CN113774098A - 一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖及其制备方法和应用。通过控制茯苓发酵培养基中的碳源的羧甲基取代度，对茯苓多糖进行生物修饰，可针对性的制备出适宜取代度的羧甲基茯苓多糖。得到的羧甲基茯苓多糖取代度范围广为0.3～1.5，生物活性高，而且不同取代度的羧甲基茯苓多糖丰富了茯苓多糖的产品类型、拓宽应用范围及使其市场化成为可能。本发明提供的制备方法具有工艺简单，转化条件温和、转化过程绿色自然、易于操作和成本低廉等特点，适宜工业化规模生产。而且，本发明的不同取代度的羧甲基茯苓多糖具有抗氧化和抑菌的功效，溶解性好，生物安全性好，在食品、化妆品及生物医药领域中有着巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖及其制备方法和应用。
背景技术
茯苓是一种我国资源丰富的药食两用真菌，是收载于《中国药典》中的传统中药材，主治水肿尿少，痰饮眩悸，惊悸失眠等。茯苓菌核主要成分为β-茯苓菌糖，约占菌核的80％～92％，主要由线型β(1→3)-D-葡聚糖组成，含有少量β-(1-6)糖苷键侧链。茯苓多糖分水溶性、碱溶性和酸溶性多糖，水溶性茯苓多糖为杂多糖，由D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-岩藻糖、D-木糖等组成。水溶性茯苓多糖的含量较低，临床证明无任何毒副作用的抗炎、抗肿瘤药物。茯苓中碱溶性茯苓多糖主要为β(1→3)-D-葡聚糖，不溶于水，活性低。
目前化学修饰茯苓多糖已鉴定具有比水溶性茯苓多糖更高的生物活性和产生了新的生物活性，现代研究证明经化学修饰茯苓多糖得到的羧甲基茯苓多糖具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、调节机体免疫力、抗肿瘤等作用，被称为生物反应调节剂，但是化学修饰存在化学药剂残留、高成本等环保问题。
为了防止不具有生物活性功能的碱溶性茯苓多糖被当成药渣弃用，带来严重资源浪费，采用生物方法对多糖分子进行定向修饰，达到改善原有生物活性和性能或获得新的活性，是目前需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，通过控制茯苓发酵培养基中的碳源的羧甲基取代度，对茯苓多糖进行生物修饰制得，包括以下步骤：
步骤S1、制备茯苓种子培养液：
将茯苓菌种接种到固体发酵培养基中，进行活化培养，然后按每15mL接种1～2cm2菌块的接种量接到茯苓种子发酵培养基中，进行种子培养；
步骤S2、制备发酵液：
将步骤S1所得的茯苓种子培养液加入到液体发酵培养基中，进行发酵培养，得发酵液；
步骤S3、过滤浓缩：
对步骤S2所得的发酵液进行过滤，滤掉菌丝，取滤液并浓缩，得浓缩液；
步骤S4、提取：
采用水提醇沉法提取步骤S3所得的浓缩液中羧甲基茯苓多糖；
步骤S5、纯化：
采用Sevag法除去步骤S4得到的羧甲基茯苓多糖粗品中的蛋白，重复多次，即得到羧甲基茯苓多糖。
进一步的，所述茯苓种子发酵培养基包括葡萄糖15.0～35.0g/L、蛋白胨5.0～15.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、无水MgSO4 0.5g/L、CaCl2 80mg/L、维生素B1 10～30mg/L和纯化水。
进一步的，所述液体发酵培养基包括葡萄糖15.0～35.0g/L、羧甲基碳源5.0～20.0g/L、蛋白胨3.0～6.0g/L、酵母浸粉4.0～7.0g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO41.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L和纯化水。
进一步的，所述的羧甲基碳源包括羧甲基纤维素、羧甲基淀粉，羧甲基壳聚糖，羧甲基葡聚糖，羧甲基-β-环糊精中的一种或多种。
进一步的，所述羧甲基纤维素的取代度范围为0.2～3.0。
进一步的，所述羧甲基淀粉的取代度范围为0.3～3.0。
进一步的，步骤S2中，所述液体发酵培养基和所述茯苓种子培养液的体积比为8～17:1。
进一步的，步骤S2中，所述发酵的条件包括温度为25℃～28℃，转速为120～150r/min和恒温培养6～8d。
本发明还提供采用上述任一项的制备方法得到的羧甲基茯苓多糖，所述羧甲基茯苓多糖的取代度范围为0.3～1.5。
本发明还提供上述不同取代度的羧甲基茯苓多糖在制备抗氧化产品或抗菌产品中的应用。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供的一种羧甲基茯苓多糖，通过控制茯苓发酵培养基中的碳源的羧甲基取代度，对茯苓多糖进行生物修饰，可针对性的制备出适宜取代度的羧甲基茯苓多糖。得到的羧甲基茯苓多糖取代度范围广为0.3～1.5，生物活性高，而且不同取代度的羧甲基茯苓多糖丰富了茯苓多糖的产品类型、拓宽应用范围及使其市场化成为可能；
(2)本发明提供的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，该方法采用液体培养生产茯苓发酵液可连续地进行规模化工业生产，大大缩短了生产时间，降低了生产成本，该方法具有工艺简单，转化条件温和、转化过程绿色自然、易于操作和成本低廉等特点，适宜工业化规模生产；
(3)本发明的不同取代度的羧甲基茯苓多糖具有抗氧化和抑菌的功效，溶解性好，生物安全性好，在食品、化妆品及生物医药领域中有着巨大的应用前景。
附图说明
图1为PM、CMP1、CMP2、CMP3和CMP4的紫外吸收图谱；
图2为PM、CMP1、CMP2、CMP3和CMP4的红外光谱图；
图3为PM、CMP1、CMP2、CMP3、CMP4和维生素C的DPPH清除率；
图4为PM、CMP1、灭菌水和CMC1的抑制枯草芽孢杆菌生长图；
图5为PM、CMP2、灭菌水和CMC2的抑制枯草芽孢杆菌生长图；
图6为PM、CMP3、灭菌水和CMC3的抑制枯草芽孢杆菌生长图；
图7为PM、CMP4、灭菌水和CMS的抑制枯草芽孢杆菌生长图；
图8为青霉素做阳性对照的抑制枯草芽孢杆菌生长图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。
研究中用到试验茯苓菌种为本申请人实验室保藏的鄂苓2号。
1、液体发酵培养基配方优化试验：
1.1碳源单因素试验
基础配方：碳源3.5％，氮源0.125％，初始pH值5.0；
以多糖产量为指标，在液体发酵培养基基础配方中，按照碳源3.5％总量分别加入0.5％、1.0％、1.5％三个水平的羧甲基纤维素(CMC)，及葡萄糖：CMC质量比为6:1、5:2、4:3三种组合，通过液体摇瓶培养，比较其生成的多糖产量来确定最佳碳源添加量。
1.2响应面设计
根据单因素试验发现，影响多糖产量的主要因素为碳源、氮源及pH。通过单因素考察基本确定了3个影响因素的参数范围：碳源3.0％～4.0％(葡萄糖和羧甲基纤维素按5:2质量比混合，即CMC添加量为0.857％～1.143％1，氮源0.1％～0.15％，pH 4.5～5.5。为了进一步确定最佳工艺参数及考察各因素之间的交互影响，采用响应面方法，选择碳源、氮源及pH三个因素，做三因素三水平的设计试验，通过统计分析得到最佳工艺参数。
试验结果表明，液体发酵培养基的pH在3.0左右，基本到达了发酵终点，并且CMC的添加会促进发酵终点的提前达到。同时，羧甲基纤维素(CMC)的添加对菌丝体干重和粗多糖产量均有影响。CMC添加量为1.0％时所产生的菌丝体干重和粗多糖产量均最大，平均值分别达到9.381g/L和21.332g/L。优化后的粗多糖产量最大值达到了37.450g/L。
单因素作用：碳源＞氮源＞pH；
双因素交互作用：碳源×pH＞碳源×氮源＞氮源×pH；
最佳配方方案：碳源3.5％(葡萄糖2.5％、CMC1.0％)×氮源0.125％(酵母浸粉0.625％，蛋白胨0.46％)×pH5.0；
影响茯苓多糖及羧甲基茯苓多糖产量的最主要因素是碳源，适量增加碳源可促进茯苓多糖及羧甲基茯苓多糖产量的提高，但是超过一定范围，过量的碳源反而会抑制多糖的生成。选用适当的复合氮源更有利于菌体的生长，但是氮源这一单因素对茯苓多糖及羧甲基茯苓多糖产量的影响并不显著，所以主要是通过碳氮比来实现其影响作用。
2、用最佳液体发酵培养基配方进行考察实施例与对比例的羧甲基茯苓多糖取代度情况
茯苓多糖PM发酵制备方法：
活化茯苓菌种的固体发酵培养基：土豆(去皮)200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，纯化水，pH值自然。
茯苓种子发酵培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO4 1.0g/L，无水MgSO40.5g/L，CaCl2 80mg/L，VB1 20mg/L，纯化水，pH值自然。
液体发酵培养基：葡萄糖35g/L、蛋白胨5.2g/L、酵母浸粉6.25g/L、KH2PO40.46g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，纯化水，初始pH值为5.0左右。
多糖脱蛋白：取醇沉多糖2g加纯化水配制成60mL溶液，加入正丁醇-氯仿(1:4)溶液15mL，用磁力搅拌器搅拌30分钟后，用离心机6000rpm/min离心10min，然后将氯仿相和水相交界处的蛋白质去除，弃掉氯仿相，重复以上操作，直到蛋白质完全去除。
抑制枯草芽孢杆菌实验：将枯草芽孢杆菌接种于LB培养基平板上，在37℃恒温进行菌种活化24h，用接种环挑取菌苔用灭菌生理盐水稀释，制成菌含量为106～108cfu/mL菌悬液，将LB固体平板培养基上加80uL的菌悬液且涂布均匀，将直径为6mm的圆形灭菌滤纸片放入多糖液中浸泡后晾干，空白对照的无菌水和阳性对照的青霉素也按此方法处理，将滤纸片按编号贴到涂布均匀的菌悬液平板上，设置三组重复，倒置于恒温培养箱中培养24h，用十字交叉法测定抑菌圈直径的大小。
实施例1：
羧甲基茯苓多糖CMP1发酵制备方法：从4℃冰箱中取出茯苓斜面保藏菌种(鄂苓2号)，在无菌操作台上挑取直径约为1cm的菌块接种到茯苓菌种活化培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4d，再从活化培养基中取8块直径约为1cm的菌块接种到茯苓液体种子培养基中(500mL锥形瓶装液量为120mL)，在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，液体种子培养结束后以10％的接种量接种到发酵培养基中(葡萄糖25g/L、取代度为0.7的CMC 10g/L、蛋白胨5.2g/L、酵母浸粉6.25g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，纯化水，初始pH值为5.0左右)在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，发酵结束后用纱布过滤掉菌丝，菌丝体进行烘干称重，收集的发酵液进行70％乙醇沉淀12h，将沉淀的多糖进行脱蛋白处理后烘干称重，本实验脱蛋白6次后，即得到羧甲基茯苓多糖CMP1。
CMP1的紫外光谱扫描仪扫描结果为：如图1所示，在260nm附近处只有弱吸收峰，说明CMP1几乎不含核酸，在280nm附近处只有弱吸收峰，说明CMP1几乎不含蛋白质。
CMP1的红外光谱测定结果为：如图2所示，CMP1有3700cm-1～3100cm-1处羟基(-OH)缔合峰、2933cm-1～2924cm-1处烷基的C-H伸缩振动峰、1150cm-1～1060cm-1处C-O伸缩振动峰等多糖的特征吸收峰，且有890cm-1附近处的β-吡喃糖特征峰。且存在1690cm-1～1540cm-1处C＝O伸缩振动峰和1420cm-1附近处C-O伸缩振动峰，1300cm-1附近处次甲基(-CH2-)振动吸收峰，说明有羧甲基的存在，因此判断羧甲基连接在多糖的分子结构上。
CMP1的理化检测结果为：CMP1多糖易溶于水，颜色为黄褐色，茯苓菌丝体干重为8.91±0.23g/L，多糖含量为19.15±0.32g/L。
CMP1的取代度检测结果为：采用滴定的方法测定茯苓多糖上的羟基被羧甲基取代的取代度为0.38±0.02。
实施例2：
羧甲基茯苓多糖CMP2发酵制备方法：从4℃冰箱中取出茯苓斜面保藏菌种(鄂苓2号)，在无菌操作台上挑取直径约为1cm的菌块接种到活化茯苓菌种培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4d，再从活化培养基中取8块直径约为1cm的菌块接种到茯苓液体种子培养基中(500mL锥形瓶装液量为120mL)，在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，液体种子培养结束后以10％的接种量接种到发酵培养基中(葡萄糖25g/L、取代度为0.9的CMC 10g/L、蛋白胨5.2g/L、酵母浸粉6.25g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，纯化水，初始pH值为5.0左右)在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，发酵结束后用纱布过滤掉菌丝，菌丝体进行烘干称重，收集的发酵液进行70％乙醇沉淀12h，将沉淀的多糖进行脱蛋白处理后烘干称重，本实验脱蛋白6次后，即得到羧甲基茯苓多糖CMP2。
CMP2的紫外光谱扫描仪扫描结果为：如图1所示，在260nm附近处只有弱吸收峰，说明CMP2几乎不含核酸，在280nm附近处只有弱吸收峰，说明CMP2几乎不含蛋白质。
CMP2的红外光谱测定结果为：如图2所示，CMP2有3700cm-1～3100cm-1处羟基(-OH)缔合峰、2933cm-1～2924cm-1处烷基的C-H伸缩振动峰、1150cm-1～1060cm-1处C-O伸缩振动峰等多糖的特征吸收峰，且有890cm-1附近处的β-吡喃糖特征峰。且存在1690cm-1～1540cm-1处C＝O伸缩振动峰和1420cm-1附近处C-O伸缩振动峰，1300cm-1附近处次甲基(-CH2-)振动吸收峰，说明有羧甲基的存在，因此判断羧甲基连接在多糖的分子结构上。
CMP2的理化检测结果为：CMP2多糖易溶于水，颜色为黄褐色，茯苓菌丝体干重为9.43±0.44g/L，多糖含量为20.28±0.70g/L。
CMP2的取代度检测结果为：采用滴定的方法测定茯苓多糖上的羟基被羧甲基取代的取代度为0.56±0.02。
实施例3：
羧甲基茯苓多糖CMP3发酵制备方法：从4℃冰箱中取出茯苓斜面保藏菌种(鄂苓2号)，在无菌操作台上挑取直径约为1cm的菌块接种到活化茯苓菌种培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4d，再从活化培养基中取8块直径约为1cm的菌块接种到茯苓液体种子培养基中(500mL锥形瓶装液量为120mL)，在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，液体种子培养结束后以10％的接种量接种到发酵培养基中(葡萄糖25g/L、取代度为1.2的CMC 10g/L、蛋白胨5.2g/L、酵母浸粉6.25g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，纯化水，初始pH值为5.0左右)在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，发酵结束后用纱布过滤掉菌丝，菌丝体进行烘干称重，收集的发酵液进行70％乙醇沉淀12h，将沉淀的多糖进行脱蛋白处理后烘干称重，本实验脱蛋白6次后，即得到羧甲基茯苓多糖CMP3。
CMP3的紫外光谱扫描仪扫描结果为：如图1所示，在260nm附近处只有弱吸收峰，说明CMP3几乎不含核酸，在280nm附近处只有弱吸收峰，说明CMP3几乎不含蛋白质。
CMP3的红外光谱测定结果：如图2所示，CMP3有3700cm-1～3100cm-1处羟基(-OH)缔合峰、2933cm-1～2924cm-1处烷基的C-H伸缩振动峰、1150cm-1～1060cm-1处C-O伸缩振动峰等多糖的特征吸收峰，且有890cm-1附近处的β-吡喃糖特征峰。且存在1690cm-1～1540cm-1处C＝O伸缩振动峰和1420cm-1附近处C-O伸缩振动峰，1300cm-1附近处次甲基(-CH2-)振动吸收峰，说明有羧甲基的存在，因此判断羧甲基连接在多糖的分子结构上。
CMP3的理化检测结果为：CMP3多糖易溶于水，颜色为黄褐色，茯苓菌丝体干重为10.57±0.48g/L，多糖含量为22.87±0.45g/L。
CMP3的取代度检测结果为：采用滴定的方法测定茯苓多糖上的羟基被羧甲基取代的取代度为0.78±0.03。
实施例4：
羧甲基茯苓多糖CMP4发酵制备方法：从4℃冰箱中取出茯苓斜面保藏菌种(鄂苓2号)，在无菌操作台上挑取直径约为1cm的菌块接种到活化茯苓菌种培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4d，再从活化培养基中取8块直径约为1cm的菌块接种到茯苓液体种子培养基中(500mL锥形瓶装液量为120mL)，在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，液体种子培养结束后以10％的接种量接种到发酵培养基中(葡萄糖25g/L、取代度为0.7的羧甲基淀粉CMS 10g/L、蛋白胨5.2g/L、酵母浸粉6.25g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L，纯化水，初始pH值为5.0左右)在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，发酵结束后用纱布过滤掉菌丝，菌丝体进行烘干称重，收集的发酵液进行70％乙醇沉淀12h，将沉淀的多糖进行脱蛋白处理后烘干称重，本实验脱蛋白6次后，即得到羧甲基茯苓多糖CMP4。
CMP4的紫外光谱扫描仪扫描结果为：如图1所示，在260nm附近处只有弱吸收峰，说明CMP4几乎不含核酸，在280nm附近处只有弱吸收峰，说明CMP4几乎不含蛋白质。
CMP4的红外光谱测定结果为：如图2所示，CMP4有3700cm-1～3100cm-1处羟基(-OH)缔合峰、2933cm-1～2924cm-1处烷基的C-H伸缩振动峰、1150cm-1～1060cm-1处C-O伸缩振动峰等多糖的特征吸收峰，且有890cm-1附近处的β-吡喃糖特征峰。且存在1690cm-1～1540cm-1处C＝O伸缩振动峰和1420cm-1附近处C-O伸缩振动峰，1300cm-1附近处次甲基(-CH2-)振动吸收峰，说明有羧甲基的存在，因此判断羧甲基连接在多糖的分子结构上。
CMP4的理化检测结果为：CMP4多糖易溶于水，颜色为黄褐色，茯苓菌丝体干重为7.08±0.15g/L，多糖含量为9.69±0.58g/L。
CMP4的取代度检测结果为：采用滴定的方法测定茯苓多糖上的羟基被羧甲基取代的取代度为0.45±0.01。
由实施例1-3的结果显示：分别添加不同取代度为0.7、0.9和1.2的羧甲基纤维素(CMC)10g/L，可得到不同取代度的羧甲基茯苓多糖。
由实施4的结果显示：添加不同类别的羧甲基碳源，也能得到适宜的取代度的羧甲基茯苓多糖。
可见，在茯苓发酵液中引入羧甲基的碳源，在发酵过程中可将羧甲基成功引入到茯苓多糖上，从而获得羧甲基茯苓多糖；通过调控羧甲基的碳源的取代度，可以获得不同取代度的羧甲基茯苓多糖。
采用本发明的方法制备不同取代度的羧甲基茯苓多糖，主要原因是在茯苓发酵过程中添加的一些含羧甲基官能团的含碳化合物，作为碳源进入细胞，参与茯苓的生理代谢途径，碳源中的羧甲基转化到茯苓多糖上，因此可制备出羧甲基茯苓多糖。
对比例1：
羧甲基茯苓多糖CMP5发酵制备方法：从4℃冰箱中取出茯苓斜面保藏菌种(鄂苓2号)，在无菌操作台上挑取直径约为1cm的菌块接种到活化茯苓菌种培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4d，再从活化培养基中取8块直径约为1cm的菌块接种到茯苓液体种子培养基中(500mL锥形瓶装液量为120mL)，在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，液体种子培养结束后以10％的接种量接种到发酵培养基中(葡萄糖25g/L、取代度为0.7的CMC8.5g/L、蛋白胨5.2g/L、酵母浸粉6.25g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，纯化水，初始pH值为5.0左右)在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，发酵结束后用纱布过滤掉菌丝，收集的发酵液进行70％乙醇沉淀12h，将沉淀的多糖进行脱蛋白处理，本实验脱蛋白6次后，精制得到的羧甲基茯苓多糖CMP5的取代度为0.305。
对比例2:
羧甲基茯苓多糖CMP6发酵制备方法：从4℃冰箱中取出茯苓斜面保藏菌种(鄂苓2号)，在无菌操作台上挑取直径约为1cm的菌块接种到活化茯苓菌种培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4d，再从活化培养基中取8块直径约为1cm的菌块接种到茯苓液体种子培养基中(500mL锥形瓶装液量为120mL)，在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，液体种子培养结束后以10％的接种量接种到发酵培养基中(葡萄糖25g/L、取代度为0.7的CMC10g/L、蛋白胨5.2g/L、酵母浸粉6.25g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，纯化水，初始pH值为5.0左右)在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，发酵结束后用纱布过滤掉菌丝，收集的发酵液进行70％乙醇沉淀12h，将沉淀的多糖进行脱蛋白处理，本实验脱蛋白6次后，精制得到的羧甲基茯苓多糖CMP6的取代度为0.309。
对比例3:
羧甲基茯苓多糖CMP7发酵制备方法：从4℃冰箱中取出茯苓斜面保藏菌种(鄂苓2号)，在无菌操作台上挑取直径约为1cm的菌块接种到活化茯苓菌种培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4d，再从活化培养基中取8块直径约为1cm的菌块接种到茯苓液体种子培养基中(500mL锥形瓶装液量为120mL)，在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，液体种子培养结束后以10％的接种量接种到发酵培养基中(葡萄糖25g/L、取代度为0.7的CMC11.5g/L、蛋白胨5.2g/L、酵母浸粉6.25g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，纯化水，初始pH值为5.0左右)在28℃恒温摇床培养7d，摇床转速为120r/min，发酵结束后用纱布过滤掉菌丝，收集的发酵液进行70％乙醇沉淀12h，将沉淀的多糖进行脱蛋白处理，本实验脱蛋白6次后，精制得到的羧甲基茯苓多糖CMP7的取代度为0.300。
对比例1-3的结果显示：分别添加不同浓度为8.5g/L、10g/L、11.5g/L的取代度为0.7的羧甲基纤维素(CMC)，得到的羧甲基茯苓多糖的取代度在0.300～0.309范围内，说明羧甲基纤维素(CMC)的浓度的改变并不能改变羧甲基茯苓多糖的取代度。
综上所述，本发明的制备羧甲基茯苓多糖的方法中羧甲基茯苓多糖的取代度与添加的羧甲基碳源的取代度显著相关，因为羧甲基的反应是对多糖分子中C-2、C-4、C-6位上的羟基进行化学改造，其中不同位置上的羟基的相对活性为C-6位>C-4位>C-2位，羧甲基反应一般取代C-6位上的羟基，羧甲基碳源进入茯苓细胞，参与茯苓的生理代谢途径，碳源中的羧甲基转化到茯苓多糖上的反应与不同空间位置上的羧甲基取代羟基相关。
为了更好的说明本发明的不同取代度的羧甲基茯苓多糖带来的有益效果，下面将通过抗氧化试验和抑菌试验进行阐述。
1、将实施例1～实施例4制备得到的不同取代度的羧甲基茯苓多糖进行抗氧化试验
试验具体内容如下：
不同取代度羧甲基茯苓多糖清除率测定：将PM、CMP1、CMP2、CMP3、CMP4和维生素C分别配制成10mg/mL溶液浓度，并在试管中进行梯度稀释。向装有2.0mL稀释液的试管中加入2mLDPPH溶液充分混合，避光反应30min，用光度计在517nm处测定吸光度。根据下式计算清除率：
清除率＝[A0-(A1-A2)]/A0×100％
式中，A0表示用蒸馏水代替样品溶液时测定的吸光度；A1代表样品溶液测定的吸光度；A2代表用无水乙醇代替DPPH溶液时测定的吸光度。
测定结果如图3所示，茯苓多糖经羧甲基修饰后DPPH自由基清除能力显著增强，且茯苓多糖和不同取代度的羧甲基茯苓多糖的DPPH自由基清除能力与浓度呈正相关，多糖浓度越高，DPPH自由基清除率越强，CMP3浓度达到1g/L时，其DPPH自由基清除率能够达到59.01％。
其原理为：DPPH能在有机溶剂中稳定存在，其醇溶液呈紫色，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517nm下具有最大吸收。羧甲基茯苓多糖可使DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。不同取代度的羧甲基茯苓多糖因被羧甲基取代的羟基数目越多，取代度越高。含羧甲基越多，捕捉DPPH的单电子的能力越强，抗氧化能力越强。
2、将实施例1～实施例5制备得到的不同取代度的羧甲基茯苓多糖进行抗菌试验
试验具体内容如下：
CMP1抑菌圈实验：将茯苓多糖、CMP1和CMC1(DS＝0.7)配制成100mg/mL的多糖溶液，经巴氏灭菌后进行抑制枯草芽孢杆菌实验，如图4所示，1号为茯苓多糖，2号为CMP1，3号为空白对照灭菌水，4号为阴性对照CMC1，以青霉素为阳性对照(如图8所示)。测定抑菌圈数值为茯苓多糖8.39±0.28mm(滤纸片直径为6mm)，CMP1 11.76±0.21mm，灭菌水6.00±0.00mm，CMC1 6.00±0.00mm，由图可以看出，茯苓多糖与CMP1之间的抑制枯草芽孢杆菌活性存在差异，CMP1的抑菌活性要明显高于茯苓多糖。
CMP2抑菌圈实验：将茯苓多糖、CMP2和CMC2(DS＝0.9)配制成100mg/mL的多糖溶液，经巴氏灭菌后进行抑制枯草芽孢杆菌实验，如图5所示，1号为茯苓多糖，2号为CMP2，3号为空白对照灭菌水，4号为阴性对照CMC2，以青霉素为阳性对照(如图8所示)。测定抑菌圈数值为茯苓多糖8.39±0.28mm(滤纸片直径为6mm)，CMP2 12.43±0.22，灭菌水6.00±0.00mm，CMC2 6.00±0.00mm，由图可以看出，茯苓多糖与CMP2之间的抑制枯草芽孢杆菌活性存在差异，CMP2的抑菌活性要明显高于茯苓多糖。
CMP3抑菌圈实验：将茯苓多糖、CMP3和CMC3(DS＝1.2)配制成100mg/mL的多糖溶液，经巴氏灭菌后进行抑制枯草芽孢杆菌实验，如图6所示，1号为茯苓多糖，2号为CMP3，3号为空白对照灭菌水，4号为阴性对照CMC3，以青霉素为阳性对照(如图8所示)。测定抑菌圈数值为茯苓多糖8.39±0.28mm(滤纸片直径为6mm)，CMP3 14.24±0.13mm，灭菌水6.00±0.00mm，CMC3 6.00±0.00mm，由图可以看出，茯苓多糖与CMP3之间的抑制枯草芽孢杆菌活性存在差异，CMP3的抑菌活性要明显高于茯苓多糖。
CMP4抑菌圈实验：将茯苓多糖、CMP4和CMS配制成100mg/mL的多糖溶液，经巴氏灭菌后进行抑制枯草芽孢杆菌实验，如图7所示，1号为茯苓多糖，2号为CMP4，3号为空白对照灭菌水，4号为阴性对照CMS，以青霉素为阳性对照(如图8所示)。测定抑菌圈数值为茯苓多糖8.39±0.28mm(滤纸片直径为6mm)，CMP4 11.27±0.25mm，灭菌水6.00±0.00mm，CMS6.00±0.00mm，由图可以看出，茯苓多糖与CMP4之间的抑制枯草芽孢杆菌活性存在差异，CMP4的抑菌活性要明显高于茯苓多糖。
其抑菌原理为：羧甲基茯苓多糖通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成而发挥杀菌作用，即羧甲基茯苓多糖抑菌作用机制是干扰革兰氏阳性细菌细胞壁的合成。不同取代度的羧甲基茯苓多糖因被羧甲基取代的羟基数目越多，取代度越高，抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合的能力越强，抑菌能力也越强。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：通过控制茯苓发酵培养基中的碳源的羧甲基取代度，对茯苓多糖进行生物修饰制得，包括以下步骤：
S1、制备茯苓种子培养液
将茯苓菌种接种到固体发酵培养基中，进行活化培养，然后按每15mL接种1～2cm2菌块的接种量接到茯苓种子发酵培养基中，进行种子培养；
S2、制备发酵液
将步骤S1所得的茯苓种子培养液加入到液体发酵培养基中，进行发酵培养，得发酵液；
S3、过滤浓缩
对步骤S2所得的发酵液进行过滤，滤掉菌丝，取滤液并浓缩，得浓缩液；
S4、提取
采用水提醇沉法提取步骤S3所得的浓缩液中羧甲基茯苓多糖；
S5、纯化
采用Sevag法除去步骤S4得到的羧甲基茯苓多糖粗品中的蛋白，重复多次，即得到羧甲基茯苓多糖。
2.如权利要求1所述的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：所述茯苓种子发酵培养基包括葡萄糖15.0～35.0g/L、蛋白胨5.0～15.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、无水MgSO4 0.5g/L、CaCl2 80mg/L、维生素B1 10～30mg/L和纯化水。
3.如权利要求1所述的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：所述液体发酵培养基包括葡萄糖15.0～35.0g/L、羧甲基碳源5.0～20.0g/L、蛋白胨3.0～6.0g/L、酵母浸粉4.0～7.0g/L、KH2PO4 0.46g/L、K2HPO41.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L和纯化水。
4.如权利要求3所述的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：所述的羧甲基碳源包括羧甲基纤维素、羧甲基淀粉，羧甲基壳聚糖，羧甲基葡聚糖，羧甲基-β-环糊精中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：所述羧甲基纤维素的取代度范围为0.2～3.0。
6.如权利要求4所述的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：所述羧甲基淀粉的取代度范围为0.3～3.0。
7.如权利要求3所述的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述液体发酵培养基和所述茯苓种子培养液的体积比为8～17:1。
8.如权利要求7所述的一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述发酵培养的条件包括温度为25℃～28℃，转速为120～150r/min和恒温培养6～8d。
9.一种采用如权利要求1-8任一项所述的制备方法得到的羧甲基茯苓多糖，其特征在于：所述羧甲基茯苓多糖的取代度范围为0.3～1.5。
10.一种不同取代度的羧甲基茯苓多糖在制备抗氧化产品或抗菌产品中的应用。
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