CN113230264B

CN113230264B - 单糖类衍生物在制备抗炎药物方面的应用

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Publication number: CN113230264B
Application number: CN202110652149.8A
Authority: CN
Inventors: 康文艺; 刘振花; 张岩; 马常阳; 王宝光; 牛云; 唐琪
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113230264A

Abstract

单糖类衍生物在制备抗炎药物方面的应用。本发明属于医药应用技术领域，具体涉及单糖类衍生物（如，乙基‑α‑D‑呋喃阿拉伯糖ethyl‑α‑D‑furaarabinose和/或乙基‑β‑D‑呋喃果糖苷ethyl‑β‑D‑fructofuranoside）的新应用，即其在制备抗炎药物方面的应用。本发明通过试验发现了单糖类衍生物的新用途，其能抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞引起的NO过量生成及iNOS mRNA水平的过度表达、下调LPS刺激的RAW264.7细胞中p‑IκBα及p‑NF‑κB‑p65蛋白的过度表达，其通过NF‑κB信号通路来发挥抗炎功能，可被用作抗炎药物。

Description

单糖类衍生物在制备抗炎药物方面的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖ethyl-α-D-furaarabinose和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷ethyl-β-D-fructofuranoside等）在制备抗炎药物方面的新应用，化合物可能是通过抑制NF-κB信号通路来实现其抗炎作用。

背景技术

炎症是指机体或组织对损伤因子正常的防御作用。一般情况下，炎症会激活巨噬细胞分泌一系列免疫细胞因子，进而杀灭病原体、消灭损伤因子、清除和吞噬坏死细胞。因此，作为机体的防御性反应，适度的炎症反应是对机体有利的。然而，过度的炎症反应会影响机体正常的代谢过程，引起感染性休克、导致多器官功能障碍，甚至危及生命。正常状态下，细胞或机体内的促炎因子与抗炎因子之间维持着动态平衡。而LPS刺激巨噬细胞活化后，这种平衡被打破，一方面，引起促炎因子长期高度表达导致组织或器官损伤，另一方面，促炎因子大量释放的同时，短期内机体会合成和分泌一定的抗炎因子进行防御。其中，促炎因子主要包括NO、iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、ROS等，这些参与调控机体炎症发生发展过程的炎症介质的含量，可以间接地反映出炎症反应的程度。抗炎因子主要包括IL-4、IL-10等，其大量分泌可以抑制炎症的进一步发展。

NF-κB转录因子控制凋亡、细胞衰老、免疫和炎症相关基因的活性。NF-κB作为二聚体存在于细胞质中，并被NF-κB抑制蛋白α (IκB-α)分离。在刺激下，IκB-α蛋白经过一系列磷酸化、泛素化和降解，从而释放NF-κB二聚体激活其靶基因的转录。

单糖类衍生物如乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷均为无色油状液体。目前，较多的是对该类衍生物的提取方法的研究，而针对该类衍生物功效应用的研究较少。检索文献发现，尚未见对单糖类衍生物如乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷等抗炎活性的研究。本发明以RAW264.7 巨噬细胞为研究对象，采用MTT、ELISA、qRT-PCR、Western blot等方法研究了单糖类衍生物如乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对LPS刺激后RAW264.7细胞的抗炎活性，并探讨其作用机制，以期对抗炎类新药具有一定的开发价值。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖ethyl-α-D-furaarabinose和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷ethyl-β-D-fructofuranoside等）在制备抗炎药物方面的新应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种单糖类衍生物在制备抗炎药物方面的新应用，其中，所述单糖类衍生物可以为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷等。

所述乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（ethyl-α-D-furaarabinose）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（ethyl-β-D-fructofuranoside），结构式分别如下式1、2所示。

。

性状：无色油状液体。乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖、乙基-β-D-呋喃果糖苷可以直接购买普通市售产品，或者采用现有方法制备获得。

上述的应用，进一步的，单糖类衍生物可抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞分泌NO，抑制iNOS和COX-2 mRNA表达水平，以及抑制细胞核内p65和IκBα蛋白磷酸化水平。

上述的应用，进一步的，单糖类衍生物通过抑制NF-κB信号通路来调节抗炎功能。

本发明还提供了一种含上述单糖类衍生物的复方制剂，其由所述单糖类衍生物与本领域常规辅料复配制成复方制剂，具体的，可以是乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷与本领域常规辅料复配制成具有抗炎作用的复方制剂。

进一步的，上述复方制剂的剂型可以为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂或注射剂等。

本发明进行了如下单糖类衍生物的抗炎应用的验证实验：

1）对RAW264.7细胞毒活性检测；

2）采用一氧化氮试剂盒检测LPS刺激后RAW264.7细胞内NO含量；

3）实时定量PCR法检测LPS刺激后RAW264.7细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达水平；

4）Western blot法分析LPS刺激后RAW264.7细胞核内p65和IκBα蛋白磷酸化水平。

本发明经常规实验验证后，发现：单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷等）可以抑制LPS刺激后RAW264.7细胞分泌大量的NO，并且抑制了NF-κB信号通路的过度激活，说明本发明所述单糖类衍生物具有抗炎作用，可用于抗炎剂或抗炎药物的制备，对抗炎类新药具有一定的开发价值。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过大量研究和试验发现了单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷等）的一种新用途。本发明研究结果表明：对于LPS刺激后RAW264.7细胞，单糖类衍生物可抑制细胞分泌NO，抑制iNOS和COX-2 mRNA表达水平，以及抑制细胞核内p65和IκBα蛋白磷酸化水平。说明本发明单糖类衍生物能够抑制NF-κB信号通路的过度激活，起到抗炎的功效。因此，本发明单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷等）可被用于制作抗炎药物或抗炎剂，对抗炎类新药物具有一定的开发价值。

附图说明

图1为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对RAW264.7细胞的细胞活力及吞噬能力的影响；注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；

图2为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响；注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；与LPS组比较，^# P<0.05，^## P<0.01，^### P < 0.001；

图3为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2 mRNA表达的影响；注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；与LPS组比较，^# P<0.05，^## P<0.01，^### P < 0.001；

图4为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对RAW264.7细胞内IκBα和p65蛋白表达的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；与LPS组比较，^# P<0.05，^## P<0.01，^### P < 0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用实施例：单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷等）对RAW264.7细胞的抗炎作用及机制研究

1.实验细胞

RAW264.7 巨噬细胞，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

仪器与试剂

分析天平 (赛多利斯科学仪器有限公司)；

全波长酶标仪 (Thermo Fisher，1510型)；

二氧化碳培养箱 (Thermo scientific，3111型)；

离心机 (上海手术器械厂，800型）；

多色荧光、化学发光和可见光成像仪 (ProteinsiMple FluorcheM Q)；

微型台式冷冻离心机 (D-37520 TherMo)；

电泳仪 (EPS600 Tanon)；

转印槽 (Mini-PROTEAN Tetra SysteM, BIO-RAD)；

梯度PCR仪 (MyCycler^TMThermal Cycler);

实时荧光定量PCR(Thermo Fisher)；

倒置显微镜 (Nikon ECLiPES TS100)；

96孔、24孔、6孔细胞培养板（Corning）；

改良Eagle培养基（DMEM，Solarbio）；

青霉素链霉素混合液（Solarbio）；

澳洲胎牛血清（FBS，Gibco）；

脂多糖（LPS，Sigma）；

PBS缓冲液（博士德）；

噻唑蓝（MTT，华蓝化学）；

二甲基亚砜（DMSO，Sigma）；

RIPA细胞裂解液（弱）（碧云天生物科技）；

一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）；

Trizol Reagent（康为世纪生物科技有限公司）；

PCR引物（Thermo Fisher）；

PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa）；

SYBR^® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（含Rox）（艾科瑞生物工程有限公司）；

BCA蛋白质定量试剂盒（Solarbio）；

蛋白酶磷酸酶抑制剂（Solarbio）；

PMSF蛋白酶抑制剂（Solarbio）

5×蛋白上样缓冲液（Solarbio）；

脱脂奶粉（Amresco）；

PVDF膜（Solarbio）；

IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、β-actin一抗（Cell signaling technology）；

辣根过氧化物酶标记的二抗（Cell signaling technology）；

ECL发光液（Solarbio）。

实验方法

（1）细胞培养与传代

在无菌环境下配制含10% FBS和1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基（下述简称“DMEM完全培养基”）。给予RAW264.7细胞一定量的DMEM完全培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育，待细胞密度达到70%～80%时进行细胞传代。用吹打管均匀吹散瓶壁上的细胞，然后吸取适量转移到培养瓶中。待细胞生长处于对数生长期时进行各项细胞实验，LPS（1 μg/mL）用作炎症模型。

（2）MTT 法测定细胞活力

取细胞，混匀后计数，以密度为1×10⁴个/孔接种到96孔板中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中，孵育24 h，而后弃掉上清，设置空白组和实验组。实验组每孔分别给予100 μL 不同浓度的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（400、200、100、50、25、12.5、6.25 μM）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（400、200、100、50、25、12.5、6.25 μM），空白组给予等量的DMEM完全培养基，每组设置6个复孔，培养箱中孵育 24 h。每孔避光加入10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，继续孵育4 h，弃掉上清，每孔加入 100 μL 二甲基亚砜，37℃避光反应10 min，并在490 nm处测定吸光度值。根据公式计算细胞存活率：细胞存活率%=（加药组细胞OD值-空白OD值/正常组的OD值-空白组OD值）×100%。

（3）一氧化氮试剂盒检测RAW264.7细胞释放的NO含量

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于24孔板中（1×10⁵个/孔），在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24小时，吸弃上清，空白组给予等量的DMEM完全培养基，LPS组给予1 µg/mLLPS，实验组分别给予500 μL不同浓度乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（200、100、50 μM）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（200、100、50 μM），1 h后给予终浓度为1 µg/mL LPS，每组设4个复孔。在37℃、5%CO₂的培养箱内孵育24 h后，收集培养液上清，按照一氧化氮试剂盒说明检测NO含量。

（4）实时荧光定量PCR法检测iNOS和COX-2的 mRNA表达

将RAW264.7细胞接种于6孔板中（8×10⁶个/孔），在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24h后弃去上清，同上设置空白组、LPS组和实验组，24 h后收集细胞，PBS清洗三次。用TrizolReagent试剂提取总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser 试剂盒，根据说明书将RNA逆转录成cDNA。用SYBR^® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒将反转录得到的cDNA进行qPCR 扩增反应，反应条件为：95℃预变性3 min；95℃ 5s，60℃ 30s 并读取荧光值，40次循环。反应结束，得出cycle threshold（Ct值），双⊿⊿法计算出基因的相对表达量。GAPDH为内参。GAPDH、COX-2、iNOS的引物序列如下表1所示。

表1 引物序列

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（5）Western blot法检测NF-κB信号通路中相关蛋白的表达

将 RAW264.7细胞接种于6孔板中（8×10⁶个/孔），37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24 h后弃去上清，同上设置空白组、LPS组和实验组，24 h后收集细胞，PBS清洗三次。加入细胞裂解液（RIPA 细胞裂解液：蛋白酶磷酸酶抑制剂：PMSF蛋白酶抑制剂=100:1:1）在冰上裂解10min。裂解产物于4℃离心机以12000 r/min离心10 min。BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度，定量后的蛋白质样品加入一定比例的5× 蛋白上样缓冲液使缓冲液稀释成1×，在100℃下高温变性，-20℃保存。蛋白质样品与10% SDS-聚丙烯凝胶电泳浓缩分离，分离后，蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜)，用5%的脱脂奶粉封闭2 h。用TBST（TBS:吐温20=200:1）按1000:1 比例稀释一抗（IκBα、p-IκBα、p65、p-p65及β-actin），将PVDF 膜用一抗溶液杂交孵育，4℃冰箱过夜。TBST洗膜5次，每次5 min。用TBST按5000:1 比例稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，进行二抗杂交，室温孵育2 h，用TBST洗膜4次，每次5 min。最后用ECL发光液显现 IκBα、p-IκBα、p65、p-p65及β-actin蛋白。

数据处理

结果采用均值±SD值表示，数据统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法（One-Way ANOVA）比较其显著性差异。

试验结果

（1）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞活力的影响

不同浓度的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7巨噬细胞活力的影响结果如图1所示。从图1中可以看出：与空白组相比（图中为Black，下同），在浓度为6.25～200 μM的浓度范围内，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对细胞活力均无显著性影响（P>0.05）。综合考虑，选择50、100、200 μM三个浓度作为后续的实验浓度。

（2）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响

乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响如图2所示。从图2中可以看出：与空白组相比，LPS刺激后RAW264.7细胞分泌NO的含量明显增加，而不同浓度（200μM、100μM、50μM）的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷实验组在LPS刺激后显著抑制了NO的分泌（P<0.05），可见，本发明单糖类衍生物均可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌。

（3）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2 mRNA表达的影响

乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX-2 mRNA表达的影响如图3所示。从图3中可以看出：与空白组相比，LPS刺激后可显著促进RAW264.7细胞iNOS和COX-2 mRNA的表达，而不同浓度（200μM、100μM、50μM）的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷实验组在LPS刺激后显著抑制了iNOS和COX-2mRNA的表达（P<0.05）。说明，本发明单糖类衍生物通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达而抑制NO的分泌。

（4）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对LPS诱导的RAW264.7细胞内NF-κB信号通路的影响

图4给出了乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对LPS诱导的RAW264.7细胞内p65和IκBα蛋白表达的影响。如图4所示，与空白组相比，LPS可刺激RAW264.7细胞中IκBα和p65蛋白磷酸化明显上调（P<0.05），乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷可以抑制LPS诱导后RAW264.7细胞内p65和IκBα蛋白表达。可见，本发明单糖类衍生物的抗炎作用可能与抑制RAW264.7细胞内NF-κB信号通路有关。

综上：本发明经试验证明了乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞具有抗炎作用。乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷能抑制LPS刺激的RAW264.7细胞的NO及iNOS mRNA表达；此外证明了其能抑制NF-κB信号通路关键蛋白的表达。表明乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷的抗炎作用是通过抑制NF-κB信号通路来实现的。

Claims

1.单糖类衍生物在制备抗炎药物方面的应用，其特征在于，所述单糖类衍生物为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖、或乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷的混合物。

2.根据权利要求1所述单糖类衍生物在制备抗炎药物方面的应用，其特征在于，单糖类衍生物可抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞分泌NO，抑制iNOS和COX-2 mRNA表达水平，以及抑制细胞核内p65和IκBα蛋白磷酸化水平。

3.根据权利要求1所述单糖类衍生物在制备抗炎药物方面的应用，其特征在于，单糖类衍生物通过抑制NF-κB信号通路来调节抗炎功能。