CN113786402A - Gl-v9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了GL‑V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用。相对于现有技术，本发明发现了在体外实验中，GL‑V9能显著恢复脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞以及大肠埃希氏菌感染巨噬细胞两种引起细胞焦亡的途径所导致的J774A.1细胞活力下降和细胞毒性损伤增加，抑制Caspase‑11所介导的细胞焦亡相关蛋白的表达情况。在体内实验中，GL‑V9能够降低盲肠结扎穿刺术(CLP)脓毒症模型小鼠死亡率，减弱器官功能损伤和抑制炎症因子释放。这些作用表明GL‑V9可用于脓毒症的治疗，具有开发药物的前景。

Description

GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用

技术领域

本发明公开了汉黄芩素衍生物GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用，属于GL-V9新用途技术领域。

背景技术

炎症是生物组织受到外伤、感染等损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。一直以来，炎症被认为是一种机体自我保护的机制。但炎症反应的持续存在会导致机体组织损伤，损害机体正常生理功能。

脓毒症就是一种机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍性疾病。脓毒症病程发展迅速、病情严重、病死率高。目前是全球人口死亡的主要原因之一。通常，脓毒症可以由身体任何部位的感染引起，包括由严重烧伤、腹膜炎、脓肿，以及由于病原微生物包括细菌、真菌等感染所引起的全身性反应综合征。临床上，患者会出现低血压、心动过速、和呼吸急促、急性肺损伤、肾损伤、进而出现脓毒性休克甚至死亡。脓毒症的病理生理学过程涉及复杂的细胞因子释放和炎症反应发生过程，其发病与先天性免疫系统的过度激活所造成的危害密切相关。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分。先天免疫系统通过监测LPS识别革兰氏阴性细菌。当LPS进入细胞，在细胞质中LPS的脂质A(Lipid A)结构域与半胱氨酸天冬蛋白酶-11(Caspase-11)的caspase募集结构域(CARD)结构域结合，激活Caspase-11，引发细胞焦亡，细胞焦亡所导致的细胞炎症因子的大量释放，继而会造成组织器官的损伤，最终会引发脓毒性休克甚至死亡。巨噬细胞作为先天性免疫细胞中重要的成员，在脓毒症过程中巨噬细胞的大量焦亡是造成病情恶化的主要原因。因此，抑制巨噬细胞焦亡，寻找安全、有效的抗炎药物对于治疗脓毒症具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用，为开发治疗脓毒症的药物提供依据。

为达到上述发明目的，本发明技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种汉黄芩素衍生物GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用，所述GL-V9分子式为C₂₄H₂₇NO₅，结构式如式Ⅰ所示：

进一步的，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

进一步的，所述巨噬细胞焦亡为Caspase-11所介导的巨噬细胞焦亡。

在某一个特定的实施例中，所述Caspase-11所介导的巨噬细胞焦亡为脂质体2000转染脂多糖LPS转入巨噬细胞引起的巨噬细胞焦亡或大肠埃希氏菌感染巨噬细胞引起的巨噬细胞焦亡。

进一步的，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度，从而恢复巨噬细细胞活力，并抑制巨噬细胞的细胞毒性损伤，从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

进一步的，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度，从而抑制患者血清中炎症因子释放，减弱患者器官功能损伤，从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

本发明的第二个目的是提供一种预防和/或治疗脓毒症药物组合物，所述组合物是以GL-V9作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

进一步的，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

进一步的，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度，从而恢复巨噬细细胞活力，并抑制巨噬细胞的细胞毒性损伤，从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

进一步的，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度，从而抑制患者血清中炎症因子释放，减弱患者器官功能损伤，从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

本发明所述预防和/或治疗脓毒症药物组合物在治疗脓毒症时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到治疗脓毒症的目的。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的口服制剂，例如可以是颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂、滴丸剂等。

本发明发现在体内实验中GL-V9具有降低盲肠结扎穿刺术(CLP)模型小鼠死亡率，减弱小鼠肝、肺、肾、肠组织损伤。在体外实验中，GL-V9能够减弱细胞焦亡程度，进而恢复脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞或大肠埃希氏菌感染巨噬细胞两种途径引起的J774A.1细胞活力下降和细胞毒性损伤增加。因此，GL-V9可以应用于制备预防和/或治疗脓毒症药物中。

技术效果：相对于现有技术，本发明发现了在体外实验中，汉黄芩素衍生物GL-V9能够显著减弱巨噬细胞焦亡程度，从而恢复巨噬细细胞活力，并抑制巨噬细胞的细胞毒性损伤；在体内实验中，GL-V9具有降低盲肠结扎穿刺术(CLP)模型小鼠死亡率，抑制炎症反应发生，降低血清中炎症因子释放，进而减弱小鼠肝、肾、肺、肠组织损伤的作用。这些作用表明GL-V9可用于脓毒症的治疗，具有开发药物的前景。

附图说明

图1.GL-V9对脂质体2000(Lipo2000)转染脂多糖(LPS)转入巨噬细胞，以及大肠埃希氏菌(E.coli)感染巨噬细胞两种途径引起的巨噬细胞J774A.1细胞活力下降和细胞毒性损伤增加的影响，数值用均值±标准差表示，**P<0.01，与空白组相比有极显著差异；#P<0.05，与LPS模型组相比有显著差异，##P<0.01，与LPS模型组相比有极显著差异(Student’stwo-tailed t-test)；

图2.GL-V9对脂质体2000(Lipo2000)转染脂多糖(LPS)转入巨噬细胞，以及大肠埃希氏菌(E.coli)感染引起的巨噬细胞J774A.1细胞焦亡通路相关蛋白表达上升的影响；

图3.GL-V9对盲肠结扎穿刺术(CLP)模型小鼠生存期的影响；

图4.GL-V9对盲肠结扎穿刺术(CLP)模型小鼠肝、肾、肺、肠组织损伤的影响；

图5.GL-V9对盲肠结扎穿刺术(CLP)模型小鼠血清中炎症因子分泌的影响，**P<0.01，与空白组相比有极显著差异；#P<0.05，与LPS模型组相比有显著差异，##P<0.01，与LPS模型组相比有极显著差异(Student’s two-tailed t-test)；

图6.GL-V9结构式。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明。

实施例1 GL-V9能够减弱细胞焦亡程度，显著恢复脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞以及大肠埃希氏菌感染巨噬细胞两种途径所引起的巨噬细胞J774A.1细胞活力下降和细胞毒性损伤增加。

1.实验材料

(1)药物

GL-V9(C₂₄H₂₇O₅N，分子量：409.47)由中国药科大学提供，淡黄色粉末，纯度为98％，用DMSO配制成母液，-20℃保存。临用前稀释成所需工作浓度。

(2)细胞株

鼠源单核巨噬细胞株J774A.1购自中国科学院上海生命科学研究所生物化学与细胞生物学研究所细胞库，用含10％胎牛血清DMEM培养液培养。

(3)试剂

1)培养液：DMEM培养基购自美国GIBCO公司，取DMEM粉末10.4g溶于1000ml灭菌三蒸水中，加入3.7g NaHCO₃调pH值至7.2～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。

2)胎牛血清：美国GIBICO公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。

3)PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na2HPO4·H2O 1.56g、KH2PO4 2.0g，溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。

4)DMSO溶液：美国Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo)公司产品。

5)Escherichia coli(#11775)：美国ATCC公司。

6)LPS：美国Sigma公司，实验前用细胞培养液配成所需浓度。

7)Cell Counting Kit(CCK-8)试剂盒：上海翊圣生物科技有限公司。

8)乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司。

9)Western Blot试剂：

RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒和预染蛋白质分子量标准溶液均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

30％聚丙烯酰胺溶液、10％SDS溶液、4×Tris-HCl缓冲液(1.5M，pH8.8)、4×Tris-HCl缓冲液(1.5M，pH6.8)、10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、10×印记膜转印缓冲液、丽春红染液购自上海生工生物工程股份有限公司。

Tween-20：南京化学试剂一厂。

PBST溶液：1mL Tween-20溶于1000mL PBS溶液中，搅拌混匀，于室温保存。

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA):美国Sigma-Aldrich公司。按质量比用PBST缓冲液配置1％的蛋白溶液，现配现用。

增强型ECL化学发光检测试剂盒：上海天能科技有限公司。

2.实验仪器：

1)1300系列A2型生物安全柜：美国Thermo Fisher Scientific公司。

2)3111型水套式CO₂培养箱：美国Thermo electron公司产品。

3)DP73型生物显微镜：日本Olympus公司。

4)FA2004型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司。

5)Centrifuge 5810R型离心机：德国Eppendorf公司产品。

6)CMax Plus滤光片型光吸收酶标仪：美谷分子仪器(上海)有限公司。

7)Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统：上海天能科技有限公司。

8)Applied Biosystems 7500Fast Real-time PCR系统购自Perkin-Elmer公司。

9)VE-180B型电泳槽：上海天能科技有限公司。

10)Mini-protean Tetra System全湿型转膜槽：美国BIO-RAD公司。

3.实验方法：

(1)细胞活性检测实验

CCK-8法利用了Dojindo开发的四唑盐-WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-Methoxy PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯)存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中：不需要预配各种成分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。

在96孔板中接种J774A.1细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃，5％CO₂)，当细胞密度达到60％左右时，将细胞分为无细胞的背景空白对照组，阴性对照组，模型组和给药组。

在脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞模型中，模型组和给药组脂多糖LPS(500ng/ml)预处理6h后，脂质体2000转染脂多糖LPS(2μg/mL)，给药组同时给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，弃培养基，换新鲜培养基100μL，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9 6h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

在大肠埃希氏菌感染巨噬细胞模型中，给药组提前12h预给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，模型组与给药组大肠杆菌(感染复数＝25)感染0.5h，随后用庆大霉素(100μg/mL)处理1.5h，弃培养基，换新鲜培养基，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9 6h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

活力计算

细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

(2)LDH释放率检测实验

在96孔板中接种J774A.1细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃，5％CO₂)，当细胞密度达到60％左右时，换新鲜培养液，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的背景空白对照组(无细胞的培养液组)，阴性对照组(未经药物处理的对照细胞组)，样品最大酶活性对照组(未经药物处理的用于后续裂解组)，模型组和给药组，并做好标记。

在脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞模型中，模型组和给药组用脂多糖LPS(500ng/mL)预处理6h后，脂质体2000转染脂多糖(2μg/mL)，给药组同时给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，弃培养基，换新鲜培养基100μL，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9，培养6h，在换新鲜培养基5h时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。到达6h后，将细胞培养板用多孔板离心机；400g离心5min。分别取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入60μL LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。

在大肠埃希氏菌感染巨噬细胞模型中，给药组提前12h预给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，模型组与给药组大肠杆菌(感染复数＝25)感染0.5h，随后用庆大霉素(100μg/mL)处理1.5h，弃培养基，换新鲜培养基，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9，培养6h，在换新鲜培养基5h时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。到达6h后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入60μl LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。

细胞毒性(％)＝(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100

(3)免疫印迹实验

(1)细胞总蛋白的提取：在脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞模型中，模型组和给药组用脂多糖LPS(500ng/mL)预处理6h后，脂质体2000转染脂多糖(2μg/mL)，给药组同时给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，弃培养基，换新鲜培养基100μL，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9，培养6h；在大肠埃希氏菌感染巨噬细胞模型中，给药组提前12h预给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，模型组与给药组大肠杆菌(感染复数＝25)感染0.5h，随后用庆大霉素(100μg/mL)处理1.5h，弃培养基，换新鲜培养基，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9，培养6h，实验结束后，收集细胞于EP管中，用PBS洗涤细胞，并在4℃，2500rpm的条件下离心5min，重复2次。加入适量的蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，吹打混匀后，置于冰上裂解40min，将细胞裂解液在4℃，13000rpm的条件下离心20min，转以上清至新的EP管中。用BCA法测定蛋白含量，加入1/3蛋白裂解液体积的4×loading buffer混匀，在100℃加热10min，使蛋白变性。置于冰上冷却10min，于-20℃保存。

上清蛋白提取：收集细胞上清于EP管中，向上清中加入等体积预冷的甲醇和1/4体积的氯仿，迅速涡旋震荡后离心，13000rpm×5min，小心吸弃上清。往上述沉淀物中加入500μL冰预冷的甲醇(进一步提纯蛋白)，涡旋震荡后离心，13000rpm×5min，小心吸弃上清(彻底吸干，注意不要碰到试管底部蛋白沉淀物)。将装有沉淀物的离心管置于37℃中5min后，加入适量2.5×loading buffer，在100℃加热10min，使蛋白变性。置于冰上冷却10min，于-20℃保存。

(2)制胶和电泳：根据所需蛋白分子量(β-actin、IL-1β、caspase-11、GSDMIND)的大小，制备8-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。将蛋白样品加入凝胶中，电泳槽中加入1×电泳缓冲液，浓缩胶选用60V电压，分离胶选用150V电压，总计1.5h。

(3)转膜：电泳后取出凝胶，截取目的蛋白所在凝胶与滤纸和硝酸纤维素膜一起放在转膜架上，采用全湿转膜方法，恒定电流250mA，转膜时间根据蛋白分子量确定。

(4)丽染和封闭：转膜结束后，取出硝酸纤维素膜放入丽春红溶液中，染色2min，双蒸水漂洗2min，剪取目的条带，用PBS漂洗条带至脱色。将蛋白条带放入2％的BSA溶液中，室温条件下在水平摇床上封闭1h。

(5)抗体孵育：用PBST洗涤蛋白条带10min，重复3次。加入用PBST稀释至工作浓度的一抗，在4℃水平摇床上孵育过夜。次日，用PBST洗涤蛋白条带10min，重复3次。加入用PBST稀释至工作液浓度的二抗，室温条件下在水平摇床上孵育1h。反应结束后，用PBST洗涤蛋白条带10min，重复3次。

(6)蛋白检测：配制ECL发光检测液，均匀滴加在蛋白条带上，于Tanon全自动化学发光成像仪中检测目的条带的蛋白表达情况。

4.试验结果

GL-V9能显著恢复脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞以及大肠埃希氏菌感染巨噬细胞两种引起细胞焦亡的途径所导致的J774A.1细胞活力下降和细胞毒性损伤增加，抑制Caspase-11所介导的细胞焦亡相关蛋白的表达情况。

在脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞模型中，模型组和给药组用脂多糖LPS(500ng/mL)预处理6h后，脂质体2000转染脂多糖(2μg/mL)，给药组同时给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，弃培养基，换新鲜培养基100μL，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9，培养6h；在大肠埃希氏菌感染巨噬细胞模型中，给药组提前12h预给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，模型组与给药组大肠杆菌(感染复数＝25)感染0.5h，随后用庆大霉素(100μg/mL)处理1.5h，弃培养基，换新鲜培养基，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9，培养6h，实验结束后分别检测J774A.1细胞活力和细胞毒性损伤变化。(图1)通过WesternBlot实验检测GL-V9对Caspase-11所介导的细胞焦亡相关蛋白(IL-1β、caspase-11、GSDMIND)的表达情况变化。(图2)

实验结果显示，如图1显示，J774A.1细胞在炎症刺激下，细胞活力出现显著下降，LDH释放出现显著增加。给予GL-V9后，J774A.1细胞活力出现一定恢复，LDH释放增加出现一定抑制。图2显示，GL-V9能抑制脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞LPS以及大肠埃希氏菌感染巨噬细胞引起的J774A.1细胞焦亡通路相关蛋白(IL-1β、caspase-11、GSDMIND)表达上升。

实施例2GL-V9能够降低盲肠结扎穿刺术(CLP)模型小鼠死亡率，改善器官功能损伤以及抑制炎症因子释放。

1.实验材料

(1)药物：

GL-V9由江苏省药科大学江苏省肿瘤发生与干预重点实验室提供，纯度为99％以上，使用前用10倍体积葡萄糖和1/3体积乳酸溶于水中，配置成50mg/kg的澄清透明黄色液体，用于腹腔注射。

(2)试剂

1)小鼠IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的ELISA试剂盒：武汉爱博泰克生物科技有限公司。

(3)实验动物

来源、种系、品系：C57BL/6J小鼠，由常州卡文斯实验动物有限公司提供(实验动物生产许可证：SCXK(苏)2016-0011)。

周龄：6-8周

体重：18-22g

性别：雄性

2.实验方法：

(1)实验动物分组

(2)盲肠结扎穿刺术(CLP)模型方法

CLP模型组和药物治疗组小鼠术前禁食16小时，自由进饮，1％戊巴比妥钠按照50mg/kg剂量予以腹腔注射麻醉，妥善仰卧固定小鼠，腹部常规消毒，取下腹部正中直切口约1cm，逐层切开腹壁开腹，仔细分离暴露盲肠，注意避免损伤肠系膜血管，轻轻提出盲肠，于盲肠和升结肠交汇处结扎盲肠，18号注射针头贯穿盲肠一次，适当挤压使盲肠内容物流出，回纳盲肠，逐层关腹，背部皮下注射生理盐水(5mL/100g)以补充术中液体丧失，脓毒症模型制作完成。

阴性对照组同法麻醉，同CLP模型组和药物治疗组提出盲肠后，不予盲肠结扎穿刺，回纳盲肠，逐层关腹，背部皮下注射生理盐水(mL/100g)以补充术中液体丧失。制模成功后，分开回笼饲养，术后禁食自由进饮。

将盲肠结扎穿刺术(CLP)模型动物随机分组：CLP模型组和药物治疗组(50mg/kgGL-V9给药)，药物治疗组以腹腔注射给药，分别在CLP模型构建前12h、模型构建后3h、24h、48h、72h给药GL-V9。

(3)盲肠结扎穿刺术(CLP)脓毒症模型小鼠死亡率统计

采用盲肠结扎穿刺术(CLP)模型诱导小鼠脓毒症，将阴性对照组、CLP模型组和药物治疗组(50mg/kg GL-V9给药组)，每组17只小鼠，采用前述处理方法，手术结束后，饲养10天后统计三组小鼠的死亡情况。

(4)盲肠结扎穿刺术(CLP)小鼠脓毒症模型的指标观察

小鼠一般情况观察，实验开始后每日观察小鼠的体温变化、精神状态、毛色变化、进食情况。手术后的小鼠出现发冷，起毛，毛发竖立凌乱且精神萎靡不振；大便稀澹且进食和饮水均明显减少。

(5)盲肠结扎穿刺术(CLP)小鼠脓毒症模型病理学评价

在CLP模型构建前12h、模型构建后3h、24h、48h、72h给药GL-V9(50mg/kg)，模型构建后第四天处死小鼠，取肝、肺、肾、肠组织用10％福尔马林固定后，石蜡包埋，脱蜡后常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察结肠组织病理学变化。本实验使用的是组织的石蜡切片。样品切片先在60℃烘箱中放置1h左右，直至切片的石蜡呈水滴状。随后置入二甲苯中脱蜡10min，换新配二甲苯，再次脱蜡10min。依次将样品切片浸泡在无水乙醇5min，90％乙醇2min，70％乙醇2min，蒸馏水2min。随后将样品切片用苏木素染色液染色10min。PBS洗去多余的染色液10min，蒸馏水再清洗10min。95％乙醇5s，伊红染色液染色30s。随后将样品切片置于95％乙醇中脱水2min，换新配95％乙醇，再次脱水2min。再将样品切片置于二甲苯中浸泡5min。换新配二甲苯，再次浸泡5min，封片剂封片，显微镜下观察。

(6)ELISA检测血清中炎症因子释放水平

小鼠血清：在CLP模型构建前12h、模型构建后3h、24h、48h、72h给药GL-V9(50mg/kg)，模型构建后第四天处死小鼠，实验小鼠摘除眼球后迅速取血，使血液流入干净EP管中。采集的血液静置30min后，3000rpm离心10min将上层血清转移至新的EP管，进行后期的ELISA检测。

使用武汉爱博泰克生物科技有限公司的鼠源性IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的含量。取100μl标准品和样品加入到抗体包埋的板孔内，每次取样时更换枪头，37℃下孵育1h，移去各孔内液体，用配好的洗涤液洗涤3次，再依次加入生物素化的抗体、辣根过氧化酶标记的亲和素酶，最后加入酶反应底物、显色液和终止液，用波长450nm检测各组吸光度(OD值)。

3.试验结果

GL-V9能够降低盲肠结扎穿刺术(CLP)模型小鼠死亡率，改善器官功能损伤以及抑制炎症因子释放。

(1)盲肠结扎穿刺术(CLP)脓毒症模型小鼠死亡率统计结果

采用前述盲肠结扎穿刺术(CLP)模型诱导小鼠脓毒症，将阴性对照组、CLP模型组和50mg/kg GL-V9给药组，每组17只，以腹腔注射给药，分别在CLP模型构建前12h、模型构建后3h、24h、48h、72h给药GL-V9(50mg/kg)。饲养10天后统计三组小鼠的死亡情况，结果显示：10天后，CLP模型组存活率为17.6％，药物治疗组存活率为47.1％，可以看到给药GL-V9后，盲肠结扎穿刺术(CLP)模型小鼠死亡率大大降低。(图3，图3中CLP(sham)代表阴性对照组，CLP代表CLP模型组，CLP+GL-V9(50mg/kg)代表GL-V9给药组)。

(2)盲肠结扎穿刺术(CLP)小鼠脓毒症模型病理学评价结果及ELISA检测血清中炎症因子释放水平结果

按照实施例2(5)(6)中的操作进行动物实验，将阴性对照组、CLP模型组和50mg/kgGL-V9给药组，每组10只，以腹腔注射给药，分别在CLP模型构建前12h、模型构建后3h、24h、48h、72h给药GL-V9(50mg/kg)，模型构建后第四天对实验小鼠眼球取血，离心收集血清，ELISA检测血清中炎症因子释放变化。

取肝、肺、肾、肠组织，H&E染色分析小鼠组织病理学改变，结果显示：对小鼠的肝、肺、肾、肠组织进行病理切片显微观察结果，观察结果显示模型组多器官组织出现肿胀，且组织纹理发生改变，呈现炎症性变化，出现炎症细胞浸润，给药GL-V9(50mg/kg)后，组织损伤减弱。(图4)。

ELISA检测血清中炎症因子释放变化，结果显示，模型组炎症因子分泌显著升高，给药GL-V9后能够抑制血清中炎症因子分泌水平(图5，图5中CLP(sham)代表阴性对照组，CLP代表CLP模型组，CLP+GL-V9(50mg/kg)代表GL-V9给药组)。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述GL-V9结构式如式Ⅰ所示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述巨噬细胞焦亡为Caspase-11所介导的巨噬细胞焦亡。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Caspase-11所介导的巨噬细胞焦亡为脂质体2000转染脂多糖LPS转入巨噬细胞引起的巨噬细胞焦亡或大肠埃希氏菌感染巨噬细胞引起的巨噬细胞焦亡。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度，从而恢复巨噬细细胞活力，并抑制巨噬细胞的细胞毒性损伤，从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度，从而抑制患者血清中炎症因子释放，减弱患者器官功能损伤，从而预防和/或治疗脓毒症的药物。

7.一种预防和/或治疗脓毒症药物组合物，所述组合物是以GL-V9作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

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