CN113811528A - 用于治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及能够穿透血脑屏障以调节EGFR酪氨酸激酶的活性的化合物。本公开还涉及治疗胶质母细胞瘤和其他EGFR介导的癌症的方法。本公开还涉及治疗已被确定在抑制剂存在下具有改变的葡萄糖代谢的胶质母细胞瘤和其他EGFR介导的癌症的方法。本公开还提供了向受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂的方法。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法

相关申请

本申请要求2019年3月15日提交的美国临时申请第62/819,332号和2019年9月23日提交的美国临时申请第62/904,241号的权益，所述美国临时申请的内容通过引用完全并入本文。

背景技术

胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤；GBM)占成人原发性恶性脑肿瘤的大多数。表皮生长因子受体(EGFR)基因的扩增和突变是GBM中遇到的特征遗传异常(Sugawa等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:8602-8606；Ekstrand等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89:4309-4313)。靶向EGFR或它的突变组成型活性形式ΔEGFR的一系列潜在疗法，包括酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、单克隆抗体、疫苗和基于RNA的剂，当前处于开发中或处于关于治疗GBM的临床试验中。然而，迄今为止，它们在临床中的功效至今一直受限于前期药物抗性与获得性药物抗性两者(Taylor等人(2012)Curr.Cancer DrugTargets.12:197-209)。一个主要限制是当前疗法诸如厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼(gefitinib)和阿法替尼(afatinib)的脑穿透性不良(Razier等人(2010)Neuro-Oncology12:95-103；Reardon等人(2015)Neuro-Oncology 17:430-439；Thiessen等人(2010)Cancer Chemother.Pharmacol.65:353-361)。

分子靶向疗法已彻底改变癌症治疗，并且为现代精准医学铺平了道路。然而，尽管可操作的遗传改变是明确确定的，但靶向药物已在胶质母细胞瘤(GBM)患者中失败。这大部分地归因于大多数靶向剂的CNS穿透不足以达到为肿瘤杀灭所必需的水平；从而潜在地激起强健适应机制以驱动治疗抗性。尽管抑制原发性病变与一种或多种代偿性信号传导路径两者的药物组合是有吸引力的，但这些组合疗法策略已受到增强的毒性的阻碍，从而导致每种药物的阈下给药。

一替代性治疗方法靶向致癌性驱动因素以改变对于肿瘤存活重要的功能性质，从而致使细胞易受互不相关的第二打击⁶。当一种或多种经致癌基因调控的功能性网络与肿瘤细胞死亡路径交叉时，这个“合成致死”策略可为特别具有吸引力的。在某一实例中，致癌性信号传导驱动葡萄糖代谢以阻抑内在凋亡，并且促进存活。用靶向疗法抑制致癌性驱动因素可触发内在凋亡机制作为葡萄糖消耗减弱的直接后果。这些致肿瘤性路径的缠结性质可为合理组合治疗提供治疗机会，然而，这还有待探究。

鉴于前述内容，对于用于治疗胶质母细胞瘤和其他癌症的脑穿透性化学治疗剂仍有临床需要。

发明内容

在一个方面，本公开提供了式I或式I*化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

Z是芳基或杂芳基；

R^2a和R^2b各自独立地选自氢、烷基、卤基、CN和NO₂；

R³是氢、烷基或酰基；

R⁴是烷氧基；

R⁵是烷基；R⁷和R⁸各自独立地选自氢、烷基诸如烷氧基烷基、芳烷基或芳基酰基；

R¹¹是氢、烷基、卤基、CN、NO₂、OR⁷、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；并且

R¹²是氢、烷基、卤基、CN、NO₂、OR⁸、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或R¹¹和R¹²一起形成碳环或杂环。

在某些方面，本公开提供了抑制EGFR或ΔEGFR的方法，所述方法包括向受试者施用一定量的本公开化合物。

在某些方面，本公开提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向需要治疗癌症的受试者施用一定量的本公开化合物。在一些实施方案中，癌症是多形性胶质母细胞瘤。

在某些方面，本公开提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂，其中所述葡萄糖代谢抑制剂是本公开化合物。在一些实施方案中，癌症是多形性胶质母细胞瘤。

在某些方面，本公开提供了制备式I或式I*化合物的方法。

附图说明

图1描绘在10mg/kg下JGK005的口服药物代谢动力学以及在25mg/kg下厄洛替尼的口服药物代谢动力学。相较于厄洛替尼，JGK005具有良好CNS穿透。

图2描绘厄洛替尼(左列)和JGK005(右列)分别针对EGFR突变胶质母细胞瘤HK301和GBM39的活性。在两种情况下，相比于厄洛替尼，JGK005均具有较低活性。

图3描绘厄洛替尼和JGK010的无细胞EGFR激酶活性。两种化合物均具有约8nM的IC₅₀。

图4描绘厄洛替尼(左列)、JGK005(居中列)和JGK010(右列)针对HK301和GBM39细胞的效能。

图5显示在10mg/kg下JGK005以及在10mg/kg下JGK010的口服药物代谢动力学。

图6描绘在多个原代胶质母细胞瘤细胞系的情况下EGFR抑制剂的比较。第1-4列：GBM39(EGFRvIII)，第5-8列：GS100(EGFRwt/EGFRvIII)，第9-12列：GS017(A289T)，第13-16列：GS024(EGFR多体性)。

图7A描绘EGFR改变的肺癌中的JGK010活性。图7B描绘EGFR扩增表皮样癌中的JGK010活性。

图8A描绘在6mg/kg下的JGK010口服药物代谢动力学。图8B描绘在10mg/kg下的JGK010口服药物代谢动力学。图8C描绘在6mg/kg下的JGK010 IV药物代谢动力学。图8D描绘在6mg/kg下的JGK010 IP药物代谢动力学。

图9描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物针对EGFR Amp WT+vIII HK301的活性。

图10描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物针对EGFR vIII Amp GBM 39的活性。

图11描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物针对HK301细胞的活性。

图12描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物针对GBM 39细胞的活性。

图13A描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物的磷酸EGFR vIII抑制。图13B描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物的磷酸EGFR vIII抑制。

图14A描绘JGK005的药物代谢动力学。图14B描绘JGK005的药物代谢动力学。

图15A描绘JGK038的药物代谢动力学。图15B描绘JGK038的药物代谢动力学。

图16A描绘JGK010的药物代谢动力学。图16B描绘JGK010的药物代谢动力学。

图17A描绘JGK037的药物代谢动力学。图17B描绘JGK037的药物代谢动力学。

图18A描绘厄洛替尼与JGK037之间小鼠脑/血液药物代谢动力学的比较。图18B描绘厄洛替尼与JGK037之间小鼠脑/血液药物代谢动力学的比较。

图19描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物的脑穿透。

图20描绘用媒介物或JGK037治疗对RLU变化的影响。

图21A-图21F描绘抑制EGFR驱动的葡萄糖代谢诱导最小细胞死亡，但对GBM细胞进行凋亡致敏。图21A描绘在19个患者源性GBM神经胶质瘤球中，相对于媒介物，在厄洛替尼处理4小时之后，¹⁸F-FDG摄取的变化百分比。“代谢响应者”(蓝色)是显示相对于媒介物，¹⁸F-FDG摄取显著降低的样品，而“非响应者”(红色)不显示显著降低。图21B描绘相对于媒介物，在厄洛替尼处理12小时下，葡萄糖消耗和乳酸产生的变化百分比。使用Nova BiomedicalBioProfile分析仪进行测量。图21C描绘在用厄洛替尼处理72小时之后，代谢响应者(蓝色，n＝10)或非响应者(红色，n＝9)的膜联蛋白V染色。图21D描绘在用厄洛替尼处理24小时的代谢响应者或非响应者中，相对于媒介物对照，在致敏方面的变化百分比，所述致敏如通过在暴露于每种BH3肽(BIM、BID或PUMA)之后的细胞色素c释放来确定。图21E描绘左侧：过度表达GFP对照或GLUT1和GLUT3(GLUT1/3)的HK301细胞的全细胞溶解产物的免疫印迹。右侧：在厄洛替尼处理12小时之后HK301-GFP或HK301-GLUT1/3的葡萄糖消耗或乳酸产生的变化。值是相对于媒介物对照的。图21F描绘使用HK301-GFP或HK301-GLUT1/3细胞。用于所有实验的厄洛替尼浓度都是1μM。使用双尾未配对史都登氏t检验(Student’s t-test)进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图22A-图22H描绘细胞质p53使EGFR关联于内在凋亡。图22A描绘表达CRISPR/CAS9蛋白与对照引导RNA(sgCtrl)或p53引导RNA(p53KO)的两个响应者(HK301和HK336)中所指示蛋白质的免疫印迹。图22B描绘在用厄洛替尼处理24小时的sgCtrl和p53KO细胞中，相对于媒介物对照，在致敏方面的变化百分比，所述致敏如通过在暴露于BIM肽之后的细胞色素c释放来确定。图22C描绘HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt中所指示蛋白质的免疫印迹。图22D描绘用以揭示HK301 sgCtrl、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt中的蛋白质定位的p53蛋白免疫荧光与DAPI染色的组合(比例尺＝20μm)。首先将神经胶质瘤球解离成单细胞，并且根据制造商说明书，使用Cell-Tak(Corning)贴壁于96孔板。接着用冰冷甲醇固定贴壁细胞10分钟，然后用PBS洗涤三次。接着将细胞与在PBS中含有10％FBS和3％BSA的封闭溶液一起孵育1小时，并且随后与p53(Santa Cruz，SC-126，1:50稀释)抗体一起在4℃下孵育过夜。次日，将细胞与二级抗体(Alexa Fluor 647，1:2000稀释)一起孵育1小时，并且DAPI染色10分钟，接着使用配备有Cascade II荧光照相机(Roper Scientific)的NikonTI Eclipse显微镜成像。以在461nM和647nM下的发射使细胞成像，接着使用NIS-ElementsAR分析软件处理。图22E描绘HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt中在100nM多柔比星处理24小时之后所指示mRNA水平的变化。水平以相应DMSO处理细胞作归一化。图22F描绘与22B类似，但在HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt的情况下的数据。图22G描绘与22E类似，但在HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^R175H、p53KO+p53^R273H和p53KO+p53^NES的情况下的数据。图22H描绘与22B和22F类似，但在HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^R175H、p53KO+p53^R273H和p53KO+p53^NES的情况下的数据。用于所有实验的厄洛替尼浓度都是1μM。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图23A-图23F描绘在EGFRi代谢响应者中，Bcl-xL通过结合和螯合细胞质p53来阻止GBM细胞死亡。图23A描绘在厄洛替尼处理24小时之后，两个代谢响应者(HK301和GBM39)中p53的免疫沉淀。用所指示抗体探测免疫沉淀。下方是相应免疫沉淀前溶解产物(输入物)。图23B描绘与23A类似，但在两个非响应者(HK393和HK254)的情况下的数据。图23C描绘与23A和23B类似，但在HK301-GFP和HK301-GLUT1/3的情况下的数据。右侧是所指示输入物的免疫印迹。图23D描绘用厄洛替尼、WEHI-539、或两者处理HK301 24小时，并且如先前所述进行免疫沉淀和免疫印迹。图23E描绘在用厄洛替尼、WEHI-539、或两者处理72小时之后，两个响应者(GBM39和HK301)和非响应者(HK393)的膜联蛋白V染色。图23F描绘在用厄洛替尼、wehi-539、或两者处理72小时之后，HK301-GFP和HK301-GLUT1/3的膜联蛋白V染色。用于所有实验的厄洛替尼和WEHI-539浓度都分别是1μM和5μM。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01。

图24A-图24G描绘组合靶向EGFR和p53的协同致死性。图24A描绘273个GBM样品中EGFR以及在p53调控中涉及的基因的改变的概述。EGFR的遗传改变(扩增/突变)与p53的遗传改变是互相排斥的。如所示，EGFR改变在表的左侧上，而p53的大多数改变在右侧上。图24B描绘指示EGFR以及在p53路径中涉及的基因的改变之间的显著关联的表。图24C描绘用表示为剂量滴定矩阵的不同浓度的厄洛替尼、努特林以及以组合方式处理的代谢响应者(左侧：HK301)和非响应者(右侧：GS017)的膜联蛋白V染色。图24D描绘对10个代谢响应者和6个非响应者进行如24C中所述的厄洛替尼和努特林的剂量滴定，并且计算协同作用评分(参见材料和方法)。图24E描绘在用厄洛替尼、努特林、或两者处理72小时之后，HK301-GFP和HK301-GLUT1/3的膜联蛋白V染色。图24F描绘的与24E相同，但在HK301-sgCtrl和HK301-p53KO的情况下。图24G描绘用厄洛替尼、努特林或以组合方式处理24小时的HK301。用免疫球蛋白G对照抗体或抗p53抗体进行免疫沉淀，并且用所指示抗体探测免疫沉淀。下方是相应免疫沉淀前溶解产物(输入物)。所有数据都代表至少n＝3个独立实验，平均值±SEM。除非指示，否则用于所有实验的厄洛替尼和努特林浓度都分别是1μM和2.5μM。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001

图25A-图25F描绘调节葡萄糖代谢对EGFRi非响应者进行p53介导的细胞死亡致敏。图25A描绘在HK393和HK254中，相对于媒介物，在厄洛替尼、2DG或匹替尼西处理4小时之后，¹⁸F-FDG摄取的变化百分比。图25B描绘在厄洛替尼、2DG或匹替尼西处理24小时之后，在HK393和HK254中，相对于媒介物对照，在致敏方面的变化百分比，所述致敏如通过在暴露于BIM肽之后的细胞色素c释放来确定。图25C描绘与25B类似，但在HK393 sgCtrl和p53KO的情况下的数据。图25D描绘在2DG或匹替尼西处理24小时之后，HK393和HK254中p53的免疫沉淀。用所指示抗体探测免疫沉淀。下方是相应免疫沉淀前溶解产物(输入物)。图25E描绘在HK393和HK254的情况下，各种药物(厄洛替尼、2DG和匹替尼西)与努特林的组合的协同作用评分。图25F描绘在用2DG、匹替尼西、2DG+努特林、或匹替尼西+努特林处理72小时之后，HK393 sgCtrl和HK393 p53KO的膜联蛋白V染色。除非指示，否则用于所有实验的厄洛替尼、2DG、匹替尼西和努特林浓度都分别是1μM、1mM、1μM和2.5μM。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图26A-图26H描绘组合靶向EGFR驱动的葡萄糖摄取和p53阻抑体内肿瘤生长。图26A描绘在厄洛替尼处理(75mg/kg)15小时之前和之后对GBM39颅内异种移植物的¹⁸F-FDGPET/CT成像。图26B描绘用媒介物(n＝5)、75mg/kg厄洛替尼(n＝7)、50mg/kg依达沙努特林(n＝5)或每日以组合方式(n＝12)治疗的GBM39颅内异种移植物，并且使用分泌型长腹水蚤荧光素酶在所指示日评估肿瘤负荷(参见材料和方法)。图26C描绘与26A类似，但在HK393颅内异种移植物的情况下的数据。图26D描绘与26B类似，但在HK393颅内异种移植物的情况下的数据(对于所有群组，n＝7)。图25E描绘26B的存活百分比。图26F描绘26C的存活百分比。图26G描绘在进行所指示治疗25天，接着停药之后，代谢响应者HK336的存活百分比(对于所有群组，n＝7)。图26H描绘在进行所指示治疗25天，接着停药之后，非响应者GS025的存活百分比(对于所有群组，n＝9)。26B和26D的比较使用来自最后测量的数据集，并且使用双尾未配对t检验进行。数据代表平均值±s.e.m.值。**p<0.01。

图27A-图27G描绘在EGFR抑制之后GBM细胞系的表征。图27A描绘在两个代谢响应者(HK301和GBM39)中，相对于媒介物，在所指示的厄洛替尼处理时间时，¹⁸F-FDG摄取的变化百分比。图27B描绘在用siRNA遗传敲低EGFR之后，代谢响应者(HK301)和非响应者(HK217)的所指示蛋白质的免疫印迹。图27C描绘在遗传敲低EGFR之后，HK301和HK217中¹⁸F-FDG摄取的变化百分比。图27D描绘三个代谢响应者(HK301、GBM39、HK390)和三个非响应者(HK393、HK217、HK254)中在厄洛替尼处理12小时下葡萄糖消耗的变化。使用Nova BiomedicalBioProfile分析仪进行测量。图27E描绘三个代谢响应者(HK301、GBM39、HK390)和三个非响应者(HK393、HK217、HK254)中在厄洛替尼处理12小时下乳酸产生的变化。使用NovaBiomedical BioProfile分析仪进行测量。图27F描绘在厄洛替尼处理12小时之后，两个响应者(HK301和GBM39，以蓝色表示)和两个非响应者(HK217和HK393，以红色表示)的基础ECAR测量结果。图27G描绘在厄洛替尼处理12小时之后，谷氨酰胺消耗的变化，如通过NovaBiomedical BioProfile分析仪所测量。用于所有实验的厄洛替尼浓度都是1μM。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图28A-图28B描绘在EGFR抑制之后下游信号传导的改变与代谢响应相关联。图28A描绘代谢响应者中在厄洛替尼处理4小时之后所指示蛋白质的免疫印迹。图28B描绘代谢非响应者中在厄洛替尼处理4小时之后所指示蛋白质的免疫印迹。

图29A-图29B描绘患者源性GBM细胞系的遗传表征。图29A描绘一组GBM株系的遗传背景。图29B描绘HK390、HK336、HK254和HK393的显示EGFR的多体性的荧光原位杂交(FISH)。使用可商购获得的经荧光标记的双色EGFR(红色)/CEP 7(绿色)探针(Abbott-Molecular)进行荧光原位杂交(FISH)。遵循制造商的建议方案，对细胞系进行FISH杂交和分析。用DAPI对细胞进行复染，并且在配备有双色和三色滤光片的Zeiss(Axiophot)荧光显微镜下使荧光探针信号成像。

图30A-图30B描绘EGFR抑制改变代谢响应者中的凋亡平衡。图30A描绘代谢响应者(GBM39、HK301和HK336)和非响应者(HK217、HK393和HK254)中在厄洛替尼处理24小时之后所指示蛋白质的免疫印迹。图30B描绘代谢响应者(HK301)中动态BH3剖析分析的实例。左侧：在暴露于所指示浓度的各种肽之后测量的细胞色素c释放百分比。计算媒介物处理的细胞与厄洛替尼处理的细胞之间的细胞色素c释放差异以获得致敏百分比。用于所有实验的厄洛替尼浓度都是1μM。

图31A-图31C描绘GLUT1/3过度表达挽救由EGFR抑制引起的减弱的葡萄糖代谢。图31A描绘HK301-GFP和HK301 GLUT1/3中在厄洛替尼处理12小时下葡萄糖消耗和乳酸产生的变化。使用Nova Biomedical BioProfile分析仪进行测量。图31B描绘左侧：过度表达GFP对照或GLUT1和GLUT3(GLUT1/3)的GBM39细胞的全细胞溶解产物的免疫印迹。右侧：在厄洛替尼处理12小时之后GBM39-GFP或GBM39-GLUT1/3的葡萄糖消耗或乳酸产生的变化。值是相对于媒介物对照的。图31C描绘与35A类似，但在GBM39-GFP和GBM39-GLUT1/3的情况下的数据。用于所有实验的厄洛替尼浓度都是1μM。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图32A-图32I描绘细胞质p53为EGFRi介导的凋亡致敏所需。图32A描绘HK301sgCtrl和p53 KO细胞中在厄洛替尼处理4小时之后¹⁸F-FDG摄取的变化百分比(平均值±s.d.，n＝3)。图32B描绘HK301(代谢响应者)中在24小时1μM厄洛替尼处理或100nM多柔比星处理之后，p53调控的基因的相对mRNA水平。图32C描绘用p53-荧光素酶报告体系统感染的HK301细胞，并且在1μM厄洛替尼处理24小时之后测量p53活性(平均值±s.d.，n＝3)。结果代表两个独立实验。图32D描绘HK336 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt中所指示蛋白质的免疫印迹。图32E描绘用以揭示HK336 sgCtrl、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt中的蛋白质定位的p53蛋白免疫荧光与DAPI染色的组合(比例尺＝20μm)。如先前所述进行免疫荧光。图32F描绘HK336 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt中在100nM多柔比星处理24小时之后所指示mRNA水平的变化(平均值±s.d.，n＝3)。水平以相应DMSO处理细胞作归一化。图32G描绘在用厄洛替尼处理24小时的HK336 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt细胞中，相对于媒介物对照，在凋亡致敏方面的变化百分比，所述凋亡致敏如通过在暴露于BIM肽之后的细胞色素c释放来确定。(平均值±s.d.，n＝2)。结果代表两个独立实验。图32H描绘HK301sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^R175H、p53KO+p53^R273H和p53KO+p53^NES中所指示蛋白质的免疫印迹。图32I描绘在有或无PFTμ预处理(10μM，持续2小时)下，在厄洛替尼处理24小时之后，HK301中致敏的变化百分比(平均值±s.d.，n＝2)。结果代表两个独立实验。

图33A-图33D描绘抑制EGFR驱动的葡萄糖代谢通过细胞质p53功能来诱导Bcl-xL依赖性。图33A描绘在用厄洛替尼处理的代谢响应者(HK301和HK336)或非响应者(HK229)中，相对于媒介物对照，在致敏方面的变化百分比，所述致敏如通过在暴露于BAD和HRK肽之后的细胞色素c释放来确定。图33B描绘左侧：在厄洛替尼处理24小时之后，GBM39-GFP和GBM39-GLUT1/3中p53的免疫沉淀。用所指示抗体探测免疫沉淀。右侧：相应免疫沉淀前溶解产物(输入物)。图33C描绘在用厄洛替尼、WEHI-539、或组合处理72小时之后，HK301(左侧)和HK336(右侧)sgCtrl、p53KO、p53 KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt的膜联蛋白V染色。图33D描绘与33C类似，但在GBM39-GFP和GBM39-GLUT1/3的情况下的数据。用于所有实验的厄洛替尼和WEHI-539浓度都是1μM。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图34A-图34H描绘EGFR调控的葡萄糖代谢的抑制和p53活化促进GBM中的内在凋亡。图34A描绘在两个代谢响应者(HK301和GBM39)中，在厄洛替尼、努特林或以组合方式处理24小时之后，所指示蛋白质的免疫印迹。图34B描绘在遗传敲低EGFR以及后续努特林处理72小时之后，HK301和HK217中的膜联蛋白V染色。图34C描绘HK301-GFP和HK301-GLUT1/GLUT3中BAX寡聚化的检测。在24小时的所指示处理之后，收集细胞，并且在1mM BMH中孵育以促进蛋白质交联，并且用所指示抗体加以免疫印迹。BAX下方是在细胞分级分离之后胞质溶胶细胞色素c的免疫印迹。图34D描绘上部：HK301-GFP和HK301-HA-BclxL中所指示蛋白质的免疫印迹。下部：在用厄洛替尼、努特林、或组合处理72小时之后，HK301-GFP和HK301-HA-BclxL中的膜联蛋白V染色。图34E描绘在有/无PFTμ预处理(10μM，持续2小时)下，在厄洛替尼、努特林、或组合处理72小时之后，HK301的膜联蛋白V染色。图34F描绘在用厄洛替尼、努特林、或组合处理72小时之后，HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^R175H、p53KO+p53^R273H和p53KO+p53^NES的膜联蛋白V染色。图34G描绘与34F类似，但在HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt的情况下的数据。用于所有实验的药物浓度都如下：厄洛替尼(1μM)、努特林(2.5μM)。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。图34H描绘与34G类似，但在HK336 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53^cyto和p53KO+p53^wt的情况下的数据。用于所有实验的药物浓度都如下：厄洛替尼(1μM)、努特林(2.5μM)。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图35A-图35F描绘抑制代谢响应者和非响应者中的葡萄糖代谢促进内在凋亡。图35A描绘在厄洛替尼或2DG处理24小时之后，在代谢响应者HK301中，相对于媒介物对照，在致敏方面的变化百分比，所述致敏如通过在暴露于BIM肽之后的细胞色素c释放来确定。图35B描绘左侧：在2DG处理24小时之后，HK301中p53的免疫沉淀。用所指示抗体探测免疫沉淀。右侧：相应免疫沉淀前溶解产物(输入物)。图35C描绘在暴露于寡霉素(oligomycin)和鱼藤酮(rotenone)之后，HK301细胞的OCR和ECAR测量结果。图35D描绘在用努特林；厄洛替尼、2DG、寡霉素、鱼藤酮作为单独剂或与努特林组合处理72小时之后，HK301中的膜联蛋白V染色。图35E描绘两个非响应者(HK254和HK393)中在厄洛替尼或匹替尼西处理4小时之后所指示蛋白质的免疫印迹。图35F描绘在匹替尼西或2DG处理24小时之后，HK254中p53的免疫沉淀。用所指示抗体探测免疫沉淀。下方是相应免疫沉淀前溶解产物(输入物)。用于所有实验的药物浓度都如下：厄洛替尼(1μM)、努特林(2.5μM)、2DG(对于HK301是3mM，并且对于HK254是1mM)、寡霉素(1μM)、鱼藤酮(1μM)和匹替尼西(1μM)。使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。****p<0.0001。

图36A-图36D描绘EGFR抑制和p53活化的体内功效。图36A描绘非携带肿瘤的小鼠中在所指示时间点时依达沙努特林的脑和血浆浓度(n＝2只小鼠/时间点)。图36B描绘在36小时依达沙努特林(50mg/kg)治疗之后，携带颅内肿瘤的异种移植物中p53表达的免疫组织化学(IHC)分析。图36C描绘GBM39(n＝3)和HK393(n＝5)颅内异种移植物中在厄洛替尼治疗15小时之后¹⁸F-FDG摄取的变化百分比。图36D描绘在用厄洛替尼(75mg/kg)、或厄洛替尼(75mg/kg)和依达沙努特林(50mg/kg)组合每日治疗之后，小鼠体重的变化。所有治疗都以口服方式进行。数据代表三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05。

图37A描绘用2DG(己糖激酶抑制剂)或细胞松弛素B(葡萄糖转运体抑制剂)直接抑制糖酵解出乎意料地与p53活化(用努特林)具有协同作用。图37B描绘低葡萄糖(0.25mM)导致与用纳维托克(navitoclax)(ABT-263)进行的BCL-xL抑制的协同细胞杀灭。图37C描绘低葡萄糖(0.25mM)导致与用努特林进行的BCL-xL抑制的协同细胞杀灭。

图38描绘对EGFRi抑制剂厄洛替尼的代谢响应者与代谢非响应者之间的比较。厄洛替尼和努特林的组合在代谢响应者中而非在非响应者中导致出乎意料的协同合成致死性。

图39A显示合成中间体5的对映异构纯度，如通过手性SFC(Chiralpak AD-3柱，40％MeOH)所测定。图39B显示合成中间体(S)-5的对映异构纯度，如通过手性SFC(Chiralpak AD-3柱，40％MeOH)所测定。图39C显示合成中间体(R)-5的对映异构纯度，如通过手性SFC(Chiralpak AD-3柱，40％MeOH)所测定。图39D显示莫舍(Mosher)酯衍生物5的对映异构纯度，如通过手性SFC(Chiralpak AD-3柱，40％MeOH)所测定。

图40描绘厄洛替尼、拉帕替尼、吉非替尼和本公开的示例性化合物针对U87EGFRwt的活性。

图41描绘厄洛替尼、拉帕替尼、吉非替尼和本公开的示例性化合物针对U87EGFRviii的活性。

图42描绘厄洛替尼、拉帕替尼、吉非替尼和本公开的示例性化合物针对作为患者源性EGFRvIII突变GBM神经胶质瘤球的HK301的活性。

图43描绘厄洛替尼、拉帕替尼、吉非替尼和本公开的示例性化合物针对作为患者源性EGFRvIII突变GBM神经胶质瘤球的GBM39的活性。

图44描绘厄洛替尼、拉帕替尼和本公开的示例性化合物在GBM39 EGFRvIII突变小鼠模型中的活性。

图45A描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物在HCC827肺癌EGFR突变细胞系中的活性。图45B描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物在PC9肺癌EGFR突变细胞系中的活性。图45C描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物在H838肺癌突变细胞系中的活性。

图46描绘厄洛替尼和本公开的示例性化合物在PC9肺癌EGFR突变小鼠模型中的活性。

图47描绘本公开的示例性化合物的某些代谢物。

图48A描绘本公开的示例性化合物针对HK301的活性。

图48B描绘本公开的示例性化合物针对GBM39的活性。图48C描绘本公开的示例性化合物针对NHA的活性。

图49A描绘在PO施用之后，本公开的示例性化合物在大鼠中的ADME特征。

图49B描绘在PO施用之后，本公开的示例性化合物在大鼠中的ADME特征。

图50A描绘相较于当前护理标准(即拉帕替尼、厄洛替尼、吉非替尼和AZD3759)，本公开的某些化合物针对作为患者源性EGFRvIII突变GBM神经胶质瘤球的HK301的活性。

图50B描绘相较于当前护理标准(即拉帕替尼、厄洛替尼、吉非替尼和AZD3759)，本公开的某些化合物针对作为患者源性EGFRvIII突变GBM神经胶质瘤球的HK301的活性。

图51A描绘相较于当前护理标准(即拉帕替尼、厄洛替尼、吉非替尼和AZD3759)，本公开的某些化合物针对作为患者源性EGFRvIII突变GBM神经胶质瘤球的GBM39的活性。图51B描绘相较于当前护理标准(即拉帕替尼、厄洛替尼、吉非替尼和AZD3759)，本公开的某些化合物针对作为患者源性EGFRvIII突变GBM神经胶质瘤球的GBM39的活性。

图52A描绘奥希替尼(osimertinib)和JGK068S针对pEGFRwt的活性。图52B描绘奥希替尼和JGK068S针对pEGFRvIII的活性。

图53A描绘奥希替尼和JGK068S针对HK301的活性。图53B描绘奥希替尼和JGK068S针对GBM39的活性。

图54A描绘AZD3759、AZD9291和JGK068S针对某些EGFR突变体的活性。图54B描绘AZD3759、AZD9291和JGK068S针对pEGFR A263P的活性。图54C描绘AZD3759、AZD9291和JGK068S针对pEGFR A289V的活性。图54D描绘AZD3759、AZD9291和JGK068S针对pEGFR A289D的活性。图54E描绘AZD3759、AZD9291和JGK068S针对pEGFR G598V的活性。

具体实施方式

神经胶质瘤是最通常发生的脑肿瘤形式，其中多形性胶质母细胞瘤(GBM)是恶性最大的形式，导致所有癌症相关死亡的3–4％(Louis等人(2007)Acta.Neuropathol.114:97-109.)。世界卫生组织将GBM定义为特征是恶性、有丝分裂活性以及易经受坏死的IV级癌症。GBM具有极其不良的预后，5年存活率是4–5％，其中GBM的中值存活率是12.6个月(McLendon等人(2003)Cancer.98:1745-1748.)。这可归因于独特治疗限制，诸如高平均发病年龄、肿瘤位置以及当前缺乏对肿瘤病理生理学的了解(Louis等人(2007)Acta.Neuropathol.114:97-109)。用于GBM的标准当前护理标准包括肿瘤切除合并放射疗法和化学疗法，而近年来，存在少许的增加存活率的显著进步(Stewart等人(2002)Lancet.359:1011-1018.)。

GBM化学疗法的标准物是替莫唑胺(temozolomide，TMZ)，其是一种使DNA中的嘌呤(A或G)甲基化，并且诱导凋亡的脑穿透性烷基化剂(Stupp等人(2005)N.Engl.J.Med.352:987-996)。然而，使用TMZ具有缺点，因为健康细胞中的DNA损害会引起重大风险，并且GBM细胞可快速产生对药物的抗性(Carlsson等人(2014)EMBO.Mol.Med.6:1359-1370)。因此，迫切需要额外化学疗法选项。

EGFR连同ERBB2、ERBB3和ERBB4一起是HER受体酪氨酸激酶超家族的成员。GBM进展的常见驱动因素是EGFR扩增，此见于所有GBM病例的接近40％中(Hynes等人(2005)Nat.Rev.Cancer.5:341-354；Hatanpaa等人(2010)Neoplasia.12:675-684)。另外，EGFR扩增与EGFR蛋白变体的存在相关：在68％的EGFR突变体中；在氨基酸6与273之间的N末端配体结合区中存在缺失。EGFR的配体结合结构域中的这些缺失可导致EGFR的配体非依赖性活化(Yamazaki等人(1990)Jpn.J.Cancer Res.81:773-779.)。

小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在EGFR靶向疗法中是临床上最先进的，并且可逆抑制剂与不可逆抑制剂两者均处于临床试验中。可逆抑制剂和不可逆抑制剂的实例包括厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、PKI166、卡奈替尼(canertinib)和培利替尼(pelitinib)(Mischel等人(2003)Brain Pathol.13:52-61)。在机理方面，这些TKI与ATP竞争结合EGFR的酪氨酸激酶结构域，然而，这些EGFR特异性酪氨酸激酶抑制剂针对神经胶质瘤已是相对无效的，其中在厄洛替尼的情况下，响应率仅高达25％(Mischel等人(2003)BrainPathol.13:52-61；Gan等人(2009)J.Clin.Neurosci.16:748-54)。尽管TKI在GBM患者中是良好耐受的，并且显示一定抗肿瘤活性，但经常发生的对受体抑制具有抗性的问题限制了它们的功效(Learn等人(2004)Clin.Cancer.Res.10:3216-3224；Rich等人(2004)Nat.Rev.Drug Discov.3:430-446)。另外，新近研究已显示在疗法之后，吉非替尼和厄洛替尼的脑血浆浓度仅是起始剂量的6–11％，从而表明这些化合物可能未能穿过血脑屏障，如表1中所说明(Karpel-Massler等人(2009)Mol.Cancer Res.7:1000-1012)。因此，向靶标的递送不充分可为临床结果令人失望的另一原因。

表1：当前护理标准药物的脑穿透率

鉴于这个证据，对于具有穿过血脑屏障，并且处理抑制EGFR和它的亚型的能力的强力酪氨酸激酶抑制剂仍有未满足的临床需要。

此外，发明人显示致癌性信号传导和代谢路径之间的相互影响为在GBM的情况下的新型组合疗法创造了机会。更具体来说，发明人已发现急性抑制EGFR驱动的葡萄糖摄取诱导最小细胞死亡，但降低患者源性GBM细胞中的凋亡阈值，并且对细胞进行凋亡“致敏”。出乎意料的是，由发明人进行的机理研究揭示Bcl-xL阻断细胞质p53触发内在凋亡，从而导致肿瘤存活。p53的药理学稳定化(诸如像采用脑穿透性小分子依达沙努特林(Idasanutlin))使得p53能够衔接内在凋亡机制，从而促进与靶向GBM异种移植物中EGFR驱动的葡萄糖摄取的协同致死性。值得注意的是，发明人还发现使用例如非侵袭性正电子发射断层摄影术确定的在¹⁸F-氟脱氧葡萄糖(¹⁸F-FDG)摄取方面的快速变化可预测对组合的体内敏感性。

发明人尤其鉴定了致癌基因信号传导、葡萄糖代谢和细胞质p53之间的关键关联，可利用所述关键关联来在GBM和其他恶性肿瘤的情况下采用组合疗法。

本公开化合物

在一个方面，本公开提供了式I或式I*化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

Z是芳基或杂芳基；

R^2a和R^2b各自独立地选自氢、烷基、卤基、CN和NO₂；

R³是氢、烷基或酰基；

R⁴是烷氧基；

R⁵是烷基；R⁷和R⁸各自独立地选自氢、烷基诸如烷氧基烷基、芳烷基或芳基酰基；

R¹¹是氢、烷基、卤基、CN、NO₂、OR⁷、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；并且

R¹²是氢、烷基、卤基、CN、NO₂、OR⁸、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或R¹¹和R¹²一起形成碳环或杂环。

在式I或式I*的某些优选实施方案中，R^2a和R^2b中的至少一者不是H。在式I或式I*的某些此类实施方案中，如果R^2a是氢，那么R^2b选自烷基、卤基、CN和NO₂。在式I或式I*的其他此类实施方案中，如果R^2b是氢，那么R^2a选自烷基、卤基、CN和NO₂。

在式I或式I*的某些实施方案中，化合物是式(IVa)或式(IVb)化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R⁶的每种情况独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO₂、卤基、烯基、炔基、芳烷基氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。

在式I、I*、Iva和IVb的某些实施方案中，R¹¹是氢。在其他优选实施方案中，R¹¹是OR⁷。

在式I、I*、Iva和IVb的某些实施方案中，R⁷是氢。在其他实施方案中，R⁷是烷基。在其他实施方案中，R⁷是烷氧基烷基。在其他实施方案中，R⁷是芳基酰基。

在式I、I*、Iva和IVb的某些实施方案中，R¹²是杂芳基，诸如呋喃基。在某些实施方案中，杂芳基被烷基、烷氧基、OH、CN、NO₂、卤基、

取代。在其他优选实施方案中，R¹²是OR⁸。

在式I、I*、Iva和IVb的某些实施方案中，R⁸是氢。在其他实施方案中，R⁸是烷基。在其他实施方案中，R⁸是烷氧基烷基。在某些实施方案中，R⁸是被

取代的烷基。

在式I、I*、Iva和IVb的某些优选实施方案中，R¹¹和R¹²组合以形成碳环或杂环，诸如5元、6元或7元碳环或杂环。在某些实施方案中，碳环或杂环被羟基、烷基(例如甲基)或烯基(例如乙烯基)取代。

在式I、I*、Iva和IVb的某些实施方案中，化合物是式Ia、Ib、Ic或Id化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

X是O、S或NH；

Z是芳基或杂芳基；

R¹是氢或烷基；

R^2a和R^2b各自独立地选自氢、烷基、卤基、CN和NO₂；

R³是氢、烷基或酰基；

R⁴是烷氧基；

R⁵是烷基；并且

n是0-3。

在式Ia、Ib、Ic或Id的某些实施方案中，R^2a或R^2b选自烷基、卤基、CN和NO₂。在式Ia、Ib、Ic或Id的某些优选实施方案中，Z是苯基。在式Ia、Ib、Ic或Id的某些优选实施方案中，X是O。在式Ia、Ib、Ic或Id的某些优选实施方案中，n是1。

在式Ia、Ib、Ic或Id的某些实施方案中，化合物是式(IIa)或式(IIb)化合物：

或药学上可接受的盐，其中

R⁶的每种情况独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO₂、卤基、烯基、炔基、芳烷基氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。

在某些实施方案中，其中R¹由式A表示：

其中，

R^7a和R^7b各自独立地选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或R^7a和R^7b组合以形成杂环基；并且

y是0-3。

在式IIa或IIb的某些实施方案中，R¹是烷基(例如甲基或乙基)。在某些实施方案中，R¹被杂环基(例如吗啉基、哌啶基、吡咯烷基或哌嗪基诸如N-甲基哌嗪基)取代。在其他实施方案中，R¹被氨基(例如二甲基氨基)取代。在其他实施方案中，R¹是被羟基取代的烷基。在某些优选实施方案中，R¹呈S构型。在其他实施方案中，R¹呈R构型。

在式IIa或IIb的某些优选实施方案中，R³是氢。在其他实施方案中，R³是酰基。在某些实施方案中，R³是烷基酰基。在某些实施方案中，R³是烷基氧基酰基。在某些实施方案中，R³是酰基氧基烷基。在某些实施方案中，R³是

并且R⁹是烷基。

在式IIa或IIb的某些实施方案中，Z是任选地被一个或多个R⁶取代的芳基或杂芳基；并且R⁶的每种情况独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO₂、卤基、烯基、炔基、芳烷基氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。在某些优选实施方案中，Z是被1、2、3、4或5个R⁶取代的苯基。在某些实施方案中，每个R⁶独立地选自卤基、烷基、炔基或芳基烷氧基。在甚至更优选实施方案中，Z是2-氟-3-氯苯基、2-氟苯基、2,3-二氟苯基、2,4-二氟苯基、2,5-二氟苯基、2,6-二氟苯基、2,4,6-三氟苯基、五氟苯基、2-氟-3-溴苯基、2-氟-3-乙炔基苯基和2-氟-3-(三氟甲基)苯基。在其他甚至更优选实施方案中，Z是3-乙炔基苯基。在其他甚至更优选实施方案中，Z是3-氯-4-((3-氟苯甲基)氧基)苯。在其他甚至更优选实施方案中，Z是3-氯-2-(三氟甲基)苯基。在其他甚至更优选实施方案中，Z是3-溴苯基。在其他甚至更优选实施方案中，Z是2-氟,5-溴苯基。在其他甚至更优选实施方案中，Z是2,6-二氟,5-溴苯基。在某些实施方案中，Z被一个选自

的R⁶取代；并且R⁹和R¹⁰独立地选自烷基。

在式IIIa或IIIb的某些实施方案中，化合物是式(IIIa)化合物：

并且每个R⁶独立地选自氟基、氯基或溴基。

在式IIIa或IIIb的某些实施方案中，化合物是式(IIIb)化合物：

并且每个R⁶独立地选自氟基、氯基或溴基。

在式IIIa或IIIb的某些实施方案中，化合物是式(IIIc)化合物：

并且每个R⁶独立地选自氟基、氯基或溴基。

在式Ia、Ib、Ic、Id、IIa、IIb、IIIa、IIIb或IIIc的某些实施方案中，R^2a是卤基(例如氟基)。在其他优选实施方案中，R^2a是氢。

在式Ia、Ib、Ic、Id、IIa、IIb、IIIa、IIIb或IIIc的某些实施方案中，R^2b是卤基(例如氟基)。在其他优选实施方案中，R^2b是氢。

在式Ia、Ib、Ic、Id、IIa、IIb、IIIa、IIIb或IIIc的某些实施方案中，化合物是

或它们的药学上可接受的盐。

在式Ia、Ib、Ic、Id、IIa、IIb、IIIa、IIIb或IIIc的某些实施方案中，化合物是

或它们的药学上可接受的盐。

在式I的某些实施方案中，化合物是

或它们的药学上可接受的盐。

在式Ia、Ib、Ic、Id、IIa、IIb、IIIa、IIIb或IIIc的某些实施方案中，化合物是

或它们的药学上可接受的盐。

治疗方法

在某些方面，本公开提供了抑制EGFR或ΔEGFR的方法，所述方法包括向受试者施用一定量的本公开化合物。

在某些方面，本公开提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向需要治疗癌症的受试者施用一定量的本公开化合物。在某些实施方案中，癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、心脏癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠癌，头部、脊柱和颈部癌，卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、肾癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、阴茎癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤癌、胸腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。在某些实施方案中，癌症是神经胶质瘤、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，癌症是多形性胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，方法降低癌细胞增殖。

在某些方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和额外剂，其中所述葡萄糖代谢是本公开化合物或其药学上可接受的盐，并且所述额外剂是细胞质p53稳定剂。在某些实施方案中，癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、心脏癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠癌，头部、脊柱和颈部癌，卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、阴茎癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤癌、胸腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。在某些实施方案中，癌症是神经胶质瘤、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，癌症是多形性胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，方法降低癌细胞增殖。在某些实施方案中，癌症是复发的或难治性的。在其他实施方案中，癌症是治疗原初性的。

在某些实施方案中，已通过包括以下的方法确定受试者易感于葡萄糖代谢抑制剂：

a.从所述受试者获得第一血液样品；

b.将所述受试者置于采用生酮膳食的情况下；

c.在置于采用生酮膳食的情况下一段时期之后从所述受试者获得第二血液样品；

d.测量所述第一血液样品中和所述第二血液样品中的葡萄糖水平；

e.将所述第二血液样品中的葡萄糖水平与所述第一血液样品中的葡萄糖进行比较；以及

f.如果相较于所述第一血液样品中的葡萄糖水平，所述第二血液样品中的葡萄糖水平降低，那么确定所述受试者是易感的。

在某些实施方案中，第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平降低是约或大于0.15mM。在某些实施方案中，第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平降低是约或大于0.20mM。在某些实施方案中，第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平降低在0.15mM-2.0mM的范围内。在某些实施方案中，第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平降低在0.25mM–1.0mM的范围内。

在某些实施方案中，细胞质p53稳定剂是MDM2抑制剂。在某些实施方案中，MDM2抑制剂是努特林(nutlin)。在某些实施方案中，MDM2抑制剂是努特林-3或依达沙努特林。在某些实施方案中，向受试者施用50mg至1600mg依达沙努特林。在某些实施方案中，向受试者施用100mg依达沙努特林。在某些实施方案中，向受试者施用150mg依达沙努特林。在某些实施方案中，向受试者施用300mg依达沙努特林。在某些实施方案中，向受试者施用400mg依达沙努特林。在某些实施方案中，向受试者施用600mg依达沙努特林。在某些实施方案中，向受试者施用1600mg依达沙努特林。在其他实施方案中，MDM2抑制剂是RO5045337、RO5503781、RO6839921、SAR405838、DS-3032、DS-3032b或AMG-232。

在某些实施方案中，细胞质p53稳定剂是BCL-2抑制剂。在某些实施方案中，BCL-2抑制剂是反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维奈托克(venetoclax)(ABT-199)、GDC-0199、奥贝托克(obatoclax)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、纳维托克(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746或APG-1252。

在某些实施方案中，细胞质p53稳定剂是Bcl-xL抑制剂。在某些实施方案中，Bcl-xL抑制剂是WEHI 539、ABT-263、ABT-199、ABT-737、萨布托克(sabutoclax)、AT101、TW-37、APG-1252或藤黄酸(gambogic acid)。

在某些实施方案中，以同一组合物施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。在其他实施方案中，以单独组合物施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。

在某些实施方案中，方法还包括施用额外疗法。

神经胶质瘤的类型和分期

原发性恶性脑肿瘤是起始于脑或脊柱中，总称为神经胶质瘤的肿瘤。神经胶质瘤不是特定类型的癌症，而是用于描述起源于神经胶质细胞的肿瘤的术语。原发性恶性脑肿瘤的实例包括星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、GBM、神经节神经胶质瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤。根据WHO脑肿瘤分类，星形细胞瘤已被分类成通过潜在病理确定的四个等级。用于分类神经胶质瘤的特征包括有丝分裂、细胞或核异型、以及血管增生和具有假性栅栏样特征的坏死。恶性(或高级)神经胶质瘤包括间变性神经胶质瘤(WHO等级III)以及多形性胶质母细胞瘤(GBM；WHO等级IV)。这些是具有最糟预后的最具侵袭性的脑肿瘤。

GBM是最常见、复杂、治疗抗性以及最致命类型的脑癌，占所有脑癌的45％，每年有接近11,000名男性、女性和儿童被确诊。GBM(也被称为4级星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤)是最常见类型的恶性(癌性)原发性脑肿瘤。它们由于许多原因而极具侵袭性。首先，胶质母细胞瘤细胞快速繁殖，因为它们分泌刺激丰富供血的物质。它们还具有通过沿着正常细胞传送肿瘤的显微卷须来长距离侵袭和浸润至正常脑中的能力。已知两种类型的胶质母细胞瘤。原发性GBM是最常见形式；它们快速生长，并且经常在早期导致症状。继发性胶质母细胞瘤是较不常见的，占所有GBM的约10％。它们从低级弥漫性星形细胞瘤或间变性星形细胞瘤进展，并且更经常见于较年轻的患者中。继发性GBM优先位于额叶中，并且具有较好预后。

通常通过包括手术移除肿瘤、放射和化学疗法的组合多模态治疗计划治疗GBM。首先，在手术期间移除尽可能多的肿瘤。肿瘤在脑中的位置经常决定它有多少可被安全移除。在手术之后，放射和化学疗法减缓剩余肿瘤细胞的生长。口服化学疗法药物替莫唑胺最经常使用六周，接着此后每月使用。另一药物贝伐珠单抗(bevacizumab)(被称为

)也在治疗期间使用。这个药物攻击肿瘤募集供血的能力，从而经常使肿瘤生长减缓或甚至停止。

还使用新型探究性治疗，并且这些治疗可涉及将治疗添加至标准疗法中，或用可更好起作用的不同治疗替换标准疗法的一部分。这些治疗中的一些包括免疫疗法诸如疫苗免疫疗法，或对脑的其中存在肿瘤的区域的低剂量电脉冲，以及涉及球形核酸(SNA)诸如NU-0129的纳米疗法。在一些实施方案中，本公开的方法与以上提及的疗法中的一者或多者组合使用。

还考虑本文讨论的方法和组合物的实施方案可应用于其他类型的癌症，包括但不限于肺癌、非CNS癌、CNS癌、以及CNS转移诸如脑转移、柔脑膜转移、脉络膜转移、脊髓转移和其他转移。

细胞质p53稳定剂

发明人已证明诸如用CNS穿透性小分子达成的药理学p53稳定化例如在患者源性原发性GBM模型中与抑制EGFR驱动的葡萄糖摄取具有协同致死性。发明人已首次证明p53的非转录功能可在刺激代谢响应者中的内在凋亡方面具有关键作用。因此，本文所述的治疗方法包括与葡萄糖代谢抑制剂组合施用一种或多种细胞质p53稳定剂。可以同一组合物或以不同组合物并行或依序施用一种或多种细胞质p53稳定剂和葡萄糖代谢抑制剂。预期在一些实施方案中，使用单一p53稳定剂，而在其他实施方案中，使用超过一种p53稳定剂。举例来说，努特林与ABT 737(其结合BCL-2和BCL-X_L)的组合据报道在线粒体水平上协同靶向促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的平衡，由此促进细胞死亡。(Hoe等人2014.Nature Reviews.第13卷第217页)如本文所预期，细胞质p53稳定剂是可直接或间接在药理学上稳定或活化p53的任何小分子、抗体、肽、蛋白质、核酸或它们的衍生物。细胞质p53的稳定化导致对细胞诸如癌细胞进行凋亡致敏。

MDM2拮抗剂

细胞内的p53的蛋白质水平通过它的负性调控物E3泛素蛋白质连接酶MDM2来严密控制并保持低下。在本公开的方法或组合物的实施方案中，细胞质p53稳定剂是MDM2拮抗剂/抑制剂。在一些实施方案中，MDM2拮抗剂是努特林。在其他实施方案中，努特林是努特林-3或依达沙努特林。在其他实施方案中，MDM2拮抗剂是RO5045337(也被称为RG7112)、RO5503781、RO6839921、SAR405838(也被称为MI-773)、DS-3032、DS-3032b或AMG-232或任何其他MDM2抑制剂。

已知会结合MDM-2的在本发明方法的范围内的其他化合物包括Ro-2443、MI-219、MI-713、MI-888、DS-3032b、苯并二氮

二酮(例如TDP521252)、磺酰胺(例如NSC279287)、色烯并三唑并嘧啶、吗啉酮和哌啶酮(AM-8553)、三联苯、查耳酮(chalcone)、吡唑、咪唑、咪唑-吲哚、异吲哚啉酮、吡咯烷酮(例如PXN822)、priaxon、哌啶、天然源性异戊二烯化呫吨酮、SAH-8(订书肽)、sMTide-02、sMTide-02a(订书肽)、ATSP-7041(订书肽)、螺旋寡聚物(α螺旋模拟物)。已知导致MDM2的蛋白质折叠的其他化合物包括PRIMA-1MET(也被称为APR-246)、Aprea 102–105、PK083、PK5174、PK5196、PK7088、苯并噻唑、斑点酸(stictic acid)和NSC319726。

BCL-2抑制剂

在本发明方法或组合物的其他实施方案中，细胞质p53稳定剂是BCL-2抑制剂。在一些实施方案中，BCL-2抑制剂是例如反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维奈托克(ABT-199)、GDC-0199、奥贝托克、太平洋紫杉醇、纳维托克(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746、APG-1252或任何其他BCL-2抑制剂。

Bcl-xL抑制剂

在本发明方法或组合物的其他实施方案中，细胞质p53稳定剂是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，Bcl-xL抑制剂是例如WEHI 539、ABT-263、ABT-199、ABT-737、萨布托克、AT101、TW-37、APG-1252、藤黄酸或任何其他Bcl-xL抑制剂。

评估方法

葡萄糖摄取测试

在本公开的方法和组合物的实施方案中，患有GBM或癌症的受试者被分类为“代谢响应者”或“代谢非响应者”，即被确定易感于葡萄糖代谢抑制剂。在某些实施方案中，对受试者分类在向受试者施用包含葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂的治疗之前。因此，本公开提供了用于评估癌症，对受试者分类，确定受试者对治疗的易感性的方法，涉及分析葡萄糖代谢、糖酵解或葡萄糖摄取。用以将受试者分类为代谢响应者的方法详细描述于实施例1中。用以监测糖酵解和葡萄糖摄取的技术由通过引用并入本文的T.TeSlaa和M.A.Teitell.2014.Methods in Enzymology,第542卷,第92-114页提供。

糖酵解是一分子葡萄糖在细胞内生物化学转化成两分子丙酮酸，同时产生两分子ATP。丙酮酸是具有若干潜在命运的代谢中间物，包括进入线粒体内的三羧酸(TCA)循环以产生NADH和FADH₂。或者，丙酮酸可在胞质溶胶中通过乳酸脱氢酶转化成乳酸，同时从NADH再生NAD⁺。通过糖酵解达成的增加的通量通过提供例如呈ATP形式的额外能量以及用于核苷酸、脂质和蛋白质生物合成的葡萄糖源性代谢中间物来支持癌细胞的增殖。Warburg(Oncologia.1956；9(2):75-83)首先观察到不同于当氧可用时主要进行呼吸的非恶性细胞，增殖中的肿瘤细胞加强有氧糖酵解，即在氧存在下使葡萄糖转化成乳酸。这个线粒体绕道，称为瓦伯格效应(Warburg effect)，发生在包括癌细胞、活化的淋巴细胞和多能干细胞的快速增殖细胞中。瓦伯格效应已被利用来进行临床诊断测试，所述临床诊断测试使用正电子发射断层摄影术(PET)扫描来鉴定氟化葡萄糖类似物诸如¹⁸F-脱氧葡萄糖的细胞摄取增加。

因此，糖酵解代表治疗和诊断方法的靶标。在本发明方法的情形下，对由恶性细胞达成的葡萄糖摄取和乳酸排泄的测量可用于检测葡萄糖分解代谢的转变和/或对葡萄糖代谢抑制剂的易感性。检测此类转变对于治疗GBM的方法、降低无效疗法的风险的方法、用于降低肿瘤存活的机会的方法是重要的。出于本公开的目的，在某些实施方案中，¹⁸F-脱氧葡萄糖PET充当用以预测对p53活化的敏感性的快速非侵袭性功能生物标志。这个非侵袭性分析对于其中药物代谢动力学/药物效应动力学评估是极其困难和不切实际的恶性脑肿瘤可为特别有价值的。在一些情况下，延迟成像方案(41)和参数响应图(PRM)与MRI融合可用于定量肿瘤¹⁸F-FDG摄取的变化(42)。

在某些方面，方法可涉及测量葡萄糖摄取和乳酸产生。对于所培养的细胞，可通过测量葡萄糖摄取和乳酸排泄来定量糖酵解通量。葡萄糖摄取至细胞中是通过葡萄糖转运体(Glut1–Glut4)来达成的，而乳酸排泄是通过在细胞膜处的单羧酸转运体(MCT1–MCT4)来达成的。

细胞外葡萄糖和乳酸

用以检测葡萄糖摄取和乳酸排泄的方法包括例如细胞外葡萄糖或乳酸试剂盒、细胞外生物分析仪、ECAR测量、[3H]-2-DG或[14C]-2-DG摄取、¹⁸FDG摄取或2-NBDG摄取。

可商购获得的试剂盒和仪器可用于定量细胞培养基内的葡萄糖和乳酸水平。试剂盒检测方法通常是比色测定法或荧光测定法，并且可与标准实验室设备诸如分光光度计相容。BioProfile分析仪(诸如Nova Biomedical)或生物化学分析仪(诸如像YSI LifeSciences)可测量细胞培养基中葡萄糖与乳酸两者的水平。GlucCell(Cesco BioProducts)仅可测量细胞培养基中的葡萄糖水平。尽管每种商业方法具有不同检测方案，但用于分析的培养基的收集是相同的。

细胞外酸化速率

还可通过测量周围培养基的细胞外酸化速率(ECAR)测定糖酵解，所述细胞外酸化速率主要来自在从丙酮酸转化成乳酸之后，乳酸的单位时间排泄。Seahorse细胞外通量(XF)分析仪(Seahorse Bioscience)是一种用于同时测量相同细胞中的糖酵解和氧化磷酸化(通过氧消耗)的工具。

葡萄糖类似物摄取

本公开的方法的某些实施方案包括使用葡萄糖类似物。如将为本领域技术人员所熟悉，为测定由细胞达成的葡萄糖摄取速率，可将葡萄糖的经标记亚型添加至细胞培养基中，接着在给定时期之后在细胞内测量。用于这些研究的示例性类型的葡萄糖类似物包括但不限于放射性葡萄糖类似物，诸如2-脱氧-D-[1,2-3H]-葡萄糖、2-脱氧-D-[1-14C]-葡萄糖或2-脱氧-2-(¹⁸F)-氟-D-葡萄糖(¹⁸FDG)，或荧光葡萄糖类似物，诸如2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)。测量放射性葡萄糖类似物摄取需要闪烁计数器，而通常通过流式细胞计量术或荧光显微术测量2-NBDG摄取。在一些实施方案中，通过经放射性标记葡萄糖2-脱氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(¹⁸F-FDG)的摄取来度量葡萄糖摄取。在其他实施方案中，检测¹⁸F-FDG是通过正电子发射断层摄影术(PET)来进行的。在一些实施方案中，从GBM肿瘤获取活检体。测量¹⁸F-FDG的一实例的详细描述提供于以下实施例中。

在某些方面，方法可涉及将生物样品诸如肿瘤样品的葡萄糖摄取与对照进行比较。倍数增加或降低可为、可为至少或可为至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更大、或其中可导出的任何范围。或者，样品与参考之间的表达差异可表示为降低或增加百分比，诸如至少或至多20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000％差异、或其中可导出的任何范围。

用以表示相对表达水平的其他方式采用归一化或相对数值，诸如0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03.0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7.3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，水平可为相对于对照的。

算法诸如加权表决程序可用于促进对生物标志物水平的评估。此外，可将其他临床证据与基于生物标志物的测试组合以降低错误评估的风险。在一些实施方案中，可考虑其他细胞遗传学评估。

合成方法

在另一方面，本公开提供了根据流程1或流程2来制备式I、I*化合物或其药学上可接受的盐的方法：

流程1

流程2

其中：

X是O、S或NH；

Z是芳基或杂芳基；

R¹是烷基；

R^2a和R^2b各自独立地选自氢、烷基、卤基、CN和NO₂；

R³是氢、烷基或酰基；

R⁴是烷氧基；

R⁵是烷基；

R²¹是被离去基团取代的烷基，例如卤代烷基或磺酰基烷基；

B是碱；

Nu是含氮杂环(例如具有至少一个N-H键)、氨基烷基或羟基烷基；

Sv¹是溶剂；并且

n是0-3。

在某些优选实施方案中，R²¹是磺酰基烷基(例如CH₃S(O)₂OCH₂-)。

在某些实施方案中，B是含氮碱(例如三乙胺或二异丙基乙胺)。

在某些实施方案中，Nu是具有至少一个N-H键的含氮杂环(例如吗啉、N-甲基哌嗪、哌啶或吡咯烷)。在其他实施方案中，Nu是氨基烷基(例如二甲胺)。

在某些实施方案中，溶剂是非质子性溶剂(例如二甲基甲酰胺)。

在某些优选实施方案中，方法还包括根据流程3或4的步骤：

流程3

流程4

其中：

R²²是烷基或羟基烷基；

R^23a和R^23b各自是烷基；

R²⁴是氨基芳基或氨基杂芳基；并且

Sv²是酸。

在某些优选实施方案中，R²²是羟基烷基。

在某些实施方案中，R^23a和R^23b各自是甲基。

在某些实施方案中，R²⁴是氨基芳基。在其他实施方案中，R²⁴是氨基杂芳基。

在某些实施方案中，Sv²是烷基酸(例如乙酸)。

在某些优选实施方案中，在115-150℃范围内的温度下进行流程3或4中的步骤。在某些实施方案中，在125-130℃范围内的温度下进行步骤。在某些实施方案中，步骤还包括用碱诸如氢氧化铵处理。

在某些实施方案中，方法还包括纯化步骤。在某些实施方案中，纯化步骤包括柱色谱法、制备型薄层色谱法、或高效液相色谱法。

定义

除非本文另外定义，否则在本申请中使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。通常，与本文所述的化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学以及蛋白质和核酸化学关联使用的命名法以及本文所述的化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学以及蛋白质和核酸化学的技术是本领域中熟知且通常使用的命名法以及技术。

除非另外指示，否则通常根据本领域中熟知以及如本说明书整篇引用和讨论的各种一般性和更特定参考文献中所述的常规方法来进行本公开的方法和技术。参见例如“Principles of Neural Science”,McGraw-Hill Medical,New York,N.Y.(2000)；Motulsky,“Intuitive Biostatistics”,Oxford University Press,Inc.(1995)；Lodish等人,“Molecular Cell Biology,第4版”,W.H.Freeman&Co.,New York(2000)；Griffiths等人,“Introduction to Genetic Analysis,第7版”,W.H.Freeman&Co.,N.Y.(1999)；以及Gilbert等人,“Developmental Biology,第6版”,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(2000)。

除非本文另外定义，否则本文所用的化学术语根据本领域中的常规用法使用，如由“The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms”,Parker S.编,McGraw-Hill,SanFrancisco,C.A.(1985)所例示。

所有以上参考文献以及本申请中提及的任何其他出版物、专利和公布的专利申请都通过引用明确并入本文。在起冲突的情况下，将以包括它的特定定义的本说明书为准。

术语“剂”在本文中用于表示化合物(诸如有机或无机化合物、化合物的混合物)、生物大分子(诸如核酸；抗体，包括其部分以及人源化抗体、嵌合抗体和人抗体和单克隆抗体；蛋白质或其部分，例如肽；脂质；碳水化合物)、或由生物材料诸如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制得的提取物。剂包括例如其结构是已知的剂，以及其结构不是已知的那些剂。此类剂抑制AR或促进AR降解的能力可致使它们适合作为本公开的方法和组合物中的“治疗剂”。

“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用，并且是指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，诸如人、灵长类动物、家畜动物(包括牛科动物、猪科动物等)、伴侣动物(例如犬科动物、猫科动物等)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。

“治疗”疾患或患者是指采取步骤来获得有益或所需结果，包括临床结果。如本文所用以及如本领域中所充分了解，“治疗”是用于获得包括临床结果的有益或所需结果的方法。有益或所需临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或状况，减弱疾病的程度，使疾病的状态稳定(即不恶化)，预防疾病的扩散，延迟或减缓疾病进展，改善或缓和疾病状态，以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测还是不可检测。“治疗”还可意指相较于如果不接受治疗的预期存活期，使存活期延长。

术语“预防”是本领域公知的，并且当关于疾患诸如局部复发(例如疼痛)、疾病诸如癌症、复合型综合征诸如心力衰竭、或任何其他医学状况使用时，是本领域中充分理解的，并且包括施用组合物，相对于未接受所述组合物的受试者，所述组合物降低受试者中的医学状况的症状的频率，或延迟所述症状的发作。因此，预防癌症包括例如相对于未治疗对照群体，降低接受防治性治疗的患者群体中可检测癌性生长物的数目，以及/或者相对于未治疗对照群体，延迟经治疗群体中可检测癌性生长物的出现，例如以统计和/或临床显著数量达成降低和/或延迟。

可使用为本领域技术人员所知的多种方法中的一者进行物质、化合物或剂向受试者的“施用”。举例来说，可以静脉内、经动脉、真皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、经眼、舌下、口服(通过摄取)、鼻内(通过吸入)、脊柱内、脑内和经皮(通过吸收，例如通过皮肤导管)方式施用化合物或剂。还可适当地通过提供化合物或剂的延长、缓慢或控制释放的可再装填或生物可降解聚合装置、或其他装置例如贴片和泵、或制剂来引入化合物或剂。还可例如一次、多次、以及/或者历经一个或多个延长时期进行施用。

将物质、化合物或剂施用至受试者的适当方法还将例如取决于受试者的年龄和/或身体状况、以及化合物或剂的化学和生物性质(例如溶解性、可消化性、生物可用度、稳定性和毒性)。在一些实施方案中，口服施用化合物或剂，例如通过摄取向受试者施用。在一些实施方案中，口服施用的化合物或剂呈延长释放或缓慢释放制剂的形式，或使用用于这种缓慢或延长释放的装置来施用。

如本文所用，短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗剂的任何施用形式，以致当先前施用的治疗剂在身体中仍然有效时施用第二剂(例如两种剂同时在患者中有效，此可包括两种剂的协同作用)。举例来说，可以同一制剂或以单独制剂并行或依序施用不同治疗性化合物。因此，接受这种治疗的个体可受益于不同治疗剂的组合作用。

药物或剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物或剂的当施用至受试者时将具有预定治疗作用的量。通过施用一次剂量未必会发生完全治疗作用，而是可能只有在施用一系列剂量之后发生。因此，可以一次或多次施用来施用治疗有效量。为受试者所需的精确有效量将取决于例如受试者的身材、健康状况和年龄，以及所治疗疾患诸如癌症或MDS的性质和程度。通过常规实验，熟练工作者可易于确定用于给定情况的有效量。

如本文所用，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可发生或可不发生，并且描述包括其中事件或情形发生的情况以及它不发生所处的情况。举例来说，“任选地被取代的烷基”是指烷基可被取代，以及其中烷基未被取代。

应了解，本发明化合物上的取代基和取代样式可由本领域中的熟练人士选择以产生化学稳定化合物，所述化学稳定化合物可通过本领域中已知的技术以及以下阐述的那些方法，从可易于获得的起始物料容易地合成。如果取代基自身被超过一个基团取代，那么应了解这多个基团可在同一碳上或在不同碳上，只要产生稳定结构即可。

如本文所用，术语“任选地被取代”是指用包括但不限于以下的指定取代基的基团替换给定结构中的一个至六个氢基团：羟基、羟基烷基、烷氧基、卤素、烷基、硝基、甲硅烷基、酰基、酰基氧基、芳基、环烷基、杂环基、氨基、氨基烷基、氰基、卤代烷基、卤代烷氧基、-OCO-CH₂-O-烷基、-OP(O)(O-烷基)₂或–CH₂-OP(O)(O-烷基)₂。优选地，“任选地被取代”是指用以上提及的取代基替换给定结构中的一个至四个氢基团。更优选地，由如上提及的取代基替换一个至三个氢基团。应了解取代基可进一步被取代。

如本文所用，术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括但不限于C₁-C₁₀直链烷基或C₁-C₁₀支链烷基。优选地，“烷基”是指C₁-C₆直链烷基或C₁-C₆支链烷基。最优选地，“烷基”是指C₁-C₄直链烷基或C₁-C₄支链烷基。“烷基”的实例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、1-己基、2-己基、3-己基、1-庚基、2-庚基、3-庚基、4-庚基、1-辛基、2-辛基、3-辛基或4-辛基等。“烷基”可任选地被取代。

术语“酰基”是本领域公知的，并且是指由通式烃基C(O)-，优选是烷基C(O)-表示的基团。

术语“酰基氨基”是本领域公知的，并且是指被酰基取代的氨基，并且可例如由式烃基C(O)NH-表示。

术语“酰基氧基”是本领域公知的，并且是指由通式烃基C(O)O-，优选是烷基C(O)O-表示的基团。

术语“烷氧基”是指具有与其连接的氧的烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。

术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基，并且可由通式烷基-O-烷基表示。

术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选实施方案中，直链或支链烷基在它的骨架中具有30个或更少碳原子(例如对于直链是C_1-30，对于支链是C_3-30)，并且更优选是20个或更少碳原子。

此外，如遍及说明书、实施例和权利要求所用的术语“烷基”意图包括未取代的烷基与取代的烷基两者，后者是指具有替换烃骨架的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基部分，包括卤代烷基，诸如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。

术语“C_x-y”或“C_x-C_y”在与化学部分诸如酰基、酰基氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基联合使用时意图包括在链中含有x至y个碳的基团。C₀烷基指示当基团在末端位置中时的氢，如果在内部，那么指示键。举例来说，C_1-6烷基在链中含有一个至六个碳原子。

如本文所用的术语“烷基氨基”是指被至少一个烷基取代的氨基。

如本文所用的术语“烷基硫基”是指被烷基取代的硫醇基团，并且可由通式烷基S-表示。

如本文所用的术语“酰胺”是指基团

其中R⁹和R¹⁰各自独立地表示氢或烃基，或R⁹和R¹⁰与它们所连接的N原子一起形成在环结构中具有4至8个原子的杂环。

术语“胺”和“氨基”是本领域公知的，并且是指未取代的胺与取代的胺两者以及它们的盐，例如可由

表示的部分，

其中R⁹、R¹⁰和R¹⁰’各自独立地表示氢或烃基，或R⁹和R¹⁰与它们所连接的N原子一起形成在环结构中具有4至8个原子的杂环。

如本文所用的术语“氨基烷基”是指被氨基取代的烷基。

如本文所用的术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。

如本文所用的术语“芳基”包括取代的或未取代的单环芳族基团，其中环的每个原子是碳。优选地，环是5至7元环，更优选是6元环。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳为两个邻接环所共有，其中至少一个环是芳族，例如其他环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。芳基包括苯、萘、菲、苯酚、苯胺等。

术语“氨基甲酸酯”是本领域公知的，并且是指基团

其中R⁹和R¹⁰独立地表示氢或烃基。

如本文所用的术语“碳环基烷基”是指被碳环基团取代的烷基。

术语“碳环”包括5-7元单环和8-12元双环。双环碳环的每个环可选自饱和、不饱和和芳族环。碳环包括其中在两个环之间共有一个、两个或三个或更多个原子的双环分子。术语“稠合碳环”是指其中环中的每一者与另一环共有两个相邻原子的双环碳环。稠合碳环的每个环可选自饱和、不饱和和芳族环。在一示例性实施方案中，芳族环例如苯基可稠合于饱和或不饱和环例如环己烷、环戊烷或环己烯。当化合价容许时，饱和、不饱和和芳族双环的任何组合都包括在碳环的定义中。示例性“碳环”包括环戊烷、环己烷、双环[2.2.1]庚烷、1,5-环辛二烯、1,2,3,4-四氢萘、双环[4.2.0]辛-3-烯、萘和金刚烷。示例性稠合碳环包括十氢化萘、萘、1,2,3,4-四氢萘、双环[4.2.0]辛烷、4,5,6,7-四氢-1H-茚和双环[4.1.0]庚-3-烯。“碳环”可在能够携带氢原子的任何一个或多个位置处被取代。

如本文所用的术语“碳环基烷基”是指被碳环基团取代的烷基。

术语“碳酸酯”是本领域公知的，并且是指基团-OCO₂-。

如本文所用的术语“羧基”是指由式-CO₂H表示的基团。

如本文所用的术语“酯”是指基团-C(O)OR⁹，其中R⁹表示烃基。

如本文所用的术语“醚”是指通过氧连接于另一烃基的烃基。因此，烃基的醚取代基可为烃基-O-。醚可为对称的或不对称的。醚的实例包括但不限于杂环-O-杂环和芳基-O-杂环。醚包括“烷氧基烷基”，其可由通式烷基-O-烷基表示。

如本文所用的术语“卤基”和“卤素”意指卤素，并且包括氯基、氟基、溴基和碘基。

如本文所用的术语“杂芳烷基(hetaralkyl/heteroaralkyl)”是指被杂芳基取代的烷基。

术语“杂芳基(heteroaryl/hetaryl)”包括其环结构包括至少一个杂原子，优选是一个至四个杂原子，更优选是一个或两个杂原子的取代的或未取代的芳族单环结构，优选是5至7元环，更优选是5至6元环。术语“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳为两个邻接环所共有，其中至少一个环是杂芳族，例如其他环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。

如本文所用的术语“杂原子”意指除碳或氢以外的任何元素的原子。优选杂原子是氮、氧和硫。

如本文所用的术语“杂环基烷基”是指被杂环基团取代的烷基。

术语“杂环基”、“杂环”和“杂环的”是指其环结构包括至少一个杂原子，优选是一个至四个杂原子，更优选是一个或两个杂原子的取代的或未取代的非芳族环结构，优选是3至10元环，更优选是3至7元环。术语“杂环基”和“杂环的”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳为两个邻接环所共有，其中至少一个环是杂环，例如其他环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂环基包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。

如本文所用的术语“烃基”是指通过不具有＝O或＝S取代基的碳原子键合，并且通常具有至少一个碳-氢键以及主要是碳的骨架，但可任选地包括杂原子的基团。因此，出于本申请的目的，如甲基、乙氧基乙基、2-吡啶基以及甚至三氟甲基的基团被视为烃基，但诸如乙酰基(其在连接碳上具有＝O)和乙氧基(其通过氧而非碳连接)的取代基不被视为烃基。烃基包括但不限于芳基、杂芳基、碳环、杂环、烷基、烯基、炔基、以及它们的组合。

如本文所用的术语“羟基烷基”是指被羟基取代的烷基。

术语“低级”在与化学部分诸如酰基、酰基氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基联合使用时意图包括其中在取代基中存在十个或更少原子，优选是六个或更少原子的基团。“低级烷基”例如是指含有十个或更少碳原子，优选是六个或更少碳原子的烷基。在某些实施方案中，本文定义的酰基、酰基氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基取代基分别是低级酰基、低级酰基氧基、低级烷基、低级烯基、低级炔基或低级烷氧基，无论它们单独出现还是与其他取代基组合出现，诸如在叙述羟基烷基和芳烷基(在所述情况下，例如当计数烷基取代基中的碳原子时不计数芳基内的原子)的情况下。

术语“多环基”、“多环”和“多环的”是指两个或更多个环(例如环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基)，其中两个或更多个原子为两个邻接环所共有，例如环是“稠环”。多环的环中的每一者可被取代或未被取代。在某些实施方案中，多环的每个环在环中含有3至10个原子，优选是5至7个原子。

术语“硫酸酯”是本领域公知的，并且是指基团–OSO₃H或其药学上可接受的盐。

术语“磺酰胺”是本领域公知的，并且是指由通式

表示的基团，

其中R⁹和R¹⁰独立地表示氢或烃基。

术语“亚砜”是本领域公知的，并且是指基团–S(O)-。

术语“磺酸酯”是本领域公知的，并且是指基团SO₃H或其药学上可接受的盐。

术语“砜”是本领域公知的，并且是指基团–S(O)₂-。

术语“取代的”是指部分具有替换骨架的一个或多个碳上的氢的取代基。应了解“取代”或“被……取代”包括隐含条件，即此取代符合取代的原子和取代基的容许化合价，并且取代产生稳定化合物，例如不自发经受诸如通过重排、环化、消除等达成的转化的稳定化合物。如本文所用，考虑术语“取代的”包括有机化合物的所有可容许取代基。在一广泛方面，可容许取代基包括有机化合物的无环和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。适当有机化合物的可容许取代基可为一个或多个，并且相同或不同。出于本发明的目的，杂原子诸如氮可具有氢取代基以及/或者本文所述的有机化合物的符合杂原子的化合价的任何可容许取代基。取代基可包括本文所述的任何取代基，例如卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、氢硫基、烷基硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基、或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员应了解如果适当，那么在烃链上取代的部分自身可被取代。

如本文所用的术语“硫烷基”是指被硫醇基团取代的烷基。

如本文所用的术语“硫酯”是指基团-C(O)SR⁹或–SC(O)R⁹，

其中R⁹表示烃基。

如本文所用的术语“硫醚”等同于醚，其中氧被硫替换。

术语“脲”是本领域公知的，并且可由通式

表示，

其中R⁹和R¹⁰独立地表示氢或烃基。

如本文所用的术语“调节”包括抑制或阻抑功能或活性(诸如细胞增殖)，以及增强功能或活性。

短语“药学上可接受的”是本领域公知的。在某些实施方案中，所述术语包括在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称的组合物、赋形剂、佐剂、聚合物以及其他材料和/或剂型。

“药学上可接受的盐”或“盐”在本文中用于指代适于治疗患者或可与对患者的治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。

如本文所用的术语“药学上可接受的酸加成盐”意指由式I表示的任何碱化合物的任何无毒有机或无机盐。形成适合盐的说明性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸、以及金属盐诸如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成适合盐的说明性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸，诸如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、顺丁烯二酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸以及磺酸诸如对甲苯磺酸和甲烷磺酸。可形成单酸盐或二酸盐，并且此类盐可以水合、溶剂化或大致上无水形式存在。一般来说，相较于式I化合物的游离碱形式，它们的酸加成盐更可溶于水和各种亲水性有机溶剂中，并且通常显示较高熔点。对适当盐的选择将为本领域技术人员所知。可其他非药学上可接受的盐例如草酸盐例如用于分离式I化合物以供实验室使用，或供后续转化成药学上可接受的酸加成盐。

如本文所用的术语“药学上可接受的碱加成盐”意指由式I表示的任何酸化合物或它们的任何中间体的任何无毒有机或无机碱加成盐。形成适合盐的说明性无机碱包括锂、钠、钾、钙、镁或钡的氢氧化物。形成适合盐的说明性有机碱包括脂族、脂环族或芳族有机胺，诸如甲胺、三甲胺和甲基吡啶或氨。对适当盐的选择将为本领域技术人员所知。

可用于本公开的方法和组合物中的化合物中的许多在它们的结构中具有至少一个立体中心。这个立体中心可以R或S构型存在，所述R和S符号与Pure Appl.Chem.(1976),45,11-30中所述的规则一致加以使用。本公开考虑化合物、其盐、前药或混合物的所有立体异构形式，诸如对映异构和非对映异构形式(包括立体异构体的所有可能的混合物)。参见例如WO 01/062726。

此外，含有烯基的某些化合物可作为Z(顺式)或E(反式)异构体存在。在每种情况下，本公开包括混合物与单独单个异构体两者。

一些化合物还可以互变异构形式存在。尽管未在本文所述的式中明确指示，但此类形式意图包括在本公开的范围内。

“前药”或“药学上可接受的前药”是指在施用之后在宿主中代谢例如水解或氧化以形成本公开的化合物(例如式I化合物)的化合物。前药的典型实例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不稳定或可裂解(保护)基团的化合物。前药包括可被氧化、还原、胺化、脱胺化、羟基化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化和/或脱磷酸化以产生活性化合物的化合物。使用酯或氨基磷酸酯作为生物不稳定或可裂解(保护)基团的前药的实例公开于美国专利6,875,751、7,585,851和7,964,580中，所述美国专利的公开内容通过引用并入本文。本公开的前药被代谢以产生式I化合物。本公开在它的范围内包括本文所述的化合物的前药。用于选择和制备适合前药的常规程序例如描述于“Designof Prodrugs”H.Bundgaard编,Elsevier,1985中。

如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指可用于配制供医学或治疗使用的药物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。

如本文所用的术语“溶解度对数”、“LogS”或“logS”在本领域中用于定量化合物的水溶性。化合物的水溶性显著影响它的吸收和分布特征。低溶解性经常与不良吸收相伴。LogS值是以摩尔/升测量的溶解度的单位剥离对数(以10为底)。

药物组合物

本发明的组合物和方法可用于治疗有需要的个体。在某些实施方案中，个体是哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物。当施用至动物诸如人时，组合物或化合物优选地以包含例如本发明化合物和药学上可接受的载体的药物组合物形式施用。药学上可接受的载体在本领域中是熟知的，并且包括例如水溶液诸如水或生理缓冲盐水，或其他溶剂或媒介物，诸如二醇、甘油、油诸如橄榄油、或可注射有机酯。在优选实施方案中，当此类药物组合物用于人类施用时，特别是对于侵袭性施用途径(即绕过通过上皮屏障进行的运输或扩散的途径，诸如注射或植入)，水溶液是无热原的，或大致上无热原的。可选择赋形剂例如以实现剂的延迟释放，或选择性靶向一种或多种细胞、组织或器官。药物组合物可呈剂量单位形式，诸如片剂、胶囊(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、颗粒剂、用于复原的亲液胶体、粉剂、溶液、糖浆、栓剂、注射剂等。组合物还可存在于经皮递送系统例如皮肤贴片中。组合物还可存在于适于表面施用的溶液诸如洗剂、乳膏剂或软膏剂中。

药学上可接受的载体可含有例如起稳定化合物诸如本发明化合物，增加所述化合物的溶解性，或增加所述化合物的吸收的作用的生理上可接受的剂。此类生理上可接受的剂包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。对包括生理上可接受的剂的药学上可接受的载体的选择例如取决于组合物的施用途径。制剂或药物组合物可为自乳化药物递送系统或自微乳化药物递送系统。药物组合物(制剂)还可为脂质体或其他聚合物基质，其可已在其中并有例如本发明化合物。例如包含磷脂或其他脂质的脂质体是制备和施用相对简单的无毒、生理上可接受和可代谢的载体。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指代在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。每种载体在可与制剂的其他成分相容，并且不对患者有害的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格氏溶液(Ringer's solution)；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)用于药物制剂中的其他无毒可相容物质。

可通过许多施用途径中的任一者将药物组合物(制剂)施用至受试者，包括例如口服(例如如在水性或非水性溶液或悬浮液中的灌服剂、片剂、胶囊(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、用于施加至舌部的糊剂)；通过口腔粘膜来吸收(例如舌下)；皮下；经皮(例如以施加至皮肤的贴片形式)；以及经表面(例如以施加至皮肤的乳膏剂、软膏剂或喷雾剂形式)。化合物还可被配制用于吸入。在某些实施方案中，可简单地将化合物溶解或悬浮于无菌水中。适当施用途径以及适于所述施用途径的组合物的细节可例如见于美国专利第6,110,973、5,763,493、5,731,000、5,541,231、5,427,798、5,358,970和4,172,896号中以及其中引用的专利中。

制剂可宜以单位剂型呈现，并且可通过制药领域中熟知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将视所治疗宿主、特定施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量通常将是化合物的产生治疗作用的那个量。通常，在100份之中，这个量将在约1％至约99％的活性成分的范围内，优选是约5％至约70％，最优选是约10％至约30％。

制备这些制剂或组合物的方法包括使活性化合物诸如本发明化合物与载体以及任选的一种或多种辅助成分联合的步骤。一般来说，通过均一地和紧密地使本发明化合物与液体载体或精细分散的固体载体或两者联合，接着如果必要，那么使产物成形来制备制剂。

适于口服施用的本发明制剂可呈胶囊(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、扁囊剂、丸剂、片剂、糖锭(使用经调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、亲液胶体、粉剂、颗粒剂的形式，或呈于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液形式，或呈水包油或油包水液体乳液形式，或呈酏剂或糖浆形式，或呈软锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)形式，以及/或者呈漱口剂形式等，各自含有预定量的本发明化合物作为活性成分。组合物或化合物还可以大丸剂、药糖剂或糊剂形式施用。

为制备用于口服施用的固体剂型(胶囊(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、片剂、丸剂、糖衣片、粉剂、颗粒剂等)，使活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合，所述载体诸如是柠檬酸钠或磷酸二钙、以及/或者以下中的任一者：(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如像羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7)湿润剂，诸如像鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、以及它们的混合物；(10)络合剂，诸如改性和未改性环糊精；和(11)着色剂。在胶囊(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可在使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软质和硬质填充明胶胶囊中用作填充剂。

可通过任选地与一种或多种辅助成分一起压制或模制来制备片剂。可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压制片剂。可通过在适合机器中模制湿润粉状化合物与惰性液体稀释剂的混合物来制备模制片剂。

可任选地将药物组合物的片剂和其他固体剂型诸如糖衣片、胶囊(包括撒布胶囊和明胶胶囊)、丸剂和颗粒剂刻痕或制备有包衣和壳体，诸如肠溶性包衣和药物配制领域中熟知的其他包衣。还可使用例如用以提供所需释放概况的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球体来配制它们以便提供其中活性成分的缓慢或控制释放。可通过例如经细菌截留过滤器过滤，或通过并有可在使用之前即刻溶解于无菌水或某一其他无菌可注射介质中的呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来对它们灭菌。这些组合物还可任选地含有遮光剂，并且可具有它们仅或优先在胃肠道的某一部分中任选地以延迟方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果适当，那么活性成分也可与上述赋形剂中的一者或多者一起呈微囊封形式。

可用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、用于复原的亲液胶体、微乳液、溶液、混悬剂、糖浆和酏剂。除活性成分之外，液体剂型还可含有在本领域中通常使用的惰性稀释剂，例如像水或其他溶剂；环糊精及其衍生物；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙脂、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇以及脱水山梨醇的脂肪酸酯；以及它们的混合物。

除惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括佐剂，诸如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除活性化合物之外，混悬剂还可含有助悬剂，如例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶、以及它们的混合物。

用于表面或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴片和吸入剂。可在无菌条件下使活性化合物与药学上可接受的载体，以及与可需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。

除活性化合物之外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂也可含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌、或它们的混合物。

除活性化合物之外，粉剂和喷雾剂还可含有赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末、或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有惯用推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未取代烃，诸如丁烷和丙烷。

经皮贴片具有提供本发明化合物向身体的控制递送的附加优势。可通过将活性化合物溶解或分散于适当介质中来制备此类剂型。吸收增强剂也可用于增加化合物穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制此通量的速率。

如本文所用的短语“胃肠外施用”和“以胃肠外方式施用”意指除经肠和表面施用以外的通常通过注射达成的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。适于胃肠外施用的药物组合物包含一种或多种与以下各物组合的活性化合物：一种或多种药学上可接受的无菌等张水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液；或可就在使用之前复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，所述各物可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质、或助悬剂或增稠剂。

可用于本发明的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及它们的适合混合物、植物油诸如橄榄油、以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。可例如通过使用包覆材料诸如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。

这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保对微生物作用的预防。也可合乎需要的是将等张剂诸如糖、氯化钠等包括至组合物中。此外，可通过包括延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成可注射药物形式的延长吸收。

在一些情况下，为延长药物的作用，可合乎需要的是减缓皮下或肌肉内注射的药物的吸收。这可通过使用具有不良水溶性的结晶或非晶材料的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率于是取决于它的溶解速率，所述溶解速率转而可取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将药物溶解或悬浮于油媒介物中来实现胃肠外施用的药物形式的延迟吸收。

通过形成主题化合物于生物可降解聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中的微囊封基质来制备可注射储库形式。视药物与聚合物的比率以及采用的特定聚合物的性质而定，可控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。还通过将药物包封在可与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库可注射制剂。

对于在本发明方法中使用，可给与活性化合物本身，或以含有例如与药学上可接受的载体组合的0.1至99.5％(更优选是0.5至90％)的活性成分的药物组合物形式给与活性化合物。

还可通过可再装填或生物可降解装置提供引入方法。近年来，已开发各种缓慢释放聚合装置并在体内测试以用于包括蛋白质生物药物的药物的控制递送。多种生物可相容聚合物(包括水凝胶)，包括生物可降解聚合物与非可降解聚合物两者，可用于形成用于在特定靶标部位处持续释放化合物的植入物。

可改变药物组合物中活性成分的实际剂量水平以便获得活性成分的有效实现为特定患者、组合物和施用模式所需的治疗响应而对患者无毒的量。

选择的剂量水平将取决于多种因素，包括采用的特定化合物或化合物的组合、或它们的酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所采用的一种或多种特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的一种或多种特定化合物组合的其他使用药物、化合物和/或材料；所治疗患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康状况和先前医学史；以及医学领域中熟知的类似因素。

具有本领域中的普通技术的医师或兽医可易于确定和指定所需药物组合物的治疗有效量。举例来说，医师或兽医可在低于为实现所需治疗作用所需的水平的水平下开始药物组合物或化合物的剂量，并且逐渐增加剂量直至实现所需作用。就“治疗有效量”来说，其意指化合物的足以引发所需治疗作用的浓度。通常了解的是，化合物的有效量将根据受试者的重量、性别、年龄和医学史而变化。影响有效量的其他因素可包括但不限于患者的疾患的严重性、所治疗病症、化合物的稳定性，以及如果需要，与本发明化合物一起施用的另一类型的治疗剂。可通过剂的多次施用来递送较大总剂量。用以确定功效和剂量的方法为本领域技术人员所知(Isselbacher等人(1996)Harrison’s Principles of InternalMedicine第13版,1814-1882，通过引用并入本文)。

一般来说，本发明的组合物和方法中使用的活性化合物的适合每日剂量将是化合物的作为有效产生治疗作用的最低剂量的那个量。此种有效剂量将通常取决于上述因素。

如果需要，那么可以全天在适当间隔下，任选地以单位剂型分开施用的一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多次亚剂量形式施用活性化合物的有效每日剂量。在本发明的某些实施方案中，可每日两次或三次施用活性化合物。在优选实施方案中，将每日一次施用活性化合物。

接受这个治疗的患者是任何有需要的动物，包括灵长类动物，特别是人；和其他哺乳动物，诸如马科动物、牛、猪、绵羊、猫和狗；家禽；以及一般来说，宠物。

在某些实施方案中，本发明化合物可单独使用或与另一类型的治疗剂联合施用。

本公开包括在本发明的组合物和方法中使用本发明化合物的药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所考虑的本发明的盐包括但不限于烷基、二烷基、三烷基或四烷基铵盐。在某些实施方案中，所考虑的本发明的盐包括但不限于L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星(benzathine)、甜菜碱、氢氧化钙、胆碱、丹醇(deanol)、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙基氨基)乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基还原葡糖胺、海卓胺(hydrabamine)、1H-咪唑、锂、L-赖氨酸、镁、4-(2-羟乙基)吗啉、哌嗪、钾、1-(2-羟乙基)吡咯烷、钠、三乙醇胺、缓血酸胺和锌盐。在某些实施方案中，所考虑的本发明的盐包括但不限于Na、Ca、K、Mg、Zn或其他金属盐。在某些实施方案中，所考虑的本发明的盐包括但不限于1-羟基-2-萘甲酸、2,2-二氯乙酸、2-羟基乙烷磺酸、2-酮戊二酸、4-乙酰胺基苯甲酸、4-氨基水杨酸、乙酸、己二酸、l-抗坏血酸、l-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、(+)-樟脑酸、(+)-樟脑-10-磺酸、癸酸(capric acid/decanoicacid)、己酸(caproic acid/hexanoic acid)、辛酸(caprylic acid/octanoic acid)、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、甲酸、反丁烯二酸、半乳糖二酸、龙胆酸、d-葡庚糖酸、d-葡萄糖酸、d-葡萄糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、l-苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、烟酸、硝酸、油酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸(pamoic acid)、磷酸、丙酸、l-焦谷氨酸、水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、硫酸、l-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸和十一碳烯酸盐。

药学上可接受的酸加成盐还可以诸如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺等的各种溶剂化物形式存在。还可制备此类溶剂化物的混合物。此溶剂化物的来源可为来自结晶的溶剂，可为制备或结晶的溶剂中固有的，或对于此溶剂来说可为外来的。

湿润剂、乳化剂和润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁、以及着色剂、释放剂、包覆剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

实施例

现已大体上描述了本发明，通过参考以下实施例，它将更易于被理解，所述实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的而被包括，并且不意图限制本发明。

实施例1：JGK系列的示例性化合物的制备

一般性程序：可通过以下描述的方法或通过任何其他适合方法制备JGK系列的化合物。JGK系列化合物有时在本文中以JCN前缀提及。所有反应都以常规方式在惰性氩气氛围下进行。除非另外指示，否则材料从商业供应商获得，并且不经纯化即使用。所有溶剂都就在使用之前通过标准技术纯化和干燥。从钠和二苯甲酮新鲜蒸馏THF和Et₂O。通过用CaH₂回流来纯化二氯甲烷、甲苯和苯。通过薄层色谱法(Kieselgel 60F254，Merck)检查反应。通过在紫外光下察看，以及通过在浸渍于对甲氧基苯甲醛溶液或磷钼酸溶液中之后炭化着色来检测斑点。在水性后处理中，所有有机溶液都经无水硫酸镁干燥并过滤，随后在水泵压力下旋转蒸发。通过硅胶(SilicaFlash P60，230-400目，SiliCycle Inc)柱色谱法来纯化粗化合物。在Bruker AV 400(400/100MHz)或Bruker AV500(500/125MHz)波谱仪上获得质子(¹H)和碳(¹³C)NMR波谱。化学位移以ppm单位报告，以Me₄Si或CHCl₃作为内部标准物。裂分样式由s，单峰；d，双重峰；t，三重峰；m，多重峰；b，宽峰指定。使用具有IonSense ID-CUBEDART源的Thermo Fisher Scientific Exactive Plus获得高分辨率质谱测定法数据。

JGK001、JGK003的制备

[JGK001]在室温下向厄洛替尼(134mg,0.3406mmol)于无水甲醇(5.0mL)中的溶液中一次性添加二碳酸二叔丁酯(228mg,1.7029mmol)。在相同温度下搅拌48小时之后，在真空中浓缩。将反应混合物用H₂O(30mL)和EtOAc(30mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1)来纯化以产生JGK001(156mg,73％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.86(s,1H),7.43(s,1H),7.20-7.23(m,2H),7.16(td,J＝1.2,7.6Hz,1H),7.09(d,J＝8.0Hz,1H),4.16-4.25(m,4H),3.80(t,J＝5.2Hz,2H),3.77(t,J＝5.2Hz,2H),3.45(s,3H),3.44(s,3H),3.44(s,3H),3.03(s,1H),1.55(s,9H),1.11(s,9H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ152.1,151.5,149.2,148.8,145.7,142.7,130.6,128.9,127.4,125.3,122.6,121.5,114.7,111.4,108.0,90.7,83.7,83.3,82.9,76.8,70.9,70.7,68.8,68.7,59.2,59.1,55.0,28.2,27.3；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：626.3061[C₃₃H₄₃N₃O₉的计算值：625.2993]。

[JGK003]在室温下向厄洛替尼(101mg,0.2567mmol)于无水乙醇(2.6mL)中的溶液中一次性添加二碳酸二叔丁酯(172mg,1.2836mmol)。在相同温度下搅拌48小时之后，在真空中浓缩。将反应混合物用H₂O(30mL)和EtOAc(30mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1)来纯化以产生JGK003(117mg,71％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.86(s,1H),7.43(s,1H),7.34(s,1H),7.21-7.24(m,2H),7.16(d,J＝7.6Hz,1H),7.10(d,J＝7.6Hz,1H),4.17-4.25(m,4H),3.61-3.82(m,6H),3.46(s,3H),3.45(s,3H),3.02(s,1H),1.55(s,9H),1.23(t,J＝6.8Hz,3H),1.12(s,9H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ152.0,151.4,149.2,148.9,145.5,143.0,130.8,128.8,127.3,125.3,122.5,121.7,114.7,111.3,107.9,89.3,83.7,83.2,82.8,76.7,70.9,70.7,68.8,68.6,63.0,59.2,59.1,28.2,27.4,14.6；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：640.3211[C₃₄H₄₅N₃O₉的计算值：639.3150]。

JGK002的制备

向厄洛替尼(165mg,0.4194mmol)的固体中添加乙酸酐(5.0mL)。在90℃(浴温)下在搅拌下加热3天之后，使反应混合物冷却至室温并用饱和NaHCO₃水溶液(20mL)中和，并且用EtOAc(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，1/1至1/3)来纯化以产生JGK002(161mg，88％分离产率)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.06(s,1H,),7.45(t,J＝1.6Hz,1H,),7.37-7.39(m,2H),7.36(s,1H),7.30-7.34(m,1H),7.15(s,1H),4.32(t,J＝4.8Hz,2H),4.16(t,J＝4.8Hz,2H),3.86(t,J＝4.8Hz,2H),3.79(t,J＝4.8Hz,2H),3.46(s,3H),3.45(s,3H),3.06(s,1H),2.14(s,3H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ170.5,158.8,156.1,153.5,151.1,150.8,141.0,130.9,130.3,129.3,127.5,123.4,117.2,107.9,103.1,82.4,78.4,70.6,70.3,68.9,68.7,59.3,59.3,23.7；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：436.1811[C₂₄H₂₅N₃O₅的计算值：435.1788]。

JGK010、JGK032的制备-用于用苯胺类似物替代的一般性程序

[环化]在室温下在Ar下，向二醇2(530mg,2.6959mmol)于DMF中的溶液(13.5mL,0.2M)中一次性添加碳酸钾(1490mg)，继之以连续逐滴添加1-溴-2-氯乙烷(1.3mL)。在60℃(浴温)下在搅拌下加热24小时之后，使反应混合物冷却至室温，用H₂O(50mL)淬灭。分离各层，并且将水层用EtOAc(50mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，6/1至3/1)来纯化以产生稠合氯喹唑啉3(404mg,67％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.84(s,1H),7.64(s,1H),7.47(s,1H),4.43-4.45(m,2H),4.39-4.42(m,2H)。[已知化合物；Chilin,A.等人J.Med.Chem.2010,53,1862-1866]

[JGK010]在室温下向稠合氯喹唑啉3(114mg,0.5120mmol)于DMF(2.6mL)中的溶液中逐滴添加3-氯-2-氟苯胺(0.10mL)。在60℃(浴温)下在搅拌下加热24小时之后，使反应混合物冷却至室温，并且用Et₂O(30.0mL)稀释以产生白色悬浮液。将所得白色固体相继用Et₂O(2×50mL)洗涤并收集以产生JGK010(140mg,82％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.68(s,1H),8.59(ddd,J＝3.2,6.8,6.8Hz,1H),7.39(s,1H),7.34(s,1H),7.29(s,1H),7.10-7.18(m,2H),4.38-4.43(m,4H)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.78(s,1H),8.79(s,1H),8.45(s,1H),7.62(t,J＝7.0Hz,1H),7.50(t,J＝7.0Hz,1H),7.43(s,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),4.46-4.53(m,2H),4.40-4.52(m,2H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ159.8,154.0,152.2,149.9,145.7,135.2,129.9,128.1,126.4,125.8,120.9,111.3,108.1,105.8,65.5,64.6；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：332.0551[C₁₆H₁₁ClFN₃O₂的计算值：331.0518]。

JGK005的制备

在室温下向稠合氯喹唑啉3(14mg,0.0628mmol)于CH₃CN(2.0mL)中的溶液中逐滴添加3-乙炔基苯胺(0.05mL)。在80℃(浴温)下在搅拌下加热12小时之后，使反应混合物冷却至室温，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1)来纯化以产生JGK005(10mg,52％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.45(s,1H),8.43(s,1H),8.04-8.05(m,2H),7.87-7.90(m,1H),7.34(t,J＝7.9Hz,1H),7.14-7.16(m,2H),4.35-4.39(m,4H),4.14(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ156.8,153.3,149.5,146.5,144.1,140.2,129.3,126.7,124.9,122.7,122.1,113.0,110.4,108.8,84.0,80.9,64.9,64.6；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：304.1079[C₁₈H₁₃N₃O₂的计算值：303.1002]。

JGK025

JGK025的制备遵循一般性程序；JGK025(25％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.30(s,1H),8.73(s,1H),8.28(s,1H),7.51-7.58(m,1H),7.41-7.48(m,1H),7.35(s,1H),7.17-7.23(m,1H),4.44-4.50(m,2H),4.39-4.44(m,2H)；¹³C NMR(125MHz,MeOD)δ161.6(J＝245.9Hz),160.0,157.6(J＝249.6Hz),152.1,150.1,145.6,135.4,130.4,121.4,112.4,110.9,108.1,108.1,105.4,65.5,64.6；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：316.0890[C₁₆H₁₁F₂N₃O₂的计算值：315.0813]。

JGK026

JGK026的制备遵循一般性程序；JGK026(22％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.09(s,1H),8.74(s,1H),8.18(s,1H),7.39-7.51(m,2H),7.30(s,1H),7.23-7.29(m,1H),4.45-4.49(m,2H),4.40-4.44(m,2H)；¹³C NMR(125MHz,MeOD)δ159.8,158.1(J＝239.6Hz),153.7(J＝243.2Hz),152.1,150.1,145.7,135.7,126.0,117.9,117.8,116.0,110.9,108.2,106.2,65.5,64.6；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：316.0893[C₁₆H₁₁F₂N₃O₂的计算值：315.0813]。

JGK027

JGK027的制备遵循一般性程序；JGK027(6％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.23(bs,1H),8.75(s,1H),8.29(s,1H),7.91(s,1H),7.46-7.55(m,1H),7.29(t,J＝8.1Hz,2H),4.46-4.50(m,2H),4.40-4.46(m,2H)；¹³C NMR(125MHz,MeOD)δ163.6,160.7,160.4,158.4,152.5,151.5,146.2,130.6,115.6,113.5,113.4,111.9,109.3,108.2,66.2,65.3；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：316.0889[C₁₆H₁₁F₂N₃O₂的计算值：315.0813]。

JGK028

JGK028的制备遵循一般性程序；JGK028(41％)；¹H NMR(500MHz,MeOD)δ8.64(s,1H),8.03(s,1H),7.31-7.38(m,2H),7.24-7.31(m,2H),4.50-4.55(m,2H),4.44-4.50(m,2H)；¹³C NMR(125MHz,MeOD)δ160.1,152.8,150.9(J＝245.6Hz),149.0,146.2,145.9(J＝249.7Hz),134.6,126.0,124.0,123.1,116.2,109.8,107.8,105.0,65.2,64.2；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：316.0884[C₁₆H₁₁F₂N₃O₂的计算值：315.0813]。

JGK029

JGK029的制备遵循一般性程序；JGK029(52％)；¹H NMR(500MHz,MeOD)δ8.60(s,1H),7.98(s,1H),7.29(s,1H),7.07-7.13(m,2H),4.50-4.53(m,2H),4.44-4.48(m,2H)；¹³CNMR(125MHz,DMSO-d₆)δ161.7,160.3,158.6,158.1,153.2,150.3,144.4,143.7,117.2,113.8,113.0,112.3,109.5,101.5,65.3,64.5；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：334.0794[C₁₆H₁₀F₃N₃O₂的计算值：333.0719]。

JGK017

JGK017的制备遵循一般性程序；JGK017(5％)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.59(s,1H),8.15(d,J＝8.3Hz,1H),7.49(t,J＝8.1Hz,1H),7.38(s,1H),7.34(d,J＝7.9Hz,1H),7.21(s,1H),4.41-4.42(m,2H),4.38-4.40(m,2H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ156.4,153.2,149.7,146.7,144.5,138.4,133.5,132.2,128.2,125.4,119.9,119.7,114.3,110.4,105.7,64.5,64.3。

JGK004的制备

[苯甲酰化]在Ar下向二醇2(205mg,1.0428mmol)于无水CH₂Cl₂中的冷却(0℃)溶液(5.2mL,0.2M)中相继逐滴添加吡啶(0.5mL)和苯甲酰氯(0.7mL)。在室温下搅拌12小时之后，将反应混合物用饱和NH₄Cl水溶液(20mL)淬灭，并且用CH₂Cl₂(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用CH₂Cl₂(2×50mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，10/1)来纯化以产生苯甲酰基氯喹唑啉2-(2)(220mg,52％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.07(s,1H),8.31(s,1H),8.16(s,1H),8.04-8.07(m,4H),7.53-7.58(m,2H),7.34-7.39(m,4H)。

[JGK004]在室温下向苯甲酰基氯喹唑啉2-(2)(180mg,0.444mmol)于CH₃CN(3.0mL)中的溶液中逐滴添加3-氯-2-氟苯胺(0.06mL,0.533mmol)。在80℃(浴温)下在搅拌下加热15小时之后，使反应混合物冷却至室温，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1)来纯化以产生JGK004(109mg,48％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.85(s,1H),8.48-8.53(m,1H),8.08(t,J＝7.2Hz,4H),7.99(d,J＝3.2Hz,2H),7.51-7.59(m,3H),7.39(dd,J＝8.4,16.0Hz,4H),7.16-7.21(m,2H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ164.2,163.7,156.6,155.1,150.6,149.1,148.6,147.5,142.1,134.1,134.1,130.3,130.2,128.6,128.6,128.1,128.0,127.9,127.8,125.3,124.6,124.5,122.9,121.6,121.0,120.9,114.4,113.3；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：514.0963[C₂₈H₁₇ClFN₃O₄的计算值：513.0886]。

JGK006的制备

在室温下向苯甲酰基氯喹唑啉2-(2)(100mg,0.247mmol)于CH₃CN(3.0mL)中的溶液中逐滴添加3-乙炔基苯胺(0.05mL,0.430mmol)。在50℃(浴温)下在搅拌下加热24小时之后，使反应混合物冷却至室温，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，4/1)来纯化以产生JGK006(48mg,40％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.71(s,1H),8.03(d,J＝8.0Hz,2H),7.96(s,1H),7.90-7.95(m,2H),7.79(s,1H),7.62-7.75(m,3H),7.55(t,J＝7.3Hz,1H),7.48(t,J＝7.5Hz,1H),7.37(t,J＝7.4Hz,2H),7.22-7.31(m,4H),3.04(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ164.8,163.9,156.7,155.3,148.9,146.9,141.3,138.1,134.1,134.0,130.3,130.1,128.9,128.6,128.5,128.1,128.0,127.9,124.8,122.7,122.4,122.1,115.1,113.1,83.3；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：486.1443[C₃₀H₁₉N₃O₄的计算值：485.1370]

JGK032的制备

通过在室温下将氯化氢溶液(0.1mL，4.0M，于二噁烷中，0.4mmol)添加至THF(0.3mL)中来产生1.0M氯化氢溶液。在室温下向JGK010(6.1mg,0.01839mmol)于MeOH中的溶液中逐滴添加以上产生的氯化氢溶液(0.030mL,0.030mmol)。在相同温度下搅拌10秒之后，将反应混合物在真空中浓缩以产生JGK032(6.7mg,99％)；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.63(s,1H),8.81(s,1H),8.36(s,1H),7.63(ddd,J＝1.6,6.9,8.3Hz,1H),7.39(s,1H),7.35(ddd,J＝1.1,8.1,16.2Hz,1H),4.49-4.51(m,2H),4.43-4.45(m,2H)。

JGK012的制备

向JGK010(39mg,0.1176mmol)的固体中添加乙酸酐(5.0mL)。在80℃(浴温)下在搅拌下加热12小时之后，使反应混合物冷却至室温并用饱和NaHCO₃水溶液(20mL)中和，并且用EtOAc(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，2/1至1/1)来纯化以产生JGK012(37mg，84％分离产率)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.01(s,1H),7.49(s,1H),7.44(s,1H),7.31-7.41(m,2H),7.09(t,J＝8.0Hz,1H),4.41-4.43(m,2H),4.37-4.40(m,2H),2.15(s,3H)；¹³CNMR(125MHz,CDCl₃)δ170.2,159.2,153.3,151.3,149.7,145.8,130.6,129.8,129.7,124.7,122.5,122.4,117.7,113.6,109.2,64.5,64.2,22.9；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：374.0701[C₁₈H₁₃ClFN₃O₃的计算值：373.0623]。

JGK015的制备

在室温下向L-氨基酸类似物A(227mg,0.7712mmol)于DMF(3.0mL)中的溶液中一次性添加稠合氯喹唑啉3(117mg,0.5932mmol)。在35℃(浴温)下在搅拌下加热12小时之后，使反应混合物冷却至室温并用饱和盐水(30.0mL)和EtOAc(30.0mL)稀释以产生黄色悬浮液。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，CH₂Cl₂/MeOH，40/1至10/1)来纯化以产生JGK015(261mg,92％)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.57(s,1H),7.64(s,1H),7.61(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(s,1H),7.27(s,1H),7.08(d,J＝8.5Hz,2H),5.09(d,J＝7.5Hz,1H),4.54(dd,J＝6.0,13.5Hz,1H),4.31-4.33(m,2H),4.27-4.29(m,2H),3.68(s,3H),3.06(dd,J＝5.6,14.0Hz,1H),3.00(dd,J＝6.1,13.8Hz,1H),1.39(s,9H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ172.4,156.5,155.2,153.6,149.1,146.3,143.8,137.6,131.6,129.7,121.7,113.8,110.3,106.6,80.0,64.4,64.2,54.4,52.2,37.6,28.3；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：481.2082[C₂₅H₂₈N₄O₆的计算值：480.2003]。

JGK016、JGK023的制备

[JGK016(Boc脱保护)]在室温下向JGK015(121mg,0.251mmol)于无水CH₂Cl₂中的溶液(5mL,0.05M)中逐滴添加三氟乙酸(1.0mL)。在相同温度下搅拌5小时之后，将反应混合物用饱和NaHCO₃水溶液(20mL)淬灭，并且用CH₂Cl₂(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用CH₂Cl₂(2×30mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，CH₂Cl₂/MeOH，20/1)来纯化以产生JGK016(74mg,77％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.5(s,1H),8.68(s,1H),8.43(s,2H),8.20(s,1H),7.68(d,J＝8.4Hz,2H),7.26(d,J＝8.4Hz,2H),7.23(s,1H),4.44-4.46(m,2H),4.39-4.41(m,2H),3.68(s,3H),3.03-3.13(m,2H)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.26(s,1H),7.73(s,1H),7.60(d,J＝8.4Hz,2H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.08(s,1H),4.31-4.35(m,4H),3.72(t,J＝6.6Hz,1H),3.68(s,3H),3.27-3.29(m,1H),3.01(dd,J＝5.9,13.6Hz,1H),2.89(dd,J＝7.0,13.5Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ174.4,157.4,152.6,149.7,145.0,144.2,137.5,132.8,129.2,122.8,122.3,111.5,110.1,107.9,64.5,64.1,55.2,51.0,39.5；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：381.1553[的计算值：C₂₀H₂₀N₄O₄ 380.1479]。

[JGK023(水解)]向JGK016(42mg,0.1104mmol)于THF/H₂O(3:1，总计4.0mL)中的冷却(0℃)溶液中一次性添加氢氧化锂(14mg)。在室温下搅拌2小时之后，将反应混合物用1NHCl中和，并且用EtOAc(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(100mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，CH₂Cl₂/MeOH，30/1至15/1)来纯化以产生JGK023(25mg,62％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.62(s,1H),8.12(s,1H),7.71(d,J＝8.4Hz,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(s,1H),4.48-4.50(m,2H),4.42-4.44(m,2H),4.28(t,J＝6.8Hz,1H),3.32-3.37(m,1H),3.20(dd,J＝7.6,14.8Hz,1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ169.7,159.1,152.4,148.8,146.0,136.1,134.1,133.1,129.7,129.7,124.8,124.8,110.0,108.1,104.9,65.2,64.2,53.6,35.4；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：367.1334[C₁₉H₁₈N₄O₄的计算值：366.1322]。

JGK020的制备

在室温下向氯喹唑啉2(104mg,0.5294mmol)于异丙醇(5.3mL)中的溶液中逐滴添加氨基酸(187mg)。在50℃(浴温)下在搅拌下加热12小时之后，使反应混合物冷却至室温，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，5/1至3/1)来纯化以产生JGK020(128mg,53％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.68(s,1H),10.22(br,1H),8.64(s,1H),7.91(s,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.26-7.31(m,4H),4.12-4.18(m,1H),3.59(s,3H),2.98(dd,J＝5.2,14.0Hz,1H),2.84(dd,J＝10.0,13.2Hz,1H),1.30(s,9H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ173.0,158.2,155.9,155.6,148.7,148.4,136.1,135.8,129.7,124.7,107.6,107.3,103.3,78.8,55.7,52.3,36.3,28.6；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：455.1920[C₂₃H₂₆N₄O₆的计算值：454.1846]。

JGK014

JGK014(26％)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.62(s,1H),7.66(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(s,1H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),4.99(d,J＝7.6Hz,1H),4.56-4.62(m,1H),4.36-4.42(m,4H),3.73(s,3H),3.03-3.15(m,2H),1.43(s,9H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ172.4,156.5,155.2,153.6,149.1,146.3,143.8,137.6,131.6,129.7,121.7,113.8,110.3,106.6,80.0,64.4,64.2,54.4,52.2,37.6,28.3；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：481.2080[C₂₅H₂₈N₄O₆的计算值：480.2003]。

JGK021

JGK021的制备遵循JGK023的合成程序；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.62(s,1H),8.12(s,1H),7.71(d,J＝8.4Hz,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(s,1H),4.48-4.50(m,2H),4.42-4.44(m,2H),4.28(t,J＝6.8Hz,1H),3.32-3.37(m,1H),3.20(dd,J＝7.6,14.8Hz,1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ169.7,159.1,152.4,148.8,146.0,136.1,134.1,133.1,129.7,129.7,124.8,124.8,110.0,108.1,104.9,65.2,64.2,53.6,35.4；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：367.1347[C₁₉H₁₈N₄O₄的计算值：366.1322]。

JGK022的制备

在室温下向二醇X(121mg,0.6155mmol)于DMF(3.0mL)中的溶液中逐滴添加3-氯-2-氟苯胺(0.14mL)。在60℃(浴温)下在搅拌下加热3天之后，使反应混合物冷却至室温，并且用Et₂O(30.0mL)稀释以产生白色悬浮液。将所得白色固体相继用Et₂O(3×50mL)和CH₂Cl₂(2×30mL)洗涤并收集以产生JGK022(132mg,70％)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.16(br,1H),10.43(br,1H),8.68(s,1H),7.91(s,1H),7.58(t,J＝7.1Hz,1H),7.48(t,J＝6.8Hz,1H),7.40(s,1H),7.30(t,J＝8.1Hz,1H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ159.1,156.4,154.1,152.1,149.1,148.3,135.1,129.7,128.1,126.8,125.7,120.8,107.4,106.9,102.9；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：306.0437[C₁₄H₉ClFN₃O₂的计算值：305.0361]。

JGK018的制备

[氯化]向11(500mg,2.134mmol)于亚硫酰氯中的溶液(7.5mL,0.28M)中逐滴添加二甲基甲酰胺(0.15mL)。在80℃(浴温)下在搅拌下加热2小时之后，使反应混合物冷却至室温，并且在真空中浓缩。将残余物相继用Et₂O(200mL)洗涤，并且立刻用于下一步骤。

[取代]]在室温下在Ar下，向以上产生的氯喹唑啉12于无水DMF中的溶液(11mL,0.2M)中逐滴添加3-氯-2-氟苯胺(0.50mL,4.548mmol)。在相同温度下搅拌1小时之后，将反应混合物用Et₂O(100.0mL)稀释以产生白色悬浮液。将所得白色固体相继用Et₂O(2×50mL)洗涤并收集以产生JGK018(525mg,68％)；波谱数据与Zhang,X.等人J.Med.Chem.2015,58,8200-8215匹配。

13的制备

[乙酰基脱保护]向JGK018(550mg,1.520mmol)中逐滴添加氨溶液(8.0mL，7N，于甲醇中)。在密封管中在50℃(浴温)下在搅拌下加热2小时之后，使反应混合物冷却至室温，并且在真空中浓缩。将所得白色固体相继用Et₂O(2×50mL)洗涤并收集以产生13(394mg,81％)；所得波谱数据与Zhang,X.等人J.Med.Chem.2015,58,8200-8215的波谱数据匹配。

14的制备

在Ar下向13(113mg,0.353mmol)于无水DMF(2mL)中的冷却(0℃)溶液中逐滴添加三乙胺(0.25mL,1.767mmol)，随后逐滴添加含二碳酸二叔丁酯(62mg,0.459mmol)的无水DMF(2mL)。在室温下搅拌3天之后，将反应混合物用饱和H₂O水溶液(10mL)淬灭，并且用EtOAc(10mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，5/1至3/1)来纯化以产生14(42mg，28％分离产率)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.69(s,1H),8.39-8.45(m,1H),7.64(s,1H),7.44(s,1H),7.11-7.16(m,2H),3.90(s,3H),1.59(s,9H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ156.2(J＝39.5Hz),154.9,151.3,150.3,149.5(J＝224.1Hz),140.4,128.1(J＝9.6Hz),124.8,124.4(J＝4.8Hz),121.5,120.8(J＝51.2Hz),113.5,109.0,108.8,84.6,56.2,27.6；

C的制备

在室温下在Ar下，向A¹(56mg,0.1904mmol)于无水CH₂Cl₂(2mL)中的溶液中逐滴添加三乙胺(0.08mL,0.5712mmol)，随后添加氯乙酰氯(0.05mL,0.6286mmol)。在相同温度下搅拌1小时之后，将反应混合物用饱和NH₄Cl水溶液(20mL)淬灭，并且用CH₂Cl₂(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用CH₂Cl₂(2×30mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤。

JGK031的制备

[烷基化]在室温下向14(44mg,0.1058mmol)于DMF(2.0mL)中的冷却(0℃)溶液中一次性添加碳酸钾(73mg,0.528mmol)，随后逐滴添加含以上产生的C(0.1904mmol)的DMF(2.0mL)。在40℃(浴温)下在搅拌下加热3天之后，将反应混合物用H₂O(10mL)淬灭，并且用EtOAc(10mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，100/1至30/1)来纯化以产生烷基化产物14-(2)(43mg，55％分离产率)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.16(s,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.44(s,1H),6.98-7.13(m,5H),6.34(m,1H),4.95(d,J＝7.4Hz,1H),4.54(d,J＝6.5Hz,1H),4.48(s,2H),3.69(s,6H),2.95-3.13(m,2H),1.53(s,9H),1.40(s,9H)。

[脱保护]向烷基化产物14-(2)(26mg,0.0348mmol)于无水MeOH(5.0mL)中的溶液中逐滴添加0.5N盐酸溶液(0.5mL)。在相同温度下搅拌24小时之后，将反应混合物在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(反相硅胶，MeOH或MeOH/H₂O，10/1)来纯化以产生JGK031(12mg,61％)；¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.20(s,1H),7.67(s,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,2H),7.24-7.30(m,1H),7.11-7.21(m,4H),3.94(s,3H),3.59(s,3H),2.83-3.01(m,2H)；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：554.1631[C₂₇H₂₅ClFN₅O₅的计算值：553.1522]。

JGK033的制备

向JGK031(5mg,0.009026mmol)于无水THF(6mL)和H₂O(2mL)中的溶液中一次性添加氢氧化锂·H₂O(3mg)。在室温下搅拌2小时之后，将反应混合物用1N盐酸溶液中和，并且在真空中浓缩。将残余物通过反相柱色谱法(反相硅胶，MeOH/H₂O，5/1)来纯化以产生JGK033(4.4mg,90％)；¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.16(s,1H),6.32(s,1H),6.03(d,J＝8.2Hz,2H),5.89-5.98(m,2H),5.59-5.79(m,4H),4.00(s,2H),2.51(s,3H),2.46(t,J＝5.6Hz,1H)；¹³C NMR(125MHz,MeOD)δ163.9,159.4,157.2,154.3,152.1,149.5,137.1,135.4,129.7,126.9,124.6,121.5,120.3,108.0,106.9,97.8,56.6,53.5,35.6；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：540.1435[C₂₆H₂₃ClFN₅O₅的计算值：539.1366]。

JGK008的制备

在Ar下向拉帕替尼(326mg,0.561mmol)于无水MeOH(5.6mL)和CH₂Cl₂(5.6mL)中的溶液中一次性逐滴添加二碳酸二叔丁酯(378mg,2.819mmol)。在室温下搅拌2天之后，将反应混合物用饱和H₂O水溶液(10mL)淬灭，并且用CH₂Cl₂(10mL)稀释。分离各层，并且将水层用CH₂Cl₂(5×50mL)萃取。将合并的有机层相继用H₂O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1至1/1)来纯化以产生JGK008(119mg，31％分离产率)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.71(bs,1H),8.64(s,1H),8.44(s,1H),7.85-7.95(m,3H),7.68(d,J＝7.8Hz,1H),7.32-7.37(m,1H),7.21(dd,J＝8.4,10.8Hz,2H),6.98-7.03(m,1H),6.96(d,J＝8.9Hz,1H),6.39(d,J＝47.1Hz,1H),5.13(s,2H),4.53(d,J＝32.2Hz,2H),3.99(t,J＝7.3Hz,2H),3.39(d,J＝66.1Hz,2H),2.89(s,3H),1.49(s,9H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ163.9,162.0,158.0,154.2,152.7,151.7,151.0,139.1(d,J＝7.3Hz),132.4,130.1(d,J＝8.1Hz),129.1,128.6,128.2,125.1,123.1,122.4,122.3,115.4,114.9(d,J＝21.0Hz),114.1(d,J＝13.9Hz),113.9,111.5,110.9,107.7,81.3,70.9,45.0,43.6,42.3,41.4,41.2,28.4；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：681.1946[C₃₄H₃₄ClFN₄O₆S的计算值：680.1866]。

JGK011的制备

在Ar下向拉帕替尼(68mg,0.353mmol)的固体中添加乙酸酐(5.0mL)。在室温下搅拌2天之后，将反应混合物在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1至1/3)来纯化以产生JGK002(48mg，62％分离产率)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.18(s,1H),8.10-8.17(m,3H),7.50(d,J＝2.5Hz,1H),7.27-7.36(m,2H),7.18(dd,J＝7.6,13.8Hz,2H),6.97-7.03(m,2H),6.79(d,J＝3.3Hz,1H),6.44(d,J＝3.3Hz,1H),5.14(s,2H),4.66(s,2H),3.86(t,J＝6.6Hz,2H),3.30(t,J＝6.6Hz,2H),2.95(s,3H),2.33(s,3H),2.23(s,3H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ171.4,171.2,163.9,162.2,162.0,154.0,153.7,152.5,151.0,138.5(J＝7.3Hz),134.2,130.8,130.3,130.2,129.9,129.1,127.4,123.9,122.4(J＝2.9Hz),121.8,118.0,115.1,115.0,114.0(J＝5.2Hz),113.8,111.1,108.9,70.1(J＝1.7Hz),52.3,47.0,41.4,40.7,23.7,21.8；HRMS-ESI[M+H]⁺实测值：665.1628[C₃₃H₃₀ClFN₄O₆S的计算值：664.1553]。

实施例2：JGK系列的其他示例性化合物的制备

一般性化学信息

所有化学品、试剂和溶剂在可获得时都从商业来源购买，并且按原样使用。必要时，通过标准方法纯化和干燥试剂和溶剂。在烘干玻璃器皿中在惰性氩气氛围下进行空气和水分敏感性反应。在单模反应器CEM Discover微波合成仪中进行微波照射反应。在环境温度(约23℃)下进行室温反应。所有反应都通过在预涂布Merck 60F₂₅₄硅胶板上进行薄层色谱法(TLC)来监测，其中通过紫外光(λ＝254、365nm)或通过使用碱性KMnO₄溶液来使斑点显影。在SiO₂ 60(粒度0.040–0.063mm，230–400目)上进行快速柱色谱法(FC)。通过在25–50℃下旋转蒸发来进行减压浓缩(在真空中)。在高真空下或在干燥器中进一步干燥纯化化合物。产率对应于纯化化合物，并且未经进一步优化。在Bruker波谱仪(在300、400或500MHz下运行)上记录质子核磁共振(¹H NMR)波谱。在Bruker波谱仪(在400或500MHz下)上记录碳NMR(¹³C NMR)波谱。NMR化学位移(δppm)以残余溶剂信号为参考。¹H NMR数据报告如下：以ppm计的化学位移；多重性(s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，m＝多重峰/复杂样式，td＝三双重峰，ddd＝双双双重峰，br＝宽信号)；以Hz计的偶合常数(J)，积分。¹³C NMR波谱的数据以化学位移报告，并且如果适用，那么以偶合常数报告。在具有IonSense ID-CUBE DART源的Thermo Fisher Scientific Exactive Plus质谱仪上记录高分辨率质量(HRMS)谱。如先前所报道来制备化合物4-氯-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉(1)、4-氯喹唑啉-6,7-二醇(2)和JGK010。

用于合成4-苯胺基喹唑啉化合物JGK035–JGK041和JKG043的一般性程序A。

将4-氯喹唑啉(1当量)于iPrOH(0.1–0.3M)中的混合物用苯胺(1当量)处理，并且在80℃下在微波照射下(60W)将混合物加热15–20分钟。使混合物冷却至23℃，用额外苯胺(1当量)处理，并且再次经受微波照射(80℃，60W，15–20分钟)。将混合物在减压下浓缩，或通过过滤(用冷iPrOH洗涤)分离沉淀的4-苯胺基喹唑啉盐酸盐。将残余物悬浮于饱和NaHCO₃水溶液中，并且用CH₂Cl₂(3x)萃取。将合并的有机萃取物用水、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且浓缩。通过FC(用CH₂Cl₂/EtOAc或己烷/EtOAc的梯度洗脱)纯化提供了通常呈白色至灰白色、或浅黄色固体状的所需产物。

N-(2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK035)。

遵循一般性程序A，在iPrOH(1.5mL)中从4-氯喹唑啉1(51mg,0.23mmol)和2-氟苯胺(40μL,0.48mmol)制备化合物JGK035。FC(CH₂Cl₂/EtOAc 10:1→10:4)产生了呈白色固体状的JGK035(56mg,82％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.68(s,1H),8.64(td,J＝8.2,1.7Hz,1H),7.38(s,1H),7.36(br,1H),7.31(s,1H),7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(ddd,J＝11.2,8.3,1.5Hz,1H),7.10–7.05(m,1H),4.44–4.37ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ156.08,153.60,153.50(d,J＝242.7Hz),149.52,146.65,144.34,127.31(d,J＝9.5Hz),124.66(d,J＝3.7Hz),123.97(d,J＝7.8Hz),122.89,115.06(d,J＝19.3Hz),114.46,110.62,106.10,64.69,64.51ppm。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₁₆H₁₁FN₃O₂ ^–的计算值：296.0841；实测值：296.0841。

4-氯(7,7,8,8-²H₄)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉(3)。

将化合物2(193mg,0.98mmol)于无水DMF(4.8mL)中的溶液用Cs₂CO₃(788mg,2.42mmol)处理，搅拌5分钟，并且用1-溴-2-氯(²H₄)乙烷(270μL,3.16mmol)逐滴处理。在23℃下将混合物搅拌1小时，接着在70℃下搅拌18小时。在使混合物冷却至23℃之后，在真空中移除所有挥发物。将残余物溶解于CH₂Cl₂(40mL)中，用水(2x13mL)、盐水(13mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。通过FC(CH₂Cl₂/EtOAc 1:0→10:1.5)纯化提供了呈白色蓬松固体状的标题化合物3(109mg,49％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.84(s,1H),7.64(s,1H),7.47ppm(s,1H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ160.19,152.52,151.54,147.93,146.06,120.10,113.72,110.83ppm(未观察到两个高磁场碳)。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₀H₄D₄ClN₂O₂ ⁺的计算值：227.0520；实测值：227.0516。

N-(3-氯-2-氟苯基)(7,7,8,8-²H₄)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK036)。

遵循一般性程序A，在iPrOH(1.2mL)中从4-氯喹唑啉3(55mg,0.24mmol)和3-氯-2-氟苯胺(52μL,0.47mmol)制备化合物JGK036。通过从粗反应混合物过滤分离JGK036·HCl，并且在碱化和萃取之后产生呈浅黄色固体状的纯JGK036(67mg,82％)。¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.62(s,1H),8.34(s,1H),7.93(s,1H),7.53–7.43(m,2H),7.27(td,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.19ppm(s,1H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.17,153.10,152.45(d,J＝249.2Hz),149.28,146.04,143.68,128.21(d,J＝12.0Hz),127.27,127.03,124.87(d,J＝4.7Hz),120.11(d,J＝16.7Hz),112.48,109.64,108.35,63.50(m,2C’s)。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₈D₄ClFN₃O₂ ⁺的计算值：336.0848；实测值：336.0841。

N-(3-溴-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK037)。

遵循一般性程序A，在iPrOH(1.5mL)中从4-氯喹唑啉1(100mg,0.45mmol)和3-溴-2-氟苯胺(100μL,0.89mmol)制备化合物JGK037。FC(CH₂Cl₂/EtOAc 10:0→10:3)产生了呈浅黄色固体状的JGK037(150mg,89％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.68(s,1H),8.65(ddd,J＝8.3,7.4,1.5Hz,1H),7.39(s,1H),7.35(br,1H),7.29(s,1H),7.29–7.24(m,1H),7.11(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.44–4.38ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ155.89,153.37,150.15(d,J＝242.2Hz),149.70,146.75,144.53,128.65(d,J＝10.5Hz),127.24,125.31(d,J＝4.7Hz),121.79,114.53,110.59,108.59(d,J＝19.4Hz),105.93,64.70,64.51ppm。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₁₆H₁₀BrFN₃O₂ ^–的计算值：373.9946；实测值：373.9946。

N-{2-氟-3-[(三乙基甲硅烷基)乙炔基]苯基}-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(4)。

将1打兰(dram)小瓶装以JGK010(75mg,0.23mmol)、XPhos(19.7mg,0.041mmol)、Cs₂CO₃(195mg,0.60mmol)、[PdCl₂·(MeCN)₂](3.6mg,0.014mmol)。将小瓶抽空，并且用氩气回填(重复至少两次)。添加无水乙腈(1mL)，并且在23℃下将橙色悬浮液搅拌25分钟，接着注射乙炔基三乙基甲硅烷(150μL,0.84mmol)。将管密封，并且在预加热油浴中在95℃下将反应混合物搅拌3.5小时。使悬浮液达到23℃，用EtOAc稀释，经SiO₂塞过滤(用EtOAc洗涤)，并且蒸发。通过FC(SiO₂；己烷/EtOAc 8:2→4:6)纯化提供了呈黄色泡沫固体状的标题化合物4(48mg,49％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.681(td,J＝8.1,1.9Hz,1H),8.678(s,1H),7.382(s,1H),7.376(br,1H),7.28(s,1H),7.21–7.12(m,2H),4.44–4.38(m,4H),1.07(t,J＝7.9Hz,9H),0.71ppm(q,J＝7.9Hz,6H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ155.95,153.81(d,J＝248.0Hz),153.44,149.62,146.66,144.47,127.68,127.60,124.15(d,J＝4.5Hz),122.79,114.49,111.77(d,J＝14.6Hz),110.61,105.97,98.65,98.49(d,J＝3.7Hz),64.70,64.51,7.63,4.50ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₄H₂₇N₃O₂Si⁺的计算值：436.1851；实测值：436.1831。

N-(3-乙炔基-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK038)。

将化合物4(40mg,0.09mmol)于湿THF(0.9mL)中的混合物用1M TBAF THF溶液(450μL,0.45mmol)逐滴处理，并且在23℃下将混合物搅拌18小时。添加水(10mL)，并且将混合物用EtOAc(3x15mL)萃取。将合并的有机物用盐水(20mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。依次通过FC(SiO₂；己烷/EtOAc 7:3→3:7)和第二FC(SiO₂；CH₂Cl₂/EtOAc 1:0→6:4)纯化提供了呈灰白色固体状的JGK038(19mg,64％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.69(td,J＝8.0,1.8Hz,1H),8.67(s,1H),7.38(s,1H),7.36(br,1H),7.29(s,1H),7.24–7.15(m,2H),4.43–4.38(m,4H),3.34ppm(s,1H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ155.94,154.04(d,J＝248.8Hz),153.39,149.65,146.70,144.47,127.81,127.68(d,J＝9.1Hz),124.30(d,J＝4.7Hz),123.47,114.49,110.58,110.50(d,J＝14.3Hz),105.99,82.95(d,J＝3.5Hz),76.70(d,J＝1.6Hz),64.69,64.50ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₃FN₃O₂ ⁺的计算值：322.0986；实测值：322.0981。

N-[2-氟-3-(三氟甲基)苯基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK039)。

遵循一般性程序A，在iPrOH(1.5mL)中从4-氯喹唑啉1(37mg,0.17mmol)和2-氟-3-(三氟甲基)苯胺(42μL,0.33mmol)制备化合物JGK039。FC(CH₂Cl₂/EtOAc 1:0→10:3)产生了呈灰白色固体状的JGK039(35mg,58％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ9.00–8.92(m,1H),8.70(s,1H),7.42(br,1H),7.40(s,1H),7.35–7.28(m,2H),7.30(s,1H),4.46–4.38ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ155.77,153.24,150.27(d,J＝252.0Hz),149.81,146.80,144.66,128.62(d,J＝8.5Hz),126.34,124.44,124.40,122.66(q,J＝272.4Hz),120.41(q,J＝4.6Hz),114.58,110.55,105.86,64.70,64.51ppm。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₁₇H₁₀F₄N₃O₂ ^–的计算值：364.0715；实测值：364.0712。

4-氯-8,9-二氢-7H-[1,4]二氧杂环庚二烯并[2,3-g]喹唑啉(5)。

将化合物2(100mg,0.51mmol)于无水DMF(10mL)中的溶液用Cs₂CO₃(460mg,1.41mmol)处理，搅拌15分钟，并且用1,3-二溴丙烷(135μL,1.33mmol)逐滴处理。在23℃下将混合物搅拌1小时，接着在65℃下搅拌18小时。在冷却至23℃之后，在真空中移除所有挥发物。将残余物悬浮于CH₂Cl₂(20mL)中，并且用水(2x5mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。依次通过FC(己烷/CH₂Cl₂ 1:10→0:1→CH₂Cl₂/EtOAc 10:1.5)和第二FC(己烷/EtOAc10:1→10:3)纯化产生了呈白色固体状的标题化合物5(41mg,34％)。¹HNMR(500MHz,CDCl₃):δ8.87(s,1H),7.75(s,1H),7.55(s,1H),4.46(t,J＝5.8Hz,2H),4.40(t,J＝6.0Hz,2H),2.34ppm(quint,J＝5.9Hz,2H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ160.57,158.86,153.10,153.03,148.88,120.83,118.19,115.64,70.51,70.33,30.51ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₁H₁₀ClN₂O₂ ⁺的计算值：237.0425；实测值：237.0416。

N-(3-氯-2-氟苯基)-8,9-二氢-7H-[1,4]二氧杂环庚二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK040)。

遵循一般性程序A，在iPrOH(1.5mL)中从4-氯喹唑啉5(33mg,0.14mmol)和3-氯-2-氟苯胺(32μL,0.29mmol)制备化合物JGK040。FC(CH₂Cl₂/EtOAc 1:0→10:3.5)产生了呈白色固体状的JGK040(34mg,70％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.72(s,1H),8.39(s,1H),8.08(s,1H),7.53–7.45(m,2H),7.29(s,1H),7.27(td,J＝8.1,1.3Hz,1H),4.32(t,J＝5.5Hz,2H),4.29(t,J＝5.6Hz,2H),2.22ppm(quint,J＝5.6Hz,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.43,156.67,153.85,152.48(d,J＝249.3Hz),150.74,147.29,128.05(d,J＝12.0Hz),127.41,127.04,124.91(d,J＝4.7Hz),120.13(d,J＝16.5Hz),117.52,113.81,110.77,70.75,70.62,30.80ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₇H₁₄ClFN₃O₂ ⁺的计算值：346.0753；实测值：346.0740。

8-氯-2H-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-g]喹唑啉(6)。

将化合物2(100mg,0.51mmol)于无水DMF(3.4mL)中的溶液用Cs₂CO₃(335mg,1.03mmol)处理，并且在23℃下搅拌15分钟。将混合物用氯碘甲烷(130μL,1.79mmol)逐滴处理，搅拌1小时，接着在70℃下搅拌17小时。在使混合物冷却至23℃之后，在真空中移除所有挥发物。将残余物悬浮于CH₂Cl₂(30mL)中，用水(2x7mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。通过FC(己烷/CH₂Cl₂ 3:10→0:1→CH₂Cl₂/EtOAc 10:2)纯化产生了呈白色蓬松固体状的标题化合物6(38mg,36％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.85(s,1H),7.49(s,1H),7.32(s,1H),6.21ppm(s,2H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ159.82,154.89,152.79,150.94,149.78,121.23,105.23,102.89,101.12ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₉H₆ClN₂O₂ ⁺的计算值：209.0112；实测值：209.0104。

N-(3-氯-2-氟苯基)-2H-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-g]喹唑啉-8-胺(JGK041)。

遵循一般性程序A，在iPrOH(1.5mL)中从4-氯喹唑啉6(35mg,0.17mmol)和3-氯-2-氟苯胺(38μL,0.35mmol)制备化合物JGK041。FC(CH₂Cl₂/EtOAc 1:0→1:1)产生了呈浅黄色固体状的JGK041(35mg,66％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.53(s,1H),8.37(s,1H),7.84(s,1H),7.53–7.44(m,2H),7.27(td,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.20(s,1H),6.25ppm(s,2H)。¹³CNMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.37,153.10,152.60,152.43(d,J＝248.9Hz),148.56,147.28,128.30(d,J＝11.9Hz),127.17,126.90,124.88(d,J＝4.8Hz),120.12(d,J＝16.4Hz),109.82,104.59,102.38,98.77ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₅H₁₀ClFN₃O₂ ⁺的计算值：318.0440；实测值：318.0435。

乙酸[(3-氯-2-氟苯基)(7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-基)氨基]甲酯(JGK043)。

在0℃下将JGK010(50mg,0.15mmol)于无水THF(0.5mL)中的混合物用1MLiHMDSTHF溶液(150μL,0.15mmol)逐滴处理。在那个温度下搅拌15分钟之后，将混合物逐滴添加至乙酸氯甲酯(55μL,0.57mmol)于无水THF(0.5mL)中的溶液中。将初始含有JGK010的溶液的烧瓶用0.5mL无水THF冲洗，并且添加至反应混合物中。在0℃下搅拌2小时之后，在23℃下继续搅拌22小时。添加饱和NaHCO₃水溶液(10mL)，并且将混合物用EtOAc(3x10mL)萃取。将合并的有机物干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且在真空中蒸发。通过FC(CH₂Cl₂/EtOAc 1:0->1:1)纯化提供了呈浅黄色固体状的标题化合物JGK043(30mg,49％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ7.93(s,1H),7.88(s,1H),7.08–6.97(m,2H),6.94(td,J＝7.2,2.1Hz,1H),6.82(s,1H),5.73(s,2H),4.40–4.29(m,4H),2.12ppm(s,3H)。¹³CNMR(126MHz,CDCl₃):δ170.33,152.96,150.10(d,J＝245.6Hz),149.37,148.05,143.24,140.17(d,J＝13.1Hz),131.89,124.17,124.12(d,J＝4.8Hz),122.59(d,J＝2.4Hz),121.33(d,J＝17.1Hz),115.41,114.31,102.24,71.19,65.07,64.23,20.85ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₉H₁₆ClFN₃O₄ ⁺的计算值：404.0808；实测值：404.0792。

实施例3：JGK系列的其他示例性化合物的制备

一般性程序：所有化学品、试剂和溶剂在可获得时都从商业来源购买，并且按原样使用。必要时，通过标准方法纯化和干燥试剂和溶剂。在烘干玻璃器皿中在惰性氩气氛围下进行空气和水分敏感性反应。在单模反应器CEM Discover微波合成仪中进行微波照射反应。在环境温度(约23℃)下进行室温(RT)反应。所有反应都通过在预涂布Merck 60F₂₅₄硅胶板上进行薄层色谱法(TLC)来监测，其中通过紫外光(λ＝254、365nm)或通过使用碱性KMnO₄溶液来使斑点显影。在SiO₂ 60(粒度0.040–0.063mm，230–400目)上进行快速柱色谱法(FC)。通过在25–50℃下旋转蒸发来进行减压浓缩(在真空中)。在高真空下或在干燥器中进一步干燥纯化化合物。产率对应于纯化化合物，并且未经进一步优化。在Bruker波谱仪(在300、400或500MHz下运行)上记录质子核磁共振(¹H NMR)波谱。在Bruker波谱仪(在400或500MHz下)上记录碳NMR(¹³C NMR)波谱。NMR化学位移(δppm)以残余溶剂信号为参考。¹H NMR数据报告如下：以ppm计的化学位移；多重性(s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，m＝多重峰/复杂样式，td＝三双重峰，ddd＝双双双重峰，br＝宽信号)；以Hz计的偶合常数(J)，积分。¹³C NMR波谱的数据以化学位移报告，并且如果适用，那么以偶合常数报告。在具有IonSense ID-CUBE DART源的Thermo Fisher Scientific ExactivePlus质谱仪上，或在具有带自动进样器的ACQUITY UPLC的Waters LCT Premier质谱仪上记录高分辨率质量(HRMS)谱。

3-[(7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-基)氨基]-2-氟苯甲腈(JGK044)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝9.06–8.98(m,1H),8.69(s,1H),7.41(s,1H),7.39(br,1H),7.35–7.31(m,2H),7.30(s,1H),4.45–4.37ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.63,153.63(d,J＝254.6Hz),153.04,149.94,146.80,144.76,128.60(d,J＝7.8Hz),127.48,126.58,125.31(d,J＝4.5Hz),114.56,113.80,110.45,105.83,101.30(d,J＝13.9Hz),64.70,64.51ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₇H₁₂FN₄O₂ ⁺的计算值：323.0939；实测值：323.0927。

3-[(7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-基)氨基]苯甲腈(JGK045)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.68(s,1H),8.52(s,1H),8.46(t,J＝1.9Hz,1H),8.18(ddd,J＝8.2,2.3,1.2Hz,1H),8.08(s,1H),7.58(t,J＝7.9Hz,1H),7.53(dt,J＝7.6,1.4Hz,1H),7.22(s,1H),4.49–4.36ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝156.24,152.69,149.31,146.15,143.80,140.52,129.87,126.35,125.96,124.15,118.93,112.66,111.23,109.96,108.30,64.52,64.19ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₇H₁₃N₄O₂ ⁺的计算值：305.1033；实测值：305.1018。

(3-氯-2-氟苯基)7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-基氨基甲酸乙酯(JGK047)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.96(s,1H),7.483(s,1H),7.477(s,1H),7.37(dd,J＝8.1,6.7Hz,2H),7.08(td,J＝8.1,1.5Hz,1H),4.45–4.38(m,4H),4.27(q,J＝7.1Hz,2H),1.22ppm(t,J＝7.1Hz,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):158.98,154.43(d,J＝250.7Hz),153.90,153.41,151.17,149.68,145.61,130.12,129.85(d,J＝12.4Hz),128.20,124.50(d,J＝5.1Hz),122.22(d,J＝16.8Hz),117.96,113.51,109.68(d,J＝2.0Hz),64.73,64.36,63.44,14.43.ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₉H₁₆ClFN₃O₄ ⁺的计算值：404.0808；实测值：404.0800。

(±)-4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-7-醇((±)-JGK050)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.61(s,1H),8.34(s,1H),7.91(s,1H),7.72(d,J＝5.4Hz,1H),7.60(t,J＝7.1Hz,1H),7.55(t,J＝7.5Hz,1H),7.21(t,J＝8.2Hz,1H),7.19(s,1H),5.70–5.59(m,1H),4.27(d,J＝11.0Hz,1H),4.17ppm(d,J＝10.6Hz,1H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝157.18,153.38(d,J＝247.4Hz),153.13,148.78,146.14,141.92,130.12,128.05(d,J＝13.8Hz),127.78,125.45(d,J＝4.4Hz),111.95,109.87,108.71,108.55(d,J＝20.3Hz),88.63,67.23ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₂BrFN₃O₃ ⁺的计算值：392.0041；实测值：392.0030。

(±)-顺-和(±)-反-N-(3-溴-2-氟苯基)-7,8-二甲基-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺的非对映异构混合物((±)-顺/反-JGK051)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃；(±)-顺/反2:1):δ＝8.68(s,1H),8.68–8.63(m,1H),7.37(s,1H),7.35(br,1H),7.28(s,1H),7.28–7.24(m,1H),7.10(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.52–4.39(m,1.3H),4.09–3.98(m,0.7H),1.453(d,J＝6.1Hz,1.1H),1.451(d,J＝6.1Hz,1.1H),1.369(d,J＝6.6Hz,1.9H),1.368ppm(d,J＝6.6Hz,1.9H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃；(±)-顺/反2:1):δ＝155.87,155.84,153.19,150.12(d,J＝242.5Hz),150.09(d,J＝242.2Hz),149.87,148.89,146.77,144.64,143.63,128.73(d,J＝10.0Hz),127.15,127.12,125.31(d,J＝4.7Hz),121.71,121.70,114.30,113.93,110.54,110.47,108.57(d,J＝19.4Hz),105.66,105.28ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₆BrFN₃O₂ ⁺的计算值：404.0404；实测值：404.0393。

(±)-顺-N-(3-溴-2-氟苯基)-7,8-二甲基-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK052)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.66(ddd,J＝8.6,7.4,1.6Hz,1H),7.38(s,1H),7.35(br,1H),7.28(s,1H),7.30–7.23(m,1H),7.10(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.50–4.41(m,2H),1.369(d,J＝6.6Hz,3H),1.368ppm(d,J＝6.5Hz,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.85,153.19,150.11(d,J＝242.1Hz),148.89,146.77,143.63,128.73(d,J＝10.2Hz),127.14,125.31(d,J＝4.7Hz),121.71,114.30,110.54,108.57(d,J＝19.5Hz),105.65,72.85,72.58,14.71,14.55ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₆BrFN₃O₂ ⁺的计算值：404.0404；实测值：404.0416。

N-(3-溴-4-氯-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK053)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.70(s,1H),8.35(s,1H),7.94(s,1H),7.61(dd,J＝8.8,7.7Hz,1H),7.55(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),7.20(s,1H),4.47–4.35ppm(m,4H)。¹³CNMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝157.03,154.14(d,J＝249.5Hz),153.01,149.36,146.08,143.74,130.75,127.77(d,J＝2.9Hz),126.80(d,J＝13.4Hz),125.37(d,J＝3.8Hz),112.50,110.15(d,J＝22.5Hz),109.66,108.39,64.51,64.14ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁BrClFN₃O₂ ⁺的计算值：409.9702；实测值：409.9697。

N-(3,4-二溴-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK054)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.65(s,1H),8.34(s,1H),7.92(s,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),7.55(t,J＝8.2Hz,1H),7.20(s,1H),4.45–4.35ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝156.95,153.98(d,J＝249.1Hz),152.99,149.35,146.09,143.74,128.50(d,J＝3.7Hz),128.14,127.21(d,J＝13.7Hz),120.96,112.51,112.33,109.68,108.36,64.51,64.14ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁Br₂FN₃O₂ ⁺的计算值：453.9197；实测值：453.9191。

N-(5-溴-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK055)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.99(dd,J＝7.3,2.5Hz,1H),8.72(s,1H),7.38(s,1H),7.36(br,1H),7.27(s,1H),7.16(ddd,J＝8.7,4.6,2.5Hz,1H),7.04(dd,J＝10.9,8.7Hz,1H),4.44–4.36ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.59,153.35,152.16(d,J＝243.1Hz),149.69,146.67,144.52,128.75(d,J＝10.5Hz),126.16(d,J＝7.6Hz),125.06,117.19(d,J＝3.4Hz),116.20(d,J＝20.9Hz),114.52,110.48,105.85,64.68,64.50ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₂BrFN₃O₂ ⁺的计算值：376.0091；实测值：376.0077。N-(3-溴-2,6-二氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK056)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.60(s,1H),8.32(s,1H),7.94(s,1H),7.74(td,J＝8.1,5.5Hz,1H),7.28(t,J＝9.3Hz,1H),7.21(s,1H),4.44–4.38ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝157.78(dd,J＝248.8,3.3Hz),157.37,155.01(dd,J＝247.9,4.9Hz),153.08,149.47,146.04,143.86,130.76(d,J＝9.3Hz),117.30(t,J＝17.5Hz),113.30(dd,J＝21.8,3.0Hz),112.56,109.45,108.28,103.55(dd,J＝20.4,3.6Hz),64.52,64.14ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁BrF₂N₃O₂ ⁺的计算值：393.9997；实测值：394.0008。

N-(3-溴-2,4-二氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK057)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.64(s,1H),8.51(td,J＝9.0,5.6Hz,1H),7.38(s,1H),7.29(s,1H),7.23(br,1H),7.04(ddd,J＝9.2,7.8,2.1Hz,1H),4.45–4.37ppm(m,4H)。¹³CNMR(126MHz,CDCl₃):δ＝156.10,155.80(dd,J＝246.6,3.5Hz),153.28,151.25(dd,J＝245.1,4.0Hz),149.74,146.56,144.53,124.39(dd,J＝10.8,3.4Hz),122.72(dd,J＝8.3,1.8Hz),114.42,111.49(dd,J＝22.5,3.9Hz),110.34,105.98,97.86(dd,J＝25.7,22.9Hz),64.69,64.50ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁BrF₂N₃O₂ ⁺的计算值：393.9997；实测值：394.0013。

N-(3-溴-5-氯-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK058)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.88(dd,J＝6.6,2.6Hz,1H),8.73(s,1H),7.41(s,1H),7.37(br,1H),7.26(s,1H),7.28–7.23(m,1H),4.44–4.39ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.45,153.13,149.88,148.60(d,J＝241.7Hz),146.76,144.72,130.30(d,J＝4.4Hz),129.26(d,J＝10.8Hz),126.08,121.21,114.60,110.49,108.68(d,J＝20.9Hz),105.71,64.70,64.52ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁BrClFN₃O₂ ⁺的计算值：409.9702；实测值：409.9713。

(±)-反-N-(3-溴-2-氟苯基)-7,8-二甲基-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK059)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.66(ddd,J＝8.6,7.3,1.6Hz,1H),7.376(s,1H),7.375(br,1H),7.28(s,1H),7.28–7.24(m,1H),7.10(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.08–3.98(m,2H),1.451(d,J＝6.1Hz,3H),1.448ppm(d,J＝6.1Hz,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.90,153.12,150.12(d,J＝242.5Hz),149.90,146.59,144.65,128.70(d,J＝10.2Hz),127.18,125.30(d,J＝4.5Hz),121.74,113.84,110.43,108.57(d,J＝19.2Hz),105.31,75.31,75.05,17.23,17.20ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₆BrFN₃O₂ ⁺的计算值：404.0404；实测值：404.0405。

N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK060)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.67(s,1H),8.59(t,J＝8.6Hz,1H),7.40(s,1H),7.38(br,1H),7.33(dd,J＝9.1,2.1Hz,1H),7.31(s,1H),4.45–4.38ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.84,153.08,149.98(d,J＝246.3Hz),149.88,146.42,144.67,127.55,127.19(d,J＝10.0Hz),125.30(d,J＝4.1Hz),121.05,120.47(d,J＝18.2Hz),114.36,110.43,105.97,64.71,64.51ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁Cl₂FN₃O₂ ⁺的计算值：366.0207；实测值：366.0207。

N-(3-溴-2,5-二氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK061)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.65(s,1H),8.40(s,1H),7.93(s,1H),7.63–7.54(m,2H),7.21(s,1H),4.45–4.37ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝157.29(d,J＝243.5Hz),156.84,152.93,149.97(d,J＝242.9Hz),149.43,146.16,143.81,129.22–128.44(m),116.30(d,J＝26.7Hz),113.99(d,J＝25.7Hz),112.53,109.73,108.76(dd,J＝22.5,12.5Hz),108.33,64.52,64.15ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁BrF₂N₃O₂ ⁺的计算值：393.9997；实测值：393.9988。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-乙烯基-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK062)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.65(ddd,J＝8.2,7.3,1.5Hz,1H),7.40(s,1H),7.37(br,1H),7.35(s,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.4,1.5Hz,1H),7.10(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),5.95(ddd,J＝17.3,10.7,5.8Hz,1H),5.60(dt,J＝17.3,1.2Hz,1H),5.48(dt,J＝10.7,1.1Hz,1H),4.82–4.74(m,1H),4.42(dd,J＝11.5,2.5Hz,1H),4.09ppm(dd,J＝11.6,8.1Hz,1H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.90,153.38,150.14(d,J＝242.4Hz),149.12,146.70,144.12,131.48,128.64(d,J＝10.3Hz),127.24,125.30(d,J＝4.7Hz),121.76,120.43,114.29,110.69,108.58(d,J＝19.3Hz),106.06,74.03,67.84ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₄BrFN₃O₂ ⁺的计算值：402.0248；实测值：402.0233。

实施例4：示例性化合物的生物活性和测定方案

使用EGFR激酶系统(Promega#V3831)进行无细胞EGFR激酶测定。采用每个反应25ng EGFR酶，一式两份地使用以2倍稀释从250nM至0.03052nM的13种浓度、无药物对照和无酶对照。ADP-Glo激酶测定(Promega#V6930)用于在抑制剂存在下测量EGFR活性。

使用患者源性胶质母细胞瘤细胞进行GI50测定。一式四份地将以2倍稀释从40,000nM至9.77nM(对于GBM株系)或从4,000nM至0.977nM(对于肺癌株系(HK031))的13种浓度铺在384孔板上，每孔1500个细胞。将细胞孵育3天，接着通过Cell Titer Glo(Promega#G7570)评估增殖。作为参考，厄洛替尼展现642nM(HK301)和2788nM(GBM39)的GI₅₀。

用8-10周龄的雄性CD-1小鼠进行药物代谢动力学研究。一式两份地如所指示对小鼠给药。在各时间点，通过眶后放血获得全血，并且收集脑组织。将血液样品离心以获得血浆，并且将脑组织洗涤和均质化。将样品用乙腈萃取，并且使用speed-vac干燥上清液。将干燥样品溶解于50:50:0.1乙腈:水:甲酸中，并且在Agilent 6400系列三重四极杆LC/MS上定量。

表3：示例性化合物的活性

实施例5：厄洛替尼以及本公开的示例性化合物的蛋白质结合

以下在表4中说明的是厄洛替尼以及若干本公开的示例性化合物的蛋白质结合。Fu是指“未结合分数”。Kpuu是指“在平衡时脑和血浆的未结合分配系数”。

表4：厄洛替尼以及本公开的示例性化合物的蛋白质结合

实施例6：EGFRi代谢响应者和非响应者的分类

对19个患者源性GBM细胞系中在急性EGFR抑制的情况下的葡萄糖消耗变化进行表征。在经补充无血清培养基中以神经胶质瘤球形式培养细胞，不同于基于血清的培养条件，此保持了患者肿瘤的许多分子特征。用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFRi)厄洛替尼处理鉴定了GBM的其经放射性标记葡萄糖摄取(¹⁸F-FDG)由于EGFR抑制而显著减弱的子组；下文被称为“代谢响应者”(图21A和图27A)。使用siRNA沉默EGFR确认了葡萄糖摄取降低不是由于厄洛替尼的脱靶效应(图27B、图27C)。经EGFRi处理细胞中降低的¹⁸F-FDG摄取伴有降低的乳酸产生、葡萄糖消耗和细胞外酸化速率(ECAR)，但谷氨酰胺水平保持不变(图21B和图27D至图27G)。最后，降低的葡萄糖利用与RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR信号传导的扰动相关联–所述信号传导各自可调控GBM和其他癌症中的葡萄糖代谢(图28A)。

相比之下，在所有“非响应者”GBM(即在EGFRi或siRNA的情况下¹⁸F-FDG摄取不变化)中(图21A以及图27B、图27C)，尽管EGFR受到强健抑制，但未观察到葡萄糖消耗、乳酸产生和ECAR的变化(图21B、图27D至图27G、以及图28B)。此外，在这些细胞中，RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR信号传导基本上不受影响(图28B)。值得注意的是，尽管所有代谢响应者都具有EGFR的改变(拷贝数增加、突变)，但6个不具有代谢响应的GBM株系也含有EGFR突变和/或拷贝数增加(图29A、图29B)。总之，这些数据说明两个关键点。首先，急性抑制EGFR快速减弱原代GBM细胞的子组中葡萄糖利用，并且其次，EGFR的遗传改变单独不可预测哪些GBM具有对EGFRi的代谢响应。

实施例7：EGFRi代谢响应者被凋亡致敏

葡萄糖代谢的扰动可诱导促凋亡因子的表达，并且刺激内在凋亡，从而表明响应于EGFRi的葡萄糖摄取降低将刺激内在凋亡路径。实际上，急性厄洛替尼处理仅在代谢响应者培养物中促进了促凋亡仅BH3蛋白BIM和PUMA的表达(图30A)。然而，膜联蛋白V染色揭示在72小时厄洛替尼暴露之后，相较于非响应者(约3％)，代谢响应者具有虽然显著更高，但仅是适度的(约17％)凋亡(图21C)。

尽管明显诱导了促凋亡因子，但低凋亡水平引导发明人要问用EGFRi扰乱葡萄糖摄取是否对GBM细胞进行凋亡“致敏”；由此增加凋亡倾向而不诱导显著细胞死亡。为对此进行测试，发明人用厄洛替尼处理代谢响应者与非响应者24小时，并且进行动态BH3剖析以定量凋亡致敏的变化(图30B)。使用多种BH3肽(例如BIM、BID和PUMA)，我们观察到在进行厄洛替尼处理的代谢响应者中，凋亡致敏显著增加，如通过相对于媒介物，细胞色素c释放的变化所确定(图21D–深灰色棒条)。重要的是，代谢响应者中的致敏显著高于非响应者中的致敏(图21D–浅灰色棒条)，从而支持用EGFRi减弱的葡萄糖摄取触发GBM中的凋亡致敏的假定。

通过检查挽救葡萄糖消耗是否将减轻这些影响，发明人测试了降低的葡萄糖摄取是否为用EGFRi凋亡致敏所需。为对此进行测试，在两个代谢响应者(HK301和GBM39)中异位表达葡萄糖转运体1(GLUT1)和3(GLUT3)。增强的GLUT1和GLUT3(GLUT1/3)表达挽救了两种细胞系中EGFRi介导的葡萄糖摄取和乳酸产生减弱(图21E和图31A至图31C)，并且重要的是，显著阻抑了响应于EGFRi的凋亡致敏(图21F)。总之，这些数据证明尽管不足以诱导显著细胞死亡，但EGFRi介导的葡萄糖消耗抑制降低凋亡阈值，从而潜在地致使GBM细胞易受利用这个致敏状态的剂的影响。

实施例8：细胞质p53为用EGFRi凋亡致敏所需

探究了在EGFRi的情况下GBM变为凋亡致敏所采用的机制。抑制致癌基因驱动的葡萄糖代谢致使GBM细胞协同地易感于细胞质p53依赖性凋亡。通过靶向致癌性信号传导(例如EGFRi)达成的GBM中葡萄糖代谢通量减弱导致细胞质p53衔接内在凋亡路径(“致敏”)。然而，Bcl-xL阻断细胞质p53介导的细胞死亡。药理学p53稳定化克服这个凋亡阻断，从而导致与组合靶向GBM中致癌基因驱动的葡萄糖代谢的协同致死性。

在处于致敏状态的细胞中，抗凋亡Bcl-2家族蛋白质(例如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)大量装载有促凋亡BH3蛋白(例如BIM、BID、PUMA、BAD、NOXA、HRK)；因此，细胞依赖于这些相互作用来达成存活。已知肿瘤抑制蛋白p53会上调促凋亡蛋白，所述促凋亡蛋白随后需要由抗凋亡Bcl-2蛋白结合以阻止细胞死亡。为考查p53是否为EGFRi诱导的致敏所需，我们用CRISPR/CAS-9沉默了两个代谢响应者(HK301和HK336，图22A)中的p53(下文被称为p53KO)。尽管在p53KO细胞中在EGFRi的情况下葡萄糖消耗的变化不受影响(图32A)，但BH3剖析揭示p53KO几乎消除了HK301细胞与HK336细胞两者中厄洛替尼诱导的凋亡致敏(图22B)。

因为已显示p53转录活性在葡萄糖限制下增强，所以我们对此进行探究以确定p53介导的转录是否由EGFRi诱导。然而，厄洛替尼不增加p53调控的基因(例如p21、MDM2、PIG3、TIGAR)的表达(图32B)，也不诱导HK301代谢响应者细胞中的p53荧光素酶报告体活性(图32C)。这些数据指示尽管p53为用EGFRi致敏所需，但它的转录活性可不是必需的。

除p53的充分描述的核功能之外，p53还可定位在细胞质中，在细胞质中，它可直接衔接内在凋亡路径。为评估细胞质p53是否对于用EGFRi凋亡致敏是重要的，我们将具有缺陷性核定位信号的p53突变体(p53^cyto)稳定引入至HK301和HK336 p53KO神经胶质瘤球中。如所预期，p53^cyto被表达(图22C和图32D)，局限于细胞质(图22D和图32E)，并且不具有转录活性(图22E和图32F)。相反，在HK301和HK336 p53KO细胞中重构野生型p53(p53^wt)显示了与亲本细胞类似的定位，并且挽救了p53调控的基因的转录(图22C至图22E和图32E至图32G)。值得注意的是，稳定引入p53^cyto使HK301 p53KO细胞与HK336 p53KO细胞两者中用厄洛替尼达成的致敏显著恢复至与p53^wt类似的水平(图22F和图32G)，从而指示p53的细胞质功能为EGFRi介导的致敏所需。对此进行支持的是，将具有转录活性(图2622G)，但局限在核的p53突变体(p53^NES)引入至HK301 p53KO细胞中未能诱导EGFRi介导的凋亡致敏(图22G、22H和图32H)。最后，用pifithrin-μ(PFTμ)药理学抑制细胞质p53活性显著降低了用厄洛替尼达成的致敏(图32I)。总之，这些结果显示在GBM中，在EGFRi之后，细胞质p53衔接内在凋亡机制。

先前工作证明除反式激活缺陷之外，人肿瘤源性p53突变体–特别是DNA结合结构域中的那些–还具有减弱的细胞质功能。因此，发明人测试了在HK301 p53KO中稳定表达这些“热点”p53突变体中的两者即R175H或R273H是否将具有降低的EGFRi介导致敏(图32H)。如所预期，两种突变体均缺乏转录能力(图22G)，并且与降低的细胞质活性一致，不能达成用EGFRi凋亡致敏(图22H)。因此，与先前研究结果一致，p53的DNA结合结构域中的致癌性突变导致“双重打击”，借此反式激活功能与细胞质功能两者均被消除–后者对于用EGFRi凋亡致敏具有影响。

实施例9：抑制EGFR驱动的葡萄糖摄取产生可利用的Bcl-xL依赖性

Bcl-xL可螯合细胞质p53，并且阻止p53介导的凋亡；由此产生致敏凋亡状态以及存活对Bcl-xL的依赖性。实际上，BH3剖析揭示了EGFRi代谢响应者中细胞存活对的Bcl-xL的依赖性(图33A)。因此，我们假设用EGFRi减弱的葡萄糖消耗可导致由Bcl-xL对细胞质p53的螯合。为对此进行探究，我们进行了共免疫沉淀以考查响应者(n＝2)与非响应者(n＝2)两者中响应于EGFRi的p53-Bcl-xL相互作用的动力学。重要的是，我们观察到在代谢响应者中(图23A)而非在非响应者中(图23B)，在厄洛替尼处理之后，Bcl-xL和p53相互作用显著加强。这表明抑制EGFR依赖性葡萄糖消耗导致由Bcl-xL对p53的螯合。与这个解释一致，挽救EGFRi介导的葡萄糖摄取降低和凋亡致敏的GLUT1/3异位表达阻止了p53与Bcl-xL的缔合(图23C和图33B)。这些研究结果强烈指示EGFRi介导的葡萄糖摄取抑制通过促进细胞质p53与Bcl-xL之间的相互作用来对GBM细胞进行凋亡致敏。

p53从Bcl-xL释放使得p53能够直接活化BAX，从而导致细胞色素c释放和细胞死亡。一旦我们认识到代谢响应者中Bcl-xL与p53之间的结合响应于EGFRi而增加，我们就要问从Bcl-xL移置p53是否会引发凋亡。为对此进行测试，我们用厄洛替尼和特异性Bcl-xL抑制剂WEHI-539处理代谢响应者(HK301)。WEHI-539的添加破坏了在厄洛替尼处理下Bcl-xL与p53的缔合(图23D)，从而在HK301和GBM39细胞(代谢响应者)中导致协同致死性(图23E)。值得注意的是，细胞质p53足以达成EGFRi代谢响应者细胞中的组合作用(图33C)。然而，WEHI-539不增强用厄洛替尼处理的非响应者(HK393)中的凋亡，从而表明用EGFRi减弱葡萄糖摄取以及后续p53与Bcl-xL之间的缔合为产生存活对Bcl-xL的依赖性所必需(图33E)。对此进行支持的是，GLUT1/3的增强表达显著缓和了以药物组合达成的细胞死亡(图23F和图33D)。总之，这些观察结果指示Bcl-xL通过螯合细胞质p53来减弱响应于EGFRi介导的葡萄糖摄取抑制的GBM细胞死亡(图32G)。

实施例10：组合靶向EGFR和p53在EGFRi代谢响应者中具有协同作用

机理研究揭示了在EGFR驱动的GBM的情况下的将取决于功能性p53的潜在治疗机会。尽管p53信号传导轴是GBM中改变的三个核心路径中的一者，但对TCGA GBM数据集的分析显示p53突变与EGFR的改变是互相排斥的(图28A和图28B)。相反，在具有EGFR突变或增加的患者中，p53路径可通过MDM2的扩增和/或在CDKN2A基因座处的MDM2负性调控物p14 ARF中的缺失而被阻抑。鉴于这些关系以及在EGFRi减弱的葡萄糖摄取下致敏需要p53，我们假设通过MDM2抑制来稳定p53可能具有与Bcl-xL拮抗类似的治疗作用。使用努特林，即一种广泛表征的MDM2抑制剂，我们发现当与厄洛替尼配对时，在代谢响应者神经胶质瘤球中具有惊人的协同致死性。采用厄洛替尼和努特林组合，大于90％的HK301细胞经受凋亡(图24C)。值得注意的是，在代谢非响应者中(GS017，图24C)，我们未观察到这些药物之间的协同作用。我们接着在我们的原代GBM细胞(全都是p53野生型)小组中测试了这个组合，并且发现仅在具有对EGFRi的代谢响应的GBM中具有协同致死性(图24D和图34A)。遗传敲低EGFR确认了仅在代谢响应者中的协同作用(图34B)。重要的是，GLUT1/3的增强表达显著降低了BAX寡聚化、细胞色素c释放以及在厄洛替尼和努特林组合的情况下的凋亡(图24E和图34C)，从而支持用EGFRi抑制葡萄糖代谢为厄洛替尼和努特林组合的协同作用所需的构思。

接着探究p53在引发厄洛替尼和努特林组合达成的细胞死亡方面的作用。如所预期，CRISPR/CAS-9靶向两个EGFRi代谢响应者(HK301和HK336)中的p53完全缓和了对药物组合的敏感性(图24F)。同样，Bcl-xL的异位表达显著阻抑在组合治疗的情况下的细胞死亡，这与Bcl-xL在拮抗p53介导的凋亡方面的关键功能一致(图34D)。此外，类似于以Bcl-xL抑制(例如WEHI-539)获得的结果，努特林的添加在厄洛替尼处理下从Bcl-xL释放p53(图24G)。这些数据与p53稳定化可刺激细胞质p53介导的凋亡的先前观察结果一致。支持细胞质p53活性为代谢响应者中EGFRi和努特林诱导的凋亡所需的提议的是，用PFTμ阻断细胞质p53活性显著降低了组合的协同作用(图34E)，同时，含有局限在核的p53突变体p53^NES的HK301细胞不能达成用厄洛替尼和努特林实现增强的凋亡(图34F)。最后，具有反式激活缺陷与细胞质缺陷两者的癌症“热点”突变体R175H和R273H对药物组合完全不敏感(图34F)。

尽管细胞质p53为促进以药物组合达成的细胞死亡所需，但我们在一些情况下观察到p53的转录依赖性功能与非依赖性功能两者均为在努特林的情况下最优执行协同凋亡所需(图34F)。这些结果与p53的转录非依赖性功能可单独执行内在凋亡，而在其他情形下可需要它的转录依赖性功能来刺激细胞质p53介导的细胞杀灭的报道一致。总之，本文所述的结果显示组合靶向EGFR驱动的葡萄糖代谢和p53可诱导原代GBM的显著协同细胞死亡；此依赖于p53的细胞质功能。

实施例11：调节葡萄糖代谢对EGFRi非响应者进行p53介导的细胞死亡致敏

以上提及的数据引导发明人提出其中EGFRi介导的葡萄糖代谢减弱引发凋亡机制，从而导致与促凋亡刺激诸如p53活化的协同作用的模型。协同作用处于由EGFR抑制剂诱导细胞应激，葡萄糖摄取降低和细胞的凋亡致敏，以及由BCL-2的拮抗剂使p53稳定之间。EGFR抑制可快速减弱细胞应激下的糖酵解。这产生了肿瘤特异性易感性，其中内在凋亡可通过以下方式显著增强：1)活化p53(诸如像通过努特林、类似物或本文所述的其他物质)，以及2)抑制BCL-2(通过如本文所述的若干剂中的任一者，诸如像ABT-263(纳维托克))。

这个模型的逻辑预测是直接抑制葡萄糖代谢应会对EGFRi的作用进行表型模拟。与此一致，葡萄糖代谢抑制剂2-脱氧葡萄糖(2DG)的添加刺激了HK301细胞(EGFRi代谢响应者)中的凋亡致敏、p53与Bcl-xL的结合、以及与努特林的协同作用(图40A、图40B和图40D)。引起关注的是，在HK301神经胶质瘤球中，用寡霉素(复合物V/ATP合成酶)或鱼藤酮(复合物I)抑制氧化磷酸化与努特林处理不具有协同作用(图35C和图35D)。因此，单独葡萄糖代谢通量降低，而非氧化代谢，似乎足以达成对p53活化的协同敏感性。

这促使发明人考虑调节EGFRi非响应者中的葡萄糖消耗是否导致类似p53依赖性易感性。为对此进行探究，他们测试了用2DG或通过靶向PI3K–一种充分表征的葡萄糖代谢驱动物-直接抑制葡萄糖摄取是否引发两个EGFRi代谢非响应者中的凋亡致敏(图25A)。不同于厄洛替尼处理，用匹替尼西(pictilisib)急性抑制PI3K消除了PI3K-AKT-mTOR信号传导(图35E)，并且显著降低了HK393和HK254细胞中的¹⁸F-FDG摄取(图25B)。用匹替尼西达成的葡萄糖消耗降低伴有显著较高的凋亡致敏，并且如所预期，2DG完全反映了这些作用(图25B和图25C)。因此，在抑制葡萄糖摄取之后，EGFRi代谢非响应者可被凋亡致敏。重要的是，CRISPR/CAS-9靶向HK393中的p53显著阻抑了由2DG或匹替尼西介导的致敏。(图25D)。此外，p53依赖性致敏伴有加强的Bcl-xL和p53结合，此指示由Bcl-xL对p53的螯合以阻断凋亡(图25E和图35F)。与这个解释一致，将2DG或匹替尼西与努特林组合在EGFRi非响应者细胞中导致了显著p53依赖性协同致死性(图25F和图25G)。总之，这些数据证明直接或用靶向疗法急性抑制葡萄糖代谢促进GBM中的p53依赖性凋亡致敏；此产生可靶向来达成增强的细胞杀灭的易感性。

实施例12：用于体内靶向GBM的组合治疗策略和非侵袭性生物标志

在细胞培养中获得的结果显示组合靶向致癌基因驱动的葡萄糖代谢和p53在原代GBM中具有协同活性。这引导我们探究这个方法是否可在原位GBM异种移植模型中有效。对于这些研究，我们采用当前处于针对许多恶性肿瘤的临床试验中的强力MDM2抑制剂依达沙努特林。鉴于依达沙努特林的CNS穿透的不确定性，我们首先证明了依达沙努特林可在具有完整血脑屏障的小鼠的脑中积累(脑:血浆，0.35)，并且在携带原位肿瘤的小鼠中使p53稳定(图41A和图41B)。

接着，因为以致癌基因抑制达成的葡萄糖代谢扰动为对p53活化的协同敏感性所需，所以我们推断在EGFRi施用之后体内葡萄糖摄取的快速减弱–如通过¹⁸F-FDG PET所测量–可充当厄洛替尼+依达沙努特林组合治疗的治疗功效的非侵袭性预测生物标志(图26A)。我们观察到，在EGFR代谢响应者神经胶质瘤球(GBM39)的原位异种移植物中，急性厄洛替尼治疗(75mg/kg)快速降低了¹⁸F-FDG摄取(厄洛替尼施用后15小时)(图26B和图36C)。在单独的小鼠群组中，他们测试了单个药物以及每日厄洛替尼(75mg/kg)治疗和依达沙努特林(50mg/kg)的组合。相对于单剂对照，如通过分泌型长腹水蚤(gaussia)荧光素酶所确定，我们观察到携带GBM39颅内肿瘤的小鼠中的协同生长抑制，伴有最小毒性(图26B和图36D)。相比之下，非代谢响应者(HK393)的原位异种移植物显示在急性EGFRi的情况下在¹⁸F-FDG摄取方面无变化(图26D和图36C)，厄洛替尼和依达沙努特林组合也无协同活性(图26E)。因此，用于测量在EGFRi的情况下葡萄糖摄取的快速变化的非侵袭性¹⁸F-FDG PET有效预测对厄洛替尼和依达沙努特林组合的后续协同敏感性。

最后，我们评估了药物组合对两个EGFRi代谢响应者(GBM39和HK336)或两个非响应者(HK393和GS025)的原位异种移植物的总体存活的影响。所有肿瘤都是p53野生型的(图29A)。在存在肿瘤生长的迹象(如通过长腹水蚤荧光素酶所确定)之后，用媒介物、厄洛替尼、依达沙努特林、或组合治疗小鼠多达25天。药物组合仅在EGFRi代谢响应者GBM肿瘤的情况下导致存活明显增加(图30F至图30I)。总之，这些数据显示在p53野生型GBM原位异种移植物的子组的情况下，组合靶向EGFR和p53协同抑制生长，并且延长存活。重要的是，¹⁸F-FDGPET有作为对这个新型组合治疗策略的敏感性的非侵袭性预测生物标志的价值。

实施例13：用2DG或细胞松弛素B直接抑制糖酵解

我们测试了用己糖激酶抑制剂(2DG)和葡萄糖转运体抑制剂(细胞松弛素B)直接抑制糖酵解如何影响由努特林达成的p53活化。显示于图37中的结果证明低葡萄糖(0.25mM)导致与用纳维托克或努特林进行的BCL-xL抑制的协同细胞杀灭。使用膜联蛋白V染色测量用糖酵解抑制剂2DG或细胞松弛素B作为单剂或与p53活化剂努特林组合处理72小时的神经胶质瘤球样品中的细胞死亡。通过在低葡萄糖条件(0.25mM)下培养神经胶质瘤球以及用努特林或纳维托克(ABT-263)处理它们72小时来重演相同作用。

实施例14：实验程序

小鼠

6-8周龄的雌性NOD scidγ(NSG)从加州大学洛杉矶分校(University ofCalifornia Los Angeles，UCLA)医疗中心动物育种研究室购买。6-8周龄的雄性CD-1小鼠从Charles River购买。所有小鼠都在UCLA实验室动物部门(DLAM)的AAALAC核准动物设施处在菌丛确定的无病原体条件下保持。所有动物实验都在UCLA动物资源监督办公室(OARO)的核准下进行。

患者源性GBM细胞

用以获得GBM细胞培养物的所有患者组织都使用UCLA机构审查委员会(IRB)方案：10-00065，通过明确的知情同意书而获得。如先前所述¹²，建立原代GBM细胞，并且在补充以肝素(5μg/mL，Sigma)、EGF(50ng/mL，Sigma)和FGF(20ng/mL，Sigma)的由DMEM/F12(Gibco)、B27(Invitrogen)、青霉素-链霉素(Invitrogen)和Glutamax(Invitrogen)组成的神经胶质瘤球条件下维持。所有细胞都在37℃、20％O₂和5％CO₂下生长并以常规方式监测，并且使用可商购获得的试剂盒(MycoAlert,Lonza)关于支原体的存在测试为阴性。在实验时，使用的大多数HK株系在20-30次传代之间(例外之处是HK385 p8、HK336p15)，而GS和GBM39株系少于10次传代。所有细胞都通过短串联重复序列(STR)分析来验证。

试剂和抗体

将来自以下来源的化学抑制剂溶解于DMSO中以进行体外研究：厄洛替尼(Chemietek)、努特林-3A(Selleck Chemicals)、WEHI-539(APExBIO)、匹替尼西(SelleckChemicals)、寡霉素(Sigma)、鱼藤酮(Sigma)。在使用之前将2DG(Sigma)新鲜溶解于培养基中。用于免疫印迹的抗体从以下所列来源获得：β-肌动蛋白(Cell signaling，3700)、微管蛋白(Cell signaling，3873)、p-EGFR Y1086(Thermo Fischer Scientific，36-9700)、t-EGFR(Millipore，06-847)、t-AKT(Cell Signaling，4685)、p-AKT T308(Cell Signaling，13038)、p-AKT S473(Cell Signaling，4060)、t-ERK(Cell Signaling，4695)、p-ERK T202/Y204(Cell Signaling，4370)、t-S6(Cell Signaling，2217)、p-S6 S235/236(CellSignaling，4858)、t-4EBP1(Cell Signaling，9644)、p-4EBP1 S65(Cell Signaling9451)、Glut3(Abcam，ab15311)、Glut1(Millipore，07-1401)、p53(Santa CruzBiotechnology，SC-126)、BAX(Cell Signaling，5023)、BIM(Cell Signaling，2933)、Bcl-2(Cell Signaling，2870)、Bcl-xL(Cell Signaling，2764)、Mcl-1(Cell Signaling，5453)、细胞色素c(Cell Signaling，4272)和经裂解卡斯帕酶-3(Cleaved Caspase-3)(CellSignaling，9661)。用于免疫沉淀的抗体从以下所列来源获得：p53(Cell Signaling，12450)和Bcl-xL(Cell Signaling，2764)。二级抗体从以下所列来源获得：HRP连接的抗兔IgG抗体(Cell Signaling，7074)和HRP连接的抗小鼠IgG抗体(Cell Signaling，7076)。所有免疫印迹抗体都在1:1000的稀释度下使用，例外之处是在1:10,000下使用的β-肌动蛋白和微管蛋白抗体。根据制造商说明书稀释免疫沉淀抗体(对于p53是1:200，并且对于Bcl-xL是1:100)。在1:5000的稀释度下使用二级抗体。

¹⁸F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)摄取测定

将细胞以5×10⁴个细胞/毫升铺板，并且用指定药物处理所指示时间点。在适当处理之后，收集细胞，并且再悬浮于含有¹⁸F-FDG(放射性1μCi/mL)的无葡萄糖DMEM/F12(USBiological)中。在37℃下将细胞孵育1小时，接着用冰冷PBS洗涤三次。接着使用γ计数器测量每个样品的放射性。

葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸测量

使用Nova Biomedical BioProfile Basic分析仪测量细胞葡萄糖消耗和乳酸产生。简要来说，将细胞以1x10⁵个细胞/毫升于2mL神经胶质瘤球条件和适当药物条件下铺板(n＝5)。在药物处理之后12小时，从每个样品移除1ml培养基，并且在Nova BioProfile分析仪中分析。将测量结果以细胞数目作归一化。

膜联蛋白V凋亡测定

收集细胞，并且根据制造商方案(BD Biosciences)分析膜联蛋白V和PI染色。简要来说，将细胞以5x10⁴个细胞/毫升铺板，并且用适当药物处理。在所指示时间点之后，收集细胞，用胰蛋白酶处理，用PBS洗涤，并且用膜联蛋白V和PI染色15分钟。接着使用BD LSRII流式细胞仪分析样品。

免疫印迹

收集细胞，并且在含有Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo FischerScientific)的RIPA缓冲液(Boston BioProducts)中溶解。在4℃下在14,000xg下将溶解产物离心15分钟。接着将蛋白质样品在NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)和NuPAGE样品还原剂(Invitrogen)中煮沸，并且使用SDS-PAGE在12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分离并转移至硝化纤维素膜(GE Healthcare)。根据抗体的制造商说明书以及如先前所提及来进行免疫印迹。使用SuperSignal系统(Thermo Fischer Scientific)使膜显色。

免疫沉淀

收集细胞，用PBS洗涤一次，并且在4℃下在IP溶解缓冲液(25mM pH 7.4Tris-HCL、150mM NaCl、1mM EDTA、1％NP-40、5％甘油)中孵育15分钟。接着将300-500μg的每种样品在蛋白A/G Plus琼脂糖珠粒(Thermo Fischer Scientific)中预清除一小时。在预清除之后，接着根据制造商说明书以及如先前所提及来使样品与抗体-珠粒缀合物一起孵育过夜。接着在1000g下将样品离心1分钟，并且用500μL IP溶解缓冲液洗涤珠粒五次。通过在95℃下在2xLDS样品缓冲液(Invitrogen)中煮沸5分钟来从珠粒洗脱蛋白质。如先前所述通过免疫印迹分析样品。根据制造商说明书稀释免疫沉淀抗体(对于p53是1:200，并且对于Bcl-xL是1:100)。

动态BH3剖析

首先用TrypLE(Gibco)将GBM神经胶质瘤球解离成单细胞悬液，并且再悬浮于MEB缓冲液(150mM甘露糖醇、10mM HEPES-KOH、50mM KCl、0.02mM EGTA、0.02mM EDTA、0.1％BSA、5mM丁二酸盐)中。将50μl细胞悬液(3×10⁴个细胞/孔)铺于96孔板中的容纳有50μL含有0.002％毛地黄皂苷(digitonin)和所指示肽的MEB缓冲液的孔中。接着在25℃下将板孵育50分钟。接着用4％多聚甲醛固定细胞10分钟，随后用N2缓冲液(1.7M Tris、1.25M甘氨酸，pH 9.1)中和5分钟。将样品用20μL含有DAPI和抗细胞色素c抗体(BioLegend)的染色溶液(含10％BSA、2％吐温20的PBS)染色过夜。次日，使用BD LSRII流式细胞仪定量细胞色素c释放。将测量结果以不促进细胞色素c释放的适当对照(DMSO和非活性PUMA2A肽)作归一化。Δ致敏是指在媒介物处理的细胞与药物处理的细胞之间在细胞色素c释放量方面的差异。

BAX寡聚化

用所指示药物处理7.5x10⁵个细胞。在处理24小时之后，收集细胞，用冰冷PBS洗涤一次，并且再混悬于含1mM双顺丁烯二酰亚胺基己烷(BMH)的PBS中，持续30分钟。接着将细胞集结，并且溶解以进行免疫印迹，如以上所描述。

细胞色素c检测

将500万个细胞以1x10⁵个细胞/毫升的浓度铺板，并且用所指示药物处理。在处理24小时之后，收集细胞，用冰冷PBS洗涤一次。接着使用线粒体分离试剂盒(Thermo FischerScientific，89874)进行亚细胞分级分离。使细胞质级分与线粒体级分两者经受免疫印迹，并且使用1:1000稀释的细胞色素c抗体(Cell Signaling，4272)检测细胞色素c。

小鼠异种移植研究

对于颅内实验，将GBM39、HK336、HK393和GS025细胞注射(每次注射4×10⁵细胞)至雌性NSG小鼠(6-8周龄)的脑的右侧纹状体中。注射坐标是在前囟侧向2mm，并且在前囟后部1mm，深度是2mm。通过分泌型长腹水蚤荧光素酶监测肿瘤负荷，并且在连续三次生长测量之后，将小鼠随机分入由适当媒介物、75mg/kg厄洛替尼、50mg/kg依达沙努特林、或两种药物的组合组成的四个治疗组别中。媒介物由用于溶解厄洛替尼的0.5％甲基纤维素水溶液以及用于溶解依达沙努特林的从Roche获得的专有制剂组成。每周两次通过分泌型长腹水蚤荧光素酶评估肿瘤负荷。当可能时，将小鼠治疗25天，然后停止治疗并监测存活。通过口服管饲施用药物。基于来自先导实验的估计和来自先前文献¹²的结果选择样本大小。研究者对于群组分配或结果评估不是不知情的。所有研究都根据UCLA OARO方案指导方针。

颅内延迟PET/CT小鼠成像

将小鼠用所指示剂量和时间的厄洛替尼处理，接着预温热，用2％异氟烷麻醉，并且用70μCi的¹⁸F-FDG静脉内注射。在1小时无意识摄取之后，将小鼠停止麻醉，但保持温热以再进行5小时摄取。在初始施用¹⁸F-FDG之后6小时，使用G8 PET/CT扫描仪(SofieBiosciences)使小鼠成像。根据以上，通过使用AMIDE软件绘制3D目标区域(ROI)来进行定量。

免疫组织化学

对从FFPE(经福尔马林固定的石蜡包埋)块切割的4μm切片进行免疫组织化学分析。接着用二甲苯将切片脱石蜡，并且通过梯度乙醇来复水。采用pH 9.5核去遮盖剂(Biocare Medical)，在去遮盖加压蒸煮器中在95℃下持续40分钟来实现抗原修复。接着用3％过氧化氢(批次161509；Fisher Chemical)以及用Background Sniper(BiocareMedical,Concord,CA,USA)处理组织切片以降低非特异性背景染色。将针对p53的初级抗体(Cell Signaling，2527)以1:150稀释度施加80分钟，随后用MACH 3兔HRP-聚合物检测试剂盒(Biocare Medical)检测。使用VECTOR NovaRED(SK-4800；Vector Laboratories,Inc.)作为色原实现显影。最后，用塔哈氏自动化苏木精(Tacha’s Automated Hematoxylin，Biocare Medical)对切片进行复染。

定量RT-PCR

使用Purelink RNA试剂盒(Invitrogen)从所有细胞提取RNA。根据制造商说明书，用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)合成cDNA。使用SYBRGreen主混合物(KapaBiosciences)，在Roche LightCycler 480上进行定量PCR(qPCR)。相对表达值是以对照基因(GAPDH)作归一化的。引物序列如所列(5’至3’)：P21(正向GACTTTGTCACCGAGACACC，反向GACAGGTCCACATGGTCTTC)、PUMA(正向ACGACCTCAACGCACAGTACG，反向GTAAGGGCAGGAGTCCCATGATG)、GAPDH(正向TGCCATGTAGACCCCTTGAAG，反向ATGGTACATGACAAGGTGCGG)、MDM2(正向CTGTGTTCAGTGGCGATTGG，反向AGGGTCTCTTGTTCCGAAGC)、TIGAR(正向GGAAGAGTGCCCTGTGTTTAC，反向GACTCAAGACTTCGGGAAAGG)、PIG3(正向GCAGCTGCTGGATTCAATTA，反向TCCCAGTAGGATCCGCCTAT)。

P53报告体活性

首先用从编码在p53响应性元件：TACAGAACATGTCTAAGCATGCTGTGCCTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCTTGG G的控制下的荧光素酶的p53报告体质粒合成的慢病毒感染细胞。接着将受感染细胞以5,000个细胞/50μL铺于96孔板中，并且用所指示药物处理24小时，接着与1mM D-虫荧光素一起孵育两小时。使用IVIS Lumina II(Perkin Elmer)测量生物发光。

遗传操作

一般来说，通过使用转脂胺2000(Invitrogen)转染293-FT细胞(Thermo)来产生用于遗传操作的慢病毒。在转染之后48小时收集病毒。慢病毒sgp53载体和sgControl载体分别含有以下引导RNA：CCGGTTCATGCCGCCCATGC和GTAATCCTAGCACTTTTAGG。LentiCRISPR-v2用作骨架。从可商购获得的载体克隆Glut1和Glut3 cDNA，并且并入至含有CMV启动子的pLenti-GLuc-IRES-EGFP慢病毒骨架中(Glut1由Wolf Frommer馈赠(Addgene#18085⁴⁴)，Glut3从OriGene#SC115791获得，并且慢病毒骨架从Targeting Systems#GL-GFP获得)。pMIG Bcl-xL由Stanley Korsmeyer馈赠(Addgene#8790⁴⁵)，并且被克隆至以上提及的慢病毒骨架(Targeting Systems)中。细胞质(K305A和R306A)和野生型p53构建体由R.Agami和G.Lahav惠赠。将目标基因克隆至含有PGK启动子的慢病毒载体中。对野生型p53构建体使用定点诱变(New England Biolabs#E0554S)来产生p53 DNA结合结构域突变体(R175H)和(R273H)以及核突变体(L348A和L350A)的构建体。

对于EGFR敲低实验，使用DharmaFECT 4(Dharmacon)将针对EGFR的siRNA(ThermoFischer Scientific，s563)转染至细胞中。在48小时之后，收集细胞，并且用于所指示实验。

免疫荧光

对于免疫荧光，首先将神经胶质瘤球解离成单细胞，并且根据制造商说明书，使用Cell-Tak(Corning)贴壁于96孔板。接着用冰冷甲醇固定贴壁细胞10分钟，然后用PBS洗涤三次。接着将细胞与在PBS中含有10％FBS和3％BSA的封闭溶液一起孵育1小时，并且随后与p53(Santa Cruz，SC-126，1:50稀释)抗体一起在4℃下孵育过夜。次日，将细胞与二级抗体(Alexa Fluor 647，1:2000稀释)一起孵育1小时，并且DAPI染色10分钟，接着使用配备有Cascade II荧光照相机(Roper Scientific)的Nikon TI Eclipse显微镜成像。以在461nM和647nM下的发射使细胞成像，接着使用NIS-Elements AR分析软件处理。

氧消耗速率(OCR)和细胞外酸化速率(ECAR)测量

对于涉及OCR和ECAR的代谢测量，首先将用所指示药物处理的神经胶质瘤球解离成单细胞悬液，并且根据制造商说明书，使用Cell-Tak(Corning)贴壁于XF24板(SeahorseBioscience)。在测定之前，将细胞补充以未缓冲的DMEM，并且在37℃下孵育30分钟，随后开始OCR和ECAR测量。显示了对照处理的细胞与厄洛替尼处理的细胞之间的基础ECAR测量结果。

质谱分析法样品制备

通过口服管饲一式两份地用50mg/kg依达沙努特林处理雄性CD-1小鼠(6-8周龄)。在施用之后0.5、1、2、4、6、8、12和24小时，将小鼠处死，通过眶后放血来收集血液，并且收集脑组织。将来自小鼠的全血离心以分离血浆。通过从血浆进行液-液萃取来分离依达沙努特林，将50μL血浆添加至2μL内部标准物和100μL乙腈中。将小鼠脑组织用2mL冷PBS洗涤，并且使用组织匀浆器，采用新鲜2mL冷PBS加以均质化。接着通过液-液萃取以类似方式分离和重构依达沙努特林：将100μL脑匀浆添加至2μL内部标准物和200μL乙腈中。在涡旋混合之后，将样品离心。移除上清液，并且通过旋转蒸发器蒸发并在100μL 50:50水:乙腈中重构。

通过质谱测定法进行的依达沙努特林检测

使用1290Infinity LC系统(Agilent)，在100x2.1mm Phenomenex Kinetex C18柱(Kinetex)上进行色谱分离。流动相由溶剂A：0.1％甲酸Milli-Q水溶液，以及B：0.1％甲酸乙腈溶液组成。用5％B(0-4分钟)、5-99％B(4-32分钟)、99％B(32-36分钟)的梯度洗脱分析物，接着返回至5％B，持续12分钟，以在注射之间再平衡。将20μL注射至色谱系统中与0.10mL/min的溶剂流速一起使用。在6460三重四极杆LC/MS系统(Agilent)上进行质谱测定法。通过以正模式使用电喷雾来实现离子化，并且以多反应监测(MRM)模式进行数据获取。用于依达沙努特林检测的MRM跃迁是m/z 616.2→421.2，碎裂器电压是114V，并且碰撞能量是20eV。将分析物信号以内部标准物作归一化，并且通过与校正曲线(0.5、5、50、250、500、2000nM)比较来确定浓度。通过小鼠脑重量的1.4％来关于脑血管结构中的残余血液调整依达沙努特林脑浓度。

分泌型长腹水蚤荧光素酶测量

用含有分泌型长腹水蚤荧光素酶(sGluc)报告基因的慢病毒载体(TargetingSystems#GL-GFP)感染细胞，并且颅内植入至小鼠的右侧纹状体中(4x10⁵个细胞/小鼠)。为测量分泌型长腹水蚤荧光素酶(sGluc)的水平，从小鼠的尾部静脉收集6μL血液，并且立刻与50mM EDTA混合以防止凝固。通过在将100μL 100μM腔肠素(Nanolight)注射于96孔板中之后测量化学发光来获得Gluc活性。

协同作用评分计算

一式三份地将1.0x10⁵个GBM细胞铺板，并且使用其中每种药物在六种浓度(0-10μM)下添加至细胞中的矩阵，用厄洛替尼、努特林、或组合在多种浓度下处理。在处理72小时之后测量膜联蛋白V染色。使用Chalice软件，将组合的响应与它的单剂进行比较。使用协同作用评分计算组合作用。

DNA测序

使用Illumina Miseq对样品HK206、HK217、HK250、HK296进行以下基因的靶向测序：BCL11A、BCL11B、BRAF、CDKN2A、CHEK2、EGFR、ERBB2、IDH1、IDH2、MSH6、NF1、PIK3CA、PIK3R1、PTEN、RB1、TP53。每个样品有100至200万个读段，每个基因的平均覆盖度是230。使用全基因组SNP阵列测定这些样品的拷贝数变异。先前已在文献中报道GBM39的遗传概况。

对样品HK157、HK229、HK248、HK250、HK254、HK296、HK301、HK336、HK350、HK390、HK393进行全外显子组测序，并且在SeqWright处进行。将样品分组成采用单独捕集反应的2个池。使用Nextera快速捕集和文库制备，并且在HiSeq 2500 2x100 bp上进行测序，采用100x中靶覆盖度，2次完全快速运行，各自采用1个正常二倍体对照。使用EXCAVATOR软件进行对这些样品的拷贝数分析。

TCGA样品的注释

分析来自TCGA的273个GBM样品在EGFR、p53和p53调控的路径方面的遗传改变。考查了突变的共同发生，并且仅显示显著相互作用。如先前所述使用cBioPortal分析数据。

荧光原位杂交(FISH)

使用可商购获得的经荧光标记的双色EGFR(红色)/CEP 7(绿色)探针(Abbott-Molecular)进行荧光原位杂交(FISH)。遵循制造商的建议方案，对细胞系进行FISH杂交和分析。用DAPI对细胞进行复染，并且在配备有双色和三色滤光片的Zeiss(Axiophot)荧光显微镜下使荧光探针信号成像。

统计分析。

使用双尾未配对史都登氏t检验进行比较，并且将p值<0.05视为统计显著。来自多个独立实验的所有数据都被假定具有正态方差。数据代表平均值±s.e.m.值。所有统计分析都使用Prism 6.0(GraphPad)计算。对于所有体外和体内实验，不使用统计方法预先确定样本大小，并且不排除样本。对于体内肿瘤测量，最后的数据集用于在群组之间比较。如上所述，在研究之前将所有小鼠随机化。

实施例15：对于JGK系列的某些化合物合理的示例性设计

根据流程1设计本公开的某些化合物。

流程1.

实施例16：JGK系列的其他示例性化合物的制备

根据以下方法制备本公开的示例性化合物。

流程1.单保护的喹唑啉中间体3的合成。

流程2.JGK063–JGK070的合成。

流程3.JGK068S((S)-JGK068)的合成。以与用于JGK068的外消旋样品((±)-JGK068)的方式相同的方式进行合成，但采用对映异构纯的(S)-(–)-缩水甘油。使用(R)-(+)-缩水甘油制备另一对映异构体JGK068R((R)-JGK068)(未显示)。

流程4.通过手性SFC(Chiralpak AD-3柱，40％MeOH)以及通过比较5的莫舍酯衍生物的¹⁹F NMR波谱(图39)来测定合成中间体5的对映异构纯度。

流程5.JGK071的合成。

流程6.JGK072的合成。

流程7.JGK076–JGK080的合成。

流程8.JGK086-JGK090的合成。

一般性化学信息

所有化学品、试剂和溶剂在可获得时都从商业来源购买，并且按原样使用。必要时，通过标准方法纯化和干燥试剂和溶剂。在烘干玻璃器皿中在惰性氩气氛围下进行空气和水分敏感性反应。在单模反应器CEM Discover微波合成仪中进行微波照射反应。在环境温度(约23℃)下进行室温(RT)反应。所有反应都通过在预涂布Merck 60F₂₅₄硅胶板上进行薄层色谱法(TLC)来监测，其中通过紫外光(λ＝254、365nm)或通过使用碱性KMnO₄溶液来使斑点显影。在SiO₂ 60(粒度0.040–0.063mm，230–400目)上进行快速柱色谱法(FC)。用Merck60F₂₅₄硅胶板(20x20cm，210–270mm)或Analtech硅胶GF TLC板(20x20cm，1000mm)进行制备型薄层色谱法(PTLC)。通过在23–50℃下旋转蒸发来进行减压浓缩(在真空中)。在高真空下或在干燥器中进一步干燥纯化化合物。产率对应于纯化化合物，并且未经进一步优化。在Bruker波谱仪(在300、400或500MHz下运行)上记录质子核磁共振(¹HNMR)波谱。在Bruker波谱仪(在400或500MHz下)上记录碳NMR(¹³C NMR)波谱。NMR化学位移(δppm)以残余溶剂信号为参考。¹H NMR数据报告如下：以ppm计的化学位移；多重性(s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，m＝多重峰/复杂样式，td＝三双重峰，ddd＝双双双重峰，br＝宽信号)；以Hz计的偶合常数(J)，积分。¹³C NMR波谱的数据以化学位移报告，并且如果适用，那么以偶合常数报告。在具有IonSense ID-CUBE DART源的Thermo Fisher ScientificExactive Plus质谱仪上，或在具有带自动进样器的ACQUITY UPLC的Waters LCT Premier质谱仪上记录高分辨率质量(HRMS)谱。

一般性程序(GP)。GP-1：用仲胺对甲磺酸喹唑啉基酯的亲核取代。将甲磺酸喹唑啉酯(1当量)于DMF(0.05M)中的混合物用仲胺(5当量)和三乙胺(2当量)处理，并且在85℃下将混合物搅拌24小时。使混合物冷却至23℃，并且蒸发。将残余物溶解于EtOAc(20mL)中，用10mM NaOH(4x5mL)、盐水(5mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。通过FC或PTLC纯化提供了通常呈灰白色脆性泡沫状的所需产物。

GP-2：用苯胺对4-氯喹唑啉的亲核芳香取代。将4-氯喹唑啉(1当量)于乙腈(0.1M)中的混合物用苯胺(2当量)以及用4M HCl二噁烷溶液(1当量)处理。在微波照射下在80℃下将混合物加热30分钟。将混合物在减压下浓缩，或通过过滤(用Et₂O洗涤)分离沉淀的4-苯胺基喹唑啉盐酸盐。将残余物悬浮于饱和NaHCO₃水溶液中，并且用CH₂Cl₂(3x)萃取。将合并的有机萃取物用水、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且浓缩。通过FC(用CH₂Cl₂/EtOAc或己烷/EtOAc的梯度洗脱)纯化提供了通常呈白色至灰白色、或浅黄色固体状的所需产物。

双(2,2-二甲基丙酸)4-(3-溴-2-氟苯胺基)喹唑啉-6,7-二基酯(1)。

将双(2,2-二甲基丙酸)4-氯喹唑啉-6,7-二基酯¹(41.08g,113mmol)于iPrOH(450mL)中的混合物用3-溴-2-氟苯胺(17.05mL,152mmol)处理，并且在80℃下搅拌3.5小时。使混合物冷却至23℃，并且蒸发。将残余物数次再悬浮于己烷(50mL)中并浓缩，接着在HV下干燥。使残余物从EtOH重结晶以产生黄色固体，将其悬浮于饱和NaHCO₃水溶液(1L)中，并且用DCM(3x550mL)萃取。将合并的有机物用水(400mL)、盐水(400mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈黄色脆性泡沫状的标题化合物1(35.057g,60％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.76(s,1H),8.46(t,J＝7.5Hz,1H),7.72(s,1H),7.68(s,1H),7.56(br,1H),7.32(ddd,J＝8.0,6.4,1.5Hz,1H),7.11(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),1.40(s,9H),1.39ppm(s,9H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝176.13,175.55,156.71,154.96,150.69(d,J_CF＝243.7Hz),148.75,147.83,142.45,128.27,127.86(d,J_CF＝10.8Hz),125.29(d,J_CF＝4.7Hz),122.70,122.51,114.43,113.21,108.84(d,J_CF＝19.4Hz),39.54,39.51,27.40,27.32ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₄H₂₆BrFN₃O₄ ⁺的计算值：518.1085；实测值：518.1072。

4-(3-溴-2-氟苯胺基)喹唑啉-6,7-二醇(2)。

在0℃下将1(34.988g,67.5mmol)的搅拌浆液用7M NH₃ MeOH溶液(241mL,1.69mol)处理。在0℃下将混合物搅拌15分钟，接着在23℃下搅拌4.5小时。蒸发混合物，并且将残余物悬浮于水(400mL)中，搅拌过夜，并且过滤。将残余物用水(500mL)、乙腈(100mL)、DCM(4x150mL)、Et₂O(2x150mL)洗涤，并且在干燥器中干燥以提供呈浅黄色粉末状的标题化合物2(23.68g，定量)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝8.18(s,1H),7.59–7.47(m,2H),7.51(s,1H),7.16(t,J＝8.0Hz,1H),6.87ppm(s,1H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝156.43,156.12,153.06(d,J_CF＝246.7Hz),151.34,148.39,146.80,129.23,129.01,127.12,125.23(d,J_CF＝4.3Hz),108.47,108.32,107.09,103.04ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₄H₁₀BrFN₃O₂ ⁺的计算值：349.9935；实测值：349.9923。

2,2-二甲基丙酸4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7-羟基喹唑啉-6-基酯(3)。

将2(3500mg,10.0mmol)于DMF(52.6mL)中搅拌悬浮液用Et₃N(5.57mL,40.0mmol)处理，冷却至–40℃，并且用Piv₂O(3.14mL,15.5mmol)逐滴处理。在–40℃下将混合物搅拌1小时，此后移除冷却浴，并且继续搅拌2.5小时。将反应混合物用DCM(500mL)稀释，用10％柠檬酸(2x50mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。FC(DCM/EtOAc 1:1→0:1)提供了固体，将其再溶解于EtOAc(750mL)中，并且用半饱和NH₄Cl水溶液(4x75mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈米黄色固体状的标题化合物3(2.844g,66％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝11.00(br,1H),9.70(s,1H),8.39(s,1H),8.14(s,1H),7.59(ddd,J＝8.0,6.2,1.6Hz,1H),7.53(ddd,J＝8.3,7.1,1.6Hz,1H),7.21(td,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.17(s,1H),1.36ppm(s,9H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝175.93,157.68,154.61,154.53,153.34(d,J_CF＝247.3Hz),149.80,139.65,130.14,127.92(d,J_CF＝12.9Hz),127.62,125.47(d,J_CF＝4.4Hz),116.36,111.00,108.55(d,J＝20.0Hz),107.77,38.64,26.93ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₉H₁₈BrFN₃O₃ ⁺的计算值：434.0510；实测值：434.0489。

(±)-2,2-二甲基丙酸4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7-[(环氧乙烷-2-基)甲氧基]喹唑啉-6-基酯((±)-4)。

将3(1350mg,3.11mmol)和PPh₃(2038mg,7.77mmol)于THF(21mL)中的混合物用缩水甘油(495μL,7.46mmol)处理，冷却至0℃，并且用DIAD(1.47mL,7.46mmol)在10分钟期间处理。在23℃下将混合物搅拌2.5小时，并且浓缩。FC(DCM/EtOAc 9:1→4:6)提供了呈灰白色固体状的标题化合物(±)-4(848mg,56％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.73(s,1H),8.54(ddd,J＝8.6,7.3,1.6Hz,1H),7.54(s,1H),7.45(br,1H),7.30(ddd,J＝8.2,6.4,1.5Hz,1H),7.28(s,1H),7.11(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.34(dd,J＝10.8,3.0Hz,1H),3.99(dd,J＝10.8,6.2Hz,1H),3.35(ddt,J＝6.2,4.1,2.8Hz,1H),2.92(dd,J＝4.8,4.1Hz,1H),2.74(dd,J＝4.8,2.6Hz,1H),1.45ppm(s,9H)。¹³CNMR(126MHz,CDCl₃):δ＝176.87,156.46,155.10,154.93,150.41(d,J_CF＝243.3Hz),150.27,140.99,128.25(d,J_CF＝10.5Hz),127.75,125.28(d,J_CF＝4.7Hz),122.22,114.02,109.72,109.49,108.74(d,J_CF＝19.1Hz),70.05,49.55,44.56,39.45,27.38ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₂H₂₂BrFN₃O₄ ⁺的计算值：490.0772；实测值：490.0764。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-乙烯基-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺

((±)-JGK062)。

在0℃下将PPh₃(832mg,3.17mmol)和DIAD(624μL,3.17mmol)于THF(23mL)中的溶液搅拌15分钟，接着在0℃下在10分钟期间逐滴添加至(±)-8(1149mg,2.73mmol)于THF(27mL)中的溶液中。在0℃下将混合物搅拌2小时，并且蒸发。FC(己烷/EtOAc 9:1→4:6)继之以另一FC(DCM/EtOAc 1:0→6:4)提供了呈灰白色脆性泡沫状的标题化合物(±)-JGK062(1115mg，定量)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.65(ddd,J＝8.2,7.3,1.5Hz,1H),7.40(s,1H),7.37(br,1H),7.35(s,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.4,1.5Hz,1H),7.10(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),5.95(ddd,J＝17.3,10.7,5.8Hz,1H),5.60(dt,J＝17.3,1.2Hz,1H),5.48(dt,J＝10.7,1.1Hz,1H),4.82–4.74(m,1H),4.42(dd,J＝11.5,2.5Hz,1H),4.09ppm(dd,J＝11.6,8.1Hz,1H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.90,153.38,150.14(d,J＝242.4Hz),149.12,146.70,144.12,131.48,128.64(d,J＝10.3Hz),127.24,125.30(d,J＝4.7Hz),121.76,120.43,114.29,110.69,108.58(d,J＝19.3Hz),106.06,74.03,67.84ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₄BrFN₃O₂ ⁺的计算值：402.0248；实测值：402.0233。

(±)-[4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-7-基]甲醇((±)-5)。

将(±)-4(842mg,1.72mmol)于MeOH(31mL)中的混合物用K₂CO₃(482mg,3.49mmol)处理，在23℃下搅拌10.5小时，并且浓缩。将残余物悬浮于半饱和NH₄Cl水溶液(130mL)中，并且用EtOAc(3x20mL)萃取。将合并的有机物用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且浓缩以提供呈黄色固体状的标题化合物(±)-5(720mg，定量)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.59(s,1H),8.34(s,1H),7.95(s,1H),7.59(ddd,J＝8.0,6.2,1.6Hz,1H),7.55(ddd,J＝8.4,7.0,1.6Hz,1H),7.24–7.18(m,1H),7.21(s,1H),5.16(t,J＝5.6Hz,1H),4.49(dd,J＝11.5,2.4Hz,1H),4.34(dtd,J＝7.6,5.2,2.3Hz,1H),4.21(dd,J＝11.5,7.4Hz,1H),3.76–3.64ppm(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝157.20,153.35(d,J_CF＝247.5Hz),153.10,148.88,145.95,143.39,130.11,128.05(d,J_CF＝13.0Hz),127.73,125.44(d,J_CF＝4.4Hz),112.33,109.79,108.56(d,J_CF＝20.0Hz),108.37,73.78,65.50,59.78ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₇H₁₄BrFN₃O₃ ⁺的计算值：406.0197；实测值：406.0185。

(±)-甲烷磺酸[4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-7-基]甲酯((±)-6)。

将(±)-5(688mg,1.69mmol)于THF(14mL)中的溶液用Et₃N(357μL,2.56mmol)处理，冷却至0℃，并且用MsCl(174μL,2.24mmol)逐滴处理。在23℃下将混合物搅拌16小时，冷却至0℃，用饱和NaHCO₃水溶液(120mL)处理，并且用DCM(3x120mL)萃取。将合并的有机物用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并蒸发。FC(DCM/EtOAc8:2→3:7)提供了呈灰白色固体状的标题化合物(±)-6(496mg,61％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.69(s,1H),8.60(ddd,J＝8.5,7.2,1.4Hz,1H),7.43(s,1H),7.39(br,1H),7.37(s,1H),7.29(ddd,J＝8.1,6.5,1.5Hz,1H),7.11(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.63(dtd,J＝7.2,4.9,2.5Hz,1H),4.52(dd,J＝4.9,0.9Hz,2H),4.49(dd,J＝11.8,2.5Hz,1H),4.29(dd,J＝11.8,7.1Hz,1H),3.13ppm(s,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝156.02,153.66,150.28(d,J_CF＝242.9Hz),148.65,146.80,143.09,128.43(d,J_CF＝10.4Hz),127.54,125.32(d,J_CF＝4.7Hz),122.01,114.77,110.90,108.66(d,J_CF＝19.4Hz),106.44,71.10,66.46,64.77,38.02ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₅BrFN₃O₅S⁺的计算值：483.9973；实测值：483.9950。

(±)-2,2-二甲基丙酸4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7-{[2-(乙酰氧基)丁-3-烯-1-基]氧基}喹唑啉-6-基酯((±)-7)。

将3(2639mg,6.08mmol)和PPh₃(3986mg,15.2mmol)于THF(41mL)中的混合物用外消旋乙酸1-羟基丁-3-烯-2-基酯²(1.7mL,13.7mmol)处理，冷却至0℃，并且用DIAD(2.7mL,13.7mmol)逐滴处理。在23℃下将混合物搅拌3小时，并且浓缩。FC(DCM/EtOAc1:0→6:4)提供了呈灰白色固体状的粗制(±)-7(5.508g，估计产率60％)，其受到剩余Ph₃PO的污染。所述物质不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝8.74(s,1H),8.53(t,J＝7.9Hz,1H),7.53(s,1H),7.45(br,1H),7.33(s,1H),7.30(t,J＝7.7Hz,1H),7.11(t,J＝8.0Hz,1H),5.90(ddd,J＝17.0,10.6,6.2Hz,1H),5.65(q,J＝6.0Hz,1H),5.49–5.29(m,2H),4.31–4.08(m,2H),2.11(s,3H),1.41ppm(s,9H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝176.51,170.08,156.49,155.24,154.88,150.46(d,J_CF＝243.2Hz),150.17,140.90,132.16,128.18(d,J_CF＝11.0Hz),127.86,125.31(d,J_CF＝4.8Hz),122.27,119.64,114.00,109.56,109.39,108.76(d,J_CF＝19.4Hz),72.18,69.81,39.34,27.33,21.19ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₅H₂₆BrFN₃O₅ ⁺的计算值：546.1034；实测值：546.1018。

(±)-4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7-[(2-羟基丁-3-烯-1-基)氧基]喹唑啉-6-醇((±)-8)。

将粗制(±)-7(5508mg，受到来自最后步骤的剩余Ph3PO的污染)于MeOH(61mL)中的混合物用K₂CO₃(4198mg,30.4mmol)处理，在23℃下搅拌1小时，并且浓缩。将残余物悬浮于半饱和NH₄Cl水溶液(1L)中，并且用EtOAc(3x600mL)萃取。将合并的有机物干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。FC(DCM/EtOAc 1:1→0:1)提供了呈灰白色固体状的标题化合物(±)-8(1154mg，45％(历经两步))。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.46(s,1H),9.40(br,1H),8.33(s,1H),7.71(s,1H),7.59–7.52(m,2H),7.203(s),7.197(td,J＝8.1,1.1Hz,1H),6.01(ddd,J＝17.4,10.7,4.9Hz,1H),5.42(dt,J＝17.3,1.9Hz,1H),5.36(br,1H),5.20(dt,J＝10.6,1.8Hz,1H),4.49(br,1H),4.20(dd,J＝9.8,3.8Hz,1H),3.95ppm(dd,J＝9.8,7.5Hz,1H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝156.77,153.30(d,J_CF＝244.9Hz),152.77,152.31,146.66,146.11,137.61,129.75,128.46(d,J_CF＝13.0Hz),127.49,125.38(d,J_CF＝4.3Hz),115.58,109.42,108.50(d,J_CF＝19.8Hz),107.68,105.14,72.56,69.26ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₆BrFN₃O₃ ⁺的计算值：420.0354；实测值：420.0340。

(±)-2-[4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-7-基]乙-1-醇((±)-9)。

将(±)-JGK062(480mg,1.19mmol)于THF(4.8mL)中的混合物用0.5M 9-BBN THF溶液(4.8mL,2.39mmol)处理，并且在68℃下将混合物搅拌16小时。使混合物冷却至0℃，用THF(2.4mL)稀释，并且用3N NaOH(3mL,8.95mmol)和30％H₂O₂(474μL,8.95mmol)处理，并且在23℃下搅拌6小时。将混合物浓缩至THF的原始体积的约一半，用水(100mL)和盐水(40mL)稀释，并且用EtOAc(3x100mL)萃取。将合并的有机物用水(70mL)、盐水(70mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈黄色泡沫状的标题化合物(±)-9(912mg)，其不经进一步纯化即直接用于下一步骤中。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.66(s,1H),8.62(ddd,J＝8.8,7.4,1.6Hz,1H),7.35(s,1H),7.33(br,1H),7.2(ddd,J＝8.0,6.5,1.6Hz,1H),7.16(s,1H),7.09(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.50(dtd,J＝8.4,6.4,2.3Hz,1H),4.43(dd,J＝11.5,2.3Hz,1H),4.09(dd,J＝11.5,8.2Hz,1H),4.01–3.91(m,2H),1.95ppm(td,J＝6.5,5.3Hz,2H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.84,153.28,150.08(d,J_CF＝242.6Hz),149.42,146.47,144.20,128.51(d,J_CF＝10.2Hz),127.31,125.30(d,J_CF＝4.7Hz),121.69,113.95,110.50,108.58(d,J_CF＝19.2Hz),105.83,71.33,68.49,58.23,33.61ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₈H₁₆BrFN₃O₃ ⁺的计算值：420.0354；实测值：420.0370。

(±)-甲烷磺酸2-[4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-7-基]乙酯((±)-10)。

将粗制(±)-9(912mg)于THF(11.9mL)中的溶液用Et₃N(931mL,6.68mmol)处理，冷却至0℃，并且用MsCl(462μL,5.97mmol)逐滴处理。在0℃下将混合物搅拌15分钟，接着在23℃下搅拌21小时。使混合物冷却至0℃，用饱和NaHCO₃水溶液(120mL)逐滴处理，并且用DCM(3x120mL)萃取。将合并的有机物用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。FC(DCM/EtOAc 9:1→4:6)提供了呈灰白色脆性泡沫状的标题化合物(±)-10(112mg，19％(历经两步))。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.60(ddd,J＝8.6,7.3,1.5Hz,1H),7.44(br,1H),7.42(s,1H),7.35(s,1H),7.29(ddd,J＝8.1,6.5,1.6Hz,1H),7.11(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.60–4.48(m,3H),4.44(dd,J＝11.6,2.4Hz,1H),4.12(dd,J＝11.6,7.6Hz,1H),3.08(s,3H),2.24–2.10ppm(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝156.03,153.39,150.31(d,J_CF＝242.9Hz),149.11,146.54,143.60,128.47(d,J_CF＝10.5Hz),127.52,125.32(d,J_CF＝4.6Hz),122.02,114.30,110.68,108.66(d,J_CF＝19.2Hz),106.32,69.78,67.82,65.05,37.75,30.90ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₉H₁₈BrFN₃O₅S⁺的计算值：498.0129；实测值：498.0144。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[(吗啉-4-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK063)。

遵循一般性程序GP-1，在DMF(826μL)中从(±)-6(20mg,0.04mmol)和吗啉(18μL,0.21mmol)制备化合物(±)-JGK063。PTLC(DCM/EtOAc 1:9)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(±)-JGK063(15mg,76％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.67(s,1H),8.63(ddd,J＝8.6,7.3,1.5Hz,1H),7.38(s,1H),7.37(br,1H),7.31(s,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.3,1.5Hz,1H),7.10(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.50–4.41(m,2H),4.21–4.12(m,1H),3.75(t,J＝4.7Hz,4H),2.77(dd,J＝13.4,5.9Hz,1H),2.69–2.54ppm(m,5H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.89,153.36,150.15(d,J_CF＝242.5Hz),149.35,146.66,144.02,128.60(d,J_CF＝10.4Hz),127.27,125.30(d,J_CF＝4.6Hz),121.80,114.29,110.63,108.58(d,J_CF＝19.5Hz),106.06,71.61,67.18,67.01,58.94,54.56ppm。HRMS(ESI)：m/z[M–H]^–，C₂₁H₁₉BrFN₄O₃ ^–的计算值：473.0630；实测值：473.0630。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[2-(吗啉-4-基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK064)。

遵循一般性程序GP-1，在DMF(1.4mL)中从(±)-10(35mg,0.07mmol)和吗啉(31μL,0.35mmol)制备化合物(±)-JGK064。PTLC(EtOAc，0.5％乙腈，1.5％NH₄OH水溶液)继之以另一PTLC(EtOAc)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(±)-JGK064(25mg,73％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.65(ddd,J＝8.3,7.4,1.5Hz,1H),7.39(s,1H),7.36(br,1H),7.28(s,1H),7.30–7.25(m,1H),7.11(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.44(dd,J＝11.3,2.3Hz,1H),4.43–4.37(m,1H),4.10(dd,J＝11.3,7.7Hz,1H),3.73(t,J＝4.7Hz,4H),2.62(ddt,J＝12.5,8.4,3.9Hz,2H),2.57–2.42(m,4H),2.00–1.82ppm(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.86,153.31,150.13(d,J_CF＝242.3Hz),149.40,146.67,144.33,128.66(d,J_CF＝10.4Hz),127.22,125.33(d,J_CF＝4.6Hz),121.75,114.21,110.63,108.58(d,J_CF＝19.2Hz),105.87,72.20,68.33,67.06,54.23,53.86,28.15ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₂₂H₂₃BrFN₄O₃ ⁺的计算值：489.0932；实测值：489.0935。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[(哌啶-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK065)。

遵循一般性程序GP-1，在DMF(1.65mL)中从(±)-6(40mg,0.08mmol)和哌啶(41μL,0.41mmol)制备化合物(±)-JGK065。PTLC(EtOAc)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(±)-JGK065(24mg,61％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.66(s,1H),8.63(ddd,J＝8.7,7.3,1.5Hz,1H),7.369(s,1H),7.368(br,1H),7.30(s,1H),7.26(ddd,J＝8.1,6.5,1.5Hz,1H),7.09(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.46(dd,J＝11.3,2.3Hz,1H),4.43(ddd,J＝8.3,5.8,2.0Hz,1H),4.12(dd,J＝11.2,7.5Hz,1H),2.71(dd,J＝13.3,5.9Hz,1H),2.58(dd,J＝13.4,6.2Hz,1H),2.59–2.42(m,4H),1.65–1.57(m,4H),1.49–1.41ppm(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.86,153.26,150.12(d,J_CF＝242.6Hz),149.49,146.62,144.23,128.65(d,J_CF＝10.3Hz),127.18,125.27(d,J_CF＝4.5Hz),121.76,114.16,110.57,108.56(d,J_CF＝19.4Hz),106.00,71.87,67.46,59.34,55.59,26.07,24.20ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₂₂H₂₃BrFN₄O₂ ⁺的计算值：473.0983；实测值：473.0991。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[(二甲基氨基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK066)。

遵循一般性程序GP-1，在DMF(1.85mL)中从(±)-6(45mg,0.09mmol)和2M Me₂NHTHF溶液(232μL,0.46mmol)制备化合物(±)-JGK066。PTLC(EtOAc，0.5％乙腈，1.5％NH₄OH水溶液)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(±)-JGK066(39mg,97％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.680(s,1H),8.675(ddd,J＝8.2,7.5,1.5Hz,1H),7.39(s,1H),7.38(s,1H),7.37(br,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.4,1.5Hz,1H),7.10(d,J＝1.6Hz,1H),4.46–4.41(m,1H),4.45(dd,J＝11.8,2.3Hz,1H),4.12(dd,J＝11.9,8.1Hz,1H),2.73(dd,J＝13.2,7.1Hz,1H),2.55(dd,J＝13.1,5.0Hz,1H),2.38ppm(s,6H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.89,153.34,150.07(d,J_CF＝242.3Hz),149.38,146.67,144.06,128.70(d,J_CF＝10.4Hz),127.16,125.29(d,J_CF＝4.7Hz),121.65,114.27,110.67,108.56(d,J_CF＝19.4Hz),106.15,71.70,67.20,59.78,46.41ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₁₉H₁₉BrFN₄O₂ ⁺的计算值：433.0670；实测值：433.0677。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[(吡咯烷-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK067)。

遵循一般性程序GP-1，在DMF(1.45mL)中从(±)-6(35mg,0.07mmol)和吡咯烷(30μL,0.36mmol)制备化合物(±)-JGK067。PTLC(EtOAc，1.5％iPrOH，1.5％NH₄OH水溶液)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(±)-JGK067(31mg,93％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.67(ddd,J＝8.7,7.5,1.6Hz,2H),7.39(s,1H),7.36(br,1H),7.35(s,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.4,1.5Hz,2H),7.10(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.49–4.42(m,1H),4.48(dd,J＝11.6,2.0Hz,1H),4.15(dd,J＝11.7,8.0Hz,1H),2.88(dd,J＝12.9,6.5Hz,1H),2.80(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),2.72–2.60(m,4H),1.90–1.79ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.87,153.32,150.09(d,J_CF＝242.6Hz),149.45,146.68,144.18,128.71(d,J_CF＝10.3Hz),127.15,125.30(d,J_CF＝4.7Hz),121.67,114.26,110.65,108.56(d,J_CF＝19.4Hz),106.06,72.73,67.35,56.57,55.15,23.75ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₂₁H₂₁BrFN₄O₂ ⁺的计算值：459.0826；实测值：459.0845。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK068)。

遵循一般性程序GP-1，在DMF(1.45mL)中从(±)-6(35mg,0.07mmol)和1-甲基哌嗪(40μL,0.36mmol)制备化合物(±)-JGK068。PTLC(EtOAc/iPrOH 85:15，1.5％NH₄OH水溶液)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(±)-JGK068(29mg,82％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.64(ddd,J＝8.3,7.3,1.5Hz,1H),7.39(s,1H),7.36(br d,J＝3.8Hz,1H),7.32(s,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.5,1.6Hz,1H),7.10(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.48–4.41(m,2H),4.15(dd,J＝11.5,8.6Hz,1H),2.78(dd,J＝13.4,6.0Hz,1H),2.661(dd,J＝13.4,5.8Hz,1H),2.656(br,4H),2.51(br,4H),2.32ppm(s,3H)。¹³CNMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.89,153.35,150.15(d,J_CF＝242.6Hz),149.40,146.69,144.11,128.64(d,J_CF＝10.3Hz),127.24,125.30(d,J_CF＝4.7Hz),121.78,114.27,110.63,108.59(d,J_CF＝19.2Hz),106.07,71.80,67.27,58.43,55.10,53.96,46.06ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₂₂H₂₄BrFN₅O₂ ⁺的计算值：488.1092；实测值：488.1109。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[2-(二甲基氨基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK069)。

遵循一般性程序GP-1，在DMF(1.3mL)中从(±)-10(32mg,0.06mmol)和2M Me₂NHTHF溶液(161μL,0.32mmol)制备化合物(±)-JGK069。PTLC(EtOAc，5％iPrOH，1.5％NH₄OH水溶液)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(±)-JGK069(19mg,66％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.67(s,1H),8.63(ddd,J＝8.7,7.4,1.6Hz,1H),7.373(br,1H),7.371(s,1H),7.28(s,1H),7.28–7.24(m,1H),7.10(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.42(dd,J＝11.4,2.3Hz,1H),4.38(tdd,J＝7.7,5.1,2.3Hz,1H),4.08(dd,J＝11.3,7.8Hz,1H),2.56(t,J＝7.2Hz,2H),2.29(s,6H),1.93(dq,J＝14.2,7.4Hz,1H),1.84ppm(dtd,J＝14.2,7.5,5.1Hz,1H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.86,153.26,150.14(d,J_CF＝242.4Hz),149.42,146.65,144.36,128.67(d,J_CF＝10.5Hz),127.18,125.30(d,J_CF＝4.7Hz),121.77,114.14,110.60,108.56(d,J_CF＝19.2Hz),105.88,72.19,68.34,55.06,45.58,29.16ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₂₀H₂₁BrFN₄O₂ ⁺的计算值：447.0826；实测值：447.0820。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK070)。

遵循一般性程序GP-1，在DMF(1.3mL)中从(±)-10(32mg,0.06mmol)和1-甲基哌嗪(36μL,0.32mmol)制备化合物(±)-JGK070。PTLC(EtOAc/iPrOH 8:2，1.5％NH₄OH水溶液)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(±)-JGK070(21mg,65％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.66(s,1H),8.62(ddd,J＝8.5,7.3,1.5Hz,1H),7.373(br,1H),7.367(s,1H),7.29–7.24(m,1H),7.28(s,1H),7.09(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.43(dd,J＝11.4,2.3Hz,1H),4.37(tdd,J＝7.7,5.4,2.3Hz,1H),4.08(dd,J＝11.4,7.9Hz,1H),2.68–2.54(m,2H),2.50(br,8H),2.30(s,3H),1.94(dtd,J＝13.6,7.5,6.0Hz,1H),1.86ppm(dtd,J＝14.2,7.3,5.3Hz,1H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.86,153.27,150.16(d,J_CF＝242.5Hz),149.41,146.64,144.37,128.64(d,J_CF＝10.3Hz),127.22,125.28(d,J_CF＝4.6Hz),121.81,114.13,110.60,108.57(d,J_CF＝19.4Hz),105.88,72.38,68.36,55.20,53.77,53.25,46.11,28.50ppm。HRMS(ESI)：m/z[M+H]⁺，C₂₃H₂₆BrFN₅O₂ ⁺的计算值：502.1248；实测值：502.1261。

5-氟-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯(11)。

将3-氟苯-1,2-二醇(7233mg,56.5mmol)于DMF(113mL)中的混合物用K₂CO₃(19514mg,141mmol)处理，在23℃下搅拌10分钟，并且用1-溴-2-氯乙烷(9.4mL,113mmol)处理。在23℃下将混合物搅拌1小时，接着在95℃下搅拌16小时。使混合物冷却至23℃，用水(150mL)稀释，并且用EtOAc(3x150mL)萃取。将合并的有机物用水(90mL)、盐水(90mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。FC(己烷/EtOAc 30:1→10:1)提供了呈澄清无色油状的标题化合物11(7973mg,92％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝6.78–6.63(m,3H),4.34–4.26ppm(m,4H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ＝152.05(d,J_CF＝244.3Hz),145.27(d,J_CF＝3.8Hz),132.78(d,J_CF＝13.9Hz),120.02(d,J_CF＝8.9Hz),112.74(d,J_CF＝3.1Hz),108.52(d,J_CF＝18.1Hz),64.50,64.45ppm。HRMS(DART)：m/z[M]^·+，C₈H₇FO₂ ^·+的计算值：154.0425；实测值：154.0420。

6-溴-5-氟-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯(12)。

将11(7812mg,50.7mmol)于MeOH(101mL)中的溶液用NBS(9022mg,50.7mmol)处理，并且在70℃下加热30分钟。使混合物冷却至23℃，并且浓缩。将残余物溶解于DCM(700mL)中，用水(300mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并且蒸发。FC(己烷/EtOAc 30:1→20:1)继之以在100℃下在HV下干燥以移除任何剩余起始物料提供了呈澄清无色油状的标题化合物12(8807mg，75％，含有约15％的区域异构体)，使其在冷冻器中固化以产生灰白色固体。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝6.96(dd,J＝9.0,7.0Hz,1H),6.59(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),4.35–4.24ppm(m,4H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ＝148.87(d,J_CF＝245.1Hz),144.53(d,J_CF＝3.5Hz),133.81(d,J_CF＝14.6Hz),123.31,113.39(d,J_CF＝3.6Hz),109.17(d,J_CF＝19.3Hz),64.51,64.34ppm。HRMS(DART)：m/z[M]^·+，C₈H₆BrFO₂ ^·+的计算值：231.9530；实测值：231.9525。

5-氟-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-甲酸(13)。

使12(7.0g,30.0mmol)于THF(108mL)中的混合物冷却至–78℃，并且用2.5M nBuLi己烷溶液(12.02mL,30.0mmol)在10分钟期间逐滴处理。在–78℃下将混合物搅拌30分钟，接着通过导管转移至碎干冰上(用10mL THF冲洗导管)。使混合物升温至23℃，并且浓缩。将水(200mL)和1M NaOH(50mL)添加至残余物中，并且将水相用Et₂O(3x60mL)萃取。将水相用6MHCl(15mL)酸化，并且用DCM(3x150mL)萃取。将合并的有机物用盐水(150mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并且蒸发。FC(己烷/EtOAc 7:3→3:7)提供了呈白色固体状的标题化合物13(3591mg,60％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝12.90(br,1H),7.33(dd,J＝8.9,7.7Hz,1H),6.78(dd,J＝8.9,1.7Hz,1H),4.39–4.29ppm(m,4H)。¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆):δ＝164.65(d,J_CF＝3.0Hz),151.21(d,J_CF＝257.5Hz),148.50(d,J_CF＝4.4Hz),132.68(d,J_CF＝13.6Hz),122.44(d,J_CF＝1.4Hz),112.12(d,J_CF＝3.4Hz),111.97(d,J_CF＝7.3Hz),64.42,63.91ppm。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₉H₆FO₄ ^–的计算值：197.0256；实测值：197.0250。

(5-氟-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-基)氨基甲酸乙酯(14)。

将13(650mg,3.28mmol)于甲苯(13.1mL)中的混合物用Et₃N(1.4mL,9.84mmol)处理，并且在10℃下用DPPA(780μL,3.62mmol)处理。在23℃下将混合物搅拌30分钟，接着在85℃下搅拌1.5小时。使混合物冷却至23℃，用EtOH(5mL)处理，在23℃下搅拌1.5小时，并且浓缩。将残余物溶解于Et₂O(150mL)中，用饱和NaHCO₃水溶液(40mL)、水(40mL)、盐水(40mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并且蒸发。FC(己烷/DCM 7:3→1:9)提供了呈白色固体状的标题化合物14(512mg,65％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝7.42(br,1H),6.64(dd,J＝9.2,2.2Hz,1H),6.56(br,1H),4.32–4.24(m,4H),4.22(q,J＝7.1Hz,2H),1.31ppm(t,J＝7.1Hz,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝153.80,142.61(d,J_CF＝246.0Hz),140.82,132.66(d,J_CF＝12.4Hz),120.36(d,J_CF＝6.9Hz),112.36,111.81(d,J_CF＝3.7Hz),64.72,64.29,61.61,14.66ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₁H₁₃FNO₄ ⁺的计算值：242.0823；实测值：242.0816。

10-氟-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉(15)。

在微波中在110℃下将14(450mg,1.87mmol)和HMTA(263mg,1.87mmol)于TFA(5.7mL)中的混合物照射10分钟。使混合物冷却至23℃，用水(60mL)稀释，用6M NaOH(12mL)处理，并且用DCM(3x60mL)萃取。将合并的有机物用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以产生泡沫状黄色油状物。

将所述油状物于含10％KOH的1:1二噁烷/水(15.5mL)中的混合物用[K₃Fe(CN)₆](614mg,1.87mmol)处理，并且在微波中在100℃下照射10分钟。将这个程序重复总计四次(4个循环的添加1当量铁氰化钾继之以微波照射)。将所得混合物用水(160mL)稀释，并且用DCM(3x120mL)萃取。将合并的有机物用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈黄色固体状的标题化合物15(330mg,86％)，其不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝9.21(br,1H),9.19(s,1H),7.18(d,J＝2.0Hz,1H),4.53–4.41ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝158.06(d,J_CF＝2.9Hz),153.81(d,J_CF＝1.8Hz),145.76(d,J_CF＝2.9Hz),144.40(d,J_CF＝256.1Hz),138.56(d,J_CF＝11.0Hz),136.73(d,J_CF＝10.1Hz),119.81(d,J_CF＝2.7Hz),106.55(d,J_CF＝4.3Hz),64.78,64.34ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₀H₈FN₂O₂ ⁺的计算值：207.0564；实测值：207.0563。

10-氟-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4(3H)-酮(16)。

将15(306mg,1.48mmol)于AcOH(1mL)中的溶液用0.833M CAN水溶液(7.12mL,5.94mmol)逐滴处理，并且在23℃下搅拌15分钟。通过过滤来收集白色沉淀，并且用水(2x2mL)、乙腈(2x2mL)、DCM(2mL)和Et₂O(2mL)洗涤以提供第一批标题化合物。将水性滤液用1M NaOH中和至pH约7，并且如前所述通过过滤收集白色沉淀，继之以洗涤以提供呈白色固体状的第二批标题化合物16(81mg,25％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝12.19(br,1H),7.98(d,J＝3.3Hz,1H),7.32(s,1H),4.52–4.28ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝159.31,144.58(d,J_CF＝251.8Hz),144.28,143.80(d,J_CF＝3.4Hz),137.86(d,J_CF＝11.1Hz),132.94(d,J_CF＝8.9Hz),115.75,106.62(d,J_CF＝3.7Hz),64.57,64.02ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₀H₈FN₂O₃ ⁺的计算值：223.0513；实测值：223.0503。

4-氯-10-氟-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉(17)。

将16(92mg,0.41mmol)于甲苯(1.2mL)中的搅拌悬浮液用DIPEA(220μL,1.26mmol)处理，继之以在10℃下逐滴添加POCl₃(103μL,1.12mmol)。在23℃下将混合物搅拌1小时，接着在90℃下搅拌5小时，并且浓缩。在0℃下将残余物用饱和NaHCO₃水溶液(10mL)处理5分钟，用水(5mL)稀释，并且用DCM(3x7mL)萃取。将合并的有机物用半饱和NaHCO₃水溶液(7mL)、盐水(7mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈浅棕色固体状的标题化合物17(51mg,51％)，其不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.90(s,1H),7.51(d,J＝2.0Hz,1H),4.55–4.43ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝160.48(d,J_CF＝4.3Hz),152.31,146.29(d,J_CF＝3.3Hz),144.63(d,J_CF＝256.2Hz),138.95(d,J_CF＝11.3Hz),137.68(d,J_CF＝10.2Hz),118.56(d,J_CF＝2.4Hz),105.82(d,J_CF＝4.2Hz),64.81,64.41ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₀H₇ClFN₂O₂ ⁺的计算值：241.0175；实测值：241.0174。

5-氟-7-硝基-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-甲酸(18)。

在10℃下将13(1500mg,7.57mmol)于AcOH(7.5mL)中的混合物用H₂SO₄(2.02mL)逐滴处理。在0℃下将剧烈搅拌的混合物用65％HNO₃(2.6mL)在10分钟期间逐滴处理。在0℃下将所得混合物搅拌30分钟，接着在23℃下搅拌16小时。将混合物倾倒至冰水(40mL)中，并且通过过滤(用40mL冷水洗涤)来收集白色沉淀，并且在干燥器中干燥以提供呈白色固体状的标题化合物18(1280mg,70％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝14.09(br,1H),7.62(d,J＝1.7Hz,1H),4.52–4.40ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝162.71,147.16(d,J_CF＝248.7Hz),144.72(d,J_CF＝5.1Hz),138.15(d,J_CF＝13.7Hz),137.10(d,J_CF＝6.6Hz),113.44(d,J_CF＝20.3Hz),109.52(d,J_CF＝2.3Hz),64.97,64.48ppm。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₉H₅FNO₆ ^–的计算值：242.0106；实测值：242.0124。

7-氨基-5-氟-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-甲酸(19)。

在23℃下在H₂氛围下将18(500mg,2.06mmol)和5％Pd/C(223mg,0.10mmol)于MeOH(21mL)中的混合物搅拌13.5小时。将混合物经Celite过滤(用EtOH洗涤)，并且蒸发以产生呈灰色固体状的标题化合物19(418mg,95％)，其似乎不是极其稳定的。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝8.35(br,2H),6.04(d,J＝1.9Hz,1H),4.29–4.24(m,2H),4.19–4.14ppm(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝167.36(d,J_CF＝2.9Hz),151.36(d,J_CF＝252.0Hz),148.86(d,J_CF＝7.0Hz),145.81(d,J_CF＝5.7Hz),122.88(d,J_CF＝15.4Hz),97.19(d,J_CF＝2.9Hz),95.37(d,J_CF＝10.9Hz),64.95,63.58ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₉H₉FNO₄ ⁺的计算值：214.0510；实测值：214.0508。

5-氟-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4(3H)-酮(20)。

在120–125℃下将19(417mg,1.96mmol)于甲酰胺(2.3mL,58.7mmol)中的混合物搅拌16小时。使混合物冷却至0℃，并且用水(4mL)处理，搅拌30分钟，用水(4mL)稀释，并且过滤。将残余物用冷水(3x5mL)洗涤，并且在HV下经干来特(Drierite)干燥以提供呈灰白色固体状的标题化合物20(249mg,57％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝12.00(br,1H),7.90(d,J＝3.6Hz,1H),6.93(d,J＝1.9Hz,1H),4.45–4.35ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝157.64(d,J_CF＝3.0Hz),149.70(d,J_CF＝6.0Hz),148.45(d,J_CF＝261.3Hz),144.60,142.99,131.47(d,J_CF＝12.7Hz),108.76(d,J_CF＝3.5Hz),106.38(d,J_CF＝3.8Hz),64.69,63.98ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₀H₈FN₂O₃ ⁺的计算值：223.0513；实测值：223.0510。

4-氯-5-氟-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉(21)。

将20(90mg,0.41mmol)于甲苯(1.2mL)中的搅拌悬浮液用DIPEA(215μL,1.24mmol)处理，继之以在10℃下逐滴添加POCl₃(100μL,1.09mmol)。在23℃下将混合物搅拌1小时，接着在88℃下搅拌5小时，并且浓缩。在0℃下将残余物用饱和NaHCO₃水溶液(10mL)处理，用水(5mL)稀释，并且用DCM(3x7mL)萃取。将合并的有机物用半饱和NaHCO₃水溶液(7mL)、盐水(7mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈浅橙色固体状的标题化合物21(96mg,99％)，其不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.83(s,1H),7.35(d,J＝2.0Hz,1H),4.51–4.45ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝156.76(d,J_CF＝4.5Hz),152.70(d,J_CF＝2.3Hz),151.66(d,J_CF＝4.9Hz),146.08,144.51(d,J_CF＝261.8Hz),134.04(d,J_CF＝14.0Hz),110.85(d,J_CF＝7.7Hz),109.43(d,J_CF＝4.0Hz),64.89,64.37ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₀H₇ClFN₂O₂ ⁺的计算值：241.0175；实测值：241.0176。

N-(3-溴-2-氟苯基)-10-氟-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK071)。

遵循一般性程序GP-2，从氯喹唑啉17(35mg,0.15mmol)和3-溴-2-氟苯胺制备化合物JGK071。FC(DCM/EtOAc 1:0→8:2)提供了呈白色固体状的JGK071(44mg,77％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ＝9.76(s,1H),8.38(s,1H),7.80(d,J＝1.8Hz,1H),7.62(ddd,J＝8.0,6.3,1.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.5,7.1,1.6Hz,1H),7.22(td,J＝8.0,1.2Hz,1H),4.53–4.40ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ＝156.93(d,J_CF＝3.7Hz),153.44(d,J_CF＝247.5Hz),153.12,144.04(d,J_CF＝250.0Hz),143.97(d,J_CF＝3.2Hz),137.04(d,J_CF＝10.9Hz),135.62(d,J_CF＝9.9Hz),130.48,127.89,127.62(d,J_CF＝13.1Hz),125.51(d,J_CF＝4.5Hz),108.58(d,J_CF＝23.4Hz),108.51,103.25(d,J_CF＝3.9Hz),64.63,64.21ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁BrF₂N₃O₂ ⁺的计算值：393.9997；实测值：393.9999。

N-(3-溴-2-氟苯基)-5-氟-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK072)。

遵循一般性程序GP-2，从氯喹唑啉21(35mg,0.15mmol)和3-溴-2-氟苯胺制备化合物JGK072。FC(DCM/EtOAc 1:0→8:2)提供了呈白色固体状的JGK072(47mg,82％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ＝8.67(ddd,J＝8.6,7.2,1.5Hz,1H),8.62(s,1H),8.52(dd,J＝19.6,2.2Hz,1H),7.29(ddd,J＝8.1,6.4,1.5Hz,1H),7.23(d,J＝2.0Hz,1H),7.10(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.48–4.42ppm(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ＝155.27(d,J_CF＝5.2Hz),153.90,150.34(d,J_CF＝243.9Hz),149.93(d,J_CF＝6.2Hz),145.75(d,J_CF＝250.3Hz),144.78,131.96(d,J_CF＝15.6Hz),128.43(d,J_CF＝10.4Hz),127.71,125.20(d,J_CF＝4.7Hz),122.48,109.69(d,J_CF＝3.3Hz),108.63(d,J_CF＝19.2Hz),101.42(d,J_CF＝7.2Hz),64.84,64.48ppm。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₁₁BrF₂N₃O₂ ⁺的计算值：393.9997；实测值：393.9996。

实施例17：本公开的示例性化合物的脑穿透

表5中公开了所指示药物在非携带肿瘤的小鼠中，脑与血浆百分比以及药物在脑中相对于在血浆中的未结合比率。

表5：本公开的示例性化合物的脑穿透

实施例18：JGK系列的示例性化合物的制备

流程1.JGK068S的合成。

流程2.(R)-对映异构体JGK068R或外消旋混合物(JGK068)的制备遵循与流程1中所示相同的途径，但分别采用(R)-缩水甘油或外消旋缩水甘油。

流程3.在一步中从苯甲醛1和手性甲苯磺酸缩水甘油酯对苯并二噁烷甲醛(R)-10的合成。这个途径避免了流程1中的光延(Mitsunobu)反应(从1制备2)。化合物(R)-10可在流程1中所示的途径中用于制备JGK068S。

一般性化学信息

所有化学品、试剂和溶剂在可获得时都从商业来源购买，并且按原样使用。必要时，通过标准方法纯化和干燥试剂和溶剂。在烘干玻璃器皿中在惰性氩气氛围下进行空气和水分敏感性反应。在单模反应器CEM Discover微波合成仪中进行微波照射反应。在环境温度(约23℃)下进行室温(RT)反应。所有反应都通过在预涂布Merck 60F₂₅₄硅胶板上进行薄层色谱法(TLC)来监测，其中通过紫外光(λ＝254、365nm)或通过使用碱性KMnO₄溶液来使斑点显影。在SiO₂ 60(粒度0.040–0.063mm，230–400目)上进行快速柱色谱法(FC)。用Merck60F₂₅₄硅胶板(20x20cm，210–270mm)或Analtech硅胶GF TLC板(20x20cm，1000mm)进行制备型薄层色谱法(PTLC)。通过在23–50℃下旋转蒸发来进行减压浓缩(在真空中)。在高真空下或在干燥器中进一步干燥纯化化合物。产率对应于纯化化合物，并且未经进一步优化。在Bruker波谱仪(在300、400或500MHz下运行)上记录质子核磁共振(¹HNMR)波谱。在Bruker波谱仪(在400或500MHz下)上记录碳NMR(¹³C NMR)波谱。NMR化学位移(δppm)以残余溶剂信号为参考。¹H NMR数据报告如下：以ppm计的化学位移；多重性(s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，m＝多重峰/复杂样式，td＝三双重峰，ddd＝双双双重峰，br＝宽信号)；以Hz计的偶合常数(J)，积分。¹³C NMR波谱的数据以化学位移报告，并且如果适用，那么以偶合常数报告。在具有IonSense ID-CUBE DART源的Thermo Fisher ScientificExactive Plus质谱仪上，或在具有带自动进样器的ACQUITY UPLC的Waters LCT Premier质谱仪上记录高分辨率质量(HRMS)谱。

乙酸5-甲酰基-2-羟基苯酯(1)。

使3,4-二羟基苯甲醛(100g,0.724mol)于THF(965mL)中的混合物冷却至0℃，并且历经4–5分钟用10％NaOH水溶液(724mL,1.81mol)处理。在0℃下将反应混合物搅拌15分钟之后，历经20分钟逐滴添加乙酸酐(Ac₂O，82.1mL,0.869mol)。在相同温度下将混合物搅拌30分钟，接着在0℃下倾倒至EtOAc(1.25L)和2M HCl(1.13L)的混合物中。分离各相，并且将水相用EtOAc(4x250mL)萃取。将合并的有机物用水(2x500mL)、盐水(500mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。将残余物用少量正庚烷处理，并且蒸发(3x)。从EtOAc重结晶(275mL；将晶体用Et₂O洗涤)产生了呈浅棕色晶体状的第一批标题化合物1(66.96g,51％)。从EtOAc进行母液重结晶产生了呈浅棕色固体状的第二批标题化合物1(29.436g,23％)。¹HNMR(500MHz,CDCl₃):δ9.85(s,1H),7.73–7.65(m,2H),7.11(d,J＝8.8Hz,1H),6.34(br,1H),2.39(s,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ190.40,168.99,152.96,138.81,130.24,129.72,124.13,117.87,21.09。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₉H₉O₄ ⁺的计算值：181.0495；实测值：181.0488。

乙酸5-甲酰基-2-{[(2R)-环氧乙烷-2-基]甲氧基}苯酯((R)-2)。

将1(32.5g,0.18mol)和三苯基膦(PPh₃，70.976g,0.27mol)于THF(905mL)中的混合物用(S)-缩水甘油(17.95mL,0.27mol)处理，冷却至0℃，并且历经30分钟用偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，56.8mL,0.289mmol)逐滴处理。在0℃下将混合物再搅拌10分钟，此后移除冷却浴，并且在23℃下继续搅拌15.5小时。蒸发所有挥发物，并且以棕色油状物形式获得的粗制(R)-2不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。

(3S)-3-(羟基甲基)-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-甲醛((S)-3)。

将粗制(R)-2于MeOH(1.564L)中的混合物用K₂CO₃(49.87g,0.36mol)处理，并且在23℃下搅拌18.5小时，接着蒸发溶剂。将残余物悬浮于半饱和NH₄Cl(750mL)中，并且用EtOAc(3x500mL)萃取。将合并的有机物用水(250mL)、盐水(250mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。将粗物质通过数轮快速色谱法(己烷/EtOAc 9:1→1:1)以及通过从1:1己烷/Et₂O沉淀(以移除三苯基氧化膦Ph₃PO)来纯化，以提供呈白色固体状的标题化合物(S)-3(17.322g，49％(历经两步))。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ9.81(s,1H),7.43(d,J＝1.8Hz,1H),7.41(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),4.39(dd,J＝11.4,2.3Hz,1H),4.31–4.25(m,1H),4.20(dd,J＝11.3,7.9Hz,1H),3.95(dd,J＝12.1,4.3Hz,1H),3.87(dd,J＝12.1,4.9Hz,1H),2.18(br,1H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ190.79,148.76,143.46,130.79,124.46,118.33,117.70,73.31,65.61,61.54。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₀H₁₁O₄ ⁺的计算值：195.0652；实测值：195.0650。

乙酸[(2R)-7-氰基-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-2-基]甲酯((R)-4)。

将(S)-3(17.322g,0.089mol)于AcOH(189mL)中的混合物用KOAc(22.944g,0.234mol)处理，在23℃下搅拌10分钟，接着用NH₂OH·HCl(16.233g,0.234mol)处理。在120–125℃下将所得混合物搅拌18.5小时。使混合物冷却至23℃，倾倒至水(1L)中，并且用EtOAc(4x250mL)萃取。将合并的有机物用3.5M NaOH(400mL)和饱和NaHCO₃水溶液(100mL)处理以获得最终pH约8，并且在23℃下将乳液搅拌1小时。分离有机层，并且用饱和NaHCO₃水溶液(300mL)、水(300mL)、盐水(300mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。通过快速色谱法(己烷/EtOAc 10:1→6:4)纯化提供了呈澄清无色油状的标题化合物(R)-4(13.513g,65％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ7.20(d,J＝2.0Hz,1H),7.16(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H),4.43–4.38(m,1H),4.36(dd,J＝11.6,2.4Hz,1H),4.34(dd,J＝11.1,4.5Hz,1H),4.30(dd,J＝11.6,4.6Hz,1H),4.11(dd,J＝11.5,7.2Hz,1H),2.12(s,3H)。¹³CNMR(126MHz,CDCl₃):δ170.64,147.13,143.11,126.28,121.56,118.85,118.32,105.13,71.11,65.45,62.24,20.83。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₂H₁₂NO₄ ⁺的计算值：234.0761；实测值：234.0759。

乙酸[(2R)-7-氰基-6-硝基-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-2-基]甲酯((R)-5)。

将(R)-4(13.345g,57.2mmol)于Ac₂O(74.3mL)中的混合物用H₂SO₄(3.05mL,57.2mmol)处理，冷却至0℃，并且在0℃下历经35分钟用70％HNO₃(19.63mL,286mmol)逐滴处理。在0℃下将混合物再搅拌2小时，接着在23℃下搅拌3.5小时。将混合物倾倒至冰水(850mL)中，并且用6M NaOH(320mL)将pH调整至约7。添加饱和NaHCO₃水溶液(200mL)，并且将混合物用CH₂Cl₂(3x500mL)萃取。将合并的有机物用饱和NaHCO₃水溶液(400mL)、水(400mL)、盐水(400mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈黄色油状的标题化合物(R)-5(15.696g,99％)，其不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ7.96(s,1H),7.80(s,1H),4.73–4.67(m,1H),4.58(dd,J＝11.8,2.6Hz,1H),4.36(dd,J＝12.5,3.7Hz,1H),4.31(dd,J＝12.5,5.7Hz,1H),4.27(dd,J＝11.8,7.0Hz,1H),2.05(s,3H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ170.11,147.75,146.26,142.23,123.77,115.21,115.17,100.06,72.00,64.98,61.72,20.52。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₂H₁₁N₂O₆ ⁺的计算值：279.0612；实测值：279.0601。

(3S)-7-氨基-3-(羟基甲基)-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-甲腈((S)-6)。

将(R)-5(15.591g,56mmol)于1:1水/乙醇(250mL)中的悬浮液用Na₂S₂O₄(39.266g,185mmol)处理，并且在50℃下将混合物搅拌105分钟，接着加热至70℃，持续2小时，同时在那个时间期间用浓HCl(73.6mL,0.897mol)逐份处理。使混合物冷却至23℃，倾倒在冰上，并且用6M NaOH(200mL)和半饱和NaHCO₃(500mL)将pH调整至约10。将混合物用EtOAc(3x500mL)萃取。将合并的有机物用水(500mL)、盐水(500mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈橙黄色固体状的粗制(S)-6(9.483g,82％)，其不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ6.92(s,1H),6.29(s,1H),5.50(br,2H),5.04(t,J＝5.7Hz,1H),4.32(dd,J＝10.7,1.6Hz,1H),4.07–3.99(m,1H),4.00(dd,J＝11.2,8.3Hz,1H),3.64–3.51(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ148.50,147.29,134.39,119.04,118.04,102.45,86.72,73.25,65.92,59.77。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₀H₁₀N₂O₃ ^·+的计算值：206.0686；实测值：206.0685。

N'-[(2S)-7-氰基-2-(羟基甲基)-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-6-基]-N,N-二甲基甲-脒((S)-7)。

将(S)-6(9.38g,45.5mmol)于甲苯(117mL)中的混合物用AcOH(143μL,2.5mmol)和DMF-DMA(13.1mL,98.9mmol)处理，并且在105℃下将混合物搅拌3小时。在迪安-斯达克分水器(Dean-Stark trap)中收集蒸发的MeOH(约4–5mL)以监测反应的进展。使混合物冷却至23℃，并且蒸发以获得呈粘性棕色油状的粗制(S)-7(14.243g，定量)，其不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ7.51(s,1H),7.05(s,1H),6.48(s,1H),4.33(dd,J＝11.2,2.0Hz,1H),4.23–4.17(m,1H),4.13(dd,J＝11.2,8.1Hz,1H),3.90(dd,J＝12.1,4.2Hz,1H),3.83(dd,J＝12.1,4.8Hz,1H),3.07(s,3H),3.05(s,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ160.40,153.78,147.68,138.63,121.08,118.64,108.16,99.31,73.34,65.83,61.67,40.51,34.82。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₃H₁₆N₃O₃ ⁺的计算值：262.1186；实测值：262.1183。

[(7S)-4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-7-基]甲醇((S)-8)。

将(S)-7于AcOH(152mL)中的混合物用3-溴-2-氟苯胺(6.63mL,59.1mmol)处理，并且在125–130℃下将混合物搅拌3小时。使混合物冷却至23℃，倾倒至冰水(500mL)中，并且用饱和NH₄OH水溶液(185mL)和半饱和NaHCO₃水溶液(200mL)将pH调整至约9。将混合物用EtOAc(3x400mL)萃取，并且将合并的有机物用半饱和NaHCO₃水溶液(400mL)、水(400mL)、盐水(400mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。将残余物溶解于MeOH(272mL)中，并且用K₂CO₃(12.579g,91mmol)处理，在23℃下搅拌1小时，并且蒸发。将残余物悬浮于半饱和NH4Cl水溶液(700mL)中，并且用EtOAc(3x400mL)萃取。将合并的有机物用水(400mL)、盐水(400mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。将橙黄色残余物悬浮于EtOAc中，升温至65℃，接着让其缓慢地过夜冷却至23℃。过滤以及用冷己烷(2x15mL)和Et₂O(2x15mL)洗涤残余物和在高真空下干燥提供了呈精细黄色粉末状的标题化合物(S)-8(9.407g，50.9％(历经两步))。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.69(s,1H),8.33(s,1H),7.99(s,1H),7.59(ddd,J＝8.0,6.2,1.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.4,7.0,1.6Hz,1H),7.24–7.17(m,1H),7.20(s,1H),5.20(t,J＝5.6Hz,1H),4.49(dd,J＝11.5,2.4Hz,1H),4.37–4.29(m,1H),4.21(dd,J＝11.6,7.4Hz,1H),3.76–3.64(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.22,153.38(d,J_CF＝247.0Hz),153.09,148.87,145.94,143.37,130.08,128.09(d,J_CF＝12.9Hz),127.75,125.43(d,J_CF＝4.5Hz),112.29,109.81,108.54(d,J_CF＝20.0Hz),108.49,73.77,65.52,59.76。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₇H₁₄BrFN₃O₃ ⁺的计算值：406.0197；实测值：406.0185。

甲烷磺酸[(7R)-4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-7-基]甲酯((R)-9)。

将(S)-8(9.01g,22.2mmol)和Me₃N·HCl(234mg,2.45mmol)于乙腈(148mL)中的混合物用Et₃N(6.18mL,44.4mmol)处理，冷却至0–5℃，并且历经10分钟用MsCl(2.57mL,33.2mmol)于乙腈(17mL；用3mL冲洗)中的溶液逐滴处理。在0℃下搅拌混合物1小时。添加水(100mL)，并且在真空中蒸发大部分乙腈。添加额外水(700mL)，并且将混合物用EtOAc(3x400mL)萃取。将合并的有机物用水(400mL)、盐水(400mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发以提供呈黄色脆性泡沫状的标题化合物(R)-9(10.33g,96％)，其不经任何进一步纯化即用于下一步骤中。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.70(s,1H),8.62(ddd,J＝8.7,7.3,1.6Hz,1H),7.44(s,1H),7.362(s,1H),7.360(br,1H),7.29(ddd,J＝8.1,6.5,1.5Hz,1H),7.11(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.67–4.61(m,1H),4.54–4.51(m,2H),4.50(dd,J＝11.7,2.4Hz,1H),4.29(dd,J＝11.8,7.1Hz,1H),3.13(s,3H)。

(7S)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK068S)。

将(R)-9于DMF(427mL)中的混合物用1-甲基哌嗪(11.83mL,107mmol)和Et₃N(5.95mL,42.7mmol)处理，并且在85℃下将混合物搅拌24小时。使混合物冷却至23℃，并且蒸发。将残余物溶解于EtOAc(1.2L)中，并且用0.5M NaOH(4x250mL)、盐水(250mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。通过快速色谱法(CH₂Cl₂/MeOH 1:0→8:2)纯化提供了呈灰白色脆性泡沫状的标题化合物JGK068S(6.013g，58％(历经两步))。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.67(s,1H),8.63(ddd,J＝8.7,7.3,1.6Hz,1H),7.374(s,1H),7.372(br,1H),7.32(s,1H),7.26(ddd,J＝8.1,6.5,1.5Hz,1H),7.09(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.48–4.40(m,2H),4.14(dd,J＝11.8,8.0Hz,1H),2.77(dd,J＝13.4,6.0Hz,1H),2.653(dd,J＝13.4,5.8Hz,1H),2.648(br,4H),2.51(br,4H),2.32(s,3H)。

流程4.JGK083S的合成。

{[(7S)-4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-7-基]甲基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯((S)-10)。

遵循实施例16的一般性程序GP-1，在DMF(3.8mL)中从R-9(91mg,0.188mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(175mg,0.94mmol)制备化合物(S)-10，并且在85℃下搅拌15小时。PTLC(CH₂Cl₂/EtOAc 4:6)提供了呈灰白色脆性泡沫状的(S)-10(50mg,46％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.68(s,1H),8.65(ddd,J＝8.3,7.4,1.5Hz,1H),7.39(s,1H),7.36(br,1H),7.31(s,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.5,1.5Hz,1H),7.11(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.50–4.42(m,2H),4.17(dd,J＝12.1,8.2Hz,1H),3.47(t,J＝5.1Hz,4H),2.78(dd,J＝13.4,5.9Hz,1H),2.67(dd,J＝13.5,5.9Hz,1H),2.62–2.47(m,4H),1.47(s,9H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ155.89,154.83,153.39,150.15(d,J_CF＝242.4Hz),149.36,146.72,144.02,128.63(d,J_CF＝10.3Hz),127.27,125.34,121.78,114.34,110.66,108.60(d,J_CF＝19.5Hz),106.06,79.97,71.76,67.18,58.56,53.96,28.57，一个碳信号缺失(可能归因于重叠峰)。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₆H₃₀BrFN₅O₄ ⁺的计算值：574.1460；实测值：574.1432.

(7S)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[(哌嗪-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK083S)。

在23℃下将(S)-10(42mg,0.073mmol)于CH₂Cl₂(500μL)和TFA(250μL)中的混合物搅拌12小时。将混合物用1M HCl(20mL)稀释，并且用CH₂Cl₂(3x7mL)洗涤。将水相用6M NaOH(4mL)稀释至pH>12，并且用EtOAc(3x8mL)萃取。将合并的有机物用盐水(8mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。通过PTLC(CH₂CL₂/MeOH 8:2)纯化提供了呈白色脆性泡沫状的标题化合物JGK083S(18mg,52％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.68(s,1H),8.66(ddd,J＝8.2,7.3,1.6Hz,1H),7.39(s,1H),7.35(br d,J＝4.0Hz,1H),7.32(s,1H),7.27(ddd,J＝8.1,6.5,1.6Hz,1H),7.11(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.50–4.42(m,2H),4.19–4.13(m,1H),2.93(t,J＝4.9Hz,4H),2.76(dd,J＝13.4,5.9Hz,1H),2.63(dd,J＝13.4,6.0Hz,1H),2.63–2.50(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ155.88,153.35,150.12(d,J_CF＝242.3Hz),149.45,146.71,144.17,128.67(d,J_CF＝10.4Hz),127.21,125.32(d,J_CF＝4.7Hz),121.74,114.30,110.64,108.58(d,J_CF＝19.3Hz),106.02,71.70,67.32,59.19,55.54,46.23。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₂₁H₂₀BrFN₅O₂ ^–的计算值：472.0790；实测值：472.0773。

乙酸[(2R)-7-甲酰基-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己二烯-2-基]甲酯((R)-10)。

将1(150mg,0.833mmol)和(2R)-甲苯磺酸缩水甘油酯(203mg,0.891mmol)于DMF(2mL)中的混合物用K₂CO₃(181mg,1.31mmol)处理，并且在60℃下将混合物搅拌15小时。使混合物冷却至23℃，添加水(30mL)，并且将混合物用EtOAc(3x15mL)萃取。将合并的有机物用水(15mL)、盐水(15mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且蒸发。通过制备型薄层色谱法(己烷/EtOAc 7:3)纯化提供了呈澄清无色油状的标题化合物(R)-10(111mg,56％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝9.82(s,1H),7.44(d,J＝1.8Hz,1H),7.42(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),7.00(d,J＝8.1Hz,1H),4.46–4.39(m,1H),4.37(dd,J＝11.5,2.4Hz,1H),4.35(dd,J＝11.7,4.9Hz,1H),4.31(dd,J＝11.9,5.1Hz,1H),4.13(dd,J＝11.5,7.1Hz,1H),2.11(s,3H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ190.72,170.67,148.57,143.22,131.15,124.38,118.76,117.85,70.94,65.54,62.36,20.83。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₂H₁₃O₅ ⁺的计算值：237.0757；实测值：237.0745。

(±)-N-(3-氯-2-氟苯基)-7-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK075)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.68(s,1H),8.61(td,J＝7.3,2.2Hz,1H),7.39(s,1H),7.35(br d,J＝3.4Hz,1H),7.32(s,1H),7.16(td,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.13(td,J＝8.2,1.9Hz,1H),4.49–4.41(m,2H),4.15(dd,J＝11.8,8.1Hz,1H),2.78(dd,J＝13.4,5.9Hz,1H),2.66(dd,J＝13.4,5.9Hz,1H),2.64(br,4H),2.48(br,4H),2.31(s,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ155.89,153.35,149.44,149.30(d,J_CF＝244.2Hz),146.72,144.15,128.76(d,J_CF＝9.3Hz),124.71(d,J_CF＝4.7Hz),124.45,121.01,120.85(d,J_CF＝16.1Hz),114.30,110.63,106.05,71.81,67.31,58.50,55.17,54.15,46.19。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₂H₂₄ClFN₅O₂ ⁺的计算值：444.1597；实测值：444.1582。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[(吗啉-4-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK076)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.62(s,1H),8.33(s,1H),7.94(s,1H),7.59(ddd,J＝8.0,6.2,1.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.5,7.1,1.6Hz,1H),7.21(td,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.19(s,1H),4.63–4.56(m,1H),4.46(dd,J＝11.6,2.5Hz,1H),4.17(dd,J＝11.6,7.1Hz,1H),3.59(t,J＝4.6Hz,4H),2.71–2.59(m,2H),2.57–2.44(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.22,153.37(d,J_CF＝247.3Hz),153.13,148.75,146.16,143.28,130.14,128.02(d,J_CF＝13.0Hz),127.74,125.45(d,J_CF＝4.7Hz),112.57,109.61,108.55(d,J_CF＝19.9Hz),108.23,71.41,66.29,66.18,57.97,53.89。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₂₁H₁₉BrFN₄O₃ ^–的计算值：,473.0630；实测值：473.0608。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[(二甲基氨基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK077)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.62(s,1H),8.33(s,1H),7.94(s,1H),7.59(ddd,J＝8.0,6.2,1.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.5,7.1,1.6Hz,1H),7.21(td,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.17(s,1H),4.57–4.51(m,1H),4.44(dd,J＝11.6,2.5Hz,1H),4.14(dd,J＝11.7,7.1Hz,1H),2.58(s,1H),2.57(s,1H),2.25(s,6H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.22,153.38(d,J_CF＝247.4Hz),153.12,148.78,146.16,143.29,130.14,128.02(d,J_CF＝13.1Hz),127.75,125.45(d,J_CF＝4.4Hz),112.54,109.59,108.55(d,J_CF＝19.8Hz),108.20,71.76,66.31,58.73,45.92。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₁₉H₁₇BrFN₄O₂ ^–的计算值：431.0524；实测值：431.0503。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK078)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.61(s,1H),8.33(s,1H),7.94(s,1H),7.59(ddd,J＝8.0,6.2,1.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.5,7.1,1.6Hz,1H),7.21(td,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.19(s,1H),4.60–4.53(m,1H),4.44(dd,J＝11.6,2.5Hz,1H),4.14(dd,J＝11.7,7.1Hz,1H),2.68–2.59(m,2H),2.53(br,4H),2.34(br,4H),2.16(s,3H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.22,153.38(d,J_CF＝247.4Hz),153.12,148.78,146.15,143.29,130.13,128.02(d,J_CF＝13.1Hz),127.74,125.45(d,J_CF＝4.5Hz),112.55,109.60,108.55(d,J_CF＝19.8Hz),108.22,71.57,66.34,57.52,54.68,53.29,45.72。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₂₂H₂₂BrFN₅O₂ ^–的计算值：486.0946；实测值：486.0928。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[(吡咯烷-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK079)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.61(s,1H),8.33(s,1H),7.94(s,1H),7.59(ddd,J＝8.0,6.3,1.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.5,7.1,1.6Hz,1H),7.21(td,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.19(s,1H),4.57–4.49(m,1H),4.46(dd,J＝11.6,2.5Hz,1H),4.16(dd,J＝11.6,7.1Hz,1H),2.80(dd,J＝12.8,6.0Hz,1H),2.73(dd,J＝12.8,6.2Hz,1H),2.62–2.48(m,4H),1.74–1.66(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.22,153.37(d,J_CF＝247.5Hz),153.12,148.79,146.17,143.29,130.13,128.02(d,J_CF＝12.9Hz),127.74,125.45(d,J_CF＝4.5Hz),112.54,109.58,108.55(d,J_CF＝20.0Hz),108.19,72.65,66.32,55.42,54.31,23.23。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₂₁H₁₉BrFN₄O₂ ^–的计算值：457.0681；实测值：457.0660。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[(哌啶-1-基)甲基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK080)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.61(s,1H),8.33(s,1H),7.94(s,1H),7.59(ddd,J＝8.0,6.3,1.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.4,7.0,1.6Hz,1H),7.21(td,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.18(s,1H),4.59–4.52(m,1H),4.44(dd,J＝11.6,2.5Hz,1H),4.14(dd,J＝11.7,7.1Hz,1H),2.65–2.54(m,2H),2.53–2.37(m,4H),1.55–1.47(m,4H),1.43–1.34(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.21,153.37(d,J_CF＝247.1Hz),153.11,148.83,146.15,143.32,130.12,128.03(d,J_CF＝13.1Hz),127.73,125.45(d,J_CF＝4.5Hz),112.53,109.57,108.55(d,J_CF＝19.8Hz),108.19,71.63,66.42,58.35,54.74,25.61,23.83。HRMS(DART)：m/z[M–H]^–，C₂₂H₂₁BrFN₄O₂ ^–的计算值：471.0837；实测值：471.0814。

N-(3-溴-2-氟苯基)(7,7,8,8-²H₄)-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK081)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.61(s,1H),8.33(s,1H),7.93(s,1H),7.59(ddd,J＝7.9,6.3,1.6Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.4,7.1,1.6Hz,1H),7.21(td,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.19(s,1H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.19,153.37(d,J_CF＝247.2Hz),153.10,149.27,146.03,143.67,130.12,128.03(d,J_CF＝13.0Hz),127.74,125.44(d,J_CF＝4.2Hz),112.47,109.63,108.55(d,J_CF＝19.9Hz),108.35。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₆H₈D₄BrFN₃O₂ ⁺的计算值：380.0342；实测值：380.0327。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[2-(吡咯烷-1-基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK084)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.60(s,1H),8.33(s,1H),7.95(s,1H),7.58(ddd,J＝8.0,6.2,1.6Hz,1H),7.53(ddd,J＝8.4,7.0,1.6Hz,1H),7.21(td,J＝8.1,1.1Hz,2H),7.20(s,1H),4.50(dd,J＝11.5,2.3Hz,1H),4.42–4.36(m,1H),4.12(dd,J＝11.5,7.7Hz,1H),2.70–2.56(m,2H),2.49–2.40(m,4H),1.89–1.78(m,2H),1.73–1.64(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.21,153.33(d,J_CF＝247.5Hz),153.13,148.95,146.02,143.37,130.08,128.07(d,J_CF＝13.1Hz),127.64,125.48(d,J_CF＝4.6Hz),112.26,109.78,108.58(d,J_CF＝19.8Hz),108.44,71.76,67.78,53.63,51.03,29.53,23.16。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₂H₂₃BrFN₄O₂ ⁺的计算值：473.0983；实测值：473.0976。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-[2-(哌啶-1-基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK085)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.60(s,1H),8.33(s,1H),7.94(s,1H),7.58(ddd,J＝8.0,6.2,1.6Hz,1H),7.53(ddd,J＝8.4,7.1,1.6Hz,1H),7.204(td,J＝8.2,1.3Hz,1H),7.198(s,1H),4.51(dd,J＝11.5,2.4Hz,1H),4.39–4.33(m,1H),4.11(dd,J＝11.6,7.8Hz,1H),2.50–2.44(m,2H),2.42–2.27(m,4H),1.90–1.76(m,2H),1.55–1.45(m,4H),1.42–1.34(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.20,153.33(d,J_CF＝247.4Hz),153.12,148.95,146.02,143.39,130.08,128.07(d,J_CF＝13.1Hz),127.64,125.48(d,J_CF＝4.5Hz),112.25,109.77,108.58(d,J_CF＝20.0Hz),108.43,71.97,67.80,54.08,53.96,27.69,25.61,24.12。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₃H₂₅BrFN₄O₂ ⁺的计算值：487.1139；实测值：487.1137。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[2-(吗啉-4-基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK086)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.63(s,1H),8.32(s,1H),7.93(s,1H),7.58(ddd,J＝8.0,6.3,1.5Hz,1H),7.53(t,J＝7.0Hz,1H),7.21(td,J＝8.1,1.2Hz,1H),4.50(dd,J＝11.5,2.4Hz,1H),4.47–4.40(m,1H),4.10(dd,J＝11.6,7.4Hz,1H),3.58(t,J＝4.7Hz,4H),2.55–2.46(m,2H),2.45–2.33(m,4H),1.92–1.79(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.20,153.33(d,J_CF＝248.3Hz),153.06,148.94,146.06,143.26,130.03,128.12(d,J_CF＝9.8Hz),127.69,125.44(d,J_CF＝4.4Hz),112.47,109.64,108.55(d,J_CF＝19.9Hz),108.18,72.30,67.35,66.22,53.53,53.28,27.25。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₂H₂₃BrFN₄O₃ ⁺的计算值：489.0932；实测值：489.0926。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[2-(二甲基氨基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK087)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.61(s,1H),8.33(s,1H),7.93(s,1H),7.59(t,J＝6.9Hz,1H),7.54(t,J＝7.5Hz,1H),7.21(t,J＝8.1Hz,1H),7.18(s,1H),4.49(dd,J＝11.6,2.3Hz,1H),4.45–4.38(m,1H),4.09(dd,J＝11.6,7.5Hz,1H),2.47–2.38(m,2H),2.17(s,6H),1.86–1.78(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.20,153.37(d,J_CF＝247.6Hz),153.08,148.99,146.14,143.29,130.10,128.07(d,J_CF＝15.6Hz),127.72,125.44(d,J_CF＝4.4Hz),112.50,109.58,108.54(d,J_CF＝19.7Hz),108.13,72.30,67.36,54.43,45.17,28.27。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₀H₂₁BrFN₄O₂ ⁺的计算值：447.0826；实测值：447.0818。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK088)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.62(s,1H),8.33(s,1H),7.93(s,1H),7.59(t,J＝7.1Hz,1H),7.54(t,J＝7.5Hz,1H),7.21(t,J＝8.0Hz,1H),7.17(s,1H),4.49(dd,J＝11.5,2.4Hz,1H),4.45–4.38(m,1H),4.10(dd,J＝11.6,7.4Hz,1H),2.48–2.21(m,10H),2.14(s,3H),1.91–1.76(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.20,153.36(d,J_CF＝246.9Hz),153.08,148.98,146.13,143.28,130.09,128.05(d,J_CF＝11.7Hz),127.72,125.44(d,J_CF＝4.3Hz),112.50,109.58,108.55(d,J_CF＝19.8Hz),108.13,72.40,67.37,54.78,53.11,52.65,45.76,27.61。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₃H₂₆BrFN₅O₂ ⁺的计算值：502.1248；实测值：502.1240。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[2-(吡咯烷-1-基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK089)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.62(s,1H),8.33(s,1H),7.93(s,1H),7.59(t,J＝7.2Hz,1H),7.53(t,J＝7.5Hz,1H),7.21(t,J＝8.0Hz,1H),7.17(s,1H),4.49(dd,J＝11.5,2.4Hz,1H),4.47–4.41(m,1H),4.10(dd,J＝11.5,7.4Hz,1H),2.68–2.53(m,2H),2.50–2.40(m,4H),1.89–1.81(m,2H),1.73–1.65(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.20,153.36(d,J_CF＝246.9Hz),153.07,148.98,146.13,143.28,130.07,128.10,127.71,125.44(d,J_CF＝4.6Hz),112.48,109.60,108.55(d,J_CF＝19.8Hz),108.15,72.31,67.37,53.57,50.97,29.58,23.14。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₂H₂₃BrFN₄O₂ ⁺的计算值：473.0983；实测值：473.0976。

(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-8-[2-(哌啶-1-基)乙基]-7,8-二氢[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK090)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ9.62(s,1H),8.32(s,1H),7.93(s,1H),7.59(t,J＝7.1Hz,1H),7.53(t,J＝7.5Hz,1H),7.21(td,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.17(s,1H),4.49(dd,J＝11.5,2.4Hz,1H),4.44–4.37(m,1H),4.10(dd,J＝11.6,7.4Hz,1H),2.48–2.43(m,2H),2.41–2.27(m,4H),1.90–1.77(m,2H),1.54–1.45(m,4H),1.42–1.34(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆):δ157.19,153.34(d,J_CF＝246.7Hz),153.07,149.00,146.11,143.29,130.07,128.10,127.71,125.44(d,J_CF＝4.3Hz),112.48,109.60,108.55(d,J_CF＝19.9Hz),108.14,72.50,67.40,54.02,53.87,27.70,25.63,24.13。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₂₃H₂₅BrFN₄O₂ ⁺的计算值：487.1139；实测值：487.1133。

N-(3-溴-2-氟苯基)-8,9-二氢-7H-[1,4]二氧杂环庚二烯并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK091)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.71(s,1H),8.65(ddd,J＝8.3,7.3,1.5Hz,1H),7.48(s,1H),7.43(s,1H),7.39(br,1H),7.28(ddd,J＝8.1,6.5,1.5Hz,1H),7.11(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.41(t,J＝5.7Hz,1H),4.38(t,J＝5.8Hz,1H),2.32(p,J＝5.8Hz,1H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ157.06,156.08,153.93,151.62,150.19(d,J_CF＝242.7Hz),147.83,128.53(d,J_CF＝10.4Hz),127.39,125.32(d,J_CF＝4.7Hz),121.84,119.15,111.47,110.85,108.62(d,J_CF＝19.3Hz),70.86,70.51,31.03。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₇H₁₄BrFN₃O₂ ⁺的计算值：390.0248；实测值：390.0236。

N-(3-溴-2-氟苯基)-2H-[1,3]间二氧杂环戊烯并[4,5-g]喹唑啉-8-胺(JGK092)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ8.69(s,1H),8.58(ddd,J＝8.3,7.3,1.5Hz,1H),7.28(ddd,J＝8.1,6.5,1.6Hz,1H),7.25(br,1H),7.14(s,1H),7.11(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),6.17(s,2H)，一个质子的信号缺失(可能由氯仿信号遮掩)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃):δ156.10,153.37,153.22,150.22(d,J_CF＝242.3Hz),149.37,148.43,128.67(d,J_CF＝10.4Hz),127.28,125.30(d,J_CF＝4.7Hz),121.84,110.75,108.64(d,J_CF＝19.4Hz),106.29,102.48,96.49。HRMS(DART)：m/z[M+H]⁺，C₁₅H₁₀BrFN₃O₂ ⁺的计算值：361.9935；实测值：361.9925。

实施例19：JGK系列的示例性化合物的代谢研究

在37℃下将示例性化合物(10mM)在人、狗、小鼠或大鼠肝微粒体(1mg/mL)中孵育多达90分钟。通过添加乙腈来终止反应。并行地进行对照(无化合物)微粒体研究。在配备有Luna Omega极性C18，1.6m，2.1x30mm柱的Waters Xevo G2 QTof上进行LCMS研究。示例性代谢物的结构描绘于图47中，

修饰	人(％)	狗(％)	小鼠(％)	大鼠(％)
					1.母体	<u>67.0</u>	3.5	59.9	70.2
2.羟基化	6.0	0.0	0.0	4.8
					3.N-脱甲基化	13.7	0.9	5.4	8.2
4.羟基化	4.2	61.9	22.0	21.9
					5.羟基化	0.7	0.0	0.0	0.6
6.N-脱烷基化	6.5	0.0	1.3	2.7

通过引用的并入

本文提及的所有出版物和专利都据此通过引用以它们的整体并入本文，所述引用的程度就好像已特定地和单独地指出将每个单独的出版物或专利通过引用并入一样。在起冲突的情况下，将以包括本文任何定义的本申请为准。

等效物

尽管已讨论本发明的具体实施方案，但以上说明书是说明性的而非限制性的。在审阅本说明书和以下权利要求后，本发明的许多变化形式将变得为本领域技术人员显而易知。应通过参考权利要求连同它们的等效物的全部范围以及说明书连同此类变化形式来确定本发明的全部范围。

Claims (115)

1.一种式I或式I*的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

Z是芳基或杂芳基；

R^2a和R^2b各自独立地选自氢、烷基、卤基、CN和NO₂；

R³是氢、烷基或酰基；

R⁴是烷氧基；

R⁵是烷基；R⁷和R⁸各自独立地选自氢、烷基诸如烷氧基烷基、芳烷基或芳基酰基；

R¹¹是氢、烷基、卤基、CN、NO₂、OR⁷、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；并且

R¹²是氢、烷基、卤基、CN、NO₂、OR⁸、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或R¹¹和R¹²一起形成碳环或杂环。

2.如权利要求1所述的化合物，其中如果R^2a是氢，那么R^2b选自烷基、卤基、CN和NO₂。

3.如权利要求1所述的化合物，其中如果R^2b是氢，那么R^2a选自烷基、卤基、CN和NO₂。

4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IVa)或式(IVb)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R⁶的每种情况独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO₂、卤基、烯基、炔基、芳烷基氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。

5.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R¹¹是氢。

6.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R¹¹是OR⁷。

7.如权利要求6所述的化合物，其中R⁷是氢。

8.如权利要求6所述的化合物，其中R⁷是烷基。

9.如权利要求6所述的化合物，其中R⁷是烷氧基烷基。

10.如权利要求6所述的化合物，其中R⁷是芳基酰基。

11.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中R¹²是杂芳基，诸如呋喃基。

12.如权利要求11所述的化合物，其中所述杂芳基被烷基、烷氧基、OH、CN、NO₂、卤基、

取代。

13.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中R¹²是OR⁸。

14.如权利要求13所述的化合物，其中R⁸是氢。

15.如权利要求13所述的化合物，其中R⁸是烷氧基烷基。

16.如权利要求15所述的化合物，其中R⁸是被

取代的烷基。

17.如权利要求15所述的化合物，其中R⁸是酰基。

18.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R¹¹和R¹²组合以形成碳环或杂环，诸如5元、6元或7元碳环或杂环。

19.如权利要求18所述的化合物，其中所述碳环或杂环被羟基、烷基(例如甲基)或烯基(例如乙烯基)取代。

20.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式Ia、Ib、Ic或Id的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

X是O、S或NH；

Z是芳基或杂芳基；

R¹是氢或烷基；

R^2a和R^2b各自独立地选自氢、烷基、卤基、CN和NO₂；

R³是氢、烷基或酰基；

R⁴是烷氧基；

R⁵是烷基；并且

n是0-3。

21.如权利要求1-20中任一项所述的化合物，其中R^2a或R^2b选自烷基、卤基、CN和NO₂。

22.如权利要求20或21所述的化合物，其中所述化合物是式(IIa)或式(IIb)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

R⁶的每种情况独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO₂、卤基、烯基、炔基、芳烷基氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。

23.如权利要求22所述的化合物，其中R¹是被杂环基(例如含氮杂环基，诸如吗啉基、哌啶基、吡咯烷基或哌嗪基诸如N-甲基哌嗪基)取代的烷基(例如甲基或乙基)。

24.如权利要求22所述的化合物，其中R¹是被氨基(例如二甲基氨基)取代的烷基(例如甲基或乙基)。

25.如权利要求20-24中任一项所述的化合物，其中R¹由式A表示：

其中，

R^13a和R^13b各自独立地选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或R^13a和R^13b组合以形成杂环基；并且

y是0-3。

26.如权利要求22所述的化合物，其中R¹是被羟基取代的烷基(例如甲基或乙基)。

27.如权利要求20-26中任一项所述的化合物，其中R¹呈S构型。

28.如权利要求20-26中任一项所述的化合物，其中R¹呈R构型。

29.如权利要求1-28中任一项所述的化合物，其中R³是氢。

30.如权利要求1-28中任一项所述的化合物，其中R³是酰基。

31.如权利要求30所述的化合物，其中R³是烷基酰基。

32.如权利要求30所述的化合物，其中R³是烷基氧基酰基。

33.如权利要求30所述的化合物，其中R³是酰基氧基烷基。

34.如权利要求30所述的化合物，其中R³是

并且

R⁹是烷基。

35.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中Z是2-氟-3-氯苯基、2-氟苯基、2,3-二氟苯基、2,4-二氟苯基、2,5-二氟苯基、2,6-二氟苯基、2,4,6-三氟苯基、五氟苯基、2-氟-3-溴苯基、2-氟-3-乙炔基苯基和2-氟-3-(三氟甲基)苯基。

36.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中Z是3-乙炔基苯基。

37.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中Z是3-氯-4-((3-氟苯甲基)氧基)苯。

38.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中Z是3-氯-2-(三氟甲基)苯基。

39.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中Z是2-氟-3-溴苯基。

40.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中Z是2-氟-5-溴苯基。

41.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中Z是2,6-二氟-5-溴苯基。

42.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中：

Z被一个选自

的R⁶取代；并且

R⁹和R¹⁰独立地选自烷基。

43.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IIIa)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

每个R⁶独立地选自氟基、氯基或溴基。

44.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IIIb)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

每个R⁶独立地选自氟基、氯基或溴基。

45.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IIIc)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

每个R⁶独立地选自氟基、氯基或溴基。

46.如权利要求1-45中任一项所述的化合物，其中R^2a是氢。

47.如权利要求1-45中任一项所述的化合物，其中R^2a是卤基(例如氟基)。

48.如权利要求1-47中任一项所述的化合物，其中R^2b是氢。

49.如权利要求1-47中任一项所述的化合物，其中R^2b是卤基(例如氟基)。

50.如权利要求1-49中任一项所述的化合物，其中所述化合物是：

或它们的药学上可接受的盐。

51.如权利要求1-49中任一项所述的化合物，其中所述化合物是：

或它们的药学上可接受的盐。

52.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是：

或它们的药学上可接受的盐。

53.如权利要求1-49中任一项所述的化合物，其中所述化合物是：

或它们的药学上可接受的盐。

54.一种药物组合物，所述药物组合物包括前述权利要求中任一项所述的化合物以及药学上可接受的赋形剂。

55.一种抑制EGFR或其变体诸如ΔEGFR、EGFR细胞外突变体、EGFR A289、EGFRT263和/或EGFR活化性突变体例如ex19缺失的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1-54中任一项所述的化合物或组合物。

56.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要治疗癌症的受试者施用权利要求1-54中任一项所述的化合物或组合物。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、心脏癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠癌，头部、脊柱和颈部癌，卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、阴茎癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤癌、胸腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述癌症是神经胶质瘤、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。

59.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和额外剂，其中所述葡萄糖代谢抑制剂是权利要求1-53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，并且所述额外剂是细胞质p53稳定剂。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、心脏癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠癌，头部、脊柱和颈部癌，卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、阴茎癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤癌、胸腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。

61.如权利要求59所述的方法，其中所述癌症是多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、低级星形细胞瘤、混合性少突星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、CNS癌症、非CNS癌症、或CNS转移或肺癌。

62.如权利要求59所述的方法，其中所述癌症是神经胶质瘤、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。

63.如权利要求55-62中任一项所述的方法，其中所述方法降低癌细胞增殖。

64.如权利要求59-63中任一项所述的方法，其中已确定所述受试者患有易感于葡萄糖代谢抑制剂的癌症。

65.如权利要求64所述的方法，其中已通过包括以下的方法确定所述受试者易感于所述葡萄糖代谢抑制剂：

a.从所述受试者获得第一血液样品；

b.将所述受试者置于采用生酮膳食的情况下；

c.在置于采用生酮膳食的情况下一段时期之后从所述受试者获得第二血液样品；

d.测量所述第一血液样品中和所述第二血液样品中的葡萄糖水平；

e.将所述第二血液样品中的葡萄糖水平与所述第一血液样品中的葡萄糖进行比较；以及

f.如果相较于所述第一血液样品中的葡萄糖水平，所述第二血液样品中的葡萄糖水平降低，那么确定所述受试者是易感的。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平降低是约或大于0.15mM。

67.如权利要求65所述的方法，其中所述第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平降低是约或大于0.20mM。

68.如权利要求65所述的方法，其中所述第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平降低在0.15mM-2.0mM的范围内。

69.如权利要求65所述的方法，其中所述第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平降低在0.25mM-1.0mM的范围内。

70.如权利要求59-69中任一项所述的方法，其中所述细胞质p53稳定剂是MDM2抑制剂。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述MDM2抑制剂是努特林。

72.如权利要求70所述的方法，其中所述MDM2抑制剂是努特林-3或依达沙努特林。

73.如权利要求72所述的方法，其中向所述受试者施用50mg至1600mg的依达沙努特林。

74.如权利要求72或73所述的方法，其中向所述受试者施用100mg的依达沙努特林。

75.如权利要求72或73所述的方法，其中向所述受试者施用150mg的依达沙努特林。

76.如权利要求72或73所述的方法，其中向所述受试者施用300mg的依达沙努特林。

77.如权利要求72或73所述的方法，其中向所述受试者施用400mg的依达沙努特林。

78.如权利要求72或73所述的方法，其中向所述受试者施用600mg的依达沙努特林。

79.如权利要求72或73所述的方法，其中向所述受试者施用1600mg的依达沙努特林。

80.如权利要求70所述的方法，其中所述MDM2抑制剂是RO5045337、RO5503781、RO6839921、SAR405838、DS-3032、DS-3032b或AMG-232。

81.如权利要求59-70中任一项所述的方法，其中所述细胞质p53稳定剂是BCL-2抑制剂。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述BCL-2抑制剂是反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维奈托克(ABT-199)、GDC-0199、奥贝托克、太平洋紫杉醇、纳维托克(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746或APG-1252。

83.如权利要求59-70中任一项所述的方法，其中所述细胞质p53稳定剂是Bcl-xL抑制剂。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述Bcl-xL抑制剂是WEHI 539、ABT-263、ABT-199、ABT-737、萨布托克、AT101、TW-37、APG-1252或藤黄酸。

85.如权利要求59-84中任一项所述的方法，其中以同一组合物施用所述葡萄糖代谢抑制剂和所述细胞质p53稳定剂。

86.如权利要求59-84中任一项所述的方法，其中以单独组合物施用所述葡萄糖代谢抑制剂和所述细胞质p53稳定剂。

87.如权利要求55-86中任一项所述的方法，其中所述癌症是复发的或难治性的。

88.如权利要求55-87中任一项所述的方法，其中所述癌症是治疗原初性的。

89.如权利要求59-88中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用额外疗法。

90.一种包含葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂的药物组合物，其中所述葡萄糖代谢抑制剂是权利要求1-53中任一项所述的化合物。

91.如权利要求90所述的药物组合物，其中所述细胞质p53稳定剂是MDM2抑制剂。

92.如权利要求91所述的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂是努特林。

93.如权利要求91或92所述的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂是努特林-3或依达沙努特林。

94.如权利要求91所述的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂是RO5045337、RO5503781、RO6839921、SAR405838、DS-3032、DS-3032b或AMG-232。

95.如权利要求90所述的药物组合物，其中所述细胞质p53稳定剂是BCL-2抑制剂。

96.如权利要求95所述的药物组合物，其中所述BCL-2抑制剂是反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维奈托克(ABT-199)、GDC-0199、奥贝托克、太平洋紫杉醇、纳维托克(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746或APG-1252。

97.如权利要求90所述的药物组合物，其中所述细胞质p53稳定剂是Bcl-xL抑制剂。

98.如权利要求97所述的药物组合物，其中所述Bcl-xL抑制剂是WEHI 539、ABT-263、ABT-199、ABT-737、萨布托克、AT101、TW-37、APG-1252或藤黄酸。

99.一种根据以下流程1或流程2制备权利要求1-52中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的方法：

其中：

X是O、S或NH；

Z是芳基或杂芳基；

R¹是烷基；

R^2a和R^2b各自独立地选自氢、烷基、卤基、CN和NO₂；

R³是氢、烷基或酰基；

R⁴是烷氧基；

R⁵是烷基；

R²¹是被离去基团取代的烷基，例如卤代烷基或磺酰基烷基；

B是碱；

Nu是含氮杂环(例如具有至少一个N-H键)、氨基烷基或羟基烷基；

Sv¹是溶剂；并且

n是0-3。

100.如权利要求99所述的方法，其中R²¹是磺酰基烷基(例如，CH₃S(O)₂OCH₂-)。

101.如权利要求99或100所述的方法，其中B是含氮碱(例如三乙胺或二异丙基乙胺)。

102.如权利要求99-101中任一项所述的方法，其中Nu是具有至少一个N-H键的杂环(例如吗啉、N-甲基哌嗪、哌啶或吡咯烷)。

103.如权利要求99-102中任一项所述的方法，其中Nu是氨基烷基(例如二甲胺)。

104.如权利要求99-103中任一项所述的方法，其中所述溶剂是非质子性溶剂(例如二甲基甲酰胺)。

105.如权利要求99-104中任一项所述的方法，其中所述方法还包括根据以下流程3或流程4的步骤：

其中：

R²²是烷基或羟基烷基；

R^23a和R^23b各自是烷基；

R²⁴是氨基芳基或氨基杂芳基；并且

Sv²是酸。

106.如权利要求105所述的方法，其中R²²是羟基烷基。

107.如权利要求105或106所述的方法，其中R^23a和R^23b各自是甲基。

108.如权利要求105-107中任一项所述的方法，其中R²⁴是氨基芳基。

109.如权利要求105-107中任一项所述的方法，其中R²⁴是氨基杂芳基。

110.如权利要求105-109中任一项所述的方法，其中Sv²是烷基酸(例如乙酸)。

111.如权利要求105-110中任一项所述的方法，其中在115-150℃范围内的温度下进行所述步骤。

112.如权利要求111所述的方法，其中在125-130℃范围内的温度下进行所述步骤。

113.如权利要求105-112中任一项所述的方法，其中所述步骤还包括用碱诸如氢氧化铵处理。

114.如权利要求99-113中任一项所述的方法，其中所述方法还包括纯化步骤。

115.如权利要求114所述的方法，其中所述纯化步骤包括柱色谱法、制备型薄层色谱法、或高效液相色谱法。

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