CN113813267A - 雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的应用 - Google Patents

雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肠道损伤保护领域，具体是雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的新用途。本发明通过体外试验发现雷公藤甲素能够抑制大田软海绵酸作用造成的血管内皮细胞凋亡，体内实验进一步验证，发现雷公藤甲素具有保护大田软海绵酸作用的小鼠肠道屏障功能的作用，是大田软海绵酸中毒后的理想解毒药物。

Description

雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道 损伤药物中的应用
技术领域
本发明涉及肠道损伤保护领域，具体地说，是雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的新用途。
背景技术
大田软海绵酸(Okadaic acid，以下简称OA，式I)是一种广泛分布于甲壳类动物体内的海洋毒素，属于腹泻型贝类中毒毒素，摄入后会引起胃肠道症状，在沿海地区及长远航期间高发，危害人体健康，造成了严重的经济损失，目前尚缺乏针对该毒素的有效治疗药物。
Figure BDA0003224371900000011
大田软海绵酸(OA)作为蛋白磷酸酶PP1和PP2A的抑制剂，能抑制蛋白磷酸酶活性进而导致蛋白质过磷酸化，诱导细胞凋亡。食用后大田软海绵酸进入消化系统会导致肠道细胞凋亡进而破坏肠道屏障功能而引起腹泻。此外，大田软海绵酸在随血液的循环转运和代谢过程中，还会对体内多种脏器造成损伤，但尚未发现可用于救治的特效药，因此成本低廉，作用效果明显的解毒特效药成为目前研究的焦点。
Figure BDA0003224371900000021
雷公藤甲素是从传统中药雷公藤中提取出来的环氧二萜内酯类化合物(式II)，是雷公藤活性最强的有效成分，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种活性，目前尚未发现雷公藤甲素对大田软海绵酸引起的肠道损伤有保护作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种价格合理，毒副作用小的活性单体——雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸(OA)引起的肠道损伤药物的新用途。
本发明的第一方面，提供雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的应用。
进一步的，所述的大田软海绵酸引起的肠道损伤包括肠道细胞凋亡和肠道屏障破坏。
进一步的，所述的雷公藤甲素在制备抑制大田软海绵酸作用造成的血管内皮细胞凋亡的药物中的应用。
进一步的，所述的雷公藤甲素在制备抑制大田软海绵酸作用造成的肠道屏障破坏的药物中的应用。
本发明的第二方面，提供雷公藤甲素在制备大田软海绵酸中毒后的解毒药物中的应用。
进一步的，所述的解毒药物为抑制大田软海绵酸作用下的肠道细胞凋亡的药物。
进一步的，所述的解毒药物为抑制大田软海绵酸作用造成的肠道屏障破坏，保护肠道屏障功能的药物。
本发明的第三方面，提供一种预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤的药物，其包含：
(A)有效量的雷公藤甲素；以及
(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的第四方面，提供一种大田软海绵酸中毒后的解毒药物，其包含：
(A)有效量的雷公藤甲素；以及
(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
进一步的，所述的大田软海绵酸中毒后的解毒药物中，雷公藤甲素在小鼠动物实验水平上的起效剂量为0.2mg/kg，对应的人用给药剂量为0.02mg/kg。
本发明的有益效果在于：
本发明通过体外试验发现雷公藤甲素能够抑制大田软海绵酸作用造成的血管内皮细胞凋亡，体内实验进一步验证，发现雷公藤甲素具有保护大田软海绵酸作用的小鼠肠道屏障功能的作用，是大田软海绵酸中毒后的理想解毒药物。
附图说明
图1：OA对HUVEC细胞的杀伤作用。
图2：雷公藤甲素在OA杀伤HUVEC细胞中的保护作用。
图3：雷公藤甲素对OA处理后HUVEC细胞凋亡比例的影响。
图4：OA处理对小鼠FITC肠道通透性的影响。
图5：雷公藤甲素对OA处理后小鼠FITC肠道通透性的影响。
图6：雷公藤甲素对OA处理后小鼠肠道病理变化的影响；
其中，(A)FITC对照组，(B)OA给药组，(C)雷公藤甲素给药组，(D)OA和雷公藤甲素共同给药组。
图7：雷公藤甲素对OA处理后小鼠肠道细胞显微结构变化的影响；
其中，(A)FITC对照组，(B)OA给药组，(C)雷公藤甲素给药组，(D)OA和雷公藤甲素共同给药组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：
1、血管内皮细胞(HUVEC)体外培养
本实验所用细胞为人血管内皮细胞(HUVEC)，使用添加10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5％CO2培养箱中进行培养，待细胞生长至占培养皿底部80％～90％时，使用胰酶进行消化并传代。
2、细胞活性的检测
本实验使用CCK8法和pSIVA技术对雷公藤甲素抑制OA作用下血管内皮细胞(HUVEC)的凋亡进行检测。
(1)将OA(式I)溶解于DMSO中配成10uM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM。细胞铺96孔板(10000个细胞/孔)，加入不同浓度的OA后，作用24h后，用CCK8法检测细胞活性，确定OA作用的合适的浓度。
实验结果：结果显示OA对HUVEC的IC50为6.029*10-7M。(图1)
(2)将雷公藤甲素(式II)溶解于DMSO中配成10mM浓缩液，-20℃保存，使用时分别稀释为0.01uM，0.03uM，0.1uM，0.3uM，1uM，3uM，10uM。细胞铺96孔板(10000个细胞/孔)，加入OA(5*10-7mol/L)后立刻加入不同浓度的雷公藤甲素，作用24h后，，用CCK8法检测细胞活性。
实验结果：结果显示雷公藤甲素可有效缓解OA对HUVEC细胞损伤作用(图2)。
3、雷公藤甲素可以抑制OA作用下细胞凋亡的发生
细胞铺96孔板(10000个细胞/孔)，在5*10-7mol/L的OA和浓度梯度为0，0.1uM，0.3uM，1uM，3uM，10uM的雷公藤甲素的共同作用24h后，用Annexin V试剂盒对细胞进行处理，通过pSIVA技术，记录细胞发生凋亡的个数。
实验结果：结果显示随着雷公藤甲素浓度的增高，HUVEC细胞凋亡发生减少(图3)。
4、构造OA诱发肠道功能损伤的动物模型
六周龄健康ICR小鼠(36只)，饲养条件：温度为22±2℃，湿度为50±5％，照明时间为12小时/天。饲养期间小鼠自由摄取高压蒸汽灭菌后的繁殖鼠料及高压蒸汽灭菌后的过滤水。各组小鼠适应环境3天后进行FITC肠道通透性实验。随机分成6组，每组6只：分别为PBS对照组、FITC对照组、OA剂量组1(25ug/kg)、OA剂量组2(50ug/kg)、OA剂量组3(100ug/kg)、OA剂量组4(200ug/kg)，腹腔给药，PBS对照组和FITC对照组给予等体积的PBS溶液；1小时后，FITC对照组及OA各给药组给予灌胃400mg/kg的4kDa FITC-dextran PBS溶液；2小时后各组进行采血，离心后取血浆上清液100uL置于96孔板中，酶标仪进行读数并计算浓度。
实验结果：结果显示，OA在200ug/kg浓度下可造成小鼠肠道屏障显著破坏(图4)。
5、雷公藤甲素体内保护功能验证
将健康ICR小鼠(30只)随机分成5组，每组6只进行FITC肠道通透性实验：分别为PBS对照组、FITC对照组、OA给药组(200ug/kg)、雷公藤甲素给药组(0.2mg/kg)，OA(200ug/kg)和雷公藤甲素(0.2mg/kg)共同给药组。另取FITC对照组及各给药组肠道组织进行病理检查及透射电镜检查。
实验结果：在FITC肠道通透性实验中(图5)，OA给药组的OD值显著高于其他处理组。
病理(图6)结果显示：OA给药组与其他三组相比肠绒毛顶端变尖(黑色箭头)，有的上皮下可见小空腔，少量上皮细胞水肿(蓝色箭头)，有的胞质空泡化，毛细血管充血；局部肠绒毛脱落，粘膜变矮；固有层可见散在的淋巴细胞浸润(黄色箭头)。各处理组的损伤程度由重到轻依次为OA给药组>OA和雷公藤甲素共同给药组>雷公藤甲素给药组>FITC对照组。
透射电镜(图7)结果显示：OA给药组与其他三组相比肠屏障与上皮细胞轻度水肿，线粒体(M)轻度肿胀，大多线粒体略显变大，膜内基质局部变淡，嵴减少，部分严重者，膜破损，基质外溢，高尔基体(Go)肥大，高尔基体池明显扩张；连接复合体张力微丝略显稀疏。各处理组的损伤程度由重到轻依次为OA给药组>OA和雷公藤甲素共同给药组>雷公藤甲素给药组>FITC对照组。
综上，雷公藤甲素能够对OA破坏的肠道屏障起到保护作用。
以上实验结果表明雷公藤甲素能够抑制OA作用下的细胞凋亡的发生，保护肠道屏障功能，是一种OA中毒后用于治疗的理想药物。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的应用，其特征在于，所述的大田软海绵酸引起的肠道损伤包括肠道细胞凋亡和肠道屏障破坏。
3.根据权利要求1所述的雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的应用，其特征在于，所述的雷公藤甲素在制备抑制大田软海绵酸作用造成的血管内皮细胞凋亡的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的雷公藤甲素在制备预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤药物中的应用，其特征在于，所述的雷公藤甲素在制备抑制大田软海绵酸作用造成的肠道屏障破坏的药物中的应用。
5.雷公藤甲素在制备大田软海绵酸中毒后的解毒药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的雷公藤甲素在制备大田软海绵酸中毒后的解毒药物中的应用，其特征在于，所述的解毒药物为抑制大田软海绵酸作用下的肠道细胞凋亡的药物。
7.根据权利要求5所述的雷公藤甲素在制备大田软海绵酸中毒后的解毒药物中的应用，其特征在于，所述的解毒药物为抑制大田软海绵酸作用造成的肠道屏障破坏，保护肠道屏障功能的药物。
8.一种预防和/或治疗大田软海绵酸引起的肠道损伤的药物，其特征在于，包含：
(A)有效量的雷公藤甲素；以及
(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
9.一种大田软海绵酸中毒后的解毒药物，其特征在于，包含：
(A)有效量的雷公藤甲素；以及
(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
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