CN113804803A

CN113804803A - 一种适用于甘草膏赭曲霉毒素a的快速测定方法

Info

Publication number: CN113804803A
Application number: CN202110717020.0A
Authority: CN
Inventors: 巩志国; 房芳; 苏敏; 王静静; 何璐; 齐冬琴; 姚伟琴; 李晓岩; 彭静怡
Original assignee: Urumqi Customs Technical Center
Current assignee: Urumqi Customs Technical Center
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2021-12-17

Abstract

本发明公开了一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A快速准确的检测方法。通过选择提取溶剂、优化液‑液萃取与反萃取净化、改进免疫亲和柱净化的淋洗溶液等关键控制步骤，最终获得一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速准确检测方法。当提取液用体积比60：40的浓度30g/L的NaHCO₃溶液与乙腈时甘草膏完全溶解，调pH值至2‑3时用三氯甲烷萃取，再用提取液反萃取技术净化，免疫亲和柱再净化后测定，简单快速，净化效果好，有效去除杂质干扰，回收率高且稳定。本发明提供的检测方法用于甘草膏中赭曲霉毒素A的检测，回收率9高达0％，有效解了决现有方法难以快速准确测定甘草膏中赭曲霉毒素A的问题，建立了一种低成本快速准确的甘草膏中赭曲霉毒素A含量的测定方法。

Description

一种适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法

发明领域

本发明涉及一种赭曲霉毒素A的检测方法，特别涉及一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速检测方法。

背景技术

中药材在采收,加工,运输和储藏等过程中，受其自身因素和外界环境条件的影响均可能侵染多种真菌尤其产毒真菌，可能产生具有严重毒副作用的真菌毒素，进而影响中药及其产品的质量和安全性。真菌毒素对机体不表现出急性毒性，但在体内有较强的蓄积性，损害肝肾功能，严重威胁人类的身体健康,甚至生命安全。中药材种类繁多，霉变情况各异，真菌毒素的污染和残留水平及对药材质量的影响也差异较大。

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，简称OTA)是赭色曲霉属和青霉属的几种真菌产生的有毒代谢产物，OTA的分子量为403.8，熔点169℃，为无色晶体，易溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。在紫外光下呈绿色荧光,最大吸收峰为333nm。该化合物相当稳定,一般的烹调和加工方法只有部分破坏，对人及多种动物具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性，国际癌症研究机构IARC将其确定为2B类致癌物。赭曲霉毒素是真菌毒素之一，是由纯绿青霉、赭曲霉及碳黑曲霉等产毒菌株侵染粮食、食品、饲料及其他农副产品后所产生的一种有毒代谢产物。同时赭曲霉毒素广泛存在于各种食物中，存在于谷物及其副产品、可可、咖啡、肉类、乳汁、干果、调味品、酒类、茶叶等中。目前，世界上有40多个国家和地区规定了粮食及其制品、果酒、干果及婴幼儿食品中OTA的限量。OTA与人类健康关系较为密切，是欧洲部分国家膳食中的主要污染物之一，因此受到全世界的广泛关注。

甘草为豆科植物甘草的干燥根和根茎，是一种常用的中药材。甘草在采收，加工，运输和储藏等过程中很易产生真菌毒素赭曲霉毒素A，甘草膏是甘草的浸汁浓缩产物，有微弱的特臭和持久的特殊甜味，黑褐色的固体。甘草膏的主要成分是甘草素，又称甘草精，甘草甙或甘草甜素(Glycyrrhizin)，为甘草酸 (Glycyrrhizin Acid)的钙盐、钾盐或钠盐。甘草膏中赭曲霉毒素A的残留量远远大于甘草中残留量。甘草膏作为较大宗的出口商品，主要有于医药、烟草和食品等工业，全世界每年需求1～2万吨。因此，甘草膏中赭曲霉毒素A的测定对于其质量安全和人类健康都有重要的意义。

目前，国内相关的标准和文献对于赭曲霉毒素A的检测范围主要适用于谷物、油料及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、葡萄干、胡椒粒/粉、辣椒及其制品等、生咖啡、熟咖啡中。仅有少量文献报道甘草中赭曲霉毒素A的检测。国内没有任何相关标准和文献研究甘草膏中赭曲霉毒素A的测定。目前已有的赭曲霉毒素A的检测标准和文献方法均不适用甘草膏中赭曲霉毒素A的检测。国外对于赭曲霉毒素A研究主要集中谷类，干坚果，调味品类，酒类、咖啡类、婴幼儿食品中，仅有少量文献报道对于甘草和提取物中赭曲霉毒素A的检测。现有赭曲霉毒素A的检测方法中甲醇水、乙腈水和碳酸氢钠溶液均不能有效溶解甘草膏和提取其中的赭曲霉毒素A。目前常用的净化方法有免疫亲和柱和离子交换固相萃取柱，两种方法均不能有效净化甘草膏(甘草的浸汁高浓缩黑褐色的固体)中杂质，无法准确测定甘草膏中赭曲霉毒素A含量。现有的检测方法中，仅有GB 5009.96-2016食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定方法中的使用苯基硅烷固相萃取柱和免疫亲和柱两次净化后，可以有效净化甘草膏(甘草的浸汁高浓缩黑褐色的固体)中杂质，并能准确定量，但此法需要两次的柱净化过程，固相柱的成本较高，净化操作步骤多且耗时，测定的重复性不好，净化效果不好时，回收率也差，难以快速有效的准确测定甘草膏中赭曲霉毒素A的含量。因此，建立一种快速有效的适用于甘草膏中赭曲霉毒素A含量的检测方法具有重要的意义。

发明内容

针对目前尚未发现关于甘草膏中赭曲霉毒素A有效测定方法的报道，现有关赭曲霉素A检测的方法不能有效溶解甘草膏和提取赭曲霉毒素A，且前处理净化杂质的步骤多，处理成本高且操作繁琐，净化效果差，导致无法准确定量的技术现状，本发明旨在于提供一种快速有效的适用于甘草膏赭曲霉毒素A的检测方法。本发明通过筛选溶解甘草膏溶剂、优化液-液萃取与反萃取净化方法、优化了免疫亲和柱净化的淋洗溶液等关键步骤，最终获得一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速准确检测方法。当提取液选用浓度为30g/L的NaHCO₃水溶液与乙腈按照体积比60：40，甘草膏能完全溶解，离心后上清液调pH值为 2-3时，采用三氯甲烷萃取两次，浓缩后再用提取液反萃取技术初净化和免疫亲和柱再净化后测定，简单快速，净化效果好，能有效去除杂质干扰，回收率高且稳定，方法用于甘草膏中赭曲霉毒素A的检测，检出率高达60％。本发明提供的适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的检测方法，有效解决了现有方法难以准确测定甘草膏中赭曲霉毒素A的问题，建立了一种低成本准确快速有效的甘草膏中赭曲霉毒素A含量的测定方法，为甘草膏中赭曲霉毒素A含量的测定提供了有效的检测技术。

本发明提供了一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法，具体包括如下步骤：

(1)称取样品1.0g，加入20mL的NaHCO₃水溶液和乙腈混合溶液，60℃下超声30min，第一次离心后取上清液，加入盐酸调节pH值至2-3时，加入三氯甲烷，涡旋混匀萃取，第二次离心分离后取三氯甲烷，重复萃取一次，合并两次三氯甲烷约30mL，旋蒸至1-2mL溶液，加入20mL的NaHCO₃水溶液和乙腈混合溶液，混合后第三次离心分离，取4mL上清液待净化。

(2)将步骤(1)上清液加入PBST溶液稀释，涡旋混匀后过免疫亲和柱净化，依次用5mLPBST和5mL水淋洗免疫亲和柱后挤干；用2.5mL的浓度为2％的乙酸甲醇洗脱并收集试管中。

(3)将步骤(2)中收集试管中的流出液于40℃下氮气吹干，用0.5mL混合溶剂溶解，涡旋后过PTFE膜。

(4)配制标准工作溶液制作标准曲线，以外标法定量。

(5)过膜后的溶液上液相色谱荧光检测法检测。

本发明提供的适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法中，所述步骤 (1)中NaHCO₃溶液和乙腈的体积比为60：40，NaHCO₃水溶液的浓度为30g/L，盐酸的浓度为5mol/L，pH值2-3时，三氯甲烷萃取两次，萃取液旋蒸至1-2mL 溶液，用NaHCO₃溶液和乙腈混合溶液来反萃取。

本发明提供的适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法中，所述步骤(2) 中PBST溶液为氯化钠8.0g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钾0.2g，用水溶解，调节PH至7.0，加入1mL吐温-20，加水定容至1L。用5mLPBST 和5mL水淋洗免疫亲和柱后挤干；用2.5mL的浓度为2％的乙酸甲醇洗脱并收集。

本发明提供的适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法中，所述步骤(5) 采用液相色谱法检测的条件为：ZORBAX SB-C18柱(4.6*150mm)色谱柱；流动相：A:浓度为2％的乙酸水溶液，B:浓度为2％的乙酸乙腈溶液。

同时，本发明提供适用于甘草膏中赭曲霉毒素A快速准确测定方法的应用。

采用上述技术方案后，本发明获得有益效果如下：

(1)本发明提供的一种适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法，当乙腈和碳酸氢钠水溶液混合体积比40：60时，混合溶液易于溶解甘草膏，且能有效提取OTA，杂质干扰少，准确定量测定回收率大于90％；精密度小于5％；重现性小于6％。

(2)本发明提供的一种适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法与现有方法相比，提取液能更完全更容易溶解甘草膏，调节pH值后采用三氯甲烷萃取两次，提取液反萃取初净化，免疫亲和柱再净化，淋洗和洗脱简单，净化效果好，能有效去除杂质干扰，回收率高且稳定，本方法用于甘草膏中赭曲霉毒素A 的检测，回收率高达90％以上，解决了现有方法无法适用于甘草膏中赭曲霉毒素A提取及提取率低、杂质干扰多、回收率差和稳定性差的问题。

(3)本发明提供的一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速准确测定，方法操作简单，净化处理时间短且成本低，建立了一种低成本快速准确有效的甘草膏中赭曲霉毒素A含量的测定方法，为甘草膏中赭曲霉毒素A含量的测定提供了有效的检测技术。

附图说明

图1为不同提取液对甘草膏溶解情况和液-液萃取反萃取后溶液情况的对比图。图1A为不同提取液溶解甘草膏的效果对比图，左起1和2位为体积比为 60:40和50:50的30g/L的NaHCO₃和甲醇混合溶液溶解甘草膏的效果图，左起 3位为体积比为60:40的30g/L的NaHCO₃和乙腈混合溶液溶解甘草膏的效果图，左起4位为三氯甲烷溶解甘草膏的图；图1B为不同提取液溶解甘草膏后，用液 -液萃取反萃取净化后溶液颜色的对比图。

图2为不同测定方法测定甘草膏中OTA的谱图，其中图2A和2D为用免疫亲和柱净化来测定甘草膏样品中OTA的谱图；图2B为苯基硅烷固相萃取柱和免疫亲和柱两次净化来测定甘草膏样品中OTA的谱图；图2C仅用离子交换固相萃取柱净化来测定甘草膏样品中OTA的谱图；图2E为本发明提供测定方法测定甘草膏样品中OTA的谱图。

具体实施方式

下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下属实施例。

本发明采用的选用的NaHCO₃、乙腈和三氯甲烷等原料均可通过公共渠道易于购买，方法中所采用的的设备和仪器均为本领域常见的设备。本发明中选用的所有材料、试剂和仪器的测定方法都为本领域熟知的但不限制本发明的实施例，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可以适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1：适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法

一种适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法，具体包括如下步骤：

(1)称取甘草膏样品1.0g，加入20mL提取液，涡旋后于60℃下超声30min，期间取出涡旋3次，超声完成后冷却至室温，于转速为8000转/min下，离心5min，取10mL上清液于离心管，加入浓度为5mol/L盐酸调节pH值至2-3后涡旋 0.5min，加入15mL三氯甲烷，震荡3min，离心后取三氯甲烷层于鸡心瓶中，重复萃取一次，合并萃取液于50℃下旋转蒸发至1-2mL，加入20mL提取液涡旋1min后将鸡心瓶中全部溶液转移至干净的离心管中，震荡5min，于8000转 /min离心5min后取上清液4mL于干净离心管中备用，其中提取液是由浓度为 30g/L的NaHCO₃溶液和乙腈按照体积比60:40组成。

(2)在步骤(1)所得上清液中加入46mL PBST溶液，涡旋混匀后过免疫亲和柱净化：取免疫亲和柱，待保护液完全流出，流速为每秒1-2滴；取上述涡旋混匀后溶液50mL全部上样，流速为每秒1-2滴；依次用5mLPBST和5mL 水淋洗免疫亲和柱后挤干；用2.5mL的浓度为2％的乙酸甲醇洗脱并收集试管中。

其中，PBST溶液为氯化钠8.0g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钾0.2g，用水溶解，调节PH至7.0，加入1mL吐温-20，加水定容至1L。

(3)将步骤(2)中收集试管中的流出液于40℃下氮气吹干，用0.5mL混合溶剂溶解，涡旋后过PTFE膜，上液相色谱荧光检测器待测。

(4)液相色谱测定条件为流动相：A:浓度为2％的乙酸水溶液，B:浓度为 2％的乙酸乙腈溶液。

实施例2：适用于甘草膏赭曲霉毒素A快速测定方法的应用

本实施例在实施例1的基础上，对本发明提供的适用于甘草膏赭曲霉毒素A 的测定方法的实际应用效果，对现有技术中免疫亲和柱净化(对照1)、离子交换固相萃取柱净化(对照2)、苯基硅烷固相萃取柱和免疫亲和柱两次净化来测定甘草膏样品中赭曲霉毒素A(对照3)、以及文献(“液-液萃取结合免疫亲和柱层析净化-高效液相色谱测定烘焙咖啡中赭曲霉毒素A”，樊祥等，理化检验-化学分册，2008,44(8)：736-739)报道的一类技术方案测定甘草膏中赭曲霉素A(对照4)的测定结果进行对比，同时对本发明提供的测定方法进行测定，每组试验测定3次，取平均值，其余条件相同，具体测试结果参见表1-3以及图 1-2所示。

表1：不同测定方法测定甘草膏中赭曲霉素A的回收率及精密度对比

表2：不同提取净化处理过程成本及效果评价

由图1A结果显示可知，不同组成提取液溶解甘草膏效果不同，其中三氯甲烷不能够完全溶解甘草膏样品，而浓度为30g/L的NaHCO₃和乙腈以及浓度为 30g/L的NaHCO₃和甲醇提取液可以有效溶解。进一步对比溶解后的溶-液萃取和反萃取后溶液的效果如图1B所示，由图1B可见，采用NaHCO₃和乙腈混合溶液溶解甘草膏液液反萃取后溶液颜色浅，杂质少干扰少，而NaHCO₃和甲醇混合溶液溶解甘草膏液液反萃取后溶液颜色深，杂质多，表明采用本发明提供的提取液进行甘草膏的溶解，溶解效果均比现有测定方法提供的溶剂效果好，溶解后的颜色浅，且杂质少，这为后续净化及测定提供基础；表1通过统计本方法测定不同甘草膏中赭曲霉素A的回收率和精密度结果可知，本发明提供的测定方法对甘草膏中赭曲霉素A的回收率高达90-96％，相较于对照测定方法，本发明提供的测定方法，甘草膏中赭曲霉毒素A的提取率显著提高，回收率高且稳定，相对标准偏差小于5％，重现性小于6％。图2为不同方法测定甘草膏中赭曲霉素A的色谱图，由图2结果可知，本发明提供的测定方法，净化效果好杂质少，基线平稳，噪音低，说明本发明萃取和净化后杂质少，有效去除了检测甘草膏中赭曲霉毒素A测定的大部分干扰杂质；进一步对本发明提供的测定方法进行了成本估算和时间统计，由表2统计结果可知，本发明提供的测定方法相对于苯基硅烷固相萃取柱和免疫亲和柱两次净化测定方法成本和时间显著降低，且淋洗和洗脱简单，解决了该测定方法在甘草膏中赭曲霉素A测定中存在的无法准确定量和步骤复杂费时成本高的问题。

同时降本发明实施例2提供的测定方法应用于不同批号不同批次的甘草浸膏、甘草浸膏粉及甘草霜中赭曲霉素A的测定，测定结果统计参见表3，由表3 数据可知，本发明提供的测定方法亦可以应用于甘草浸膏、甘草浸膏粉及甘草霜中赭曲霉素A的测定，甘草膏中赭曲霉毒素A的含量检出率高达60％以上。

表3：甘草膏样品测定中检出赭曲霉毒素A含量的统计表

综上所述，本发明提供的适用于甘草膏中赭曲霉毒素A测定方法，有效解决了现有方法在测定甘草膏中赭曲霉毒素A中存在的操作过程复杂时间长、杂质多无法准确定量以及成本高的问题，建立了一种低成本快速准确的测定甘草膏中赭曲霉毒素A含量的方法，其中，甘草膏中赭曲霉毒素A的检出率高达60％，远大于对照方法测定甘草膏样品中赭曲霉毒素A的检出率，为甘草膏中赭曲霉毒素A含量的测定提供了有力且有效的检测技术。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims

1.一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法，其特征在于，该测定方法具体包括如下步骤：

(1)称取样品1.0g，加入20mL的NaHCO₃水溶液和乙腈混合溶液，60℃下超声30min，第一次离心后取上清液，加入盐酸调节pH值至2-3时，加入三氯甲烷后涡旋混匀萃取；第二次离心分离后取三氯甲烷层，重复萃取一次，合并三氯甲烷约30mL，旋转蒸发至1-2mL溶液，加入20mL的NaHCO₃溶液和乙腈混合的提取液，混合后第三次离心分离，取4mL上清液待净化；

(2)将步骤(1)上清液加入PBST溶液稀释，涡旋混匀后过免疫亲和柱净化，依次用5mLPBST和5mL水淋洗免疫亲和柱后挤干，用2.5mL的浓度为2％的乙酸甲醇洗脱并收集试管中；

(3)将步骤(2)中收集试管中的流出液于40℃下氮气吹干，用0.5mL混合溶剂溶解，涡旋后过PTFE滤膜；

(4)配制标准工作溶液制作标准曲线，以外标法定量；

(5)过膜后溶液上液相色谱荧光检测器法检测。

2.如权利要求1所述的一种适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中NaHCO₃水溶液和乙腈的体积比为60：40，NaHCO₃水溶液的浓度为30g/L，盐酸的浓度为5mol/L；用盐酸调节pH值至2-3时加入三氯甲烷后涡旋混匀萃取两次合并，旋转蒸发至1-2mL溶液，用20mL的NaHCO₃溶液和乙腈混合的提取液来反萃取。

3.如权利要求1所述的一种适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中PBST溶液为氯化钠8.0g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钾0.2g，用水溶解，调节PH至7.0，加入吐温-201mL，加水定容至1L；用5mLPBST和5mL水淋洗免疫亲和柱，用2.5mL的浓度为2％的乙酸甲醇洗脱并收集试管中。

4.如权利要求1所述的一种适用于甘草膏赭曲霉毒素A的快速测定方法，其特征在于，所述步骤(5)采用液相色谱法检测的条件为：ZORBAX SB-C18柱(4.6*150mm)色谱柱；流动相：A:浓度为2％的乙酸水溶液，C:浓度为2％的乙酸乙腈溶液。

5.如权利要求1所述的适用于甘草膏中赭曲霉毒素A的快速测定方法的应用。