CN113845605A - 一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，包括如下步骤：将全脱乙酰化的壳寡糖溶于水，制成壳寡糖溶液，然后加入乙醇进行沉淀，离心，收集沉淀；其中，加入乙醇的体积占最终溶液体积的比例为30‑55％；将收集的沉淀用乙酸缓冲溶液溶解后，用填料为Bio‑gel P10的凝胶排阻色谱柱进行分离纯化，洗脱液为乙酸缓冲溶液，通过示差折光检测器检测流出的洗脱液，收集检测到的三个洗脱液组分；将所收集的三个洗脱液组分分别经填料为Sephadex G10的凝胶排阻色谱柱进行脱盐，浓缩后即得到单一高聚合度壳寡糖。本发明所公开的方法可制备纯度高的壳八糖、壳九糖和壳十糖标准品，且制备方法简单可行。

Description

一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法
技术领域
本发明涉及海洋生物工程领域，特别涉及一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法。
背景技术
壳寡糖，即寡聚β-1,4-氨基葡萄糖，是海洋氨基多糖-壳聚糖的降解产物。壳寡糖被报道具有多种生理活性，如抗肿瘤，抗菌，抗炎，抗氧化，调节血糖血脂，增强免疫力等等，常作为一种重要的营养素组分应用于功能食品。
目前壳寡糖的含量一般采取间接法测定，即将壳寡糖水解成氨基葡萄糖单糖，以单糖当量表示，主要包括Elson-Morgan法、苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法等显色法，也可采用高效液相色谱对氨基葡萄糖直接测定。然而，新食品原料壳寡糖主要成分为2-10个聚合度的寡聚氨基葡萄糖，如果采用间接测定法对食品中的壳寡糖进行质量监控，一些聚合度>10的壳寡糖甚至氨基葡萄糖单糖的混入均会对食品中壳寡糖的含量检测产生干扰，无法精准定量测定。如何获得聚合度2-10的单一聚合度壳寡糖标准品，对于检测壳寡糖食品原料至关重要。
近年来已有多位研究者通过离子交换色谱、聚丙烯酰胺凝胶层析等初步建立了壳寡糖单体的分离方法，但这些分离方法基本只是对低聚合度(聚合度n＝2-7)的单一壳寡糖进行制备，对于高聚合度的壳寡糖标准品(聚合度n>7)的分离仍是非常困难。如何对高聚合度的壳八糖、壳九糖和壳十糖(n＝8，9或10)进行分离，构建完整的壳寡糖单体标准品体系，对于食品行业中壳寡糖的精准质量控制具有重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，以达到可制备纯度高的壳八糖、壳九糖和壳十糖标准品，且制备方法简单可行的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)将全脱乙酰化的壳寡糖溶于水，制成壳寡糖溶液，然后加入乙醇进行沉淀，离心，收集沉淀；其中，加入乙醇的体积占最终溶液体积的比例为30-55％；
(2)将收集的沉淀用乙酸缓冲溶液溶解后，用填料为Bio-gel P10的凝胶排阻色谱柱进行分离纯化，洗脱液为乙酸缓冲溶液，通过示差折光检测器检测流出的洗脱液，收集检测到的三个洗脱液组分；
(3)将所收集的三个洗脱液组分分别经填料为Sephadex G10的凝胶排阻色谱柱进行脱盐，浓缩后即得到单一高聚合度壳寡糖。
上述方案中，制得的单一高聚合度壳寡糖为式I所示：
Figure BDA0003335846080000021
式I中，n＝8，9或10。
上述方案中，步骤(1)中制成的壳寡糖溶液的浓度为45-65g/L。
上述方案中，所述乙酸缓冲溶液为乙酸钠或乙酸铵溶液，浓度为20-100mmol/L。
上述方案中，所述乙酸缓冲溶液的pH为3-5。
上述方案中，步骤(2)中，分离纯化时，洗脱液的流速为0.1-0.5mL/min。
上述方案中，步骤(2)中，分离纯化时，收集到的三个洗脱液组分的流出时间分别为1720-1770min，1790-1830min，1855-1895min。
通过上述技术方案，本发明提供的一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法具有如下有益效果：
1、本发明通过控制乙醇的浓度可以有效去除全脱乙酰化壳寡糖中的聚合度过高或过低的壳寡糖组分(壳二糖-壳七糖和大于壳十糖的组分)，进而有针对性的制备具有壳八糖-壳十糖为组分的原料用于后续的分离实验，避免其它壳寡糖组分对分离效率的干扰，提高壳八糖-壳十糖的分离纯度。
2、本发明采用凝胶排阻色谱法分离得到高聚合度的单一壳寡糖(壳八糖、壳九糖和壳十糖)，分辨率高、且分离步骤少，只经过一步分离就能够得到纯的单一壳寡糖。
3、本发明方法得到的高聚合度的单一壳寡糖纯度高，利用HPLC检测其纯度，其中全脱乙酰化壳八糖纯度大于97％，全脱乙酰化壳九糖纯度大于96％，全脱乙酰化壳十糖纯度大于95％，这些高纯度的单一壳寡糖可以作为标准品，用于壳寡糖产品的质量控制检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例提供的乙醇分级沉淀制备全脱乙酰化壳寡糖原料的高效液相分析谱图。
图2为本发明实施例提供的凝胶排阻色谱制备单一高聚合度壳寡糖的洗脱层析图。
图3a、3b、3c为本发明实施例提供的分离到的单一高聚合度壳寡糖的高效液相分析谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，具体实施例如下：
实施例1
配置50g/L的全脱乙酰化的壳寡糖水溶液，(全脱乙酰化的壳寡糖的制备方法见专利CN201210146042.7)，加入无水乙醇进行沉淀，使乙醇最终浓度为40％(体积分数)，而后以5000g离心10min，收集沉淀，冷冻干燥，得聚合度主要为8-10的全脱乙酰化壳寡糖样品(参见图1)。称取所得到全脱乙酰化壳寡糖200mg，用4mL pH＝4的乙酸钠缓冲溶液溶解后，用填料为Bio-gel P10的凝胶排阻色谱柱进行分离纯化，洗脱液为pH＝4的乙酸钠缓冲溶液,流速为0.3mL/min，通过示差折光检测器检测洗脱液，收集检测到的三个分离组分(参见图2，流出时间分别为1750min，1800min，1875min)，将收集的三个组分分别经填料为Sephadex G10的凝胶排阻色谱柱进行脱盐，旋转蒸发浓缩后，即得到式I所示的高聚合度的单一壳寡糖：
Figure BDA0003335846080000031
式I中，n＝8,9或10。
将上述所得浓缩液用HPLC检测其纯度，其中，全脱乙酰化壳八糖(n＝8)纯度大于97％，全脱乙酰化壳九糖(n＝9)纯度大于96％，全脱乙酰化壳十糖(n＝10)纯度大于95％(参见图3a，图3b，图3c)。
实施例2
配置45g/L的全脱乙酰化的壳寡糖水溶液，加入无水乙醇进行沉淀，使乙醇最终浓度为55％(体积分数)，而后以5000g离心10min，收集沉淀，冷冻干燥，得聚合度主要为8-10的全脱乙酰化壳寡糖样品(参见图1)。称取所得到全脱乙酰化壳寡糖100mg，用3mL pH＝3的乙酸铵缓冲溶液溶解后，用填料为Bio-gel P10的凝胶排阻色谱柱进行分离纯化，洗脱液为pH＝3的乙酸铵缓冲溶液,流速为0.15mL/min，通过示差折光检测器检测洗脱液，收集检测到的三个分离组分(参见图2，流出时间分别为1760min，1820min，1880min)，将收集的三个组分分别经填料为Sephadex G10的凝胶排阻色谱柱进行脱盐，旋转蒸发浓缩后，即得到式I所示的高聚合度的单一壳寡糖：
Figure BDA0003335846080000041
式I中n＝8,9或10。
将上述所得浓缩液用HPLC检测其纯度，其中全脱乙酰化壳八糖纯度大于97％，全脱乙酰化壳九糖纯度大于96％，全脱乙酰化壳十糖纯度大于95％(参见图3a，图3b，图3c)。
实施例3
配置65g/L的全脱乙酰化的壳寡糖水溶液，加入乙醇进行沉淀，使乙醇最终浓度为30％(体积分数)；而后以5000g离心10min，收集沉淀，冷冻干燥，得聚合度主要为8-10的全脱乙酰化壳寡糖样品(参见图1)。称取所得到全脱乙酰化壳寡糖50mg，用4mL pH＝5的乙酸钠缓冲溶液溶解后，用填料为Bio-gel P10的凝胶排阻色谱柱进行分离纯化，洗脱液为pH＝5的乙酸缓冲液溶,流速为0.5mL/min，通过示差折光检测器检测洗脱液，收集检测到的三个分离组分(参见图2，流出时间分别为1720min，1790min，1855min)，将收集的三个组分分别经凝胶排阻色谱Sephadex G10进行脱盐，旋转蒸发浓缩后，即得到式I所示的高聚合度的单一壳寡糖：
Figure BDA0003335846080000042
式I中n＝8,9或10。
将上述所得浓缩液用HPLC检测其纯度，其中全脱乙酰化壳八糖纯度大于97％，全脱乙酰化壳九糖纯度大于96％，全脱乙酰化壳十糖纯度大于95％(参见图3a，图3b，图3c)。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将全脱乙酰化的壳寡糖溶于水，制成壳寡糖溶液，然后加入乙醇进行沉淀，离心，收集沉淀；其中，加入乙醇的体积占最终溶液体积的比例为30-55％；
(2)将收集的沉淀用乙酸缓冲溶液溶解后，用填料为Bio-gel P10的凝胶排阻色谱柱进行分离纯化，洗脱液为乙酸缓冲溶液，通过示差折光检测器检测流出的洗脱液，收集检测到的三个洗脱液组分；
(3)将所收集的三个洗脱液组分分别经填料为Sephadex G10的凝胶排阻色谱柱进行脱盐，浓缩后即得到单一高聚合度壳寡糖。
2.根据权利要求1所述的一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，其特征在于，制得的单一高聚合度壳寡糖为式I所示：
Figure FDA0003335846070000011
式I中，n＝8，9或10。
3.根据权利要求1所述的一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中制成的壳寡糖溶液的浓度为45-65g/L。
4.根据权利要求1所述的一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述乙酸缓冲溶液为乙酸钠或乙酸铵溶液，浓度为20-100mmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述乙酸缓冲溶液的pH为3-5。
6.根据权利要求1所述的一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，分离纯化时，洗脱液的流速为0.1-0.5mL/min。
7.根据权利要求1所述的一种单一高聚合度壳寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，分离纯化时，收集到的三个洗脱液组分的流出时间分别为1720-1770min，1790-1830min，1855-1895min。
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