胞和4T1细胞后，与对照组相比，药物处理组G0/G1期细胞比例逐渐降低，S期细胞比例逐渐升高，G2/M期细胞比例逐渐降低。
实施例5
将长势良好的MDA-MB-231、4T1细胞按照1000个/孔的密度均匀接种于六孔板中，每孔加入2mL含10％FBS的完全培养液，置于含有5％CO2的细胞培养箱培养。当细胞培养24h后，同时加入不同浓度的马度米星铵(0μM、0.0625μM、0.25μM、1μM)，每隔两天更换一次培养基，并实时观察克隆形成情况。大约14天后，当对照组细胞形成较大克隆时，弃去培养基，PBS漂洗，甲醇固定5min，然后用PBS漂洗，加入0.5％结晶紫1mL染色10min，弃去染液，去超纯水漂洗，拍照记录。利用细胞计数相关软件(Quantity One 4.62)对细胞克隆数进行计数分析。
结果表明：如图6所示，与对照组相比马度米星铵药物处理组克隆形成比率极显著降低(P<0.001)，随着马度米星铵作用浓度的增加，MDA-MB-231、4T1细胞克隆数量逐渐减少。
实施例6
在6孔板底部用马克笔均匀地划横线，每条线的上下缘与划痕交叉点作为观察点。取出长势良好的细胞，制备成单细胞悬液，以每孔5×105个细胞的密度接种到6孔板上，在含10％FBS的培养基中培养过夜。隔天取出6孔板，用200μL枪头垂直于细胞表面由孔一端划向另一端。随后吸掉旧培养基，用PBS洗去划下的细胞，加入含有1％FBS的培养液为阴性对照，含有不同浓度的1％FBS培养液配制的马度米星铵(0μM、0.0625μM、0.25μM、1μM)为药物刺激组，放入37℃细胞培养箱中培养。分别取0h、12h、24h和48h时间点于200倍倒置显微镜下观察不同处理组的“划痕”宽度并拍照。
结果表明：如图7所示，马度米星铵可以显著抑制MDA-MB-231和4T1细胞的迁移速度。
实施例7
选取长势良好的MDA-MB-231和4T1细胞，胰酶消化离心后弃上清，用不同浓度的马度米星铵(0-1μM)无血清培养基重悬细胞，每孔加入2×104个细胞。在小室下层加入500μL含10％FBS的培养液，置于培养箱中孵育。24h后取出小室，用棉签擦去上层未迁移的细胞，PBS漂洗细胞两遍，4％多聚甲醛固定小室下层的细胞15min，随后用0.5％结晶紫染色10min，PBS清洗干净后，在显微镜下观察拍照并计数迁移到下层的细胞。
结果表明：如图8所示，对照组有较多的细胞细胞穿过微孔膜，而马度米星铵用药组穿过微孔膜的MDA-MB-231和4T1细胞数量明显减少，呈剂量依赖效应，说明马度米星铵可以抑制两种乳腺癌细胞的迁移。
实施例8
试验前一天将Matrigel基质胶置于4℃化冻。在预冷的transwell小室中加入含10％基质胶的无血清培养液100μL，37℃孵育4-6h，直至呈现“白色层”固态。选取长势良好的细胞，胰酶消化离心，弃上清用不同浓度的马度米星铵(0-1μM)无血清培养基重悬细胞。先用无血清培养基漂洗Matrigel基质胶，然后每孔加入2×104个细胞。同时在小室下层加入500μL含10％FBS的完全培养基，置于37℃培养箱中孵育。24h后取出小室，用棉签擦去上层未侵袭的细胞，PBS漂洗细胞两遍，4％多聚甲醛固定小室下层的细胞15min，随后用0.5％结晶紫染色10min，PBS清洗干净后，在显微镜下观察拍照并计数侵袭到下层的细胞。
结果表明：如图8所示，对照组有较多的细胞细胞穿过微孔膜，而马度米星铵用药组穿过微孔膜的MDA-MB-231和4T1细胞数量明显减少，呈剂量依赖效应，说明马度米星铵可以抑制两种乳腺癌细胞的侵袭。
实施例9
细胞总蛋白提取：收集长势良好的MDA-MB-231细胞和4T1细胞，使细胞以1×105/孔数量接种于6孔板后置于37℃培养箱中培养。次日弃去原培养液，每孔加入含有不同浓度(0μM、0.0625μM、0.25μM、1μM)的马度米星铵无菌培养液2mL，继续置于培养箱中常规培养48h后，中止细胞培养。吸去培养液，用PBS洗涤。将RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂99:1混合后，每孔加入100μL混合液，混匀使细胞湿润，用细胞刮将细胞刮下，随后用移液枪将细胞吸入到1.5mL离心管中，放入4℃冰箱内混合1h后取出，12000r/min转速4℃条件下离心10min，取上清至新的离心管中待测蛋白浓度。
蛋白浓度测定：将BCA试剂A液和B液按50:1的体积比例均匀混合配制成工作液待用。用稀释液稀释5mg/mL的BSA标准品，使其终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加至96孔板的标准品孔中，不足20μL的加稀释液至20μL，样品孔中每孔加入样品蛋白2μL，同时加入稀释液补足至20μL。每孔加入200μL BCA工作液，于37℃恒温箱中孵育30min。酶标仪测定562nm波长处的吸光度，绘制标准曲线，依据回归曲线方程计算出所测样品的实际浓度。根据测定的蛋白浓度向细胞裂解液中加入不同体积的5×loading buffer，用沸水煮10min，使蛋白完全变性，分装蛋白样品至-80℃冰箱中冻存，用于SDS-PAGE凝胶电泳检测。
Western blot：将清洗干净的玻璃片固定在制胶架上并夹紧。沿玻璃片外侧加水20min检查是否漏水，若不漏水，根据试验需要配制相应浓度的分离胶和浓缩胶。先按配方表配分离胶，沿玻璃片外侧快速灌胶，至胶体平面距离玻璃顶端2-2.5cm左右时停止灌胶，用蒸馏水封闭分离胶，静待适当时间胶体完全凝固后倒去胶上层的水并配制浓缩胶，快速灌胶，并插入合适大小的胶梳。SDS-PAGE胶配制完成后即可加样，每孔加入适量的蛋白量，加样时要缓慢，避免加样太快使样品冲出加样孔。浓缩胶80V 30min使蛋白样品浓缩，分离胶120V，待溴酚蓝迁移至分离胶底部时停止电泳。剪取适当大小的NC膜(8cm×8cm)，浸入转印缓冲液中湿润。撬开玻璃板，将浓缩胶全部切去(注意分清加样方向，可切角标记)，分离胶浸入水中保持湿润，切去多余胶边。制作三明治顺序：海绵-NC膜-分离胶-海绵，调转膜仪器程序转膜，根据目的蛋白的kD值，选择大致的条带区间剪下。封闭液封闭90min。孵育一抗(MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin)4℃过夜。TBST洗涤，每次10min左右换液，共三次。二抗室温孵育60min。TBST洗涤，每次15min左右换液，共三次。配制好ECL化学发光试剂液滴在NC膜上进行反应，显影液覆盖5min后曝光，凝胶成像系统拍照，对获得蛋白条带用Quantity-One进行灰度分析。
结果表明：如图9所示，MDA-MB-231细胞和4T1细胞经过不同浓度的马度米星铵处理48h后，MMP-2、MMP-9和Vimentin三种蛋白表达量随马度米星铵作用浓度的升高而下降，马度米星铵上调E-cadherin的表达水平，且表现出浓度依赖性。
实施例10
消化4T1细胞，离心去上清，用PBS重悬细胞沉淀，配置成1×107个/mL的细胞悬液。取18g左右的雌性BALB/c裸鼠，在右侧第四对乳腺脂肪垫皮下接种4T1细胞，每只接种0.1mL。每天观察肿瘤生长情况，每2天用游标卡尺测量肿瘤的长(a)和宽(b)，并按照公式：V＝a×b2/2计算肿瘤体积。7天后皮下肿瘤大小约50-100mm3，原位乳腺癌模型建立成功，分组开始给药。将28只原位乳腺癌小鼠模型随机分为4组，每组7只。对照组灌胃无菌PBS，用药组根据小鼠体重灌胃0.35mg/kg、0.7mg/kg、3.5mg/kg的马度米星铵溶液。每天观察小鼠情况是否有异常，每隔两天给药一次，并称量小鼠体重，用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤的体积。给药14天后处死小鼠，取小鼠血液测定血常规血生化用。切去小鼠肿瘤，用电子天平测量肿瘤的重量，并拍摄照片。每组随机选取5只小鼠肿瘤标本，连同小鼠的心脏、肝脏、肾脏等组织标本浸泡于4％多聚甲醛中固定，待后续染色使用。
结果表明：在给予不同浓度的马度米星铵治疗期间，小鼠对药物均表现出良好的耐受性。药物组与对照组的小鼠体重在治疗期间无明显差异(图10A)，药物组肿瘤平均体积生长速率及大小均显著小于对照组肿瘤(P<0.001)，不同药物浓度处理组间差异极显著(图10B)。药物处理14天后，从各组小鼠身体分离肿瘤称重同样发现药物处理组小鼠肿瘤重量极显著小于对照组小鼠肿瘤重量(图10C)。肿瘤照片见图10D。上述结果表明马度米星铵能显著4T1接种小鼠原位乳腺癌的生长，证实了马度米星铵的体内抗肿瘤效应。
实施例11
将固定24h以上的肿瘤组织及小鼠相关脏器组织修整后梯度酒精脱水，每个梯度分别浸泡20min，然后置于酒精-二甲苯比例为1:1的溶液中透明30min，二甲苯透明2次每次30min，使用石蜡将组织进行包埋，修块后切片，厚度为5μm，将切好的石蜡条带正面平铺于水上，水温35℃，待延展充分后的蜡条黏附于载玻片上，吸去多余的水分自然风干。进行苏木精染色：在切片上滴加苏木精覆盖组织，室温3min，用自来水冲洗5min(镜下实时观察)。伊红染色：将切片置于95％乙醇中30sec，然后滴加伊红染色2sec，迅速用95％乙醇进行固定后用100％乙醇脱水2次，每次3min。放入二甲苯中10min，中性树胶封片后于光学显微镜下观察拍照。
结果表明：如图11所示，与对照组相比，低、中、高三个剂量组对小鼠的各脏器均无明显的损伤，提示马度米星铵在体内有良好的抗耐受性。在肿瘤组织切片中(图12)，对照组癌细胞排列散乱，肿瘤细胞数量多、异型性大，细胞核染色深且呈多形性，核分裂现象多见，窦状毛细血管丰富，可为肿瘤细胞提供丰富的营养，而用药组肿瘤细胞数量少，窦状毛细血管减少，有坏死肿瘤细胞出现。
实施例12
将固定24h以上的肿瘤组织修整后梯度酒精脱水，石蜡包埋切片，厚度为4μm。将石蜡切片脱蜡处理，滴加浓度为20μg/mL蛋白酶K，室温下作用20min。PBS洗涤后加入TUNEL检测液50μL，37℃避光孵育60min。用PBS洗涤1次，滴加0.2mL标记反应终止液，室温孵育10min。用PBS洗涤3次，继续在样品上加50μL Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30min。用PBS洗涤3次，最后滴加0.3mL 3,3’-二氨基联苯胺(DAB)显色液后在显微镜下观测并拍照。
结果表明：如图13所示，肿瘤组织TUNEL表达呈阳性的细胞胞核呈棕色深染。对照组肿瘤细胞核完整，着色均匀且颜色较浅，马度米星铵用药组细胞核体积增大，并呈碎块状浓染，且随浓度升高凋亡的肿瘤细胞增多、凋亡现象越来越明显。
实施例13
进行石蜡切片，厚度为5μm，60℃烤片1h。脱蜡水化，步骤同H&E染色。切片置于柠檬酸钠溶液中(pH 6.0)，微波炉中火8min至沸腾，停火8min保温再转中低火7min。自然冷却后用PBS(pH7.4)洗3次，每次5min。切片放入3％双氧水溶液室温避光孵育25min，PBS(pH7.4)洗涤3次，每次5min。用疏水组化笔将组织圈住，将封闭液滴加在组织上，室温封闭30min。一抗稀释液稀释抗体(MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin)，将封闭液去掉，加入稀释好的抗体，4℃孵育过夜。使用PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5min。加入二抗，室温孵育50min。PBS(pH7.4)洗涤3次，每次5min，加入配好的DAB溶液进行显色，显色结束后放入蒸馏水中终止反应进行苏木精复染，方法同H&E染色。乙醇梯度脱水，二甲苯中浸泡10min后中性树胶封片，置显微镜下观察并拍照。
结果表明：肿瘤组织中MMP-2、MMP-9、Vimentin及E-cadherin的表达均呈阳性，且与体外实验表达结果一致。图14中，与对照组相比，用药组MMP-2和MMP-9的表达量减少，图15中各组肿瘤组织中Vimentin的表达量随着用药浓度的升高而减少(P<0.01)，E-cadherin的表达量与马度米星铵用药浓度呈正比(P<0.05)。
Claims (10)
1.马度米星铵在制备抗乳腺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，马度米星铵有效抗乳腺癌浓度为0.0625μM～1μM。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，马度米星铵诱导MDA-MB-231细胞、4T1细胞、CMT-U27细胞及犬原代乳腺癌细胞的死亡与凋亡。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，马度米星铵改变MDA-MB-231、4T1细胞的周期，将乳腺癌细胞阻滞在S期。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，马度米星铵抑制MDA-MB-231、4T1细胞集落形成能力，抑制体内肿瘤的形成。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，马度米星铵抑制MDA-MB-231、4T1细胞体外迁移速率及侵袭能力，降低乳腺癌的远端转移能力。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，马度米星铵显著抑制MDA-MB-231、4T1细胞中MMP-2、MMP-9、Vimentin的表达，显著上调E-cadherin的表达水平。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，马度米星铵使用剂量为0.35mg/kg～3.5mg/kg。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，马度米星铵诱导4T1接种的原位乳腺癌细胞的体内凋亡。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌及犬乳腺癌。
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