CN113786426B - 一种富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法 - Google Patents

一种富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法，属于天然产物制备技术领域。本发明以花生植株为原料，经超微粉碎后除杂，向除杂后的花生植株中加入乙醇水溶液浸提，上清液经浓缩冻干后，所得粉末进一步经复溶处理，所得花生植株活性成分富集物经大孔树脂纯化、浓缩、冻干后，获得高纯度类黄酮、萜类和/或芪类化合物粉末，包装后得成品。本发明的方法高效提升了花生植株提取物产品中有效成分的纯度，且工艺简单，可操作性强，成本低，高效环保，易于工业化生产，所制备的产品有效活性成分含量高、安全性高。

Description

一种富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法
技术领域
本发明属于天然产物制备技术领域，具体涉及一种富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法。
背景技术
花生植株作为花生的废弃物，除少数用作饲料外，大部分被丢弃或焚烧，造成资源浪费和环境污染。花生植株中含有多种活性成分，其中，花生壳中富含木犀草素、圣草酚等为主的类黄酮化合物，还包括一些酚类、皂苷、甾醇等活性成分；花生根中具有生物活性的芪类化合物；花生茎叶富含类黄酮、萜类、酚类、生物碱、蒽醌类(如芦荟苷、大黄酚等)、苯丙素类(如香豆素、木脂素等)、甾体类(如植物甾醇等)、芪类(如白藜芦醇等)化合物等多种活性成分。
目前花生壳中活性成分的开发利用主要以木犀草素的提取纯化为主，其他有效成分并未得到有效的开发利用，但研究发现花生壳醇提物比木犀草素具有更明显的镇咳、祛痰、平喘作用，以及更高的脲酶抑制活性。可见富含以类黄酮化合物为主的多种活性成分的花生壳提取物可以发挥更好的生理活性与功能。
花生根中富含白藜芦醇等芪类化合物，其中白藜芦醇的含量显著高于花生茎叶及花生衣等其他花生部位中的含量，更是葡萄籽中白藜芦醇含量的几百倍。花生根中具有生物活性的芪类化合物并未得到充分的开发利用，工业化生产并不成熟。
近年来，含有落花生茎叶的中成药如落花安神合剂、避风降压片、紫癜宁丸已被广大患者认可。尽管，花生茎叶的药用价值逐渐为人重视，但目前花生茎叶活性成分工业化提取生产能力不强，大量的落花生茎叶仍被作为废弃物焚烧，实际利用程度不高。
综上，目前花生植株并未得到充分的开发利用。因此，开发花生植株中的功能成分，高效利用花生植株及其中的活性成分对花生产业链的延伸极具经济价值。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法，该方法简单易行，适用于工业推广。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法，步骤为：
(1)将花生植株超微粉碎后除杂；
(2)向除杂后的花生植株中加入乙醇水溶液浸提；
(3)步骤(2)浸提出的上清液经浓缩冻干后，向所得粉末再加入乙醇水溶液复溶，复溶后的溶液再经浓缩冻干后，即得含类黄酮、萜类和/或芪类化合物的花生植株活性成分富集物；
(4)将获得的含类黄酮、萜类和/或芪类化合物的花生植株活性成分富集物经大孔树脂纯化后，即得类黄酮、萜类和/或芪类化合物。
上述富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法中，所述大孔树脂纯化的步骤如下：
将获得的含类黄酮、萜类和/或芪类化合物的花生植株活性成分富集物溶于上样液中，以 0.75～1.5BV/h的流速上样，经平衡后的大孔树脂柱吸附后，采用洗脱液以1.5～2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，经旋转蒸发浓缩和冷冻干燥得类黄酮、萜类和/或芪类化合物。
所述的大孔树脂为D101、DM301、HZ801、AB-8、XDA-1、HPD400型大孔树脂中的任意一种。
上述富集花生植株中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的方法，所述的花生植株包含花生壳、花生根或花生茎叶中的至少一种。
从花生壳中富集类黄酮化合物的方法，步骤如下：
(1)将花生荚壳超微粉碎后分别经过水浸泡除杂、5～10％乙醇水溶液浸泡除杂；
(2)向除杂后的花生荚壳中加入40～60％乙醇水溶液浸提；
(3)步骤(2)浸提出的上清液经浓缩冻干后，向所得粉末再加入浓度为40～60％乙醇水溶液复溶，复溶后的溶液再经浓缩冻干后，即得含类黄酮化合物的花生荚壳活性成分富集物；
(4)将获得的含类黄酮化合物的花生荚壳活性成分富集物经大孔树脂纯化后，即得类黄酮化合物。
从花生壳中富集类黄酮化合物的方法中：
所述水浸泡除杂为：按固液比1:15～30(g/mL)向经超微粉碎后的花生荚壳粉中加水，于 25-35℃、180-200r/min条件下震荡浸提45-75min，离心抽滤后保留沉淀；
所述5～10％乙醇水溶液浸泡除杂为：按固液比1:15～30(g/mL)向经水浸泡除杂后所得沉淀中加入浓度为5～10％乙醇水溶液，于25-35℃、180-200r/min条件下震荡浸提45-75min，离心抽滤后保留沉淀；
所述40～60％乙醇水溶液浸提为：按固液比1:15～30(g/mL)向5～10％乙醇水溶液浸泡除杂后所得沉淀中加入浓度为40～60％乙醇水溶液，于25-35℃、180-200r/min条件下震荡浸提 45-75min，离心抽滤后保留上清液；
为了进一步提高含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物中活性成分的含量，所述水浸泡除杂和5～10％(v/v)乙醇水溶液浸泡除杂步骤可以重复3-5次；所述40～60％(v/v)乙醇水溶液浸提步骤可以重复4-6次；在一个具体的实施例中，所述水浸泡除杂和5～10％(v/v)乙醇水溶液浸泡除杂步骤重复3次；所述40～60％(v/v)乙醇水溶液浸提步骤重复4次。
所述的复溶步骤中浓度为40～60％(v/v)乙醇水溶液的添加量为固液比1:150～200(g/mL)，在一个具体的实施例中，此处的固液比1:200(g/mL)。
所述的浓缩是采用旋转蒸发浓缩至原体积的10～20％；在一个具体的实施例中，浓缩至原体积的15％。
所述的大孔树脂为D101、DM301、HZ801型大孔树脂中的任意一种，优选径高比为1:5-8。
所述大孔树脂纯化的步骤如下：
a.用上样液以1～2BV/h流速平衡大孔树脂柱，待pH试纸指示流出液pH为5.0～6.0时，平衡完毕；
b.将含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物溶于上样液中制成样品液，以0.75～1.5 BV/h的流速上样，经大孔树脂柱吸附1.5～2个柱体积后，采用上样液以0.75～1.5BV/h流速洗脱1～1.5个柱体积，最后采用洗脱液以1.5～2BV/h的流速进行洗脱，待0.5～1个柱体积后收集流出液，至1.5～2个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的10～20％和冷冻干燥得花生壳类黄酮富集物粉末；
所述上样液为pH 5.0～6.0的浓度为40％的乙醇水溶液，其pH调节可以采用醋酸、盐酸、柠檬酸中的一种进行；
所述洗脱液为pH 9.0～10.0的浓度为70％的乙醇水溶液，其pH调节可以采用氢氧化钠水溶液进行调节。
所述步骤b中含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物与上样液的比例为1:50～80 (g/mL)。
从花生根中富集芪类化合物的方法，步骤如下：
(1)将花生根超微粉碎后分别经过水浸泡除杂、10～20％乙醇水溶液浸泡除杂；
(2)向除杂后的花生根中加入50～70％乙醇水溶液浸提；
(3)步骤(2)浸提出的上清液经浓缩冻干后，向所得粉末再加入浓度为40～60％乙醇水溶液复溶，复溶后的溶液再经浓缩冻干后，即得含芪类化合物的花生根活性成分富集物；
(4)将获得的含芪类化合物的花生根活性成分富集物经大孔树脂纯化后，即得芪类化合物。
从花生根中富集芪类化合物的方法中：
所述的水浸泡除杂为：按固液比1:10～20(g/mL)向花生根中加水，于25-35℃、180-200r/min 条件下震荡浸泡30-45min，离心抽滤后保留沉淀；
所述10～20％乙醇水溶液浸泡除杂为：按固液比1:15～30(g/mL)向经水浸泡除杂后所得沉淀中加入浓度为10～20％乙醇水溶液，于25-35℃、180-200r/min条件下震荡浸提30-45min，离心抽滤后保留沉淀；
所述50～70％的乙醇水溶液浸提为：按固液比1:10～20(g/mL)向经水浸泡除杂后所的沉淀中加入浓度为50～70％的乙醇水溶液，于25-35℃、180-200r/min条件下震荡浸提45-75min，离心抽滤后保留上清液；
为了进一步提高含芪类化合物的花生根活性成分富集物中活性成分的含量，所述水浸泡除杂和10～20％(v/v)乙醇水溶液浸泡除杂步骤可以重复3-5次；所述50～70％(v/v)乙醇水溶液浸提步骤可以重复4-6次；在一个具体的实施例中，所述水浸泡除杂和10～20％(v/v)乙醇水溶液浸泡除杂步骤重复4次；所述50～70％(v/v)乙醇水溶液浸提步骤重复5次。
所述的复溶步骤中浓度为40～60％(v/v)乙醇水溶液的添加量为固液比1:150～200(g/mL)，在一个具体的实施例中，此处的固液比1:200(g/mL)。
所述的浓缩是采用旋转蒸发浓缩至原体积的10～20％；在一个具体的实施例中，浓缩至原体积的15％。
所述的大孔树脂为DM301、D101、AB-8、HPD400型大孔树脂中的任意一种，优选径高比为1:5-8；
所述大孔树脂纯化的步骤如下：
a.用上样液以1～2BV/h流速平衡大孔树脂柱，待pH试纸指示流出液pH为4.5～5.5时，平衡完毕；
b.将含芪类化合物的花生根活性成分富集物溶于上样液中制成样品液，以0.75～1.5BV/h 的流速上样，经大孔树脂柱吸附1.5～2个柱体积后，采用上样液以0.75～1.5BV/h流速洗脱 1～1.5个柱体积，最后采用洗脱液以1.5～2BV/h的流速进行洗脱，待0.5～1个柱体积后收集流出液，至1.5～2个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的10～20％和冷冻干燥得花生根芪类富集物粉末；
所述上样液为pH 4.5～5.5的浓度为40～60％的乙醇水溶液，其pH调节可以采用醋酸、盐酸、柠檬酸中的一种进行；
所述洗脱液为pH 6.5～7.5的浓度为70～85％的乙醇水溶液，其pH调节可以采用醋酸、盐酸、柠檬酸中的一种进行条件pH至7.0以下，或采用氢氧化钠水溶液进行调节pH至7.0以上。
所述步骤b中含芪类化合物的花生根活性成分富集物与上样液的比例为1:50～80(g/mL)。
从花生茎叶中富集类黄酮和萜类化合物的方法，步骤如下：
(1)将花生茎叶粉碎；
(2)向粉碎后的花生茎叶中加入20～30％乙醇水溶液浸提，获得浸提上清液A；
(3)向步骤(2)浸提后的沉淀中加入50～70％乙醇水溶液浸提，获得浸提上清液B；
(4)步骤(2)浸提出的上清液A经浓缩冻干后，向所得粉末再加入浓度为30～50％乙醇水溶液复溶，复溶后的溶液再经浓缩冻干后，即得含类黄酮化合物的花生茎叶活性成分富集物；
(5)步骤(3)浸提出的上清液B经浓缩冻干后，向所得粉末再加入浓度为30～60％乙醇水溶液复溶，复溶后的溶液再经浓缩冻干后，即得含萜类化合物的花生茎叶活性成分富集物；
(6)将获得的含类黄酮化合物的花生茎叶活性成分富集物和含萜类化合物的花生茎叶活性成分富集物分别经大孔树脂纯化后，即得类黄酮化合物和萜类化合物。
上述从花生茎叶中富集类黄酮和萜类化合物的方法中：
所述20～30％乙醇水溶液浸提为：按固液比1:15～30(g/mL)向经粉碎后的花生茎叶粉中依次加20～30％乙醇水溶液，于25-35℃、180-200r/min条件下震荡浸提25-45min，离心抽滤后保留上清液和沉淀；
所述50～70％乙醇水溶液浸提为：按固液比1:15～30(g/mL)向20～30％乙醇水溶液浸提后所得沉淀中加入50～70％乙醇水溶液，于25-35℃、180-200r/min条件下震荡浸提25-45min，离心抽滤后保留上清液。
为了进一步提高分别含类黄酮和萜类化合物的花生茎叶活性成分富集物中活性成分的含量，所述20～30％(v/v)乙醇水溶液浸提步骤可以重复5-7次，所述50～70％(v/v)乙醇水溶液浸提步骤可以重复4-6次；在一个具体的实施例中，所述20～30％(v/v)乙醇水溶液浸提步骤重复 5次，所述50～70％(v/v)乙醇水溶液浸提步骤重复5次。
所述的复溶步骤中乙醇水溶液的添加量为固液比1:150～200(g/mL)，在一个具体的实施例中，此处的固液比1:200(g/mL)。
所述的浓缩是采用旋转蒸发浓缩至原体积的10～20％；在一个具体的实施例中，浓缩至原体积的15％。
所述的大孔树脂为D101、HZ801、AB-8、XDA-1、DM301型大孔树脂中的任意一种，优选径高比为1:5-8；
所述大孔树脂纯化的步骤如下：
①采用大孔树脂纯化类黄酮化合物的步骤如下：
a.用上样液以1～2BV/h流速平衡大孔树脂柱，待pH试纸指示流出液pH为5.0～6.0时，平衡完毕；
b.将含类黄酮化合物的花生茎叶活性成分提取物溶于上样液中制成样品液，以0.75～1.5 BV/h的流速上样，经大孔树脂柱吸附1.5～2个柱体积后，采用上样液以0.75～1.5BV/h流速洗脱1～1.5个柱体积，最后采用洗脱液以1.5～2BV/h的流速进行洗脱，待0.5～1个柱体积后收集流出液，至1.5～2个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的10～20％和冷冻干燥得花生茎叶类黄酮富集物粉末；
所述含类黄酮化合物的花生茎叶活性成分富集物的上样液为pH 5.0～6.0的浓度为 30～50％的乙醇水溶液，其pH调节可以采用醋酸、盐酸、柠檬酸中的一种进行；洗脱液为pH 9.0～10.0的浓度为50～70％的乙醇水溶液，其pH调节可以采用氢氧化钠水溶液进行调节。
所述步骤b中含类黄酮化合物的花生茎叶活性成分提取物与上样液的比例为1:50～80 (g/mL)。
②采用大孔树脂纯化萜类化合物的步骤如下：
a.用上样液以1～2BV/h流速平衡大孔树脂柱，待pH试纸指示流出液pH为8.5～10.0时，平衡完毕；
b.将含萜类化合物的花生茎叶活性成分提取物溶于上样液中制成样品液，以0.75～1.5 BV/h的流速上样，经大孔树脂柱吸附1.5～2个柱体积后，采用上样液以0.75～1.5BV/h流速洗脱1～1.5个柱体积，最后采用洗脱液以1.5～2BV/h的流速进行洗脱，待0.5～1个柱体积后收集流出液，至1.5～2个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的10～20％和冷冻干燥得花生茎叶萜类富集物粉末；
所述含萜类化合物的花生茎叶活性成分富集物的上样液为pH 8.5～10.0的浓度为30～50％的乙醇水溶液，其pH调节可以采用氢氧化钠水溶液进行调节；洗脱液为pH 5.5～6.5的浓度为70～90％的乙醇水溶液，其pH调节可以采用醋酸、盐酸、柠檬酸中的一种进行。
上述方法制备的花生植株类黄酮、萜类和/或芪类化合物有效成分含量高、杂质少、安全性高，可直接用于食品、饲料、医药、化工等领域。
本发明技术方案的优点：
本发明以花生壳、花生茎叶或花生根为原料，价格低廉，采用分级提取与复溶处理相结合的富集提取方法，提高了花生壳、花生茎叶或花生根提取物干物质中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的含量；所得提取物的有效成分含量高、杂质少、安全性高，可直接应用于食品、医药、化学品、饲料、农药等工业领域；并且，结合pH控制的大孔树脂纯化工艺，进一步提升了花生壳、花生茎叶或花生根提取物干物质中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的纯度，可作为抗炎、抗病、保健行业中具有针对性的开发制剂。该方法操作简单，易于实施，成本低，高效环保，产品安全、得率高，效果显著，能够带来较高的经济效益，可用于工业化生产。
(1)本发明以花生加工副产物花生壳、花生茎叶或花生根为原料，采用分级提取的方式，该方式简单易操作，仅通过调整提取溶剂乙醇的浓度，就可以达到除杂脱毒、提高提取物中有效成分含量和安全性的效果，从而改善了通过提取纯化仅获取单一成分而造成的其他活性成分未被有效开发的问题，同时，可以有效提升单一组分产品所不具有的生物学功能和生理功能，用途更加广泛，效果也更显著。
(2)在分级提取的基础上，进一步采用复溶处理，可显著提高提取物干物质中有效成分的含量。
(3)采用基于pH调控的大孔树脂纯化工艺，高效快速，可进一步提升提取物中类黄酮、萜类和/或芪类化合物的含量，从而满足医药等特殊领域所需。
(4)本发明方法操作简单、成本降低、效率提高，所制备的提取物有效成分含量高，安全性高，能够满足不同领域的需求，易于推广。
附图说明
图1为实施例1复溶前后含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物粉末中的成分组成；
图2为不同富集方式对花生壳提取物中类黄酮化合物的纯度的影响；
图3分级提取花生壳中活性成分的步骤图；
图4花生壳分级提取物中活性成分的得率与含量；
图5不同乙醇浓度对类黄酮、花色素以及黄烷醇提取效果的影响；
图6提取时间与花生壳提取液颜色以及干物质得率变化的关系(a.提取时间与花生壳提取液颜色变化的关系；b.不同提取时间下的干物质得率)；
图7提取次数的确定与花生壳提取液颜色以及干物质得率变化的关系(a.提取次数与花生壳提取液颜色变化的关系；b.不同提取次数下的干物质得率)；
图8最优富集条件下各组分的得率及含量；
图9不同型号的大孔树脂对花生壳中活性成分提取的影响；
图10花生壳总黄酮与木犀草素的动态吸附；
图11花生壳木犀草素和总黄酮的动态解吸。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明实施例所采用的花生荚壳、花生茎叶均为市售，花生根为田间收获获得。
多酚含量的测定：采用Folin-Ciocalteu法测定花生壳提取物中的多酚。具体是：吸取500 μg/mL的没食子酸标准溶液0、25、50、75、100、150、200、300、400μL于EP管中，用60％乙醇溶液补足至1mL后，从中吸取100μL于新的EP管中，依次加入1mL蒸馏水、150 μLFolin-Ciocalteu试剂、600μL 10％Na2CO3溶液，加水补足至2.5mL，于30℃下避光放置2 h，以0样为空白，于760nm处测定吸光值，绘制标准曲线。移取100μL浓度为1mg/mL 提取物待测液于EP管中，根据以上方法测定760nm处的吸光值，代入回归方程计算待测液中多酚浓度。
类黄酮含量的测定：吸取500μg/mL木犀草素标准溶液0、25、50、75、100、150、200、300、400μL于EP管并用40％(v/v)乙醇水溶液补足至1mL，从中吸取50μL于新的EP管中，加入0.1mol/L AlCl3溶液25μL、醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH 5.5)50μL，用60％乙醇稀释至 500μL，摇匀，静置15min，以0样为空白，于402nm处测定吸光值，绘制标准曲线。移取 50μL浓度为1mg/mL提取物待测液于EP管中，根据以上方法测定402nm处的吸光值，代入回归方程计算待测液中类黄酮浓度。
皂苷含量的测定：精确称取熊果酸标准品并以无水乙醇为溶剂配置成浓度为0.1mg/mL 的标准溶液，分别移取0.1mg/mL熊果酸标准溶液70、90、110、130、150、170μL和50μL 5mg/mL的待测液于60℃下蒸干，冷却后加入40μL的5％香草醛-冰醋酸溶液(现配现用)和100μL高氯酸，摇匀后60℃保温10min，冰水中冷却至室温，加入1mL冰醋酸，摇匀后静置30min，于544nm处测定吸光值，绘制标准曲线，计算待测液中皂苷浓度。
总甾醇含量的测定：分别吸取10、25、50、75、100、150、200μL浓度为200μg/mL豆甾醇标准液于EP管中，用无水乙醇补足至200μL后再加入200μL无水乙醇，沿管壁缓慢加入200μL磷硫铁显色剂(1.5mL 10％FeCl3溶液用浓硫酸定容至100mL)，摇匀，室温冷却 15min，以无水乙醇为空白，于520nm处测定吸光值，绘制标准曲线。移取200μL浓度为2 mg/mL提取物待测液于EP管中，根据以上方法测定520nm处的吸光值，代入回归方程计算待测液中甾醇浓度。
木糖含量的测定：分别移取0、1、2、3、4、5、6μL浓度为1mg/mL的木糖标准液，用蒸馏水补至100μL，加入500μL间苯三酚显色液(0.5g间苯三酚，加入100mL冰乙酸及6 mL浓盐酸)，混匀，100℃水浴加热8min，流水冷却至室温，立即于波长554nm下测定吸光值。移取100μL浓度为1mg/mL提取物待测液于EP管中，根据以上方法测定554nm处的吸光值，代入回归方程计算待测液中木糖浓度。
芪类化合物含量的测定：精密称取白藜芦醇标准品适量，加无水乙醇溶解制成质量浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。分别精确吸取对照品溶液20、40、60、80、100、120、150μL置于EP管中，乙醇补足至1mL，以乙醇做参比，测定318nm波长下的吸光度。移取50μL 浓度为0.5mg/mL提取物待测液于EP管中，根据以上方法测定318nm处的吸光值，代入回归方程计算待测液中芪类化合物浓度。
花青素含量的测定：采用pH示差法。吸取20μL浓度为5mg/mL的待测液，分别用pH1.0的盐酸-氯化钠缓冲液及pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释20倍。花色素含量用二甲花翠素葡萄糖苷(CGE，mg/L)表示时，稀释液分别在520nm与700nm下测定吸光度，最终吸光值按照A＝(A520-A700)pH 1.0-(A520-A700)pH4.5计算。待测液中花色素的含量按照CGE(mg/g)＝(A×MW×DF×Ve×1000)/(ε×1×M)计算；式中：MW为二甲花翠素葡萄糖苷分子量(493.5)， DF为稀释倍数，ε为二甲花翠素葡萄糖苷的消光系数28000L/(mol·cm)，Ve为提取液总体积 (L)，M为取样质量(g)。
总黄烷醇含量的测定：分别吸取浓度为0.50mg/mL儿茶素标准溶液0、25、50、100、200、400μL于EP管中，60％乙醇溶液补足至1mL，从中吸取30μL于新的EP管中，加入 900μLp-DMACA(0.1％p-DMACA 1mol/L盐酸甲醇溶液)，混匀，室温下反应10min，于 640nm处测定吸光值，绘制标准曲线。移取30μL浓度为5mg/mL提取物待测液于EP管中，根据以上方法测定640nm处的吸光值，代入回归方程计算待测液中黄烷醇浓度。
实施例1
一种富集花生荚壳中类黄酮化合物的方法，具体步骤如下：
(1)将花生荚壳清洗晾干后超微粉碎并过100目筛；
(2)按固液比1:20(g/mL)向经超微粉碎的花生荚壳粉中加水，于30℃、180r/min条件下震荡浸提60min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作3次；
(3)向步骤(2)所得沉淀中按固液比1:20(g/mL)加入10％乙醇水溶液，于30℃、180r/min 条件下震荡浸提60min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作3次；
(4)向步骤(3)所得沉淀中按固液比1:20(g/mL)加入40％乙醇水溶液，于30℃、180r/min 条件下震荡浸提60min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作4次；
(5)将步骤(4)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得粉末；
(6)按照固液比1:200(g/mL)向步骤(5)所得粉末中加入40％乙醇水溶液复溶，离心抽滤后保留上清液。
(7)将步骤(6)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物粉末；
(8)按照径高比1:5(直径30cm，高150cm)对D101型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用上样液(经2mol/L醋酸调节的pH值为5.0的40％乙醇水溶液)以2BV/h流速平衡柱子，待pH试纸指示流出液pH值为5.0时，平衡完毕。将步骤(7)所得含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物粉末按照固液比1:50(g/mL)溶于上样液中制成样品溶液，以0.75BV/h的流速上样，经D101型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，再采用上样液以0.75BV/h流速洗脱1.5 个柱体积，再采用洗脱液(经4mol/L的NaOH调节的pH 10.0的70％乙醇水溶液)以1.5BV/h 的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得花生壳类黄酮富集物粉末；
(9)将步骤(7)和步骤(8)所得花生壳活性成分富集物粉末和花生壳类黄酮富集物粉末，分别包装后得成品。
分别检测步骤(5)(即复溶处理前)的冻干粉末和步骤(7)(即复溶处理后)含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物粉末中类黄酮、多酚、皂苷、甾醇、木糖含量，结果如图1所示；由图1可知，复溶处理前类黄酮、多酚、皂苷、甾醇、木糖的含量分别为47.47％、11.2％、 4.86％、12.94％、4.13％，其他组分含量为19.4％；而复溶处理后的含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物粉末中仅含有类黄酮、多酚、皂苷、甾醇、木糖五种组分，几乎不含有其他杂质成分，上述组分含量分别为52.35％、14.33％、7.5％、16.7％、9.12％；相对于复溶处理前，杂质含量少，有效活性成分占比明显提高，安全性高，可直接用于食品、饲料、医药、化工等领域。
检测步骤(8)经大孔树脂纯化后获得的花生壳类黄酮富集物粉末中类黄酮化合物的含量，结果发现，类黄酮化合物的纯度可达96.51±0.56％，这说明，该方法具有富集花生荚壳中类黄酮化合物的效果。花生壳类黄酮富集物含有除木犀草素以外的多种类黄酮化合物，如花色素、黄烷醇。
对比例1
一种花生荚壳中类黄酮化合物的提取方法，具体步骤如下：
(1)将花生荚壳清洗晾干后超微粉碎并过100目筛；
(2)按照1:20(g/mL)的比例向经超微粉碎的花生荚壳粉中加入60％乙醇水溶液，于功率1000W、55℃超声波辅助提取60min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作4次；
(3)将步骤(2)所得上清液经旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得花生壳提取物粉末；
(4)按照径高比1:5(直径30cm，高150cm)对D101型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用40％乙醇水溶液的上样液以2BV/h流速平衡柱子，1.5～2个柱体积后平衡完毕。将步骤(3)所得花生壳提取物粉末按照固液比1:50(g/mL)溶于上样液中，以0.75BV/h的流速上样，经D101型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，采用上样液以0.75BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用经70％乙醇水溶液的洗脱液以1.5BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩和冷冻干燥得花生壳类黄酮纯化物粉末；
(5)将步骤(3)和步骤(4)所得花生壳提取物粉末和花生壳类黄酮纯化物粉末，分别包装后得成品。
经检测该对比例1步骤(3)制备的花生壳提取物粉末中类黄酮化合物的纯度仅为5.55％；经步骤(4)的大孔树脂纯化后的花生壳类黄酮纯化物粉末中类黄酮化合物的纯度为 10.54±0.16％。
通过比较实施例1步骤(5)的冻干粉末(即复溶处理前富集提取物)和步骤(7)含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物粉末(即复溶处理后富集提取物)与对比例1步骤(3)制备的花生壳提取物粉末(普通提取物)中类黄酮化合物的纯度结果如图2所示，实施例1与对比例1相比，分级提取与复溶处理可显著提升花生壳提取物中有效成分的含量，提高提取效率，降低成本；并且经过pH调控的纯化工艺可显著提高类黄酮的吸附与洗脱，类黄酮的纯度得到很大的提升。
(一)不同分级提取对花生壳中活性成分含量和得率的影响
分级提取花生壳中的活性成分：其中0-7级指的是乙醇的含量为0％-70％提取溶剂；花生壳依次与每种提取溶剂按1:20混合，于30℃、180r/min条件下浸提多次至提取液的黄色变淡，离心抽滤后，上清液经旋转蒸发浓缩、冷冻干燥得粉末备用，并计算干物质得率。提取步骤如图3。
由图4可知，多酚、类黄酮、皂苷、甾醇、木糖五类组分的总得率在水提取时最高，但所得0级提取物中以木糖居多，其次为皂苷，而甾醇与类黄酮的含量则相当少；继续采用醇提后，尽管干物质得率下降，但所得的1～7级提取物中类黄酮化合物和甾醇的含量显著增加，木糖组分则明显降低，尤其是1～4级提取物，干物质得率相当，多酚含量相近，类黄酮化合物和甾醇的含量逐渐提高，皂苷含量与0级提取物接近；而5～7提取物中，虽然类黄酮化合物和多酚的含量也较高，但五种组分的总得率则过低，相对于生产成本而言并不适用。此外，通过比较0～7级提取物还可发现类黄酮化合物和多酚主要是通过醇提的方式获得，而水提可消减木糖等成分的含量，因此，采用先依次水提与10％乙醇提取后，再采用40％乙醇溶液提取的方式在具有富集类黄酮化合物和多酚作用的同时，还可降低成本，提高生产效率。
(二)不同乙醇浓度对类黄酮、花色素以及黄烷醇提取效果的影响
测定分级提取花生壳中的类黄酮、花色素和黄烷醇结果如图5所示，由图5(a)可知，花生壳中类黄酮化合物的得率随着提取溶剂中乙醇浓度的升高呈先升高后降低的趋势，当提取溶剂中乙醇浓度为40％时，类黄酮化合物的得率最高；并且当依次采用水、10％乙醇提取后，再采用20％～40％的乙醇溶液提取，所得干物质中类黄酮化合物的含量显著提升，呈现富集效果，而之后提升乙醇浓度继续提取，类黄酮化合物的含量仍会下降，且得率降低显著，效益降低。该结果表明，如果依次采用水和10％乙醇溶液提取后，再采用40％乙醇溶液继续提取，既可以提升类黄酮化合物的得率又可以富集类黄酮化合物，降低成本，提高类黄酮化合物的提取效率。
此外，采用分光光度法分析花生壳分级提取物中花色素和黄烷醇的含量，二者都属于类黄酮化合物，如图5(b)和(c)所示。尽管花色素和黄烷醇在4级提取物的类黄酮化合物中的占比不是最高，但它们在该级提取物中的含量最高，特别是黄烷醇在2～4级提取物中的含量及在相应级的提取物中类黄酮化合物中的占比都较高，由此可见，不同类黄酮化合物的醇溶性也存在明显的差异性，但高浓度的乙醇溶液可以提取更多的类黄酮化合物。
(三)提取时间和提取次数对花生壳中活性成分得率的影响
提取方法：花生壳与水按1:20混合，于30℃、180r/min条件下，提取不同时间后，离心抽滤，比较上清液颜色，上清液经旋转蒸发浓缩、冷冻干燥得粉末，计算干物质得率。
考察水提取时，不同时间下提取液颜色的变化确定最佳提取时间，结果如图6中(a)所示，随着提取时间的增加，提取颜色逐渐加深，当提取时间为60min，再延长提取时间，提取液的颜色基本稳定，同时，从图6中的(b)也可看出，当提取60min时，随着时间的延长，干物质得率趋于稳定，因此，选择的提取时间不低于60min。
提取方法：花生荚壳超微粉碎后，于30℃、180r/min条件下，按1:20(m/v)分别经过水浸泡3次、10％乙醇水溶液浸泡3次除杂后，40％乙醇水溶液提取不同次数，离心抽滤，比较上清液颜色，上清液经旋转蒸发浓缩、冷冻干燥得粉末，计算干物质得率。
考察不同醇提次数下提取液颜色变化结合干物质得率确定了40％乙醇溶液的提取次数，如图7中(a)所示，随着提取次数的增加，提取液的颜色逐渐变淡，当提取至第四次时，提取液的颜色已变很淡，再增加提取次数，提取液的颜色变化不大，同时，从图7中(b)也可看出，当提取至第四次时，干物质得率也已下降至约0.1％，因此，40％乙醇溶液的提取次数选择为四次，干物质总得率约为1.34％。
(四)最优富集条件下，各组分的得率及含量
(1)将花生荚壳清洗晾干后超微粉碎并过100目筛；
(2)按固液比1:20(g/mL)向经超微粉碎的花生荚壳粉中加水，于30℃、180r/min条件下震荡浸提60min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作3次；
(3)向步骤(2)所得沉淀中按固液比1:20(g/mL)加入10％乙醇水溶液，于30℃、180r/min 条件下震荡浸提60min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作3次；
(4)向步骤(3)所得沉淀中按固液比1:20(g/mL)加入40％乙醇水溶液，于30℃、180r/min 条件下震荡浸提60min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作4次；
(5)将步骤(4)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得粉末；
检测冻干粉中各组分的含量及得率，结果如图8所示，由图8可知，五种成分的得率与含量的变化趋势一致，并且富集提取后类黄酮化合物的得率和含量显著提高，其次为甾醇和多酚，另有少量皂苷和木糖。可见，采用依次水提与10％乙醇提取后，再采用40％乙醇溶液提取的方式能够有效富集花生壳中的类黄酮成分。
(五)不同型号的大孔树脂对花生壳中活性成分提取的影响
静态吸附与解吸：分别取预处理后的5种大孔吸附树脂各2g于150mL具塞锥形瓶中，加入20mL花生壳黄酮提取液，于25℃恒温摇床中120r/min下振荡24h后，吸取上清液，测定吸附平衡后提取液中的类黄酮浓度，按如下公式计算不同树脂的黄酮类物质的吸附率和树脂的吸附能力(吸附量)。
Figure BDA0003269616560000131
Figure BDA0003269616560000132
式中：A-吸附率；C0-原液中黄酮浓度，mg/mL；C1-吸附液中黄酮浓度，mg/mL；V-吸附溶液的体积，20mL；W-干树脂质量，2g；Q-吸附量，mg/g。
过滤收集树脂填料，蒸馏水冲洗至洗脱液无色，去除树脂表面残留提取液。向已达到吸附饱和的树脂中加入20mL不同浓度的乙醇溶液，于25℃、转速为120r/min下震荡解吸24h，测定黄酮浓度，按下式计算解吸率。
Figure BDA0003269616560000141
Figure BDA0003269616560000142
式中：B-解吸率；C0-原液中黄酮浓度，mg/mL；C1-吸附液中黄酮浓度，mg/mL；C2 解吸液中黄酮浓度，mg/mL；V-吸附溶液的体积，20mL；V′-解吸液的体积，20mL。
通过比较五种可用于类黄酮纯化的大孔树脂，确定最适于花生壳黄酮纯化的大孔树脂。如图9所示，大孔树脂D101对提取液中黄酮的吸附量和吸附率最高(p<0.05)，吸附率接近 35％；其次为DM301，但比D101型大孔树脂低了约为10％；而与常用的AB-8型大孔树脂相比，D101型大孔树脂的吸附能力是其2倍，表现出更好的吸附性能。可见，D101型大孔树脂更适合于纯化花生壳黄酮。
(六)大孔树脂纯化中上样量、流速、上样液和洗脱液对花生壳中活性成分提取的影响
(1)动态吸附
将浓度为2mg/mL的花生壳类黄酮提取液通过D101大孔树脂的吸附柱，根据静态吸附试验的结果选用pH 5.0的60％乙醇溶液作为上样缓冲液，间隔1min收集流出液，测定其吸光值，考察0.75BV/h和1.5BV/h的吸附流速对树脂吸附效果的影响，如图10所示。由图10的拟合曲线可以看出，不管是花生壳木犀草素(A340)还是花生壳总黄酮(A510)，都在吸附流速为0.75BV/h时，出现的泄漏点较晚，尤其是吸附流速对木犀草素的吸附影响较为明显。因此，以较慢的流速通过，利于花生壳木犀草素和花生壳总黄酮的吸附。但过慢的流速会显著影响工业化的生产效率与周期，因而0.75BV/h的上样流速为最佳流速。
(2)动态解吸
上样吸附后，经2BV上样缓冲液洗柱后，采用pH 10.0的70％乙醇溶液进行洗脱，间隔 1min收集洗脱液，测定吸光值，考察洗脱流速0.75BV/h和1.5BV/h对解吸效果的影响，动态解吸曲线如图11所示。由图11可知，当洗脱流速为1.5BV/h时，木犀草素(图11中(A)) 与总黄酮(图11中(B))的洗脱曲线相似，但洗脱流速为0.75BV/h时，二者的峰形差异明显。此外，洗脱速度为0.75BV/h时，木犀草素与总黄酮洗脱曲线的峰形宽，峰值低；洗脱速度为1.5BV/h时，解吸较快，洗脱曲线峰型集中，且峰形、峰值及拖尾现象明显好于洗脱速度为0.75BV/h时。因此，选择解吸流速为1.5BV/h。
实施例2
一种富集花生根中芪类化合物的方法，具体步骤如下：
(1)将花生根清洗晾干后超微粉碎并过100目筛；
(2)按固液比1:20(g/mL)向经超微粉碎的花生根粉中加水，于30℃、180r/min条件下震荡浸提40min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作4次；
(3)向步骤(2)所得沉淀中按固液比1:20(g/mL)加入20％乙醇水溶液，于30℃、180r/min 条件下震荡浸提40min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作4次；
(4)向步骤(3)所得沉淀中按固液比1:20(g/mL)加入60％乙醇水溶液，于30℃、180r/min 条件下震荡浸提60min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作5次；
(5)将步骤(4)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得粉末；
(6)按照固液比1:200(g/mL)向步骤(5)所得粉末中加入40％乙醇水溶液复溶，离心抽滤后保留上清液。
(7)将步骤(6)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得含芪类化合物的花生根活性成分富集物粉末；
(8)按照径高比1:5(直径30cm，高150cm)对DM301型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用上样液(经2mol/L醋酸调节的pH值为4.5的40％乙醇水溶液)以2BV/h流速平衡柱子，待pH试纸指示流出液pH值为4.5时，平衡完毕。将步骤(7)所得含芪类化合物的花生根活性成分富集物粉末按照固液比1:50(g/mL)溶于上样液中制成样品溶液，以0.75BV/h的流速上样，经DM301型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，再采用上样液以0.75BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用洗脱液(经4mol/L的NaOH调节的pH 7.5的85％乙醇水溶液)以 1.5BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得花生根芪类富集物粉末；
(9)将步骤(7)和步骤(8)所得花生根活性成分富集物粉末和花生根芪类富集物粉末，分别包装后得成品。
检测步骤(5)制得的含芪类化合物的花生根活性成分富集物中芪类化合物的含量，结果发现，芪类化合物的含量达到了54.62％；含芪类化合物的花生根活性成分富集物的得率约为 6.79％。
检测步骤(8)制得的花生根芪类富集物粉末的活性成分，结果发现，经大孔树脂纯化后芪类化合物的纯度可达90％以上，具有较好的生物学功能和生理作用，产品安全性高，可直接使用。
对比例2
一种花生根中芪类化合物的提取方法，步骤如下：
(1)按照1:20(g/mL)的比例向经超微粉碎后的花生根中加入60％乙醇水溶液，于功率 1000W、55℃超声波辅助提取60min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作5次；
(2)将步骤(1)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得花生根提取物粉末；
(3)按照径高比1:5(直径30cm，高150cm)对DM301型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用40％乙醇水溶液的上样液以2BV/h流速平衡柱子，2个柱体积后平衡完毕。将步骤(2) 所得花生根提取物粉末按照固液比1:50(g/mL)溶于上样液中，以0.75BV/h的流速上样，经DM301型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，采用上样液以0.75BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用经85％乙醇水溶液的洗脱液以1.5BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，收集洗脱液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％和冷冻干燥得花生根芪类纯化物粉末；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得花生根提取物粉末和花生根芪类纯化物粉末，分别包装后得成品。
经检测，该方法制得的花生根提取物粉末的得率约为11.58％，其中芪类化合物的纯度为 0.87％；经大孔树脂纯化后，制得的花生根芪类纯化物粉末中芪类化合物的纯度为20.16％。
实施例2与对比例2相比，分级提取与复溶处理可显著提升花生根提取物中有效成分的含量，提高提取效率，降低成本，具有富集芪类化合物的效果；并且经过pH调控的纯化工艺可显著提高芪类化合物的吸附与洗脱，芪类化合物的得率和纯度得到很大的提升。
实施例3
一种富集花生茎叶中类黄酮与萜类化合物的方法，具体步骤如下：
(1)将花生茎叶清洗晾干后粉碎并过30目筛；
(2)按固液比1:20(g/mL)向粉碎后花生茎叶粉中加入30％乙醇水溶液，于30℃、180r/min 条件下震荡浸提30min，离心抽滤后保留上清液与沉淀，重复该操作5次，获得浸提上清液 A；
(3)将步骤(2)所得上清液A经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得粉末A；
(4)向步骤(2)所得沉淀中按固液比1:20(g/mL)加入50％乙醇水溶液，于30℃、180r/min 条件下震荡浸提30min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作5次，获得浸提上清液B；
(5)将步骤(4)所得上清液B经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得粉末B；
(6)按照固液比1:150(g/mL)向步骤(3)和(5)所得粉末A、B中分别加入30％和50％乙醇水溶液复溶，离心抽滤后保留上清液A和B。
(7)将步骤(6)所得上清液A和B分别经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得含类黄酮和萜类化合物的花生茎叶活性成分提取物粉末；
(8)按照径高比1:5(直径30cm，高150cm)对D101型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用上样液(经2mol/L醋酸调节的pH值为5.0的30％乙醇水溶液)以2BV/h流速平衡柱子，待pH试纸指示流出液pH值为5.0时，平衡完毕。将步骤(7)所得含类黄酮化合物的花生茎叶活性成分提取物粉末按照固液比1:50(g/mL)溶于上样液中制成样品溶液，以0.75BV/h的流速上样，经D101型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，再采用上样液以0.75BV/h流速洗脱 1.5个柱体积，再采用洗脱液(经4mol/L的NaOH调节的pH 10.0的70％乙醇水溶液)以1.5 BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得花生茎叶类黄酮富集物粉末；
(9)按照径高比1:5(直径30cm，高150cm)对DM301型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用上样液(经2mol/L的NaOH调节的pH值为9.0的50％乙醇水溶液)以2BV/h流速平衡柱子，待pH试纸指示流出液pH值为9.0时，平衡完毕。将步骤(7)所得含萜类化合物的花生茎叶活性成分提取物粉末按照固液比1:50(g/mL)溶于上样液中制成样品溶液，以0.75BV/h 的流速上样，经DM301型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，再采用上样液以0.75BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用洗脱液(经2mol/L的醋酸调节的pH 6.0的85％乙醇水溶液) 以1.5BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15％后冷冻干燥得花生茎叶萜类富集物粉末；
(10)将步骤(7)、步骤(8)和步骤(9)所得花生茎叶类黄酮提取物粉末、萜类提取物粉末和花生茎叶类黄酮富集物粉末、萜类富集物粉末，分别包装后得成品。
检测步骤(7)制得的含类黄酮和萜类化合物的花生茎叶活性成分提取物中类黄酮和萜类化合物的含量，结果发现，类黄酮和萜类化合物的含量分别达到了58.21％、36.74％。
检测步骤(8)和步骤(9)制得的花生茎叶类黄酮和萜类富集物粉末的活性成分，结果发现，经大孔树脂纯化后类黄酮和萜类化合物的纯度可分别达95％和86％以上，具有较好的生物学功能和生理作用，产品安全性高，可直接使用。
对比例3
一种花生茎叶中类黄酮化合物的提取方法，具体步骤如下：
(1)将花生茎叶清洗晾干后粉碎并过30目筛；
(2)按照1:20(g/mL)的比例向经粉碎的花生茎叶粉中加入30％乙醇水溶液，于功率1000 W、55℃超声波辅助提取60min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作5次；
(3)将步骤(2)所得上清液经旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得花生茎叶提取物粉末；
(4)按照径高比1:5(直径30cm，高150cm)对D101型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用30％乙醇水溶液的上样液以2BV/h流速平衡柱子，1.5～2个柱体积后平衡完毕。将步骤(3)所得花生茎叶提取物粉末按照固液比1:50(g/mL)溶于上样液中，以0.75BV/h的流速上样，经D101型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，采用上样液以0.75BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用经70％乙醇水溶液的洗脱液以1.5BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩和冷冻干燥得花生茎叶类黄酮纯化物粉末；
(5)将步骤(3)和步骤(4)所得花生茎叶提取物粉末和花生茎叶类黄酮纯化物粉末，分别包装后得成品。
经检测该对比例3步骤(3)制备的花生茎叶提取物粉末中类黄酮化合物的纯度仅为 18.76％；经步骤(4)的大孔树脂纯化后的花生壳类黄酮纯化物粉末中类黄酮化合物的纯度为 33.82％。
对比例4
一种花生茎叶中萜类化合物的提取方法，具体步骤如下：
(1)将花生茎叶清洗晾干后粉碎并过30目筛；
(2)按照1:20(g/mL)的比例向经粉碎的花生茎叶粉中加入50％乙醇水溶液，于功率1000 W、55℃超声波辅助提取60min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作5次；
(3)将步骤(2)所得上清液经旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得花生茎叶提取物粉末；
(4)按照径高比1:5(直径30cm，高150cm)对DM301型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用50％乙醇水溶液的上样液以2BV/h流速平衡柱子，1.5～2个柱体积后平衡完毕。将步骤(3)所得花生茎叶提取物粉末按照固液比1:50(g/mL)溶于上样液中，以0.75BV/h的流速上样，经DM301型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，采用上样液以0.75BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用经85％乙醇水溶液的洗脱液以1.5BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩和冷冻干燥得花生茎叶萜类纯化物粉末；
(5)将步骤(3)和步骤(4)所得花生茎叶提取物粉末和花生茎叶萜类纯化物粉末，分别包装后得成品。
经检测该对比例4步骤(3)制备的花生茎叶提取物粉末中萜类化合物的纯度仅为1.89％；经步骤(4)的大孔树脂纯化后的花生茎叶萜类纯化物粉末中萜类化合物的纯度为18.48％。
实施例3与对比例3和对比例4相比，分级提取具有同时区分提取类黄酮和萜类化合物的作用，并且结合复溶处理可显著提升花生茎叶提取物中有效成分的含量，提高提取效率，降低成本，具有富集类黄酮和萜类化合物的效果；并且经过pH调控的纯化工艺可显著提高类黄酮或萜类化合物的吸附与洗脱，两种化合物的得率和纯度都得到很大的提升。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种富集花生荚壳中类黄酮化合物的方法，其特征在于，步骤如下：
(1) 将花生荚壳清洗晾干后超微粉碎并过100目筛；
(2) 按固液比1:20 g/mL向经超微粉碎的花生荚壳粉中加水，于30℃、180 r/min条件下震荡浸提60 min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作3次；
(3) 向步骤(2)所得沉淀中按固液比1:20 g/mL加入10%乙醇水溶液，于30℃、180 r/min条件下震荡浸提60 min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作3次；
(4) 向步骤(3)所得沉淀中按固液比1:20 g/mL加入40%乙醇水溶液，于30℃、180 r/min条件下震荡浸提60 min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作4次；
(5) 将步骤(4)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得粉末；
(6) 按照固液比1: 200 g/mL向步骤(5)所得粉末中加入40%乙醇水溶液复溶，离心抽滤后保留上清液；
(7) 将步骤(6)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物粉末；
(8) 按照径高比1:5，其中，直径30 cm，高150 cm，对D101型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用上样液以2 BV/h流速平衡柱子，待pH试纸指示流出液pH值为5.0时，平衡完毕；将步骤(7)所得含类黄酮化合物的花生壳活性成分富集物粉末按照固液比1:50 g/mL溶于上样液中制成样品溶液，以0.75 BV/h的流速上样，经D101型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，再采用上样液以0.75 BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用洗脱液以1.5 BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得花生壳类黄酮富集物粉末；
(9) 将步骤(7)和步骤(8)所得花生壳活性成分富集物粉末和花生壳类黄酮富集物粉末，分别包装后得成品；
所述步骤(8)中上样液为经2 mol/L醋酸调节的pH值为5.0的40%乙醇水溶液；洗脱液为经4 mol/L的NaOH调节的pH 10.0的70%乙醇水溶液。
2.一种富集花生根中芪类化合物的方法，其特征在于，步骤如下：
(1) 将花生根清洗晾干后超微粉碎并过100目筛；
(2) 按固液比1:20 g/mL向经超微粉碎的花生根粉中加水，于30℃、180 r/min条件下震荡浸提40 min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作4次；
(3) 向步骤(2)所得沉淀中按固液比1:20 g/mL加入20%乙醇水溶液，于30℃、180 r/min条件下震荡浸提40 min，离心抽滤后保留沉淀，重复该操作4次；
(4) 向步骤(3)所得沉淀中按固液比1:20 g/mL加入60%乙醇水溶液，于30℃、180 r/min条件下震荡浸提60 min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作5次；
(5) 将步骤(4)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得粉末；
(6) 按照固液比1: 200 g/mL向步骤(5)所得粉末中加入40%乙醇水溶液复溶，离心抽滤后保留上清液；
(7) 将步骤(6)所得上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得含芪类化合物的花生根活性成分富集物粉末；
(8) 按照径高比1:5，其中，直径30 cm，高150 cm，对DM301型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用上样液以2 BV/h流速平衡柱子，待pH试纸指示流出液pH值为4.5时，平衡完毕；将步骤(7)所得含芪类化合物的花生根活性成分富集物粉末按照固液比1:50 g/mL溶于上样液中制成样品溶液，以0.75 BV/h的流速上样，经DM301型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，再采用上样液以0.75 BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用洗脱液以1.5 BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得花生根芪类富集物粉末；
(9) 将步骤(7)和步骤(8)所得花生根活性成分富集物粉末和花生根芪类富集物粉末，分别包装后得成品；
所述步骤(8)中上样液为经2 mol/L醋酸调节的pH值为4.5的40%乙醇水溶液；洗脱液为经4 mol/L的NaOH调节的pH 7.5的85%乙醇水溶液。
3.一种富集花生茎叶中类黄酮与萜类化合物的方法，其特征在于，步骤如下：
(1) 将花生茎叶清洗晾干后粉碎并过30目筛；
(2) 按固液比1:20 g/mL向粉碎后花生茎叶粉中加入30%乙醇水溶液，于30℃、180 r/min条件下震荡浸提30 min，离心抽滤后保留上清液与沉淀，重复该操作5次，获得浸提上清液A；
(3) 将步骤(2)所得上清液A经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得粉末A；
(4) 向步骤(2)所得沉淀中按固液比1:20 g/mL加入50%乙醇水溶液，于30℃、180 r/min条件下震荡浸提30 min，离心抽滤后保留上清液，重复该操作5次，获得浸提上清液B；
(5) 将步骤(4)所得上清液B经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得粉末B；
(6) 按照固液比1: 150 g/mL向步骤(3)和(5)所得粉末A、B中分别加入30%和50%乙醇水溶液复溶，离心抽滤后保留上清液A和B；
(7) 将步骤(6)所得上清液A和B分别经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得含类黄酮和萜类化合物的花生茎叶活性成分提取物粉末；
(8) 按照径高比1:5，其中直径30 cm，高150 cm，对D101型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用上样液以2 BV/h流速平衡柱子，待pH试纸指示流出液pH值为5.0时，平衡完毕；将步骤(7)所得含类黄酮化合物的花生茎叶活性成分提取物粉末按照固液比1:50 g/mL溶于上样液中制成样品溶液，以0.75 BV/h的流速上样，经D101型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，再采用上样液以0.75 BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用洗脱液以1.5 BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得花生茎叶类黄酮富集物粉末；
(9) 按照径高比1:5，其中，直径30 cm，高150 cm，对DM301型大孔树脂纯化柱进行装柱，采用上样液以2 BV/h流速平衡柱子，待pH试纸指示流出液pH值为9.0时，平衡完毕；将步骤(7)所得含萜类化合物的花生茎叶活性成分提取物粉末按照固液比1:50 g/mL溶于上样液中制成样品溶液，以0.75 BV/h的流速上样，经DM301型大孔树脂纯化柱吸附2个柱体积后，再采用上样液以0.75 BV/h流速洗脱1.5个柱体积，再采用洗脱液以1.5 BV/h的流速进行洗脱，待0.5个柱体积后收集流出液，至1.5个柱体积后停止收集，洗脱液经旋转蒸发浓缩至原体积的15%后冷冻干燥得花生茎叶萜类富集物粉末；
(10) 将步骤(7)、步骤(8)和步骤(9)所得花生茎叶类黄酮提取物粉末、萜类提取物粉末和花生茎叶类黄酮富集物粉末、萜类富集物粉末，分别包装后得成品；
所述步骤(8)中上样液为经2 mol/L醋酸调节的pH值为5.0的30%乙醇水溶液；洗脱液为经4 mol/L的NaOH调节的pH 10.0的70%乙醇水溶液；
所述步骤(9)中上样液为经2 mol/L的NaOH调节的pH值为9.0的50%乙醇水溶液；洗脱液为经2 mol/L的醋酸调节的pH 6.0的85%乙醇水溶液。
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