CN113262234B

CN113262234B - 单糖类衍生物在制备免疫调节药物方面的应用

Info

Publication number: CN113262234B
Application number: CN202110652141.1A
Authority: CN
Inventors: 康文艺; 刘振花; 张岩; 牛云; 王宝光; 王森业
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113262234A

Abstract

本发明属于医药应用技术领域，具体涉及单糖类衍生物（如，乙基‑α‑D‑呋喃阿拉伯糖ethyl‑α‑D‑furaarabinose和/或乙基‑β‑D‑呋喃果糖苷ethyl‑β‑D‑fructofuranoside）在制备免疫调节药物方面的应用。本发明通过试验发现了单糖类衍生物能够提高RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力、提高细胞中NO含量、促进细胞因子TNF‑α和IL‑6的分泌，上调iNOS、COX‑2及细胞因子TNF‑α和IL‑6 mRNA表达水平，以及上调细胞核内p65和IκBα蛋白磷酸化水平，其通过NF‑κB信号通路来调节免疫功能，可被用作免疫调节药物。

Description

单糖类衍生物在制备免疫调节药物方面的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖ethyl-α-D-furaarabinose和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷ethyl-β-D-fructofuranoside等）在制备免疫调节药物方面的新应用，化合物可能是通过激活NF-κB信号通路来实现其免疫调节作用。

背景技术

免疫反应作为一种重要的生理过程，可以识别和破坏外来有害物质或生物以保护疾病，其中巨噬细胞在吞噬、细胞毒和细胞内杀伤活性等方面发挥着重要的作用。巨噬细胞一旦被激活，可以直接通过吞噬作用抵抗病原体，也可以通过产生相关因子，包括一氧化氮（NO）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和活性氧（ROS）来间接抵抗病原体。其作用机制与模式识别受体（PRRs）介导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）有关。

单糖类衍生物如乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷均为无色油状液体。目前，较多的是对该类衍生物的提取方法的研究，而针对该类衍生物功效应用的研究较少。检索文献发现，尚未见对单糖类衍生物如乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷等免疫活性的研究。本发明以RAW264.7 巨噬细胞为研究对象，采用MTT、ELISA、qRT-PCR、Western blot等方法研究单糖类衍生物如乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞的免疫调节活性，并探讨其作用机制，以期对免疫调节药物的研发提供参考。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖ethyl-α-D-furaarabinose和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷ethyl-β-D-fructofuranoside等）在制备免疫调节药物方面的新应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种单糖类衍生物在制备免疫调节药物方面的新应用，其中，所述单糖类衍生物可以为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷等。

所述乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（ethyl-α-D-furaarabinose）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（ethyl-β-D-fructofuranoside），结构式分别如下式1、2所示。

。

性状：无色油状液体。乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖、乙基-β-D-呋喃果糖苷可以直接购买普通市售产品，或者采用现有方法制备获得。

上述的应用，进一步的，单糖类衍生物可提高巨噬细胞的吞噬能力、提高细胞中NO含量及细胞因子TNF-α和IL-6分泌，上调iNOS、COX-2及细胞因子TNF-α和IL-6 mRNA表达水平，以及上调细胞核内p65和IκBα蛋白磷酸化水平。

上述的应用，进一步的，单糖类衍生物通过NF-κB信号通路来调节免疫功能。

本发明还提供了一种含上述单糖类衍生物、具有调节免疫功效的复方制剂，其由所述单糖类衍生物与本领域常规辅料复配制成复方制剂。具体的，可以是乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷等与本领域常规辅料复配制成具有调节免疫功效的复方制剂。

进一步优选的，上述复方制剂的剂型可以为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂或注射剂等。

本发明进行了如下单糖类衍生物的免疫调节应用的验证实验：

1）RAW264.7细胞毒活性检测；

2）采用一氧化氮试剂盒检测RAW264.7细胞内NO含量；

3）采用酶联免疫法（ELISA）检测TNF-α和IL-6细胞因子含量；

4）实时定量PCR法检测iNOS、COX-2及TNF-α和IL-6 mRNA表达水平；

5）Western blot法分析细胞核内p65和IκBα蛋白磷酸化水平。

本发明经常规实验验证后，发现：单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷等）可以刺激细胞分泌大量的促炎介质，并且激活了NF-κB信号通路，说明单糖类衍生物具有免疫调节作用，可用于免疫调节剂或药物的制备，对免疫类新药具有一定的开发价值。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过大量研究和试验发现了单糖类衍生物（如，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖ethyl-α-D-furaarabinose和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷ethyl-β-D-fructofuranoside等）的一种新用途。本发明研究结果表明：单糖类衍生物可提高巨噬细胞的吞噬能力、提高细胞中NO含量及细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-6，上调iNOS、COX-2及细胞因子TNF-α和IL-6mRNA表达水平，以及上调细胞核内p65和IκBα蛋白磷酸化水平。说明本发明单糖类衍生物能够激活NF-κB信号通路，促进细胞大量分泌促炎因子，吞噬和消灭外来病原菌，激活细胞的免疫功能，起到免疫调节的功效。因此，本发明单糖类衍生物可被用于制作免疫增强剂，对免疫类新药具有一定的开发价值。

附图说明

图1为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对RAW264.7细胞的细胞活力的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；

图2为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对RAW264.7细胞的吞噬能力的影响；注：不同的字母代表相互之间有显著性差异；

图3为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对RAW264.7细胞分泌NO的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；

图4为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对RAW264.7细胞iNOS 和COX-2 mRNA表达的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P <0.001；

图5为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6 及mRNA表达水平的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P <0.001；

图6为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（1）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（2）对RAW264.7细胞内p65、IκBα蛋白表达的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用实施例：单糖类衍生物对RAW264.7细胞的免疫调节及机制研究

1.实验细胞

RAW264.7 巨噬细胞，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

仪器与试剂

分析天平 (赛多利斯科学仪器有限公司)；

全波长酶标仪 (Thermo Fisher，1510型)；

二氧化碳培养箱 (Thermo scientific，3111型)；

离心机 (上海手术器械厂，800型）；

多色荧光、化学发光和可见光成像仪 (ProteinsiMple FluorcheM Q)；

微型台式冷冻离心机 (D-37520 TherMo)；

电泳仪 (EPS600 Tanon)；

转印槽 (Mini-PROTEAN Tetra SysteM, BIO-RAD)；

梯度PCR仪 (MyCycler^TMThermal Cycler);

实时荧光定量PCR(Thermo Fisher)；

倒置显微镜 (Nikon ECLiPES TS100)；

96孔、24孔、6孔细胞培养板（Corning）；

改良Eagle培养基（DMEM，Solarbio）；

青霉素链霉素混合液（Solarbio）；

澳洲胎牛血清（FBS，Gibco）；

脂多糖（LPS，Sigma）；

PBS缓冲液（博士德）；

噻唑蓝（MTT，华蓝化学）；

二甲基亚砜（DMSO，Sigma）；

中性红染色液（碧云天生物科技 C0125）

无水乙醇（华蓝化学）

冰乙酸（华蓝化学）

RIPA细胞裂解液（弱）（碧云天生物科技）；

一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）；

酶联免疫试剂盒（ELISA，北京四正柏生物科技公司）；

Trizol Reagent（康为世纪生物科技有限公司）；

PCR引物（Thermo Fisher）；

PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa）；

SYBR^® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（含Rox）（艾科瑞生物工程有限公司）；

BCA蛋白质定量试剂盒（Solarbio）；

核蛋白提取试剂盒（Solarbio）；

蛋白酶磷酸酶抑制剂（Solarbio）；

5×蛋白上样缓冲液（Solarbio）；

PMSF蛋白酶抑制剂（Solarbio）

脱脂奶粉（Amresco）；

PVDF膜（Solarbio）；

IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、β-actin一抗（Cell signaling technology）；

辣根过氧化物酶标记的二抗（Cell signaling technology）；

ECL发光液（Solarbio）。

实验方法

（1）细胞培养与传代

在无菌环境下配制含10% FBS和1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基（下述简称“DMEM完全培养基”）。给予RAW264.7细胞一定量的DMEM完全培养基，置于 37℃、5% CO₂的培养箱中孵育，待细胞密度达到70%～80%时进行细胞传代。用吹打管均匀吹散瓶壁上的细胞，然后吸取适量转移到培养瓶中。待细胞生长处于对数生长期时进行各项细胞实验，LPS（1 μg/mL）用作阳性对照。

（2）MTT 法测定细胞活力

取细胞，混匀后计数，以密度为1×10⁴个/孔接种到96孔板中，置于37℃、5% CO₂的培养箱中，孵育24 h，而后弃掉上清，设置空白组和实验组。实验组每孔分别给予100 μL 不同浓度的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（400、200、100、50、25、12.5、6.25 μM）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（400、200、100、50、25、12.5、6.25 μM），空白组给予等量的DMEM完全培养基，每组设置6个复孔，培养箱中孵育 24 h。每孔避光加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续孵育4 h，弃掉上清，每孔加入 100 μL 二甲基亚砜，37℃避光反应10 min，并在490 nm处测定吸光度值。根据公式计算细胞存活率：细胞存活率％=（加药组细胞OD值-空白OD/正常组的OD值-空白组OD值）×100％。

（3）中性红法检测RAW264.7细胞的吞噬能力

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中（2×10⁵/mL），在37℃、5% CO₂的培养箱中孵育24 h，吸弃上清，设置空白组、实验组和阳性对照组，实验组分别给予500 μL 不同浓度乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（200、100、50、25、12.5、6.25 μM）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（200、100、50、25、12.5、6.25 μM），空白组给予等量的DMEM完全培养基，阳性对照组给予1 µg/mL LPS，每组设6个复孔。培养箱中孵育24 h，吸弃上清，用PBS缓冲液清洗两次，每孔加入浓度为0.075 %的中性红染色液100 μL，继续孵育4h后，弃去上清，用PBS缓冲液轻洗两次，甩干，每孔加入细胞裂解液（V_冰乙酸：V_无水乙醇=1:1）100 µL，并在540 nm处测定吸光度值。根据公式计算细胞吞噬指数：细胞指数%=（加药组细胞OD值-空白OD/正常组的OD值-空白组OD值）×100%。

（4）一氧化氮试剂盒检测RAW264.7细胞释放的NO含量

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于24孔板中（2×10⁵/mL），在37℃、5% CO₂的培养箱中孵育24小时，吸弃上清，设置空白组、实验组和阳性对照组。空白组给予等量的DMEM完全培养基，实验组分别给予500 μL不同浓度乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（200、100、50 μM）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（200、100、50 μM），阳性对照组给予1 µg/mL LPS，每组设4个复孔。培养箱内孵育24 h后，收集培养液上清，按照一氧化氮试剂盒说明检测NO含量。

（5）ELISA法检测RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6的含量

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于24孔板中（2×10⁵/mL），在37℃、5% CO₂的培养箱中孵育24小时，吸弃上清，设置空白组、实验组和阳性对照组。空白组给予等量的DMEM完全培养基，实验组分别给予500 μL不同浓度的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖（200、100、50 μM）和乙基-β-D-呋喃果糖苷（200、100、50 μM），阳性对照组给予1 µg/mL LPS，每组设4个复孔。37℃、5% CO₂培养箱内继续孵育24h后，离心收集细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α和IL-6的含量。

（6）实时荧光定量PCR法检测iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA表达

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中（8×10⁵/孔），在37℃、5% CO₂的培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，设置空白组、实验组和阳性对照组。空白对照组给予DMEM完全培养基，实验组加入2 mL浓度分别为200、100、50 μM的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖或乙基-β-D-呋喃果糖苷溶液，阳性对照组给予1 µg/mL LPS。37℃、5% CO₂的培养箱内继续孵育24h后，用移液枪吸弃培养基上清，用PBS溶液轻洗2次RAW264.7细胞。使用TrizolReagent试剂提取总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser 试剂盒，根据说明书将RNA逆转录成cDNA。用SYBR^® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒将反转录得到的cDNA进行qPCR 扩增反应，反应条件为：95℃预变性3 min；95℃ 5s，60℃ 30s 并读取荧光值，40次循环。反应结束，得出cycle threshold（Ct值），双⊿⊿法计算出基因的相对表达量。GAPDH为内参。GAPDH、iNOS、TNF-α 和IL-6的引物序列如下表1所示。

表1 引物序列

。

（7）Western blot法检测NF-κB信号通路中相关蛋白的表达

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中（8×10⁵/孔），37℃、5% CO₂的培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，设置空白组、实验组和阳性对照组。空白对照组给予DMEM培养基，实验组加入2 mL浓度分别为200、100、50 μM 乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖或乙基-β-D-呋喃果糖苷溶液，阳性对照组给予1 µg/mL的LPS。37℃，5%CO₂培养箱内继续孵育24h后，从培养箱中拿出，弃去培养基上清，用PBS溶液轻洗2次，收集至1.5 mL EP管中，-20℃保存。

以RIPA 细胞裂解液：蛋白酶磷酸酶抑制剂：PMSF蛋白酶抑制剂=100:1:1的比例配制浆蛋白裂解液，依据EP管中细胞量加入适量浆蛋白裂解液，充分涡旋，冰上裂解10 min，涡旋10 s，4℃ 12000 r/min 离心10分钟，取上清于干净的EP管中。根据核蛋白提取试剂盒说明书配制核蛋白裂解液，裂解管底沉淀后，收集上清即为核蛋白，-20℃保存。BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度，定量后的蛋白质样品加入一定比例的5×蛋白上样缓冲液使缓冲液稀释成1×，在100℃下高温变性，-20℃保存。蛋白质样品与10% SDS-聚丙烯凝胶电泳浓缩分离，分离后，蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜)，用5%的脱脂奶粉封闭2 h。用TBST（TBS:吐温20=200:1）按1000:1 比例稀释一抗（IκBα、p-IκBα、p65、p-p65及β-actin），将PVDF 膜用一抗溶液杂交孵育，4℃冰箱过夜。TBST洗膜5次，每次5 min。用TBST按5000:1比例稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，进行二抗杂交，室温孵育2 h，用TBST洗膜4次，每次5min。最后用ECL发光液显现 IκBα、p-IκBα、p65、p-p65及β-actin蛋白。

数据分析

以上实验均进行多次重复，实验结果进行统计学分析使用SPSS 19.0软件，数据表示为平均值±标准差，并使用t检验或单向ANOVA分析，P<0.05时有统计学意义。

数据处理

结果采用均值±SD值表示，数据统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法（One-Way ANOVA）比较其显著性差异。

试验结果

（1）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞活力及吞噬能力的影响

不同浓度（400、200、100、50、25、12.5、6.25 μM）的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7巨噬细胞活力的影响结果如图1所示。从图1中可以看出：与空白组相比，在浓度为6.25～200 μM的浓度范围内，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对细胞活力没有显著性影响（P>0.05）。综合考虑，选择50、100、200 μM三个浓度作为后续的实验浓度。

不同浓度（200、100、50、25、12.5、6.25 μM）的乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7巨噬细胞吞噬能力影响结果如图2所示。从图2中可以看出：与空白对照组（图中为Black，下同）相比，LPS与各浓度乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷均能够提高RAW264.7细胞吞噬中性红的能力，具有统计学差异 (P<0.05)。这表明乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷能够显著增强 RAW264.7巨噬细胞的吞噬活性。

（2）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞分泌NO的影响

乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞分泌NO的影响如图3。从图3中可以看出：与空白组相比，阳性对照组LPS可显著提高RAW264.7细胞内NO含量，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷的高中剂量组（200μM、100μM）均能够提高RAW264.7细胞释放NO的能力 (P<0.05)。由此可知，两个化合物可刺激RAW264.7细胞释放NO。

（3）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞iNOS和COX-2蛋白及其 mRNA的影响

乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞iNOS 和COX-2蛋白及其 mRNA表达的影响如图4所示。从图4中可以看出，与空白组相比，阳性对照组LPS显著提高了iNOS和COX-2 mRNA的表达水平。乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷高剂量组能显著上调正常培养RAW264.7细胞iNOS和COX-2 mRNA转录水平。与空白组相比，正常条件下，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷显著促进RAW 264.7细胞中iNOS和COX-2蛋白的表达。说明，B12和C7在基因和蛋白水平上显著促进iNOS和COX-2的表达。

（4）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6及mRNA表达水平的影响

乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6及mRNA表达水平的影响如图5。从图5中可以看出：与空白组相比，阳性对照组LPS可显著提高RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6及mRNA表达水平，乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷显著提高了TNF-α和IL-6的水平及mRNA表达水平。可见，本发明单糖类衍生物可以上调RAW264.7巨噬细胞中IL-6和TNF-α的mRNA水平，促进IL-6和TNF-α的分泌。

（5）乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞内NF-κB信号通路的影响

图6给出了乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7细胞内p65和IκBα蛋白表达的影响。如图6所示，与空白对照组相比，阳性对照LPS诱导后RAW264.7细胞中p65和IκBα蛋白磷酸化水平显著升高 (P<0.001)。乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷能显著上调RAW264.7细胞核内磷酸化p65和IκBα表达水平，促进NF-κB由胞浆转至细胞核。以上结果表明：本发明单糖类衍生物的免疫调节反应可能与激活RAW264.7细胞内NF-κB信号通路有关。

综上：本发明经试验证明了单糖类衍生物乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用。说明乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷能增强RAW264.7细胞的吞噬能力及炎性细胞因子、NO及其mRNA表达；此外证明了其能增强NF-κB信号通路关键蛋白的表达，表明乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和乙基-β-D-呋喃果糖苷的免疫调节能力是通过激活NF-κB信号通路来实现的。

Claims

1.单糖类衍生物在制备免疫调节药物方面的应用，其特征在于，所述单糖类衍生物为乙基-α-D-呋喃阿拉伯糖和/或乙基-β-D-呋喃果糖苷。