CN113831742B - 一种含prp的生物墨水的制备方法及应用 - Google Patents

一种含prp的生物墨水的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了本发明提供了一种含PRP的生物墨水的制备方法，该制备方法包括以下步骤：制备液态水凝胶，所述液态水凝胶包括以下质量百分比的各组分：1％‑30％的明胶，1％‑10％的海藻酸钠；将体积比为9‑36:1的液态水凝胶和PRP充分混匀，所述PRP的质量标准如下：以血小板浓度为准：单采血小板法≥1000×109/L，二次离心法≥1×109/L，即得含PRP的生物墨水；本发明提供的组织类器官的制备方法具有以下优点：(1)在不改变生物墨水的原有理化性能的同时，加入了生物活性成分；(2)在创面治疗中应用的安全性和有效性已得到广泛认可，具有优越的临床应用潜力。

Description

一种含PRP的生物墨水的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物3D打印领域，特别涉及一种含PRP的生物墨水的 制备方法及应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，对维持人体内环境稳态和正常生理功能 具有十分重要的作用，较大皮肤缺损和病理性创面(如糖尿病创面) 通过常规临床消毒和换药，难以达到皮肤功能性无瘢痕愈合。虽然目 前已有多种组织工程皮肤可以用于创面治疗，但是这些产品缺乏个性 化功能，不能满足临床中特殊创面的需求。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种含PRP的生物墨水的 制备方法，该生物墨水经3D打印和交联固化后，可形成特定的三维结 构的水凝胶。
本发明提供的制备方法包括以下步骤：
制备液态水凝胶，所述液态水凝胶包括以下质量百分比的各组分： 1％-30％的明胶，1％-10％的海藻酸钠；
将体积比为9-36:1的液态水凝胶和PRP充分混匀，所述PRP的质 量标准如下：以血小板浓度为准：单采血小板法≥1000×109/L，二次 离心法≥1×109个血小板/mL，即得含PRP的生物墨水。
其中，PRP为富血小板血浆，富血小板血浆(PRP)是通过离心的 方法从血中提取出来的血小板浓缩物，PRP含有高浓度的纤维蛋白，可 以封闭创面和止血，更含有高浓度的血小板，经活化后可以释放出多 种生长因子，促进创面修复和一定程度的再生，PRP还含有大量的白细 胞，在机体验证反应和感染控制方面起重要作用，另外，PRP还含有多 种抑菌蛋白原，这些蛋白可以抑制细菌和真菌生长；本申请在液态水 凝胶中加入的PRP可以为临床患者自体来源的PRP，也可以是低免疫原 性的脐血PRP，本发明将PRP做为生物活性物质，加入生物墨水中，能 够增加生物墨水的功能型和个性化，从而更能满足临床创面治疗的需求；申请人研发过程中发现，PRP在生物墨水中的加入量会影响打印组 织块的性能，如加入的量超过临界值时，会导致生物墨水变烯，难以 成型，无法进行3D打印，即现有技术中的生物墨水在保证其各项性能 的前提下无法加入更多的PRP，而本发明的生物墨水中PRP的量较大 (每5ml生物墨水中可以加入0.125ml-0.5ml的PRP，PRP中的血小板 数量≥1×109个血小板/mL，即每ml生物墨水中含有1×107个血小板 /mL-1×108个血小板/mL)，PRP的添加量显著高于现有技术，更适合 创面治疗的临床需求；且在提高PRP含量的同时并未影响生物墨水的 打印过程和交联效果，本发明中生物墨水的混匀、打印、交联均可以 在床边进行，无需进行多种试剂的反复混合操作，操作简单方便；而 且操作流程中无需光交联，用到的试剂均无细胞毒性，众所周知，部 分光交联剂被证实有致癌作用、皮肤接触毒性和生殖毒性，总之，本 发明具备临床应用的可行性和安全性。
进一步地，液态水凝胶的制备方法为：取明胶和海藻酸钠加入PBS 缓冲溶液中密封，在水浴条件下搅拌均匀，即得液态水凝胶。
进一步地，将液态水凝胶、PBS缓冲液和PRP充分混匀具体是在无 菌环境中，利用无菌注射器和三通装置将液态水凝胶、PBS缓冲液和 PRP混匀。
本发明还提供了一种含PRP的生物墨水，由以上任意一种制备方 法制备而成。
本发明还提供了含PRP的生物墨水在3D打印中的应用。
本发明还提供了应用含PRP的生物墨水进行3D打印的方法，该方 法包括以下步骤：将含PRP的生物3D打印墨水装入打印筒，连接气压 装置并装入打印臂，调整打印机参数，开始打印，打印完成后利用交 联剂进行交联，即得含PRP的3D打印组织。
以上方法制得的3D打印组织具有特定的形状。
进一步地，打印参数为：气压0.05-0.3MPa，针头移动速度 5.0-15.0cm/s，打印筒温度0-10℃，打印平台温度0-10℃。
进一步地，交联剂为2.5％-10％氯化钙溶液，交联温度为0-10℃。
进一步地，所述交联剂的制备方法是将氯化钙固体粉末溶解于去 离子水中搅拌至充分溶解，即得交联剂。
本发明提供的含有PRP的生物墨水具有以下优点：
(1)本发明提供了含有PRP的生物墨水，具有低温固化和剪切变 稀性质，并可以用氯化钙溶液进行交联，总之在不改变生物墨水的原 有理化性能的同时，加入了更多的生物活性成分；
(2)明胶-海藻酸钠具有良好的生物安全性和生物相容性；其在 创面治疗中应用的安全性和有效性已得到广泛认可，因此，本发明提 供的含有PRP的生物墨水具有优越的临床应用潜力，能够达到皮肤功 能性无瘢痕愈合。
附图说明
图1为用于生物3D打印的含PRP的生物墨水的外观图(1为明胶- 海藻酸钠生物墨水，2、3、4分别是含PRP体积比为1:36、1:18、1:9 的明胶-海藻酸钠生物墨水)；
图2为利用含PRP的生物墨水进行生物3D打印的示意图；
图3为CCK-8检测结果；
图4为利用含PRP的生物3D打印组织的外观。(A)为对照例1 生物墨水打印得到的生物3D打印墨水，(B)为实施例3的生物墨水 打印得到的含PRP的生物3D打印墨水；
图5为利用含PRP的生物3D打印组织进行裸鼠背部创面治疗的实 验结果；Group A为对照例1组，Group B为实施例3组，Control为 不用生物3D打印组织进行治疗组。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的， 不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明 中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明 中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
实施例1
称取0.5g的明胶和0.05g海藻酸钠置于小烧杯中，加入4.5ml PBS 缓冲溶液，密封烧杯，在40℃条件下的水浴锅内溶解30min后，用玻 璃棒柔和搅拌，至溶液均一无溶质颗粒，即得液态水凝胶；将该水凝 胶于高压蒸汽灭菌锅中121℃条件下处理30min，灭菌完成后室温下平 衡1h，而后密封4℃冷藏保存；
将2.5g氯化钙固体粉末溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌至充 分溶解，经过高压蒸汽灭菌后，密封4℃保存，即得交联剂；
将4.5ml无菌明胶-海藻酸钠水凝胶、0.375ml PBS缓冲液和 0.125mlPRP混匀后装入预灌封注射器中，利用无菌三通装置充分混匀， 即得到含PRP的生物墨水(图1的2号生物墨水)；
将含PRP的生物墨水载入打印筒，并装入3D打印机，调节打印喷 头温度为4℃，平台温度为0℃，气压0.15MPa，喷头移动速度8cm/s， 开始打印，打印完成后在0℃条件下用交联剂交联10min，交联完成后 去除交联剂，即得含PRP的生物3D打印墨水；
本发明中所有实施例和对照例均采用相同的PRP，该PRP的质量标 准为：二次离心法，血小板数量≥1×109个血小板/ml。
实施例2
称取0.5g的明胶和0.05g海藻酸钠置于小烧杯中，加入4.5ml PBS 缓冲溶液，密封烧杯，在40℃条件下的水浴锅内溶解30min后，用玻 璃棒柔和搅拌，至溶液均一无溶质颗粒，即得液态水凝胶；将该水凝 胶于高压蒸汽灭菌锅中121℃条件下处理30min，灭菌完成后室温下平 衡1h，而后密封4℃冷藏保存；
将2.5g氯化钙固体粉末溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌至充 分溶解，经过高压蒸汽灭菌后，密封4℃保存，即得交联剂；
将4.5ml无菌明胶-海藻酸钠水凝胶、0.25ml PBS缓冲液和 0.25mlPRP混匀后装入预灌封注射器中，利用无菌三通装置充分混匀， 即得到含PRP的生物墨水(图1的3号生物墨水)；
将含PRP的生物墨水载入打印筒，并装入3D打印机，调节打印喷 头温度为4℃，平台温度为0℃，气压0.20MPa，喷头移动速度6.5cm/s， 开始打印，打印完成后在0℃条件下用交联剂交联10min，交联完成后 去除交联剂，即得含PRP的生物3D打印墨水。
实施例3
称取0.5g的明胶和0.05g海藻酸钠置于小烧杯中，加入4.5ml PBS 缓冲溶液，密封烧杯，在40℃条件下的水浴锅内溶解30min后，用玻 璃棒柔和搅拌，至溶液均一无溶质颗粒，即得液态水凝胶；将该水凝 胶于高压蒸汽灭菌锅中121℃条件下处理30min，灭菌完成后室温下平 衡1h，而后密封4℃冷藏保存；
将2.5g氯化钙固体粉末溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌至充 分溶解，经过高压蒸汽灭菌后，密封4℃保存，即得交联剂；
将4.5ml无菌明胶-海藻酸钠水凝胶和0.5mlPRP装入预灌封注射 器中，利用无菌三通装置充分混匀，即得到含PRP的生物墨水(图1 的4号生物墨水)；
将含PRP的生物墨水载入打印筒，并装入3D打印机，调节打印喷 头温度为4℃，平台温度为0℃，气压0.25MPa，喷头移动速度6.5cm/s， 开始打印，打印完成后在0℃条件下用交联剂交联10min，交联完成后 去除交联剂，即得含PRP的生物3D打印墨水。
对照例1
称取1g的明胶和0.1g海藻酸钠置于小烧杯中，加入10ml PBS缓 冲溶液，密封烧杯，在40℃条件下的水浴锅内溶解30min后，用玻璃 棒柔和搅拌，至溶液均一无溶质颗粒，即得液态水凝胶；将该水凝胶 于高压蒸汽灭菌锅中121℃条件下处理30min，灭菌完成后室温下平衡 1h，而后密封4℃冷藏保存；
将2.5g氯化钙固体粉末溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌至充 分溶解，经过高压蒸汽灭菌后，密封4℃保存，即得交联剂；
将明胶-海藻酸钠水凝胶载入打印筒，并装入3D打印机，调节打 印喷头温度为4℃，平台温度为0℃，气压0.15MPa，喷头移动速度 8cm/s，开始打印，打印完成后在0℃条件下用交联剂交联10min，交 联完成后去除交联剂，即得生物3D打印墨水。
试验例1含PRP的生物墨水的外观观察
取对照例1制得的生物3D打印墨水和实施例1-3制得的含PRP的 生物墨水，观察其外观，结果见图1，可知，未加PRP的生物墨水呈淡 黄色，随着加入PRP含量的增多，生物墨水呈逐渐加深的淡红色，同 时，生物墨水充分混匀后于37℃下放置48h未出现分层现象，可以保 持稳定的凝胶态。
试验例2含PRP的生物墨水的细胞毒性实验
取永生化小鼠成纤维细胞按每孔1×104的浓度接种到96孔板，每 孔加入DMEM完全培养基100ul，于细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后， 弃掉旧培养基，分别加入100ul的DMEM培养基和10ul对照例1的生 物3D打印墨水和实施例3制得的含PRP的生物墨水，于细胞培养箱中 培养48h后，每孔加入10ulCCK-8溶液，再放回培养箱中培养2h，最 后用酶标仪测定450nm处得吸光度，测定细胞存活率，结果见图2，各 组细胞存活率均高于90％，且实施例3的细胞存活率与对照例1的差别 没有统计学意义；表明本发明提供的含PRP的生物墨水无细胞毒性。
试验例3含PRP的生物3D打印组织块的外观观察和力学性能
取对照例1的生物3D打印墨水和实施例3制得的含PRP的生物3D 打印墨水，肉眼观察其外观，并监测其力学性能，结果见图3；各组打 印组织具有相似的打印保真度，且结构稳定，打印结果为20mm×20mm ×2mm的多孔立方体结构，力学性能测定得到对照例1的生物3D打印 墨水和实施例3的含PRP的生物3D打印墨水的杨氏模量均大于20KPa。
试验例4利用含PRP的生物3D打印组织块进行创面治疗实验
取裸鼠9只，实验前在每只裸鼠背部用眼科剪造一个直径1cm的 圆形皮肤全层创面，分别取实施例3的含PRP的生物3D打印墨水和对 照例1制得的生物3D打印墨水，敷贴在3只裸鼠背部创面上，并用水 胶体敷料予以覆盖；另外3只裸鼠背部创面仅用水胶体敷料予以覆盖， 创面敷料隔天更换，并于创面治疗后的第1、7和14天观察创面愈合 情况，结果如图4所示，实施例3治疗的第7天创面周围血管化明显， 创面表面完全上皮化，第14天完全愈合，创面收缩不明显；对照例1 治疗的第7天创面表面部分上皮化，第14天可以愈合，但创面收缩明 显；对照组治疗的第7天未见上皮化，第14天创面未愈合。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非 限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通 技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利 要求范围当中。

Claims (9)

1.一种含PRP的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
制备液态水凝胶，所述液态水凝胶是将0.5g的明胶和0.05g海藻酸钠溶解于4.5mlPBS缓冲溶液中；
将体积比为9-36:1的液态水凝胶和PRP充分混匀，所述PRP的质量标准如下：以血小板浓度为准：单采血小板法≥1000×109个血小板/mL，二次离心法≥1×109个血小板/mL，即得含PRP的生物墨水。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液态水凝胶的制备方法为：取明胶和海藻酸钠加入PBS缓冲溶液中密封，在水浴条件下搅拌均匀，即得液态水凝胶。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将液态水凝胶、PBS缓冲液和PRP充分混匀具体是在无菌环境中，利用无菌注射器和三通装置将液态水凝胶、PBS缓冲液和PRP混匀。
4.一种含PRP的生物墨水，由权利要求1-3任一所述的制备方法制备而成。
5.权利要求4所述的含PRP的生物墨水在3D打印中的应用。
6.应用权利要求4所述的含PRP的生物墨水进行3D打印的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将含PRP的生物3D打印墨水装入打印筒，连接气压装置并装入打印臂，调整打印机参数，开始打印，打印完成后利用交联剂进行交联，即得含PRP的特定形状的3D打印组织。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述打印机参数为：气压0.05-0.3MPa，针头移动速度5.0-15.0cm/s，打印筒温度0-10℃，打印平台温度0-10℃。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述交联剂为2.5％-10％氯化钙溶液，交联温度为0-10℃。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述交联剂的制备方法是将氯化钙固体粉末溶解于去离子水中搅拌至充分溶解，即得交联剂。
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