CN115569142B - 麦角甾醇在制备抗弧菌感染性疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了麦角甾醇在制备抗弧菌药物中的应用，本发明通过实验证实，麦角甾醇能够对副溶血弧菌的细胞膜产生明显破坏作用，有效地抑制副溶血弧菌的生长，具有显著抗弧菌效果，在抗副溶血弧菌药物的开发应用上具有潜力，在抗菌药物的研究方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物化合物技术领域，具体涉及麦角甾醇在制备预防和/或治疗弧菌感染的药物中的应用。
背景技术
弧菌是革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛存在于靠近河流以及海水的地区。由病原弧菌感染所引起的鱼、虾、贝类等的弧菌病是水产养殖动物最主要的细菌性疾病。目前，已发现有27种弧菌可引起弧菌病，其中以副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)最为常见。副溶血性弧菌给人和各种生物带来了潜在的危害。进食含有副溶血弧菌的食物可致食物中毒，引起急性病、腹痛、呕吐、腹泻等。因此，有效防治副溶血弧菌病是水产动物健康养殖的关键一环，寻找防治副溶血弧菌的药物显得尤为重要。
天然产物是药物以及前体药物的重要来源之一。麦角甾醇是从真菌类酵母与麦角菌中发现的一种植物固醇，是微生物细胞膜的重要组成部分，对确保细胞膜的完整性、膜结合酶的活性、膜的流动性、细胞活力以及细胞物质运输等起着重要作用。近年来，新型疾病和耐药性致病菌的出现，使已有抗生素药物的临床疗效不断减弱，开发作用机制新颖或活性显著的药物显得愈发重要。
发明内容
针对上述背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种麦角甾醇在制备抗弧菌感染性疾病药物中的应用。本发明意外发现并通过大量实验研究证实，麦角甾醇可以对副溶血弧菌的细胞膜产生明显破坏作用，有效地抑制副溶血弧菌的生长，其在抗副溶血弧菌药物的开发上具有潜力和应用前景。
本发明第一方面，提供麦角甾醇在制备预防和/或治疗弧菌感染的产品中的应用。
在其中一些实施方案中，所述弧菌为副溶血性弧菌。
在其中一些实施方案中，所述产品为药品或食品。
在其中一些实施方案中，所述药品还包括药学上可接受的赋性剂。
在其中一些实施方案中，所述药品为人用药或动物用药。
在其中一些实施方案中，所述产品中还包括其他抗弧菌药物。
本发明第二方面，提供一种含麦角甾醇的组合物在制备预防和/或治疗弧菌感染的药物中的应用。
在其中一些实施方案中，所述含麦角甾醇的组合物中，麦角甾醇可以为其任一形式的化合物。
在其中一些实施方案中，所述含麦角甾醇的组合物为晶体、粉体或液体中的任一种形式。
在其中一些实施方案中，所述弧菌为副溶血性弧菌。
在其中一些实施方案中，所述含麦角甾醇的组合物为药物组合物或食品组合物。
第三方面，本发明提供麦角甾醇在制备在水产养殖中的应用，所述应用为提高水产品防御副溶血弧菌的免疫能力；
优选地，所述水产品为鱼、虾和贝。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种麦角甾醇的新用途，通过实验证明了麦角甾醇对副溶血弧菌具有很强的抑制生长作用。通过细胞荧光染色和透射电子显微镜实验探索了麦角甾醇对副溶血弧菌的抑菌机理，发现麦角甾醇使副溶血弧菌的细胞膜结构受损，导致其渗透压失衡而吸入水份，形态发生改变，破坏其细胞膜结构，从而强力杀灭弧菌。本发明提供的麦角甾醇在制备抗菌药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例2麦角甾醇对副溶血弧菌细胞膜完整性破坏的染色图:从上到下依次为，A：空白对照组，B:低剂量组，C：高剂量组；从左到右，依次为活细胞、死细胞、融合细胞；
图2为本发明实施例2麦角甾醇处理副溶血弧菌的透射电镜图：A为空白对照组；B为低剂量组；C为高剂量组。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
实施例1麦角甾醇最小抑菌浓度(MIC值)检测
本实施例采用微量肉汤法来检测麦角甾醇的最小抑菌浓度。
1.实验内容
分组及给药：本实施例设置阴性对照组(DMSO/PBS混合液)、阳性对照组(氯霉素，50μg/mL)和给药组(麦角甾醇，200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL)。
实验方法：
(1)将麦角甾醇用DMSO溶解，然后加入0.01mol的PBS缓冲液配制浓度为4mg/mL的母液，贮藏于-20℃的冰箱中。
(2)将副溶血弧菌在LB培养基中进行摇床培养(12h，35℃)，得到指示菌菌液，取部分菌液，将其稀释至0.01OD600/mL,备用。
(3)取无菌96孔板，吸取95μL步骤(2)中制备的副溶血弧菌菌液加入各孔中，其中阳性对照组加入5μL氯霉素(50μg/mL)，给药组分别加入5μL倍半稀释后的麦角甾醇化合物，使之终浓度分别为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL，阴性对照组加入等量DMSO/PBS混合液。
(4)将接种好的96孔板放置在35℃培养箱中静置培养24h，观察菌液生长情况。
2.实验结果
能明显抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度即为麦角甾醇药物的最小抑菌浓度。通过肉眼观察96孔板中菌体生长情况，发现麦角甾醇的最小抑菌浓度为12.5μg/mL。
实施例2麦角甾醇对副溶血弧菌的抑制机理探究
1.实验内容
分组及给药：本实施例设置空白对照组(二甲基亚砜，2μL)、低剂量组(麦角甾醇8μg/mL，2μL)、高剂量组(麦角甾醇24μg/mL，2μL)。
实验方法：
1)将副溶血弧菌在液体LB培养基(胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl10.0g/L，pH 8.6)中进行振荡培养，35℃、150rpm培养12h，得到指示菌菌液。
2)使用麦氏比浊法对指示菌菌液浓度进行测定，将指示菌菌液浓度稀释至1OD600/mL，取1mL该菌液至1.5mL离心管中，备用。
3)在空白对照组中加入2μL二甲基亚砜、低剂量试验组中加入2μL的麦角甾醇使之终浓度为8μg/mL、高剂量试验组中加入2μL麦角甾醇使之终浓度为24μg/mL。各组菌液置于35℃培养箱中静置培养12h。
4)将步骤3)中各组菌液在4000rpm离心2min，吸去上清液，沉淀用0.01mol PBS缓冲液洗涤三次，然后加入1mL 0.01mol的PBS缓冲液重悬，加入3μL SYTO-9/PI染料，室温染色15min，离心去除上清，菌体用0.01mol的PBS缓冲液洗涤3次，再加入1mL0.01mol的PBS缓冲液重悬，取5μL滴加在载玻片上，使用共聚焦显微镜观察染色情况。
5)将步骤3)中各组菌液在4000rpm离心2min，吸去上清液，沉淀用0.01mol PBS缓冲液洗涤三次，再次离心收集沉淀，制片进行透射电子显微镜观察。
2.实验结果
SYTO-9染料可以穿过完整或不完整的细胞膜，和细胞中的RNA/DNA结合，发出绿色荧光；而PI只能穿过受损的细胞膜和DNA结合，发出红色荧光。如图1所示，使用SYTO-9/PI染色后的菌体产生了明显不同的结果：对照组中副溶血弧菌生长状态正常，只被SYTO-9染色，呈现出绿色荧光(图1A)；使用化合物麦角甾醇处理后的副溶血弧菌被SYTO-9和PI两种染料同时染色，呈现出绿/红两种荧光(图1B和C)，这表明麦角甾醇对副溶血弧菌的细胞膜完整性产生了较明显的破坏，使PI染料穿过受损的细胞膜进入到细菌内部。
如图2所示，在透射电子显微镜成像中，可以明显看到，空白对照组的副溶血弧菌菌体较短，呈扁圆状(图2A)；而相比于空白对照组，试验组的副溶血弧菌形态较长、较细(图2B和C)。说明麦角甾醇使副溶血弧菌的细胞膜结构受损，导致其渗透压失衡而吸入水份，形态发生改变。这一结果也与上述荧光染色结果相一致。
综上，麦角甾醇对副溶血弧菌的细胞膜产生明显破坏作用，从而有效地抑制副溶血弧菌的生长，具有抗弧菌效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.麦角甾醇在制备预防和/或治疗副溶血性弧菌感染的药品中的应用，其特征在于，所述麦角甾醇的最小抑菌浓度为12.5μg/mL。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药品还包括药学上可接受的赋性剂。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药品为人用药或动物用药。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述药品中还包括其他抗弧菌药物。
5.一种含麦角甾醇的组合物在制备预防和/或治疗副溶血性弧菌感染的药物中的应用，其特征在于，所述麦角甾醇的最小抑菌浓度为12.5μg/mL。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含麦角甾醇的组合物为晶体、粉体或液体中的任一种形式。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含麦角甾醇的组合物为药物组合物。
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| CHEMICAL CONSTITUENTS AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF THREE TANZANIAN WILD MUSHROOM SPECIES;LD Baraza等;《Tanzania Journal of Science》;第33卷(第1期);1-7 * |
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