CN113826899A - 一种增强人体免疫力的营养片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强人体免疫力的营养片及其制备方法，属于保健食品技术领域，该营养片由氨基葡萄糖、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锰、碳酸钙、硫酸软骨素、维生素C、透明质酸钠、牡蛎粉、海参粉、蛋黄卵磷脂、辅料以及包衣粉组成，且经粉碎、过筛、称量、混合、制软材、制粒、干燥、整粒、混合、压片、包衣、挑选、包装等工艺步骤制成。本发明将硫酸软骨素与氨基葡萄糖配合使用，海参粉与牡蛎粉配合使用，同时辅以碳酸钙、透明质酸、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸锰、维生素C和蛋黄卵磷脂制成营养片，可以增强机体免疫力、增加骨密度，改善身体的健康状况。

Description

一种增强人体免疫力的营养片及其制备方法
技术领域
本发明涉及保健食品技术领域，特别涉及一种增强人体免疫力的营养片及其制备方法。
背景技术
免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)，处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞，以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力，是人体识别和排除“异己”的生理反应。人体免疫力功能低下，会对机体健康产生极为不利的影响，使多种传染病、非传染疾病的发病率和死亡率提高。因此，增强免疫力，提高人体对病原的抵抗能力，是人体保持健康的重要手段。
近年来，随着人们健康意识的不断提升，越来越多的人希望通过保健食品来增强机体的免疫力，改善身体的健康状况。目前，虽然用于增强免疫力的保健食品的种类繁多，但这些产品普遍存在功能单一，效果不明显的缺陷。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种增强人体免疫力的营养片及其制备方法，该营养片可以增强免疫力，提高骨密度，改善身体的健康状况。
本发明采用的技术方案是：
一种增强人体免疫力的营养片，按照重量份数计，包括以下原料：
氨基葡萄糖20-30份、葡萄糖酸锌0.1-0.5份、葡萄糖酸钙1-3份、葡萄糖酸锰0.3-0.5份、碳酸钙15-20份、硫酸软骨素1-3份、维生素C 0.5-1份、透明质酸钠0.5-1份、牡蛎粉3-5份、海参粉3-5份、蛋黄卵磷脂3-5份。
在本申请公开的增强人体免疫力的营养片中，所述原料还包括辅料，所述辅料按照重量份数计，具有微晶纤维素10-15份、玉米淀粉3-5份以及硬质酸镁 0.6-1份。
在本申请公开的增强人体免疫力的营养片中，所述原料还包括包衣粉，所述包衣粉按照重量份数计，具有羟丙基甲基纤维素0.5-0.8份、二氧化钛0.2-0.5 份、滑石粉0.1-0.3份、聚乙二醇60000.05-0.1份。
在本申请公开的增强人体免疫力的营养片中，所述氨基葡萄糖为氨基葡萄糖盐酸盐或氨基葡萄糖硫酸盐。
在本申请公开的增强人体免疫力的营养片中，所述营养片为口服制剂，所述口服制剂为片剂。
氨基葡萄糖是人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的物质，发生骨关节炎时，其合成受阻或不足，会导致软骨基质软化失去弹性，关节滑液减少，软骨磨损及破坏，因此，氨基葡萄糖可以从根本上阻断骨关节炎的发生且无明显副作用。硫酸软骨素是由动物喉骨、鼻软骨、气管、骨腱、韧带等软骨组织中提取的动物粘多糖，具有成骨作用，还可以将关节液吸入软骨从而保护软骨。本发明将硫酸软骨素与氨基葡萄糖配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效，可以从根本改善关节问题。
葡萄酸钙和葡萄酸锌均为营养强化剂，用于补充人体的钙含量和锌含量。葡萄糖酸钙可降低毛细血管渗透性，增加致密度，维持神经与肌肉的正常兴奋性，加强心肌收缩力，并有助于骨质形成。葡萄糖酸锌可以增强人体免疫力，人体体内的锌含量如果长期处于缺乏状态，就会引起疾病，只有锌量充足才能有效保证胸腺发育，正常分化淋巴细胞，促进细胞免疫功能。
葡萄糖酸锰可激活大量的酶，参与机体代谢活动，促进人体生长和正常的成骨作用，缺乏时可引起生长迟缓，生殖功能变阻，是良好的食品强化剂。
透明质酸是一种细胞外基质的重要构成成分，它在组织发育、重塑及修复中起着独特的信号作用。不同分子量大小的透明质酸片段在组织损伤后会发挥多重作用，特别是在诱导炎症、抗细胞凋亡、细胞存活、细胞增殖、细胞迁移和血管生成等方面有重要作用，并且在提高人体免疫力、改善免疫力缺乏症状方面功效显著。
生物碳酸钙为天然来源的钙源，更为安全且更适合人体消化吸收。生物碳酸钙的含钙量高，钙是骨骼及骨关节的重要组成部分，可增加骨密度及强度，预防骨质疏松。
维生素C是维持正常人体代谢和生理功能所必不可少的物质。维生素C的生理功能主要有抗氧化作用、促进结缔组织形成、解毒、促进神经递质以及肉碱的合成、促进铁吸收、提高免疫功能、降低动脉硬化、预防和控制炎症等。维生素C可通过使免疫功能和体内抗感染细胞的细菌活性的增加来帮助免疫系统抵抗病毒和细菌感染，因此维生素C与人体免疫系统密切相关。
海参属棘皮动物门海参纲，是海洋中重要的食物和药物资源，具有增强免疫力、补肾益精、养血润燥、止血消炎的功效，因此海参可以用来开发具有抗疲劳、提高免疫力功能的新型保健食品。牡蛎是名贵海珍，富含维生素及矿物质，特别是硒、锌等微量元素含量丰富，有助于机体各系统功能进入最佳运行状态，并可加速病体康复、防老抗衰。本发明将海参粉与牡蛎粉配合，可明显提高机体免疫力、有效缓解体力疲劳。
蛋黄卵磷脂由蛋黄中分离获得，属动物胚胎磷脂，含有人体不可缺少的营养物质包括微量元素。蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒再透过血管壁被组织利用，可降低血浆中胆固醇沉积的危险，可以促进脑功能、预防老年痴呆、保护心脑血管。
本发明的营养片将硫酸软骨素与氨基葡萄糖配合使用，海参粉与牡蛎粉配合使用，同时辅以碳酸钙、透明质酸、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸锰、维生素C和蛋黄卵磷脂，可以增强机体免疫力、增加骨密度，改善身体的健康状况。
前述营养片的制备方法，包括如下步骤：
S1.原料的准备，将各种原料超微粉碎，然后过60-100目筛，60Co辐照灭菌后备用，辐照剂量为5kGy；
S2.混料，按重量份数称取葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锰、硫酸软骨素、维生素C、牡蛎粉、海参粉和蛋黄卵磷脂混合8-15min，得混合粉1；按重量份数称取玉米淀粉、碳酸钙、氨基葡萄糖盐酸盐与混合粉1采用分步混合法混合得到混合粉2，总混合时间为20-40min。
S3.制粒，在混合粉2中加入浓度为70-80％的乙醇制成软材，将软材过20 目筛制粒，得湿颗粒；将湿颗粒干燥，过筛，整粒得到干颗粒；
S4.混合压片，按重量份数称取透明质酸钠、微晶纤维素采用等量递增法混合，得混合粉3；将混合粉3与步骤S3中制得的干颗粒混合15-35min，得混合物；按重量份数称取硬脂酸镁与混合物混合5-10min，得总混合物；将总混合物用高速压片机压片，得素片；
S5.包衣，按重量份数称取包衣粉，混合；在包衣粉中加入适量乙醇搅拌均匀配成薄膜包衣液，对素片进行包衣，得薄膜包衣片；
S6.包装，将薄膜包衣片进行挑选，剔除不合格产品，对合格产品进行包装、质检和入库。
在本申请公开的营养片的制备方法中，所述步骤S2中的分步混合法具体为取混合粉1与玉米淀粉混合均匀，再加入碳酸钙混合均匀，最后加入氨基葡萄糖盐酸盐混合均匀，得混合粉2。
在本申请公开的营养片的制备方法中，所述步骤S3中湿颗粒在高效沸腾干燥机中，于60℃条件下进行干燥，至水分≤5％，过20目筛，整粒，得干颗粒。
在本申请公开的营养片的制备方法中，所述步骤S4中的等量递增法混合具体为称取透明质酸钠与等量的微晶纤维素混合至均匀，再加入等量的微晶纤维素混合至均匀，直至混合完毕，得混合粉3。
在本申请公开的营养片的制备方法中，所述步骤S5中包衣粉用70％的乙醇配成薄膜包衣液，包衣时间30-60min。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将硫酸软骨素与氨基葡萄糖配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效，可以从根本改善关节问题。葡萄酸钙和葡萄酸锌均为营养强化剂，用于补充人体的钙含量和锌含量。葡萄糖酸锰可激活大量的酶，参与机体代谢活动，促进人体生长和正常的成骨作用。透明质酸在提高人体免疫力、改善免疫力缺乏症状方面功效显著。碳酸钙可增加骨密度及强度，预防骨质疏松。维生素C可通过使免疫功能和体内抗感染细胞的细菌活性的增加来帮助免疫系统抵抗病毒和细菌感染。将海参粉与牡蛎粉配合，可明显提高机体免疫力、有效缓解体力疲劳。蛋黄卵磷脂可以促进脑功能、预防老年痴呆、保护心脑血管、无毒副作用。
(2)经口给予小鼠0.333g/kg.bw、0.667g/kg.bw、2.000g/kg.bw剂量的营养片30天，0.667g/kg.bw和2.000g/kg.bw剂量能增加小鼠迟发型变态反应能力、抗体生成细胞数和NK细胞活性，与对照组比较差异具有显著性(P<0.05或 P<0.01)；对小鼠体重增长、脾脏/体重比值、胸腺/体重比值、血清半数溶血值、单核-巨噬细胞碳廓清能力、巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力和淋巴细胞转化能力无明显影响(P>0.05)。提示该样品具有增强免疫力的功能。
(3)以0.333g/kg·bw、0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw剂量的营养片给大鼠灌胃三个月后的结果表明：高剂量组大鼠的末期身长及净增加值、股骨中心及远心端的骨密度、股骨钙含量及总钙量、摄入钙、粪钙含量显著高于低钙对照组，表观吸收率和钙存留率显著低于低钙对照组，差异具有显著性(P<0.01 或P<0.05)；中剂量组大鼠的摄入钙和粪钙排出量显著高于低钙对照组，钙表观吸收率和存留率显著低于低钙对照组，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)；低剂量组大鼠的粪钙排出量显著高于低钙对照组，差异具有显著性(P<0.01)。高剂量实验组大鼠的各项指标与相应的碳酸钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。提示营养片具有增加大鼠骨密度的作用。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。
下面对本发明的实施例进行详细说明。
实施例1
一种增强人体免疫力的营养片，该营养片为口服制剂，口服制剂具体为片剂，片剂规格为1g/片。营养片按照重量份数计，包括以下原料：
氨基葡萄糖(氨基葡萄糖盐酸盐或氨基葡萄糖硫酸盐)20份、葡萄糖酸锌0.1份、葡萄糖酸钙1份、葡萄糖酸锰0.3份、碳酸钙15份、硫酸软骨素1份、维生素C 0.5份、透明质酸钠0.5份、牡蛎粉3份、海参粉3份、蛋黄卵磷脂3 份。
辅料：微晶纤维素10份、玉米淀粉3份以及硬质酸镁0.6份。
包衣粉：羟丙基甲基纤维素0.5份、二氧化钛0.2份、滑石粉0.1份、聚乙二醇60000.05份。
该营养片的制备方法，包括如下步骤：
S1.原料的准备，将各种原料超微粉碎，然后过60目筛，60Co辐照灭菌后备用，辐照剂量为5kGy。
S2.混料，按重量份数称取葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锰、硫酸软骨素、维生素C、牡蛎粉、海参粉和蛋黄卵磷脂混合8min，得混合粉1。按重量份数称取玉米淀粉、碳酸钙、氨基葡萄糖盐酸盐与混合粉1采用分步混合法混合得到混合粉2，总混合时间为20min，具体为取混合粉1与玉米淀粉混合均匀，再加入碳酸钙混合均匀，最后加入氨基葡萄糖盐酸盐混合均匀，得混合粉2。
S3.制粒，在混合粉2中加入浓度为70％的乙醇制成软材，将软材过20目筛制粒，得湿颗粒。将湿颗粒在高效沸腾干燥机中，于60℃条件下进行干燥，至水分≤5％，过20目筛整粒，得干颗粒。
S4.混合压片，按重量份数称取透明质酸钠、微晶纤维素采用等量递增法混合，得混合粉3，具体为称取透明质酸钠与等量的微晶纤维素混合至均匀，再加入等量的微晶纤维素混合至均匀，直至混合完毕，得混合粉3。再将混合粉3与步骤S3中制得的干颗粒混合15min，得混合物。按重量份数称取硬脂酸镁与混合物混合5min，得总混合物。将总混合物用高速压片机压片，得素片。
S5.包衣，按重量份数称取包衣粉，混合。包衣粉用70％的乙醇配成薄膜包衣液，对素片进行包衣，包衣时间30min，得薄膜包衣片；
S6.包装，将薄膜包衣片进行挑选，剔除不合格产品，对合格产品进行包装、质检和入库。
制备过程中，所用设备名称及型号：高速压片机，ZPT-16；高效沸腾干燥机，GFG-120；多向三维运动混合机，SYH-200。
实施例2
一种增强人体免疫力的营养片，该营养片为口服制剂，口服制剂具体为片剂，片剂规格为1g/片。营养片按照重量份数计，包括以下原料：
氨基葡萄糖(氨基葡萄糖盐酸盐或氨基葡萄糖硫酸盐)25份、葡萄糖酸锌 0.3份、葡萄糖酸钙2份、葡萄糖酸锰0.4份、碳酸钙18份、硫酸软骨素2份、维生素C 0.8份、透明质酸钠0.8份、牡蛎粉4份、海参粉4份、蛋黄卵磷脂4 份。
辅料：微晶纤维素12份、玉米淀粉4份以及硬质酸镁0.8份。
包衣粉：羟丙基甲基纤维素0.7份、二氧化钛0.3份、滑石粉0.2份、聚乙二醇60000.08份。
该营养片的原料均来自于市售，且符合《国家药品标准》、《食品安全国家标准》、《中华人民共和国药典》的规定。
该营养片的制备方法，包括如下步骤：
S1.原料的准备，将各种原料超微粉碎，然后过80目筛，60Co辐照灭菌后备用，辐照剂量为5kGy。
S2.混料，按重量份数称取葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锰、硫酸软骨素、维生素C、牡蛎粉、海参粉和蛋黄卵磷脂混合12min，得混合粉1。按重量份数称取玉米淀粉、碳酸钙、氨基葡萄糖盐酸盐与混合粉1采用分步混合法混合得到混合粉2，总混合时间为30min，具体为取混合粉1与玉米淀粉混合均匀，再加入碳酸钙混合均匀，最后加入氨基葡萄糖盐酸盐混合均匀，得混合粉2。
S3.制粒，在混合粉2中加入浓度为75％的乙醇制成软材，将软材过20目筛制粒，得湿颗粒。将湿颗粒在高效沸腾干燥机中，于60℃条件下进行干燥，至水分≤5％，过20目筛整粒，得干颗粒。
S4.混合压片，按重量份数称取透明质酸钠、微晶纤维素采用等量递增法混合，得混合粉3，具体为称取透明质酸钠与等量的微晶纤维素混合至均匀，再加入等量的微晶纤维素混合至均匀，直至混合完毕，得混合粉3。再将混合粉3与步骤S3中制得的干颗粒混合25min，得混合物。按重量份数称取硬脂酸镁与混合物混合8min，得总混合物。将总混合物用高速压片机压片，得素片。
S5.包衣，按重量份数称取包衣粉，混合。包衣粉用70％的乙醇配成薄膜包衣液，对素片进行包衣，包衣时间45min，得薄膜包衣片；
S6.包装，将薄膜包衣片进行挑选，剔除不合格产品，对合格产品进行包装、质检和入库。
制备过程中，所用设备名称及型号：高速压片机，ZPT-16；高效沸腾干燥机，GFG-120；多向三维运动混合机，SYH-200。
实施例3
一种增强人体免疫力的营养片，该营养片为口服制剂，口服制剂具体为片剂，片剂规格为1g/片。营养片按照重量份数计，包括以下原料：
氨基葡萄糖(氨基葡萄糖盐酸盐或氨基葡萄糖硫酸盐)30份、葡萄糖酸锌 0.5份、葡萄糖酸钙3份、葡萄糖酸锰0.5份、碳酸钙20份、硫酸软骨素3份、维生素C 1份、透明质酸钠1份、牡蛎粉5份、海参粉5份、蛋黄卵磷脂5份。
辅料：微晶纤维素15份、玉米淀粉5份以及硬质酸镁1份。
包衣粉：羟丙基甲基纤维素0.8份、二氧化钛0.5份、滑石粉0.3份、聚乙二醇60000.1份。
该营养片的原料均来自于市售，且符合《国家药品标准》、《食品安全国家标准》、《中华人民共和国药典》的规定。
该营养片的制备方法，包括如下步骤：
S1.原料的准备，将各种原料超微粉碎，然后过100目筛，60Co辐照灭菌后备用，辐照剂量为5kGy。
S2.混料，按重量份数称取葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锰、硫酸软骨素、维生素C、牡蛎粉、海参粉和蛋黄卵磷脂混合15min，得混合粉1。按重量份数称取玉米淀粉、碳酸钙、氨基葡萄糖盐酸盐与混合粉1采用分步混合法混合得到混合粉2，总混合时间为40min，具体为取混合粉1与玉米淀粉混合均匀，再加入碳酸钙混合均匀，最后加入氨基葡萄糖盐酸盐混合均匀，得混合粉2。
S3.制粒，在混合粉2中加入浓度为80％的乙醇制成软材，将软材过20目筛制粒，得湿颗粒。将湿颗粒在高效沸腾干燥机中，于60℃条件下进行干燥，至水分≤5％，过20目筛整粒，得干颗粒。
S4.混合压片，按重量份数称取透明质酸钠、微晶纤维素采用等量递增法混合，得混合粉3，具体为称取透明质酸钠与等量的微晶纤维素混合至均匀，再加入等量的微晶纤维素混合至均匀，直至混合完毕，得混合粉3。再将混合粉3与步骤S3中制得的干颗粒混合35min，得混合物。按重量份数称取硬脂酸镁与混合物混合10min，得总混合物。将总混合物用高速压片机压片，得素片。
S5.包衣，按重量份数称取包衣粉，混合。包衣粉用70％的乙醇配成薄膜包衣液，对素片进行包衣，包衣时间60min，得薄膜包衣片；
S6.包装，将薄膜包衣片进行挑选，剔除不合格产品，对合格产品进行包装、质检和入库。
制备过程中，所用设备名称及型号：高速压片机，ZPT-16；高效沸腾干燥机，GFG-120；多向三维运动混合机，SYH-200。
实施例4
本发明实施例2所制备的营养片进行增强免疫力功能试验。
1.材料和方法
1.1样品
实施例2所制备的营养片，人体口服推荐量为每日2次，每次2片，成人体重按60kg计算，折合计量为0.0667g/kg·bw。
1.2实验动物与分组
SPF级昆明种雌性小鼠200只，体重为18g～22g，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2009-0012。每40只分为1组，共五组。免疫I组，进行碳廓清实验；免疫II组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；免疫III组，进行迟发型变态反应实验；免疫IV组，进行脏体比值、半数溶血值(HC50)和抗体生成细胞数的测定；免疫V组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞的活性测定。每大组随机分为对照组、低、中、高剂量组，每组10只小鼠。
1.3实验环境条件
实验条件为屏障环境，温度22～24℃，湿度50％～56％，实验动物使用许可证号为SCXK(湘)2010-0011。
1.4剂量选择及样品处理
根据人体口服推荐量，设营养片的低、中、高剂量分别为0.333g/kg.bw、 0.667g/kg.bw、2.000gkg.bw(分别相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)。分别取样品3.33g、6.67g、20.00g加1％羧甲基纤维素定容至200mL，分别给予受试动物灌胃，每天灌胃一次，灌胃体积为0.2mL/10g·bw，对照组予以等体积的溶剂，连续灌胃至少30天。
1.5主要仪器与试剂
动物台秤、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722S分光光度计、恒温水浴箱、酶标仪、显微镜等。
无菌手术器械、游标卡尺、微量注射器、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板，96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等。
绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank′s液(pH7.2-7.4)、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、ConA，1mol/L的HCl溶液，酸性异丙醇(96mL 异丙醇加1mol/L的HCl溶液4mL)、MTT、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)、补体、 SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂、YAC-1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液、2.5％Triton、印度墨汁、0.1％的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。
1.6实验方法
1.6.1脏器/体重比值测定
称重后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。
1.6.2迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法)
小鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC(0.2mL/每鼠)，致敏后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC(20μL/每鼠)，于注射后24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。
1.6.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank′s液的小平皿中，制成细胞悬液，经200 目筛网过滤。用Hank′s液洗2次，每次离心10分钟(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃二氧化碳孵箱培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL 不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm 波长测定光密度值(OD)。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
1.6.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，制备成压积SRBC。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。5天后，将小鼠处死，取脾，轻轻磨碎，用Hank′s液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在8mL Hank′s 液中。计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，与等量的2倍浓度的Hank′s液(pH7.4) 混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加入用SA缓冲液配制的10％(v/v) SRBC 50μL、20μL脾细胞悬液(5×106个/mL)，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，将用SA缓冲液稀释的补体(1：8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后计数溶血空斑数。
1.6.5半数溶血值(HC50)的测定
每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)SRBC悬液0.2mL进行免疫。 5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为200 倍，取1mL稀释后血清置试管内，依次加入10％(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC 悬液0.5mL，补体1mL(用SA缓冲液按1：8稀释)。另设不加血清的对照管(以 SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000r/min 离心10min，取上清液1mL，加都氏试剂3mL。同时取10％(v/v)SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算：
半数溶血值(HC50)＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值x稀释倍数
1.6.6小鼠碳廓清实验
按体重从小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁(0.1mL/10g)，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，立即加入到2mL Na2CO3溶液中，混匀。以Na2CO3溶液作空白对照，用722S 型分光光度计在600nm波长处比色测光密度值。将小鼠处死，取肝、脾称重，计算吞噬指数a，以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。
1.6.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
每只鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)的鸡红细胞悬液1mL，间隔 30min，颈椎脱臼处死，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min。取出腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗以除去未贴片细胞。晾干，以1：1甲醇-丙酮溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，用蒸馏水漂洗晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬率(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
1.6.8 NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶测定法)
受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank′s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank′s液及8mLHank′s液，1000rpm离心10min，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用台酚兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为2×107个/mL，即为效应细胞；取传代后24h生长良好的YAC-1细胞，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为4× 105个/mL，此为靶细胞。取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50：1)，加入 U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％Triton各100μL；上述各项均设三个平行孔，于37℃， 5％，二氧化碳培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，根据室温反应3～10min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
NK细胞活性＝[(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)]×100％
2结果
2.1营养片对小鼠体重的影响
表1样品增强免疫力功能实验I组小鼠体重
Figure BDA0003236926580000161
表2样品增强免疫力功能实验II组小鼠体重
Figure BDA0003236926580000162
表3样品增强免疫力功能实验III组小鼠体重
Figure BDA0003236926580000163
表4样品增强免疫力功能实验IV组小鼠体重
Figure BDA0003236926580000171
表5样品增强免疫力功能实验V组小鼠体重
Figure BDA0003236926580000172
由表1-5可见，各剂量组实验初期、实验中期、实验末期小鼠体重及实验期间小鼠体重增长与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.2营养片对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响
表6样品对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响
Figure BDA0003236926580000173
由表6可见，经口给予小鼠不同剂量的营养片30天，对小鼠脾脏/体重比值和胸腺/体重比值无显著性(P>0.05)。
2.3营养片对小鼠细胞免疫功能的影响
2.3.1营养片对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
表7样品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
Figure BDA0003236926580000181
由表7可见，经口给予小鼠不同剂量的营养片30天，中、高剂量组小鼠足趾肿胀度大于对照组，差异具有显著性(P＜0.05)。
2.3.2营养片对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力的影响
表8样品对小鼠淋巴细胞转化能力的影响
Figure BDA0003236926580000182
由表8可见，经口给予小鼠不同剂量的营养片30天，各剂量组小鼠淋巴细胞转化能力与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
2.4营养片对体液免疫的影响
2.4.1营养片对小鼠抗体生成细胞数的影响
表9样品对小鼠抗体生成细胞数的影响
Figure BDA0003236926580000183
由表9可见，经口给予小鼠不同剂量的营养片30天，中、高剂量组小鼠能增加小鼠抗体生成细胞数，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。
2.4.2营养片对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
表10样品对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
Figure BDA0003236926580000191
由表10可见，经口给予小鼠不同剂量的营养片30天，各剂量组小鼠半数溶血值与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
2.5营养片对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响
2.5.1营养片对小鼠单核-巨噬细胞吞噬廓清的影响
表11样品对小鼠单核-巨噬细胞吞噬廓清的影响
Figure BDA0003236926580000192
由表11可见，经口给予小鼠不同剂量的营养片30天，各剂量组小鼠单核- 巨噬细胞吞噬廓清能力与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
2.5.2营养片对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响
表12样品对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率的影响
Figure BDA0003236926580000201
表13样品对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数的影响
Figure BDA0003236926580000202
由表12-13可见，经口给予小鼠不同剂量的营养片30天，各剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力未见显著影响，与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
2.6营养片对小鼠NK细胞活性的影响
表14样品对小鼠NK细胞活性的影响
Figure BDA0003236926580000203
由表14可见，经口给予小鼠不同剂量的营养片30天，中、高剂量组小鼠能增强小鼠NK细胞活性，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。
3结论
本实验室条件下，经口给予小鼠0.333g/kg.bw、0.667g/kg.bw、2.000g/kg.bw 剂量的营养片30天，0.667g/kg.bw和2.000g/kg.bw剂量能增加小鼠迟发型变态反应能力、抗体生成细胞数和NK细胞活性，与对照组比较差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)；对小鼠体重增长、脾脏/体重比值、胸腺/体重比值、血清半数溶血值、单核-巨噬细胞碳廓清能力、巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力和淋巴细胞转化能力无明显影响(P>0.05)。提示该样品具有增强免疫力的功能。
实施例5
本发明实施例2所制备的营养片进行增加骨密度功能试验。
1材料和方法
1.1样品
实施例2所制备的营养片，人体口服推荐量为每日2次，每次2片，成人体重按60kg计算，折合计量为0.0667g/kg·bw。
1.2实验动物
SPF级SD雌性大鼠50只，体重为55g～75g，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2009-0012。每10只分为1组，共五组。
1.3实验环境条件
实验条件为屏障环境，温度22～24℃，湿度50％～56％。实验动物使用许可证号为SCXK(湘)2010-0011。
1.4剂量选择及样品处理
根据人体口服推荐量，设营养片低、中、高剂量分别为0.333g/kg·bw、 0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw(分别相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)。
样品配制时，低、中、高剂量分别取营养片6.66g、13.34g、40.00g加1％羧甲基纤维素至200mL。设置碳酸钙对照组和低钙对照组，并予以等体积的1％羧甲基纤维素，分别给受试动物灌胃，每天灌胃一次，灌胃体积为1.0mL/100g·bw。
自试验开始，各组动物均单笼饲养，喂饲低钙饲料，灌胃给予各自的受试液，饮用去离子水。共3个月。
1.5实验方法
1.5.1动物生长发育指标：每周称量体重和身长。
1.5.2代谢实验：给予该产品4周后，将大鼠置不锈钢代谢笼中进行三天代谢实验，收集72小时粪、尿和饲料样品，用EDTA滴定法测定钙含量。
1.5.3股骨骨密度测定：实验结束时，断头处死大鼠，剥离右股骨，经105℃烤箱中烤至恒重，冷却至室温后，测量股骨中点处和远心端的骨密度。
1.5.4骨钙含量的测定：称量股骨的总重量后，用EDTA滴定法测定。
1.6结果判定
给予受试物组的骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组，且与相同剂量碳酸钙对照组相比没有显著差异，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可判定该受试物具有增加骨密度的作用。
2结果
2.1营养片对大鼠体重的影响
表15样品对大鼠体重的影响
Figure BDA0003236926580000221
结果见表15，各实验组大鼠的初始、中期和末期体重及其净增加值与低钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)；高剂量实验组大鼠的初始、中期和末期体重及其净增加值与碳酸钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.2营养片对大鼠身长的影响
表16样品对大鼠身长的影响
Figure BDA0003236926580000231
结果见表16，各实验组大鼠的起始和中期身长与低钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)；高剂量组和碳酸钙对照组大鼠末期身长及其净增值与低钙对照组比较，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)；高剂量实验组大鼠的初始、中期和末期身长及其净增值与碳酸钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.3营养片对大鼠股骨长度和骨密度的影响
表17样品对大鼠股骨长度和骨密度的影响
Figure BDA0003236926580000232
结果见表17，碳酸钙对照组和高剂量组股骨中心和远心端骨密度显著大于低钙对照组，差异具有显著性(P<0.05)；高剂量组大鼠的股骨长度、中心和远心端骨密度与相应的碳酸钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.4营养片对大鼠股骨重量和钙含量的影响
表18样品对大鼠股骨重量和钙含量的影响
Figure BDA0003236926580000233
结果见表18，碳酸钙对照组和高剂量组大鼠的股骨含量及总钙量显著大于低钙对照组，差异具有显著性(P<0.05)；高剂量组大鼠的股骨重量、钙含量及总钙量与相应的碳酸钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.5营养片对大鼠摄入钙、粪钙和尿钙的影响
表19样品对大鼠摄入钙、粪钙和尿钙的影响
Figure BDA0003236926580000241
结果见表19，高剂量组大鼠的摄入钙、粪钙和尿钙排出量与相应的碳酸钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。碳酸钙对照组和中、高剂量组大鼠摄入钙显著高于低钙对照组(P<0.01或P<0.05)；碳酸钙对照组和低、中、高剂量组大鼠的粪钙排出量显著高于低钙对照组(P<0.01)；碳酸钙对照组大鼠的尿钙排出量显著高于低钙对照组(P<0.05)。
2.6营养片对大鼠表吸收率和钙存留率的影响
表20样品对大鼠表吸收率和钙存留率的影响
Figure BDA0003236926580000242
表观吸收率(％)＝(摄入钙-粪钙)/摄入钙×100
钙存留率(％)＝(摄入钙-粪钙-尿钙)/摄入钙×100
结果见表20，高剂量组钙的表观吸收率和存留率与相应的碳酸钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。碳酸钙对照组和中、高剂量实验组大鼠的表观吸收率和钙存留率显著低于低钙对照组(P<0.01或P<0.05)。
3结论
本实验条件下，以0.333g/kg·bw、0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw剂量的营养片给大鼠灌胃三个月后的结果表明：高剂量组大鼠的末期身长及净增加值、股骨中心及远心端的骨密度、股骨钙含量及总钙量、摄入钙、粪钙含量显著高于低钙对照组，表观吸收率和钙存留率显著低于低钙对照组，差异具有显著性 (P<0.01或P<0.05)；中剂量组大鼠的摄入钙和粪钙排出量显著高于低钙对照组，钙表观吸收率和存留率显著低于低钙对照组，差异具有显著性(P<0.01或 P<0.05)；低剂量组大鼠的粪钙排出量显著高于低钙对照组，差异具有显著性 (P<0.01)。高剂量实验组大鼠的各项指标与相应的碳酸钙对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。提示营养片具有增加大鼠骨密度的作用。

Claims (10)

1.一种增强人体免疫力的营养片，其特征在于，按照重量份数计，包括以下原料：
氨基葡萄糖20-30份、葡萄糖酸锌0.1-0.5份、葡萄糖酸钙1-3份、葡萄糖酸锰0.3-0.5份、碳酸钙15-20份、硫酸软骨素1-3份、维生素C 0.5-1份、透明质酸钠0.5-1份、牡蛎粉3-5份、海参粉3-5份、蛋黄卵磷脂3-5份。
2.根据权利要求1所述的增强人体免疫力的营养片，其特征在于，所述原料还包括辅料，所述辅料按照重量份数计，具有微晶纤维素10-15份、玉米淀粉3-5份以及硬质酸镁0.6-1份。
3.根据权利要求1所述的增强人体免疫力的营养片，其特征在于，所述原料还包括包衣粉，所述包衣粉按照重量份数计，具有羟丙基甲基纤维素0.5-0.8份、二氧化钛0.2-0.5份、滑石粉0.1-0.3份、聚乙二醇6000 0.05-0.1份。
4.根据权利要求1所述的增强人体免疫力的营养片，其特征在于，所述氨基葡萄糖为氨基葡萄糖盐酸盐或氨基葡萄糖硫酸盐。
5.根据权利要求1所述的增强人体免疫力的营养片，其特征在于，所述营养片为口服制剂，所述口服制剂为片剂。
6.一种增强人体免疫力的营养片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.原料的准备，将各种原料超微粉碎，然后过60-100目筛，60Co辐照灭菌后备用，辐照剂量为5kGy；
S2.混料，按重量份数称取葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锰、硫酸软骨素、维生素C、牡蛎粉、海参粉和蛋黄卵磷脂混合8-15min，得混合粉1；按重量份数称取玉米淀粉、碳酸钙、氨基葡萄糖盐酸盐与混合粉1采用分步混合法混合得到混合粉2，总混合时间为20-40min；
S3.制粒，在混合粉2中加入浓度为70-80%的乙醇制成软材，将软材过20目筛制粒，得湿颗粒；将湿颗粒干燥，过筛，整粒得到干颗粒；
S4.混合压片，按重量份数称取透明质酸钠、微晶纤维素采用等量递增法混合，得混合粉3；将混合粉3与步骤S3中制得的干颗粒混合15-35min，得混合物；按重量份数称取硬脂酸镁与混合物混合5-10min，得总混合物；将总混合物用高速压片机压片，得素片；
S5.包衣，按重量份数称取包衣粉，混合；在包衣粉中加入适量乙醇搅拌均匀配成薄膜包衣液，对素片进行包衣，得薄膜包衣片；
S6.包装，将薄膜包衣片进行挑选，剔除不合格产品，对合格产品进行包装、质检和入库。
7.根据权利要求6所述的增强人体免疫力的营养片的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的分步混合法具体为取混合粉1与玉米淀粉混合均匀，再加入碳酸钙混合均匀，最后加入氨基葡萄糖盐酸盐混合均匀，得混合粉2。
8.根据权利要求6所述的增强人体免疫力的营养片的制备方法，其特征在于， 所述步骤S3中湿颗粒在高效沸腾干燥机中，于60℃条件下进行干燥，至水分≤5%，过20目筛，整粒，得干颗粒。
9.根据权利要求6所述的增强人体免疫力的营养片的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的等量递增法混合具体为称取透明质酸钠与等量的微晶纤维素混合至均匀，再加入等量的微晶纤维素混合至均匀，直至混合完毕，得混合粉3。
10.根据权利要求6所述的增强人体免疫力的营养片的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中包衣粉用70％的乙醇配成薄膜包衣液，包衣时间30-60min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102224896A (zh) * 2011-05-13 2011-10-26 营养屋(成都)生物医药有限公司 用于增加人体免疫力及增加骨密度的保健食品及制备方法
RU2011130943A (ru) * 2011-07-25 2013-01-27 Еврофарм (ЮК) Ко. Лтд Фармацевтическая композиция, обладающая гепатопротекторным, гиполипидемическим, иммуностимулирующим и нормализующим деятельность почек действием и способ ее получения
CN103750399A (zh) * 2014-01-20 2014-04-30 周维官 一种海参蛋白营养健康食品

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