CN113817840B - 柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记及其应用 - Google Patents

柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记，属于分子生物学技术领域，分子标记包括SNP位点，SNP位点位于山羊参考基因组Capra hircus ARS1的29号染色体第23714606位核苷酸，SNP位点具有A或C多态性。利用该分子标记可实现羊绒舒适因子优良性状在柴达木绒山羊中的分子选育。

Description

柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记及其应用。
背景技术
研究发现羊毛织物引起的刺痒感觉主要与织物贴近皮肤的机械刺激相关，而并非过敏性反应。织物引起的刺痒由位于皮肤外层的角皮质层下的机械刺激神经末梢引起，神经生理学研究表明这些神经末梢在0.75mN的平均力值刺激下就会产生痒感。有研究认为织物表面突出的毛羽在弯曲前能够支持足够的力值刺激神经末梢产生痒感；通过计算表明，羊绒织物表面突出2mm的纤维，其纤维的直径为30μm将会产生0.75mN的刺扎力。因此，在羊绒性状测定中引入舒适因子的概念，用舒适系数表示，定义为低于或等于30μm的纤维百分比，舒适系数越高则织物舒适性越好；羊绒舒适因子直接影响到羊绒或加工成品的经济效益。
鉴于目前尚无对羊绒舒适因子相关分子研究，因此，在分子水平进行羊绒舒适因子的基因型选择，对于培育优质、纯合、稳定遗传的柴达木绒山羊群体具有重要意义。
发明内容
本发明公开了柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记，通过对chr29g.23714606的多态性进行鉴定，可为柴达木绒山羊的遗传改良提供理论依据及指导。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记，该分子标记包括SNP位点，SNP位点位于山羊参考基因组Capra hircus ARS1的29号染色体第23714606位核苷酸，SNP位点具有A或C多态性。
柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述SNP位点位于分子标记5’端第322位碱基。
鉴定柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记的引物，包括：
com-OF：5'-TGCACATGTATGCGTCCTC-3'，SEQ ID No.2；
com-OR：5'-GGCAGTTTCTCATTGTTACCAG-3'，SEQ ID No.3；
com-AF：5'-ACTCCCCAGGGAGCTGTGAAGA-3'，SEQ ID No.4；
com-CR：5'-CTGTTAGAGGCATCTCCCAGCCAG-3'，SEQ ID No.5。
上述引物仅为本发明用于扩增分子标记的一种实现方式，在上述引物的基础上，本领域技术人员可以根据需要在其5'端或3'端进行若干碱基的增减，能够实现PCR扩增即可；基于本发明分子标记还可涉及其他引物，能够实现分子标记的扩增检测即可。
上述柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记或上述引物在柴达木绒山羊选育中的应用。
优选地，AA型纯合个体为优势基因型，羊绒舒适度优于CC型纯合个体和AC型杂合体。
利用上述柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记进行分型检测的方法，包括如下步骤：
(1)提取柴达木绒山羊基因组DNA；
(2)以柴达木绒山羊基因组DNA为模板，利用上述引物进行T-ARMS-PCR扩增；
(3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据琼脂糖凝胶电泳结果进行基因型判定：
外引物扩增目的条带898bp；
含有598bp特征条带，不含345bp特征条带为AA型纯合体；
含有345bp特征条带，不含598bp特征条带为CC型纯合体；
同时存在598bp和345bp特征条带为AC型杂合体。
通过建立T-ARMS-PCR检测方法，使用常规仪器设备和分子手段即可进行分子标记检测，操作简单方便。
优选地，扩增体系为：
DNA模板2μL，引物com-OF、com-OR各0.2μL，引物com-AF、com-CR各0.3μL，rTaq PCRMix 10μL，ddH2O补齐至20μL；
其中，com-OF、com-OR、com-AF、com-CR工作浓度均为10μM。
优选地，扩增程序为：
预变性98℃、2min；
变性98℃、15s，退火56℃、30s，延伸72℃、45s，35个循环；
72℃延伸5min。
综上所述，本发明公开了柴达木绒山羊羊绒舒适因子性状相关分子标记chr29g.23714606，其可信度高，AA型纯合个体为优势基因型，羊绒舒适度优于CC型纯合个体和AC型杂合体，进而为柴达木绒山羊的分子选育提供依据。
附图说明
图1所示为羊绒舒适因子显著相关SNP标记的曼哈顿图；
图2所示为外引物PCR及T-AMRS-PCR的扩增产物部分琼脂糖凝胶电泳图；
其中，A为外引物PCR扩增结果；
B为T-AMRS-PCR扩增结果；
图3所示为外引物对柴达木绒山羊基因组DNA进行PCR扩增的扩增产物部分Sanger测序结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记的筛选
1、试验材料选择
选取自青海省海西州境内的都兰、乌兰、德令哈、格尔木、大柴旦五个地区的柴达木绒山羊群体33184头，在柴达木绒山羊体左侧肩胛骨后缘10cm和体中线交叉的部位，用弯剪贴皮肤剪取直径为3cm大小的绒毛，密封袋保存，记录好羊号、性别等相关信息。
采用光学纤维直径分析仪(Optical-based Fibre Diameter Analyser/OFDA2000)测定山羊绒毛直径，舒适因子。每个样品测量三次取均值作为最终测量结果记录备用。
选取五个地区各4只山羊的羊绒舒适因子记录作为示例，记录信息包括测定个体编号、测定批次、年龄、地区，详情见表1。
表1部分采样样本信息
2、组织DNA提取
数据清洗后，选取测定了绒性状表型的3512只柴达木绒山羊个体，采集耳组织样品，放置于装有70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。使用磁珠法提取耳组织基因组DNA(长春市志昂生物科技有限公司)。
3、柴达木绒山羊简化基因组测序分型
利用简化基因组测序技术(Restriction-site associated DNA sequencing,RAD-seq)，按照MGIEasy简化基因组文库制备试剂盒标准流程进行建库，采用BGISEQ-500测序平台对柴达木绒山羊耳组织样提取的基因组DNA信息进行PE100测序。
原始测序数据下机后，根据barcode序列抽取个体测序数据，并过滤掉每个个体低质量测序数据，下一步采用软件BWA(Li,Durbin,2009)将过滤后的高质量测序数据比对到国内山羊参考基因组(Capra hircus ARS1)序列上；下一步采用软件samtools(Version：0.1.18)进行变异位点检测，得到7204221个SNP-Indel标记；下一步采用软件vcftools(Version：0.1.13)，滤除in-del位点、滤除多等位基因位点、按照最小等位基因频率为0.05(maf＝0.05)、SNP检出率为0.75(snp call rate＝0.75)、哈代温伯格平衡系数为10-6(hwe＝10-6)的过滤条件进行过滤，过滤后得到SNP标记共138005个；下一步采用软件Beagle对基因型缺失位点进行填充，填充完毕后按照上一步的过滤标准再次过滤，最终得到134300个高质量SNP标记备用。
4、柴达木绒山羊羊绒舒适因子的全基因组关联分析(GWAS)
使用软件EMMAX对柴达木绒山羊羊绒舒适因子进行全基因组关联分析，分析模型如下：
y＝Xb+Zu+m+e
模型中y表示舒适因子记录值，X表示固定效应关联矩阵，b表示为固定效应向量，固定效应包括批次、地区、年龄和测试人，Z表示加性遗传效应关联矩阵，u表示个体加性遗传效应向量，e表示残差，G表示基因组亲缘关系矩阵，I表示单位矩阵，/>分别代表加性遗传效应方差和残差方差，m表示SNP标记效应。
GWAS分析结果显示，与柴达木绒山羊羊绒舒适因子性状相关的SNP标记位于山羊基因组参考序列的第29号染色体上第23714606核苷酸位点，具有A/C多态性(chr29g.23714606A/C)，并且该位点达到染色体显著水平(P＝4.67*10-6)(图1)。
实施例2柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记的多因素方差分析
以实施例1中的SNP位点chr29g.23714606A/C为基础，在试验群3512只柴达木山羊中，采用R软件的aov()函数进行多因素方差分析，研究chr29g.23714606A/C核苷酸位点的不同基因型对柴达木绒山羊羊绒舒适因子的影响。
分析模型如下：
Yijklm＝μ+Bi+Aj+Ck+Tl+Mm+eijklm
其中，Yijklm为柴达木绒山羊羊绒舒适因子；μ为平均值；Bi为第i个测定批次；Aj为第j个年龄效应；Ck为第k个地区效应；Tl为第l个测定人员效应；Mm为第m个SNP的基因型效应；eijklm为随机残差。
由表2可知，在3512只试验柴达木绒山羊群体中，chr29g.23714606A/C位点呈现AA基因型柴达木绒山羊的舒适因子极显著高于CA基因型及AA基因型柴达木绒山羊的羊绒舒适因子(P<0.01)。在以上出现的三种基因型中AA型个体舒适因子最高，其次是CA型，最后是CC型，A等位基因为柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关的优势等位基因，该等位基因频率越高，柴达木绒山羊羊绒舒适度越高。
表2 chr29g.23714606A/C不同基因型对柴达木绒山羊羊绒舒适因子的影响
注：P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。
实施例3柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记的检测
1、引物设计
根据山羊参考基因组(Capra hircus ARS1)29号染色体第23714606位核苷酸上下游碱基序列设计引物如表3所示，委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物。
表3
SEQ ID NO. 引物名称 引物序列5'-3'
2 com-OF TGCACATGTATGCGTCCTC
3 com-OR GGCAGTTTCTCATTGTTACCAG
4 com-AF ACTCCCCAGGGAGCTGTGAAGA
5 com-CR CTGTTAGAGGCATCTCCCAGCCAG
2、外引物PCR扩增
随机选取具有表型的柴达木绒山羊样本，提取基因组DNA作为模板，利用com-OF、com-OR进行PCR扩增；
扩增体系为：
DNA模板2μL，引物com-OF、com-OR各0.2μL，rTaq PCR Mix(TaKaRa TaqTM Version2.0，Code No.R004Q)10μL，ddH2O(高压灭菌的去离子水)补齐至20μL；其中，com-OF、com-OR工作浓度均为10μM。
扩增程序为：
预变性98℃、2min；变性98℃、15s，退火56℃、30s，延伸72℃、45s，35个循环；72℃延伸5min。
3、T-ARMS-PCR扩增
使用与步骤2相同的模板，利用com-OF、com-OR、com-AF、com-CR进行T-ARMS-PCR扩增；
扩增体系为：
DNA模板2μL，引物com-OF、com-OR各0.2μL，引物com-AF、com-CR各0.3μL，rTaq PCRMix(TaKaRa TaqTM Version 2.0，Code No.R004Q)10μL，ddH2O(高压灭菌的去离子水)补齐至20μL；其中，com-OF、com-OR、com-AF、com-CR工作浓度均为10μM。
扩增程序为：
预变性98℃、2min；变性98℃、15s，退火56℃、30s，延伸72℃、45s，35个循环；72℃延伸5min。
4、基因分型
扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。
根据琼脂糖凝胶电泳结果可知，特异性外引物扩增片段大小为898bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1：
TGCACATGTATGCGTCCTCAGAGGAGGCAGCGCTGAACCCTGTGCCTTTGGAAGCTCTGGCTTCCAGGTGACAGACAGATGGTGGGATGGTCCCTTCATCTCAATCAGCAGGCTTTCTGTACTATGAGCAGGCGAGGGAGCCAGGGCGGCACTTCCCAGTGGCCTGGTTACCGGGGAGTTACCACGCAGGCCCCGGAAATCTACACGCACTGTGCTCCCCTGCTGCGTCTGATCCAGCCCTGTTGCAGGTGGGTGAGCATCTGGGCAGCGCTCTGGGCAGGATTCTGACGGTGAGTCAGCACTCCCCAGGGAGCTGTGAAG[A/C]TGGCTGGGAGATGCCTCTAACAGGCTGACTTCCCAGGAAGCTGCTTTTCTGAAGTCGACGCCTGAGAAGACCATGCCCCCTTCCCTGTGCCCATCGTAAGAGCAGAAGACGGCCTGGTCTCATACCAATCCACCCTCAGTCACCCTCAGTCTGATACAGCCAAGATTTGAGGTAGTGACTTTGAGCCTCTCTTAAAAGGAAGCTCTAAATAAAATGCTCTACTGTTAGGTCATTAGAGAGAACCAGCTTTGGGCTGAATATCAAAGCACAGTTACTAACGCCGGATCAGCACAGATGAACTCAACGTTCACTGCCAGTGTCACCTAGCAAGGAGGGCATGGGGCTGGCACCTAATGCAGGCCTGACCCCAAACCTCTGTCCTGTATTCTGCAGGGCCCCCATTATACCAGAGGAAATCAGACAGCCTGCAAATCACATACAATAAAGTATGTGAGTTCAAATGAGCAGGGTTAGCTGCCCATGGGTCTGAGAGAAGACTTCAAGGGCCCCTGCCTCTCCCCCGTGGGGGATGAGACCCACTTCTGGTGGGTCTGCTGGTAACAATGAGAAACTGCC。
T-ARMS-PCR扩增电泳结果中，不含345bp特征条带，含有598bp特征条带为AA型纯合体；不含598bp特征条带，含有345bp特征条带为CC型纯合体(试验群中CC型个体概率较低，取样时未取到)；同时存在598bp和345bp特征条带的为AC型杂合体。
5、序列分析
将外引物PCR扩增产物送华大六合进行Sanger测序，验证T-ARMS-PCR分型结果的准确性。
测序结果用SnapGene软件与GenBank中山羊的相关基因片段序列比对、分析，使用Chromas软件进行峰图判读，结果显示扩增序列与参考序列高度一致，分子标记存在AA、AC和CC型突变，同一样本的峰图结果与T-ARMS-PCR的检测结果相一致。说明本实施例中T-ARMS-PCR检测方法检测准确性可达到分型要求。部分突变位点的Sanger测序峰图见图3。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 海西州农牧业技术推广服务中心（海西州农村经济经营服务站、柴达木生物研究所）
<120> 柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 898
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (322)..(322)
<223> n=a,t
<400> 1
tgcacatgta tgcgtcctca gaggaggcag cgctgaaccc tgtgcctttg gaagctctgg 60
cttccaggtg acagacagat ggtgggatgg tcccttcatc tcaatcagca ggctttctgt 120
actatgagca ggcgagggag ccagggcggc acttcccagt ggcctggtta ccggggagtt 180
accacgcagg ccccggaaat ctacacgcac tgtgctcccc tgctgcgtct gatccagccc 240
tgttgcaggt gggtgagcat ctgggcagcg ctctgggcag gattctgacg gtgagtcagc 300
actccccagg gagctgtgaa gntggctggg agatgcctct aacaggctga cttcccagga 360
agctgctttt ctgaagtcga cgcctgagaa gaccatgccc ccttccctgt gcccatcgta 420
agagcagaag acggcctggt ctcataccaa tccaccctca gtcaccctca gtctgataca 480
gccaagattt gaggtagtga ctttgagcct ctcttaaaag gaagctctaa ataaaatgct 540
ctactgttag gtcattagag agaaccagct ttgggctgaa tatcaaagca cagttactaa 600
cgccggatca gcacagatga actcaacgtt cactgccagt gtcacctagc aaggagggca 660
tggggctggc acctaatgca ggcctgaccc caaacctctg tcctgtattc tgcagggccc 720
ccattatacc agaggaaatc agacagcctg caaatcacat acaataaagt atgtgagttc 780
aaatgagcag ggttagctgc ccatgggtct gagagaagac ttcaagggcc cctgcctctc 840
ccccgtgggg gatgagaccc acttctggtg ggtctgctgg taacaatgag aaactgcc 898
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tgcacatgta tgcgtcctc 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ggcagtttct cattgttacc ag 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
actccccagg gagctgtgaa ga 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
ctgttagagg catctcccag ccag 24

Claims (7)

1.柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记包括SNP位点，所述SNP位点位于所述分子标记5’端第322位碱基。
2.鉴定柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记的引物，其特征在于，包括：
com-OF：5'-TGCACATGTATGCGTCCTC-3'，SEQ ID No.2；
com-OR：5'-GGCAGTTTCTCATTGTTACCAG-3'，SEQ ID No.3；
com-AF：5'-ACTCCCCAGGGAGCTGTGAAGA-3'，SEQ ID No.4；
com-CR：5'-CTGTTAGAGGCATCTCCCAGCCAG-3'，SEQ ID No.5。
3.权利要求1所述的柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记或权利要求2所述的引物在柴达木绒山羊选育中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
AA型纯合个体为优势基因型，羊绒舒适度优于CC型纯合个体和AC型杂合体。
5.利用权利要求1所述柴达木绒山羊羊绒舒适因子相关分子标记进行分型检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取柴达木绒山羊基因组DNA；
(2)以柴达木绒山羊基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物进行T-ARMS-PCR扩增；
(3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据琼脂糖凝胶电泳结果进行基因型判定：
外引物扩增目的条带898bp；
含有598bp特征条带，不含345bp特征条带为AA型纯合体；
含有345bp特征条带，不含598bp特征条带为CC型纯合体；
同时存在598bp和345bp特征条带为AC型杂合体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
扩增体系为：
DNA模板2μL，引物com-OF、com-OR各0.2μL，引物com-AF、com-CR各0.3μL，rTaqPCRMix10μL，ddH2O补齐至20μL；
其中，com-OF、com-OR、com-AF、com-CR工作浓度均为10μM。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
扩增程序为：
预变性98℃、2min；
变性98℃、15s，退火56℃、30s，延伸72℃、45s，35个循环；
72℃延伸5min。
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