CN113797127A - 一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物及其制备方法，其特征在于：包含4.12~4.75%的茯茶素A、3.23~3.67%的硫酸半乳聚糖、2.18~2.54%的异嗪皮啶和1.98~2.32%的熊果酸，所述百分比均为质量百分比。本发明具有抗黑眼圈效果优异的优点。

Description

一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物及其制备方法。

背景技术

随着近年来人们生活节奏加快、娱乐活动日渐丰富，黑眼圈作为一种眼部皮肤问题的发生率显著增加，大大影响了消费者的容貌以及日常生活。黑眼圈的治疗方法可分为两种：一种是以激光治疗为代表的物理疗法，存在着恢复期长、易反复等弊端；一种是以高浓度氢醌为代表的化学疗法，也存在治疗过程痛苦、可能对皮肤造成二次伤害等缺点。因此，如何安全、有效、无刺激地缓解乃至消除黑眼圈症状，成为人们日益关注的问题。

双向发酵技术是指采用具有一定活性成分的植物材料作为活性基质来代替传统营养基质，通过加入特定的真菌共同构成发酵组合物进行微生物转化。其双向性体现在植物基质材料为真菌提供所需营养的同时受到真菌影响，发酵改变自身组成，获得更好的功效活性。双向发酵可以更好地破坏植物细胞壁以提升功效性成分得率，亦可将基质中有毒成分转化为毒性较低或无毒物质，此外可以提升基质功效活性。

在使用双向发酵制备化妆品活性物时，现在的研究方法通常只关注双向发酵对基质原料活性的影响以及产物得率的提高，并未考虑真菌与基质原料之间存在的千丝万缕、密不可分的相互作用。因此，选择匹配性好的基质原料和真菌，可以协同增效，进一步提升发酵物整体，包括植物发酵物和真菌溶胞物的功效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物及其制备方法，所述植物发酵物具有较好的抗黑眼圈功效，可作为化妆品功能性添加剂添加到抗黑眼圈类护肤品中。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物，其特征在于：包含4.12~4.75%的茯茶素A、3.23~3.67%的硫酸半乳聚糖、2.18~2.54%的异嗪皮啶和1.98~2.32%的熊果酸，所述百分比均为质量百分比。

本发明还提供一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、选取干燥的四川藏茶、幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲，洗净后置于40℃的真空干燥箱中干燥8~12h，然后分别用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，按质量比5:1~3:1~2:1称取四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，混合后作为植物基质；

B、按质量比5:10:1:1:20:0.033:0.1:1000称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素和去离子水，混合后于121℃灭菌30~45min，得孟加拉红琼脂培养基；按质量比1:1.5:10:10:30:1000称取无水硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母膏、玉米粉、葡萄糖和去离子水，混合后于121℃灭菌30~45min，得到种子培养基；

C、将冠突散囊菌接种于步骤B所得孟加拉红琼脂培养基中，接种量为孟加拉红琼脂培养基体积的10~30%，在25~30℃下恒温培养5~7d，得初培物；将所述初培物接种至步骤B所得种子培养基中，接种量为种子培养基体积的5%，置于恒温空气浴振荡器中，在200~400RPM、25~30℃条件下培养5~7d，测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到0.7，停止发酵，得冠突散囊菌发酵培养液；

D、按质量比20:1称取步骤C所得冠突散囊菌发酵培养液和步骤A所得植物基质，混合于恒温空气浴振荡器中，在200~400RPM、25~30℃、pH为5.5~6.5的条件下培养5~10d，得植物发酵液；

E、按质量比1:1:2称取步骤D所得植物发酵液、1,3-丙二醇、1,2-己二醇，混合后泵入微射流提取器，控制流量为50~120mL/min，温度为25~50℃，压力为80~120Mpa，待所有植物发酵液通过微射流提取器，将所得流出液经过孔径为1微米的不锈钢过滤器过滤，得滤出液；将所述滤出液泵入微射流提取器并进行提取，循环泵入提取3次，得发酵提取液；

F、将步骤E所得发酵提取液通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，旋转蒸发至发酵提取液的质量降低到步骤D称取的植物基质质量的3倍，得黄色溶液，对所述黄色溶液进行巴氏杀菌，即得具有抗黑眼圈功效的植物发酵物。

所述四川藏茶购自四川雅安，为当地生产的山茶科山茶属小叶种茶树的干燥叶片。

所述幌伞枫叶购自广东云浮，为五加科幌伞枫属植物幌伞枫的干燥叶片。

所述三角褐指藻购自广西北海，为褐指藻科褐指藻属植物三角褐指藻的干燥全株。

所述旱金莲购自江西赣州，为旱金莲科旱金莲属植物旱金莲的干燥全株。

所述马铃薯浸出粉，购自北京鸿润宝顺科技有限公司，干燥失重<7.0%，灼烧残渣<6.0%，质量浓度10%水溶液pH为5~7。

所述葡萄糖，CAS：50-99-7，购自西陇科学股份有限公司，分析纯。

所述琼脂，CAS：9002-18-0，购自广州凯闻生物科技有限公司。

所述无水硫酸镁，CAS：7487-88-9，购自西陇科学股份有限公司，分析纯。

所述磷酸二氢钾，CAS：7778-77-0，购自西陇科学股份有限公司，分析纯。

所述酵母膏，购自安琪酵母股份有限公司，固性物≥70%，总氮≥7.2%。

所述玉米粉，平均粒径小于0.1mm，玉米品种不限，购自河北康冉创鑫生物科技股份有限公司。

所述1,3-丙二醇，CAS：504-63-2，购自杜邦中国集团有限公司。

所述1,2-己二醇，CAS：629-11-8，购自德之馨上海有限公司。

所述冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是发菌科散囊属(Eurotium)的真菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC：41041。

所述真空干燥箱为DZF-1型立式真空干燥箱，生产商为北京林茂科技公司。

所述空气浴恒温振荡器为ZD-85型气浴恒温振荡器，生产商为常州隆和仪器制造有限公司。

所述微射流提取器为MFIC型微射流均质提取机，生产商为美国Microfluidics公司。

所述旋转蒸发仪为RE-52A型旋转蒸发仪，生产商为巩义市英峪予华仪器厂。

采用HPLC方法测定（测定方法详见实验一），本发明方法制备的具有抗黑眼圈功效的植物发酵物中，茯茶素A的质量含量为4.12~4.75%、硫酸半乳聚糖的质量含量为3.23~3.67%、异嗪皮啶的质量含量为2.18~2.54%、熊果酸的质量含量为1.98%~2.32%。

本发明制备的具有抗黑眼圈功效的植物，在-10℃、50℃环境下保存三个月基本不变色、气味基本无变化，稳定性良好。

本发明采用双向发酵的方法，通过真菌产生的各种生物酶，更好地破坏植物的细胞壁，更好地得到植物中含有的活性成分的同时，也可以得到植物中不含有的次级活性物，高效得到了化妆品需要的抗黑眼圈功效活性物。

本发明制备的植物发酵物中五种主要活性物的组合，在以下三个方面起作用，共同促成本发明优异的抗黑眼圈功效：1）美白——清除自由基、抑制酪氨酸酶的活性、温和促进角质剥脱、降低皮肤炎症因子含量等路径，抑制黑色素的生成、清除已经存在于皮肤中的黑色素，达到对抗色素型黑眼圈的功效；2）促进血液循环——调节凝血活性、降低凝血因子含量，维持眼部血液循环功能的稳定，达到对抗血管型黑眼圈的功效；3）抗氧化——清除自由基，促进胶原蛋白生长，提拉眼部皮肤，减少眼部皮肤松弛，增加皮肤厚度，达到对抗结构型黑眼圈的功效。本发明从以上三个方面解决黑眼圈问题，相对于现有技术仅从一方面对抗黑眼圈，具有更为显著更具普适性的抗黑眼圈效果。

本发明所制备的具有抗黑眼圈功效的植物发酵物，可用作化妆品功能性添加剂，添加到抗黑眼圈护肤品中，也可以直接涂抹使用，具有显著的抗黑眼圈功效。

为证实本发明具有上述特点，本发明进行了以下实验。

实验一、本发明所制备的具有抗黑眼圈功效的植物发酵物中活性成分含量的测定

用高效液相色谱（HPLC）法测定植物发酵物中茯茶素A、异嗪皮啶和熊果酸的含量；用高效凝胶渗透色谱法测定硫酸半乳聚糖的纯度及分子量，气相色谱法测定硫酸半乳聚糖的单糖组成，离子色谱法测定硫酸半乳聚糖的硫酸根含量。

具体测定方法如下：

1.茯茶素A含量的测定

HPLC色谱条件为：色谱柱为Diamonsil ODS C18柱（250mm×4.6mm，5μm），采用乙醇-水（20∶80）等度洗脱，柱温为30℃，流速为0.3mL/min，检测波长为283nm，进样量为2μL。

精密称定茯茶素A对照品15.0mg，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，设定15000r/min离心10min，取上清液，即得对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、2、4、8、10mL于10mL量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别取样10μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。经线性回归，茯茶素A回归方程为：Y=102.35X-23.41，r=0.9996。标准曲线回归方程均未通过原点，因此测定时采用外标法计算各实施例所得植物发酵物中茯茶素A的质量分数。

2.异嗪皮啶含量的测定

HPLC色谱条件为：Venusil XBP-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，USA)，流动相为乙腈：0.1%磷酸(20:80)，流速0.8mL/min，检测波长343nm，进样量10μL。

精密称取异嗪皮啶对照品10.0mg，置100mL量瓶中，加甲醇使溶解至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、2、4、8、10mL于10mL量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别取样10μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。经线性回归，异嗪皮啶回归方程为：Y=36.14X+3.57，r=0.9994。测定时采用外标法计算各实施例所得植物发酵物中异嗪皮啶的质量分数。

3.熊果酸含量的测定

HPLC色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Cl8色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：甲醇-0.2%醋酸溶液(85∶15)，流速：0.8ml/min，检测波长：210nm；进样量10μL。

精密称取山楂酸对照品49.63mg，用甲醇溶解，定容于25ml量瓶中，制得对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、2、4、8、10mL于10mL量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别取样10μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。经线性回归，熊果酸线性方程为：Y=87.62X+22.18，r=0.9997。测定时采用外标法计算各实施例所得植物发酵物中熊果酸的质量分数。

4.硫酸半乳聚糖的相关测定

1）硫酸根含量的测定

准确称取0.74g的Na₂SO₄，用去离子水溶解，使得硫酸根的最终浓度为1mg/mL，放置于4℃冰箱内，恒温后吸取该液体1.0mL，去离子水50mL溶解，使最后浓度为20μg/mL标准液，放置于4℃冰箱内保存。

测定方法：分别准确量取上述标准液0.125、0.5、1.5、2、3、4mL，加去离子水稀释至0.5、2、6、8、12、16μg/mL标准液。

样品准备：预备10mL的植物发酵物，0.45μm微滤膜将该植物发酵物过滤，备用。

色谱条件：SH-AC-1阴离子互换柱(苯乙烯和二乙烯基苯共聚物，4.6mm×250mm，13μm)：3.6mmol/L Na₂CO₃和4.5mmol/L NaHCO₃混合液。流速设定：1.5mL/min；电导检测器检测；抑制器电流75mA；柱温：35℃；柱压：5.5MPa；背景电导：65μS/cm；进样量：100μL；采集时间：12min。

经测定，实施例1~5的硫酸根含量范围为13.12%~15.35%。

2）单糖组成的测定

取5mg植物发酵物样品，依次加入100μL去离子水，50μL 80mg/mL的α-甲基萘-硼烷和100μL 6mol/L三氟乙酸到2mL特氟隆反应管中，80℃反应30min，冷却，加入50μL α-甲基萘-硼烷溶液，旋蒸蒸干。再次加入100μL去离子水，100μL 4 mol/L三氟乙酸，120℃反应1h，冷却，加入100μL α-甲基萘-硼烷溶液，旋蒸蒸干，加入500μL乙腈，N₂吹干后，40℃减压干燥24h。分别精确称取此干燥的水解产物2mg加入500μL乙酸乙酯，1.5mL的乙酸酐，50μL的高氯酸，超声反应10min，放置15min后，加入5mL去离子水，用2mL二氯甲烷萃取，用去离子水5mL×3洗二氯甲烷层。收集二氯甲烷层直接进行气相色谱分析。柱温210℃；进样口温度250℃；氢火焰离子化检测器(FID)；检测器温度：250℃；载气：N₂。根据出峰时间及峰面积比确定和计算样品的单糖组成及其摩尔比。

经计算，实施例1~5的单糖组成为葡萄糖、甘露糖、半乳糖，摩尔比分别为1.1：0.2：4.3、0.9：0.1：4.8、1.4：0.2：4.4、1.1：0.3：3.8、0.8：0.1：5.2。

3）硫酸半乳聚糖含量的测定和分子量的计算

将5g植物发酵物加入到100 mL磷酸缓冲盐溶液(20mmol/L NaH₂PO₄+Na₂HPO₄，pH=7.2)中，溶解后经DEAE-SepharoseFastFlow凝胶色谱柱层析，分别以磷酸缓冲盐溶液及0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0mol/L的氯化钠磷酸缓冲盐溶液洗脱，苯酚-硫酸法检测收集。其中1.5mol/L NaCl洗脱组分再经SepharoseCL-6B纯化，纯水洗脱，得到精制硫酸半乳聚糖。

采用高效凝胶色谱法，使用PL aquagel-OH mixed色谱柱测定多糖分子量；流动相：0.2mol/L Na₂SO₄水溶液；柱温35℃；流速0.5 mL/min；示差检测器。经测定，实施例1~5的硫酸半乳聚糖分子量分别为：188KDa、163KDa、192KDa、175KDa、201KDa。

通过Agilent 1100 HPLC，检测器为示差检测器，色谱柱为ShodexKS-805和KS-804串联，用纯水洗脱，检测纯度，进而计算出植物发酵物中硫酸半乳聚糖的含量。

各实施例所得植物发酵物中茯茶素A、硫酸半乳聚糖、异嗪皮啶和熊果酸的质量含量具体含量见表1。

表1 ：各实施例所得植物发酵物中茯茶素A、硫酸半乳聚糖、异嗪皮啶和熊果酸的含量

由表1可见，本发明的制备方法可利用双向发酵技术，通过冠突散囊菌与四川藏茶、幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲相互作用，同时制备茯茶素A、硫酸半乳聚糖、异嗪皮啶和熊果酸等活性物，且所得植物发酵物中活性成分的含量高。

实验二、本发明所采用的菌种和植物培养基与其他菌种和植物培养基的比较实验

设立对照组1~6，对照组1的植物培养基由四川藏茶、幌伞枫叶和三角褐指藻组成，对照组2的植物培养基由四川藏茶、幌伞枫叶和旱金莲组成，对照组3的植物培养基由四川藏茶、三角褐指藻和旱金莲，对照组4的植物培养基由幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲组成，对照组5以红曲霉作为发酵菌种，对照组6以青霉作为发酵菌种，其他制备步骤和条件与实施例1相同。各对照组所得植物发酵物中活性成分茯茶素A、硫酸半乳聚糖、异嗪皮啶和熊果酸的含量见表2。

表2 ：实施例1和对照组1~6所得植物发酵物中茯茶素A、硫酸半乳聚糖、异嗪皮啶和熊果酸的含量

由表2可见，对照组1~6所得植物发酵物中活性成分含量较低，远低于实施例1中总活性成分含量，且茯茶素A、异嗪皮啶、熊果酸等活性成分在无特定质量含量比的四种植物作为培养基与冠突散囊菌的进行双向发酵条件下，均难以得到。

实验三、本发明所制备的植物发酵物的抗黑眼圈功效测定实验

皮肤黑色素含量（MI值）：MI值表征黑色素指数，数值范围为0~999，测量数值越高说明皮肤中黑色素含量越高。Mexameter MX18皮肤黑色素和血红素测试探头的测定原理是基于光谱吸收的原理（RGB），通过测定特定波长的光照在人体皮肤上的反射量来确定皮肤中黑色素的含量。

选取受试者30人，年龄25~49岁，均为室内工作者。受试者排除条件符合GB171492－1997《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》，受试者无严重系统性疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病；无活动性过敏性疾病；对护肤类化妆品无过敏史；1个月内未曾全身使用激素类药物及免疫抑制剂；非妊娠或哺乳期；无伦理学禁忌。

控制测试环境温度20±2℃，相对湿度52%~58%，测试者面部进行清洁后，在此环境下静坐30min后进行测试，用皮肤黑色素和血红素测试探头检测受试者使用植物发酵物样品前眼周区域的MI值。根据受试者使用样品前测试的MI值情况，将受试者分为对照组和实验组，保证对照组和实验组受试者的初始值无明显差异。

受试者在每天洁面后，实验组1~11将实施例1~5（实验组1-5）和上述实验二中的对照组1~6（实验组6-11）制备的植物发酵物以1.25μL/cm²密度均匀涂敷于眼周测试部位，每天早晚各1次，而对照组洁面后不使用任何产品。在使用植物发酵物后的1、2和4周，在温度20±2℃，相对湿度52%-58%的条件下静坐30min，待血流稳定后检测对照组和实验组受试者的MI值，每人每次连续测量3次，取平均值。

皮肤MI值的测试结果见表3（

±s为对照组和实验组所有受试者MI值的平均数± 标准差）。由表3可知，在测试的4周内，受试者使用实施例1制备的植物发酵物后，MI值呈降 低趋势，且在第1、2和4周时，均低于对照组和其他实验组。统计学结果显示，第2和4周时，实 验组1相对于未涂抹样品前，MI值存在显著性差异（P＜0.05），实验组1相对于其他实验组和 对照组，MI值存在显著性差异（P＜0.05），说明该植物发酵物可以降低眼周皮肤中的黑色素 含量，具有显著的抗黑眼圈的效果。

表3 皮肤MI值的变化情况（

±s）

综上所述，本发明通过冠突散囊菌产生的各种生物酶，更好地破坏四种植物的细胞壁，相互协同、相互作用，制备的具有抗黑眼圈功效的植物发酵物，含有茯茶素A、硫酸半乳聚糖、异嗪皮啶和熊果酸活性成分，具有抗黑眼圈效果优异的优点。

具体实施方式：

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、选取干燥的四川藏茶、幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲，洗净后置于40℃的真空干燥箱中干燥8h，然后分别用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，按质量比5:1: 2:1称取四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，混合后作为植物基质；

B、按质量比5:10:1:1:20:0.033:0.1:1000称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素和去离子水，混合后于121℃灭菌30min，得孟加拉红琼脂培养基；按质量比1:1.5:10:10:30:1000称取无水硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母膏、玉米粉、葡萄糖和去离子水，混合后于121℃灭菌45min，得到种子培养基；

C、将冠突散囊菌接种于步骤B所得孟加拉红琼脂培养基中，接种量为孟加拉红琼脂培养基体积的15%，在25℃下恒温培养5d，得初培物；将所述初培物接种至步骤B所得种子培养基中，接种量为种子培养基体积的5%，置于恒温空气浴振荡器中，在400RPM、25℃条件下培养7d，测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到0.7，停止发酵，得冠突散囊菌发酵培养液；

D、按质量比20:1称取步骤C所得冠突散囊菌发酵培养液和步骤A所得植物基质，混合于恒温空气浴振荡器中，在400RPM、25℃、pH为5.7的条件下培养10d，得植物发酵液；

E、按质量比1:1:2称取步骤D所得植物发酵液、1,3-丙二醇、1,2-己二醇，混合后泵入微射流提取器，控制流量为80mL/min，温度为50℃，压力为80Mpa，待所有植物发酵液通过微射流提取器，将所得流出液经过孔径为1微米的不锈钢过滤器过滤，得滤出液；将所述滤出液泵入微射流提取器并进行提取，循环泵入提取3次，得发酵提取液；

F、将步骤E所得发酵提取液通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，旋转蒸发至发酵提取液的质量降低到步骤D称取的植物基质质量的3倍，得黄色溶液，对所述黄色溶液进行巴氏杀菌，即得具有抗黑眼圈功效的植物发酵物。

实施例2：一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、选取干燥的四川藏茶、幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲，洗净后置于40℃的真空干燥箱中干燥12h，然后分别用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，按质量比5:3:2:1称取四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，混合后作为植物基质；

B、按质量比5:10:1:1:20:0.033:0.1:1000称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素和去离子水，混合后于121℃灭菌45min，得孟加拉红琼脂培养基；按质量比1:1.5:10:10:30:1000称取无水硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母膏、玉米粉、葡萄糖和去离子水，混合后于121℃灭菌45min，得到种子培养基；

C、将冠突散囊菌接种于步骤B所得孟加拉红琼脂培养基中，接种量为孟加拉红琼脂培养基体积的20%，在30℃下恒温培养7d，得初培物；将所述初培物接种至步骤B所得种子培养基中，接种量为种子培养基体积的5%，置于恒温空气浴振荡器中，在400RPM、30℃条件下培养7d，测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到0.7，停止发酵，得冠突散囊菌发酵培养液；

D、按质量比20:1称取步骤C所得冠突散囊菌发酵培养液和步骤A所得植物基质，混合于恒温空气浴振荡器中，在400RPM、30℃、pH为6.5的条件下培养10d，得植物发酵液；

E、按质量比1:1:2称取步骤D所得植物发酵液、1,3-丙二醇、1,2-己二醇，混合后泵入微射流提取器，控制流量为120mL/min，温度为30℃，压力为120Mpa，待所有植物发酵液通过微射流提取器，将所得流出液经过孔径为1微米的不锈钢过滤器过滤，得滤出液；将所述滤出液泵入微射流提取器并进行提取，循环泵入提取3次，得发酵提取液；

F、将步骤E所得发酵提取液通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，旋转蒸发至发酵提取液的质量降低到步骤D称取的植物基质质量的3倍，得黄色溶液，对所述黄色溶液进行巴氏杀菌，即得具有抗黑眼圈功效的植物发酵物。

实施例3：一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、选取干燥的四川藏茶、幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲，洗净后置于40℃的真空干燥箱中干燥10h，然后分别用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，按质量比5:2:1:1称取四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，混合后作为植物基质；

B、按质量比5:10:1:1:20:0.033:0.1:1000称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素和去离子水，混合后于121℃灭菌35min，得孟加拉红琼脂培养基；按质量比1:1.5:10:10:30:1000称取无水硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母膏、玉米粉、葡萄糖和去离子水，混合后于121℃灭菌30min，得到种子培养基；

C、将冠突散囊菌接种于步骤B所得孟加拉红琼脂培养基中，接种量为孟加拉红琼脂培养基体积的10%，在30℃下恒温培养5d，得初培物；将所述初培物接种至步骤B所得种子培养基中，接种量为种子培养基体积的5%，置于恒温空气浴振荡器中，在200RPM、25℃条件下培养7d，测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到0.7，停止发酵，得冠突散囊菌发酵培养液；

D、按质量比20:1称取步骤C所得冠突散囊菌发酵培养液和步骤A所得植物基质，混合于恒温空气浴振荡器中，在400RPM、30℃、pH为5.5的条件下培养10d，得植物发酵液；

E、按质量比1:1:2称取步骤D所得植物发酵液、1,3-丙二醇、1,2-己二醇，混合后泵入微射流提取器，控制流量为120mL/min，温度为50℃，压力为90Mpa，待所有植物发酵液通过微射流提取器，将所得流出液经过孔径为1微米的不锈钢过滤器过滤，得滤出液；将所述滤出液泵入微射流提取器并进行提取，循环泵入提取3次，得发酵提取液；

F、将步骤E所得发酵提取液通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，旋转蒸发至发酵提取液的质量降低到步骤D称取的植物基质质量的3倍，得黄色溶液，对所述黄色溶液进行巴氏杀菌，即得具有抗黑眼圈功效的植物发酵物。

实施例4：一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、选取干燥的四川藏茶、幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲，洗净后置于40℃的真空干燥箱中干燥8h，然后分别用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，按质量比5:1:2:1称取四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，混合后作为植物基质；

B、按质量比5:10:1:1:20:0.033:0.1:1000称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素和去离子水，混合后于121℃灭菌30min，得孟加拉红琼脂培养基；按质量比1:1.5:10:10:30:1000称取无水硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母膏、玉米粉、葡萄糖和去离子水，混合后于121℃灭菌45min，得到种子培养基；

C、将冠突散囊菌接种于步骤B所得孟加拉红琼脂培养基中，接种量为孟加拉红琼脂培养基体积的20%，在30℃下恒温培养6d，得初培物；将所述初培物接种至步骤B所得种子培养基中，接种量为种子培养基体积的5%，置于恒温空气浴振荡器中，在400RPM、30℃条件下培养7d，测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到0.7，停止发酵，得冠突散囊菌发酵培养液；

D、按质量比20:1称取步骤C所得冠突散囊菌发酵培养液和步骤A所得植物基质，混合于恒温空气浴振荡器中，在200RPM、30℃、pH为6.0的条件下培养7d，得植物发酵液；

E、按质量比1:1:2称取步骤D所得植物发酵液、1,3-丙二醇、1,2-己二醇，混合后泵入微射流提取器，控制流量为90mL/min，温度为25℃，压力为80Mpa，待所有植物发酵液通过微射流提取器，将所得流出液经过孔径为1微米的不锈钢过滤器过滤，得滤出液；将所述滤出液泵入微射流提取器并进行提取，循环泵入提取3次，得发酵提取液；

F、将步骤E所得发酵提取液通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，旋转蒸发至发酵提取液的质量降低到步骤D称取的植物基质质量的3倍，得黄色溶液，对所述黄色溶液进行巴氏杀菌，即得具有抗黑眼圈功效的植物发酵物。

实施例5：一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、选取干燥的四川藏茶、幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲，洗净后置于40℃的真空干燥箱中干燥9h，然后分别用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，按质量比5:3:2:1称取四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，混合后作为植物基质；

B、按质量比5:10:1:1:20:0.033:0.1:1000称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素和去离子水，混合后于121℃灭菌40min，得孟加拉红琼脂培养基；按质量比1:1.5:10:10:30:1000称取无水硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母膏、玉米粉、葡萄糖和去离子水，混合后于121℃灭菌45min，得到种子培养基；

C、将冠突散囊菌接种于步骤B所得孟加拉红琼脂培养基中，接种量为孟加拉红琼脂培养基体积的30%，在25~30℃下恒温培养5d，得初培物；将所述初培物接种至步骤B所得种子培养基中，接种量为种子培养基体积的5%，置于恒温空气浴振荡器中，在200RPM、25℃条件下培养5d，测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到0.7，停止发酵，得冠突散囊菌发酵培养液；

D、按质量比20:1称取步骤C所得冠突散囊菌发酵培养液和步骤A所得植物基质，混合于恒温空气浴振荡器中，在400RPM、30℃、pH为6.2的条件下培养10d，得植物发酵液；

E、按质量比1:1:2称取步骤D所得植物发酵液、1,3-丙二醇、1,2-己二醇，混合后泵入微射流提取器，控制流量为80mL/min，温度为35℃，压力为100Mpa，待所有植物发酵液通过微射流提取器，将所得流出液经过孔径为1微米的不锈钢过滤器过滤，得滤出液；将所述滤出液泵入微射流提取器并进行提取，循环泵入提取3次，得发酵提取液；

F、将步骤E所得发酵提取液通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，旋转蒸发至发酵提取液的质量降低到步骤D称取的植物基质质量的3倍，得黄色溶液，对所述黄色溶液进行巴氏杀菌，即得具有抗黑眼圈功效的植物发酵物。

Claims (2)

1.一种具有抗黑眼圈功效的植物发酵物，其特征在于：包含4.12~4.75%的茯茶素A、3.23~3.67%的硫酸半乳聚糖、2.18~2.54%的异嗪皮啶和1.98~2.32%的熊果酸，所述百分比均为质量百分比。

2.权利要求1所述具有抗黑眼圈功效的植物发酵物的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：

A、选取干燥的四川藏茶、幌伞枫叶、三角褐指藻和旱金莲，洗净后置于40℃的真空干燥箱中干燥8~12h，然后分别用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，按质量比5:1~3:1~2:1称取四川藏茶粉、幌伞枫叶粉、三角褐指藻粉和旱金莲粉，混合后作为植物基质；

B、按质量比5:10:1:1:20:0.033:0.1:1000称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素和去离子水，混合后于121℃灭菌30~45min，得孟加拉红琼脂培养基；按质量比1:1.5:10:10:30:1000称取无水硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母膏、玉米粉、葡萄糖和去离子水，混合后于121℃灭菌30~45min，得到种子培养基；

C、将冠突散囊菌接种于步骤B所得孟加拉红琼脂培养基中，接种量为孟加拉红琼脂培养基体积的10~30%，在25~30℃下恒温培养5~7d，得初培物；将所述初培物接种至步骤B所得种子培养基中，接种量为种子培养基体积的5%，置于恒温空气浴振荡器中，在200~400RPM、25~30℃条件下培养5~7d，测量OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到0.7，停止发酵，得冠突散囊菌发酵培养液；

D、按质量比20:1称取步骤C所得冠突散囊菌发酵培养液和步骤A所得植物基质，混合于恒温空气浴振荡器中，在200~400RPM、25~30℃、pH为5.5~6.5的条件下培养5~10d，得植物发酵液；

E、按质量比1:1:2称取步骤D所得植物发酵液、1,3-丙二醇、1,2-己二醇，混合后泵入微射流提取器，控制流量为50~120mL/min，温度为25~50℃，压力为80~120Mpa，待所有植物发酵液通过微射流提取器，将所得流出液经过孔径为1微米的不锈钢过滤器过滤，得滤出液；将所述滤出液泵入微射流提取器并进行提取，循环泵入提取3次，得发酵提取液；

F、将步骤E所得发酵提取液通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，旋转蒸发至发酵提取液的质量降低到步骤D称取的植物基质质量的3倍，得黄色溶液，对所述黄色溶液进行巴氏杀菌，即得具有抗黑眼圈功效的植物发酵物。