CN113773355A - 一种多烯大环内酯类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及真菌防治技术，公开了一种多烯大环内酯类化合物及其制备方法和应用。本发明提供的多烯大环内酯类化合物的结构式如式(I)所示。本发明提供的制备多烯大环内酯类化合物的方法，包括以下步骤：将放线动孢菌进行发酵培养得到发酵液，将所述发酵液经分离纯化得到所述多烯大环内酯类化合物；本发明还提供了该多烯大环内酯类化合物在防治植物真菌病害中的应用和制备抗真菌药物中的应用。该多烯大环内酯类化合物不仅对植物真菌病害具有良好的防治作用，而且对动物浅表及系统真菌感染具有明显的抑制作用。
Figure DDA0003225117760000011

Description

一种多烯大环内酯类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及真菌防治技术，具体涉及一种多烯大环内酯类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
由植物病原真菌引起土传病害影响农产品质量和数量，若防治不当将造成重大的经济损失。目前，化学农药仍是作物病害管理的主力军，然而，化学农药不仅污染农产品，影响产品质量，破坏生态环境，威胁人类健康，而且长期使用还会导致害虫产生抗药性，降低防治效果。近年来，随着人们生活水平的不断提高，“有机食品”、“无公害蔬菜”的需求量持续增加。化学农药残留带来的一系列食品安全和环境污染问题成为制约传统农业快速发展的瓶颈之一。
生物农药是指利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂，在实际农业生产中，以微生物源农药居多。与化学农药相比，生物农药常具有更多靶标位点、更独特的作用机制、因而不易诱导害虫产生抗性。此外，生物农药还具较强的选择性强，对人、畜等非靶标生物安全；且能自行降解，无污染低残留。尽管如此，生物农药研发现状仍不容乐观，病原菌多样性及耐药性也使得新农用抗生素的需求更为迫切。
此外，真菌感染也严重威胁着人类健康，目前常用的抗真菌药物主要有氟胞嘧啶(flucytosine)、唑类(azoles)、棘白菌素类(echinocandins)及多烯大环内酯(polyenemacrolide)等。由于病原体耐药性、药物之间相互作用、药物自身毒性及窄谱性等原因，这四类药物的临床应用均具有一定局限性，新型抗真菌药物的研发同样迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种多烯大环内酯类化合物及其制备方法和应用，该多烯大环内酯类化合物不仅对植物真菌病害具有良好的防治作用，而且对动物浅表及系统真菌感染具有明显的抑制作用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种多烯大环内酯类化合物，该多烯大环内酯类化合物的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003225117740000021
本发明第二方面提供一种制备多烯大环内酯类化合物的方法，该方法包括以下步骤：将放线动孢菌进行发酵培养得到发酵液，将所述发酵液经分离纯化得到所述多烯大环内酯类化合物；
其中，所述多烯大环内酯类化合物的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003225117740000022
优选地，所述分离纯化的过程包括：
(1)将所述发酵液经浸提、浓缩得到浸提物，将所述浸提物经溶解、固液分离得到浸提物溶液；
(2)将步骤(1)得到的浸提物溶液利用硅胶柱层析I进行梯度洗脱I，经抑菌试验得到抑菌组分A；
(3)将步骤(2)得到的抑菌组分A利用硅胶柱层析II进行梯度洗脱II，经抑菌试验得到抑菌组分B，将所述抑菌组分B利用半制备柱层析进行梯度洗脱III，得到所述多烯大环内酯类化合物。
优选地，步骤(1)中，所述浸提采用的浸提溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和丙酮中的至少一种，所述溶解采用的溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种；
所述固液分离的过程包括：将所述溶解得到的溶液离心后进行过滤。
优选地，步骤(2)中，所述硅胶柱层析I采用100-200目正向硅胶柱；
所述梯度洗脱I依次采用环己烷、环己烷-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇混合液和甲醇作为洗脱剂，所述环己烷、所述环己烷-乙酸乙酯混合液、所述乙酸乙酯、所述乙酸乙酯-甲醇混合液、所述甲醇各自与所述浸提物的体积质量比为6-15:1。
优选地，步骤(3)中，所述硅胶柱层析II采用葡聚糖Sephadex LH-20柱；
所述梯度洗脱II和所述梯度洗脱III的流动相分别独立地采用低级有机醇-水溶液；
所述半制备柱层析采用Agilent ZORBAXSB-C18柱。
本发明第三方面提供上述的多烯大环内酯类化合物、上述的方法制得的多烯大环内酯类化合物在防治植物真菌病害中的应用。
优选地，所述植物真菌病害为茄病镰刀菌、链格孢菌、辣椒刺盘孢菌、立枯丝核菌、齐整小核菌、辣椒疫霉菌和禾谷镰刀菌中的至少一种引起的植物真菌病害。
本发明第四方面提供上述的多烯大环内酯类化合物、上述的方法制得的多烯大环内酯类化合物在制备抗真菌药物中的应用。
优选地，所述抗真菌药物为抑制酿酒酵母、白色念珠菌和新生隐球菌中的至少一种的药物。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种新的多烯大环内酯类化合物，该多烯大环内酯类化合物能够显著抑制多种致病真菌的生长，包括西瓜枯萎病菌茄病镰刀菌、烟草赤星病原菌链格孢菌、辣椒炭疽病病原菌辣椒刺盘孢菌、水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌、辣椒白绢病病原菌齐整小核菌、辣椒疫病病原菌辣椒疫霉菌和小麦赤霉病原菌禾谷镰刀菌，以及引起动物浅表及系统真菌感染的白色念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母等；进而该多烯大环内酯类化合物不仅对多种植物真菌病害具有良好的防治作用，而且对动物浅表及系统真菌感染具有明显的抑制作用，能够用于制备抗真菌的农药、药物、试剂或食品等，具有广泛的开发应用前景。
附图说明
图1是实施例1获得的活性成分C的高分辨二级质谱图；
图2是实施例1获得的活性成分C的氢谱图；
图3是实施例1获得的活性成分C的HSQC谱图；
图4是实施例1获得的活性成分C的HMBC谱图；
图5是实施例1获得的活性成分C的COSY谱图；
图6是实施例1获得的活性成分C的NOESY谱图；
图7是实施例1获得的活性成分C的红外光谱图；
图8是实施例1获得的活性成分C的紫外光谱图；
图9是实施例1获得的活性成分C对白色念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母的抑菌圈，其中，1为白色念珠菌、2为新生隐球菌、3为酿酒酵母；
图10是实施例1获得的活性成分C对植物病原真菌的抑菌圈，其中，1为茄病镰刀菌、2为链格孢菌、3为禾谷镰刀菌、4为齐整小核菌、5为辣椒刺盘孢菌、6为立枯丝核菌。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种多烯大环内酯类化合物，该多烯大环内酯类化合物的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003225117740000051
发明人在研究过程中，通过基因组挖掘发现了一个聚酮合酶基因簇，经分离鉴定后确定其产物的结构式如式(I)所示，属于多烯大环内酯。现今报道的多烯大环内酯骨架多为26/28、38元环，常见的糖基修饰为海藻糖胺(mycosamine)，仅表霉素(perimycin)、美洁霉素(meijimycin)等为数不多的几个多烯为海藻糖胺的异构体perosamine，现有的多烯大环内酯中多烯骨架含一个或不含环氧基，骨架上的侧链多为直链烷烃。而经核磁数据分析发现，本发明中提供的如式(I)所示的多烯大环内酯类化合物的骨架为26元环，其内酯环上具有两个环氧基，并连有一个异丁烯基侧链，环外糖基化修饰为海藻糖胺的异构体perosamine。
发明人在进一步的研究中发现，该多烯大环内酯类化合物能够显著抑制多种致病真菌的生长，包括能够引起植物病害的茄病镰刀菌、链格孢菌、辣椒刺盘孢菌、立枯丝核菌、齐整小核菌、辣椒疫霉菌和禾谷镰刀菌，以及能够引起动物浅表及系统真菌感染的白色念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母等。
根据本发明，如式(I)所示的多烯大环内酯类化合物可以是合成的，或者是从菌种发酵产物中分离纯化获得，具体地从放线动孢菌的发酵液中分离纯化获得。
第二方面，本发明提供了一种制备多烯大环内酯类化合物的方法，该方法包括以下步骤：将放线动孢菌进行发酵培养得到发酵液，将所述发酵液经分离纯化得到所述多烯大环内酯类化合物；
其中，所述多烯大环内酯类化合物的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003225117740000061
根据本发明，放线动孢菌的发酵培养可以采用常规的培养方式，只要能够实现放线动孢菌的增殖即可。具体地，放线动孢菌的菌种先经平板或斜面进行活化后，将活化得到的孢子接种至发酵培养基进行发酵培养，以得到发酵液。其中，活化的平板或斜面采用的培养基可以是常规的链霉菌培养基，例如ISP2培养基，活化的条件至少满足：温度为25-30℃、时间为10-20天；发酵培养采用的发酵培养基含有大豆蛋白胨5-15g/L、麦芽浸膏2-8g/L、碳酸钙0.5-2g/L和甘露糖2-8g/L；发酵培养的条件至少满足：温度为25-30℃、时间为5-25天。
根据本发明，从放线动孢菌的发酵液中分离纯化得到如式(I)所示的多烯大环内酯类化合物，可以采用现有的进行提取分离纯化的方法。
优选情况下，所述分离纯化的过程包括：
(1)将所述发酵液经浸提、浓缩得到浸提物，将所述浸提物经溶解、固液分离得到浸提物溶液；
(2)将步骤(1)得到的浸提物溶液利用硅胶柱层析I进行梯度洗脱I，经抑菌试验得到抑菌组分A；
(3)将步骤(2)得到的抑菌组分A利用硅胶柱层析II进行梯度洗脱II，经抑菌试验得到抑菌组分B，将所述抑菌组分B利用半制备柱层析进行梯度洗脱III，得到所述多烯大环内酯类化合物。
根据本发明，步骤(2)和步骤(3)中的抑菌试验分别可以采用琼脂扩散法，测定梯度洗脱I或者梯度洗脱II获得的各组分的抑菌活性，收集抑菌圈较大的组分，以得到抑菌组分A和抑菌组分B。
根据本发明，步骤(1)中，可以根据浸提物的特性选择合适的浸提溶剂和溶解溶剂，浸提溶剂和溶解溶剂的用量可根据浸提物的溶解度进行适当的调节。优选地，所述浸提采用的浸提溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和丙酮中的至少一种，需要说明的是，浸提溶剂可以不含有水，也可以是以与水混合形成的水溶液的形式。
根据本发明，浸提的次数可以为一次或者多次，优选为2-5次，将每次浸提得到的浸提溶液混合后进行浓缩，得到浸提物；每次浸提时，浸提溶剂与发酵液的体积比为1-2:1。
根据本发明，所述溶解采用的溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种。
根据本发明，所述固液分离的过程包括：将所述溶解得到的溶液离心后进行过滤。溶解得到的溶液经离心除去沉淀物，将离心获得上清液进行过滤除去杂质，得到的滤液即为浸提物溶液。
根据本发明，步骤(2)中，所述硅胶柱层析I采用100-200目正向硅胶柱；所述梯度洗脱I依次采用环己烷、环己烷-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇混合液和甲醇作为洗脱剂，所述环己烷、所述环己烷-乙酸乙酯混合液、所述乙酸乙酯、所述乙酸乙酯-甲醇混合液、所述甲醇各自与所述浸提物的体积质量比为6-15:1。
根据本发明，步骤(3)中，所述硅胶柱层析II采用葡聚糖Sephadex LH-20柱；所述半制备柱层析采用Agilent ZORBAXSB-C18柱。
根据本发明，步骤(3)中，所述梯度洗脱II和所述梯度洗脱III的流动相分别独立地采用低级有机醇-水溶液。梯度洗脱II和梯度洗脱III的流动相可以是采用相同的低级有机醇，也可以是采用不同的低级有机醇。示例性地，梯度洗脱II和梯度洗脱III的流动相分别独立地采用甲醇-水溶液、乙醇-水溶液、正丙醇-水溶液、异丙醇-水溶液中的一种。
第三方面，本发明提供了上述的多烯大环内酯类化合物、上述的方法制得的多烯大环内酯类化合物在防治植物真菌病害中的应用。
根据本发明，所述植物真菌病害为茄病镰刀菌(Fusariums solani)、链格孢菌(Alternaria alternate Fries Keisslar)、辣椒刺盘孢菌(Colletotrichum capsici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsi)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)中的至少一种引起的植物真菌病害。具体地，植物真菌病害可以为茄病镰刀菌引起的西瓜枯萎病、链格孢菌引起的烟草赤星病、辣椒刺盘孢菌引起的辣椒炭疽病、立枯丝核菌引起的水稻纹枯病、齐整小核菌引起的辣椒白绢病、辣椒疫霉菌引起的辣椒疫病和禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病中的至少一种。
根据本发明，式(I)所示的多烯大环内酯类化合物可以是单独使用，也可以用于制备防治植物真菌病害的农药、试剂等制剂，相应的农药或试剂还含有其他与该多烯大环内酯类化合物联合的化合物组分；农药或试剂可以为乳油、悬浮剂、可湿性粉剂、粉剂、粒剂、水剂、母液、母粉等各种剂型。
第四方面，本发明提供了上述的多烯大环内酯类化合物、上述的方法制得的多烯大环内酯类化合物在制备抗真菌药物中的应用，该药物可用于人体及动物的抗真菌感染治疗。
优选地，所述抗真菌药物为抑制引起动物浅表及系统真菌感染的白色念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母中的至少一种的药物。
根据本发明，所述抗真菌药物中还可以含有药学上可接受的辅助成分。多烯大环内酯类化合物在用于抗真菌时，不局限于在制备抗真菌药物中的应用，还包括在抗真菌试剂和抗真菌食品中的应用。
根据本发明，所述抗真菌药物可以为口服剂型或者外用剂型。所述外用剂型选自：膏药、巴布剂、软膏剂、乳膏剂、酊剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂；所述口服剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、溶液剂。
根据本发明，多烯大环内酯类化合物应用于防治植物真菌病害和制备抗真菌药物时，多烯大环内酯类化合物的纯度优选为≥95％。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，放线动孢菌(Actinokineospora sp.)的突变株由湖南省微生物研究院诱变获得并保存；
ISP2培养基的组分为：酵母浸膏4g/L、葡萄糖4g/L、麦芽浸出物10g/L、琼脂20g/L；
发酵培养基的组分为：大豆蛋白胨10g/L、麦芽浸膏4g/L、碳酸钙1g/L、甘露糖4g/L；
其它原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
(1)取放线动孢菌突变株的菌种保藏液，接种于ISP2培养基平板上，在温度为28℃的条件下培养15天，从平板上取适量的放线动孢菌孢子接种于发酵培养基中，温度为28℃的条件下培养20天，得到发酵液；
(2)将步骤(1)得到发酵液与等体积的甲醇混合并浸提15h，重复浸提3次，将3次浸提获得的浸提溶液混合后进行减压蒸馏浓缩，得到浸提物，取40g浸提物用甲醇充分溶解后进行离心得到上清液，将上清液进行过滤得到浸提物溶液；
(3)将步骤(2)得到的浸提物溶液上样于100-200目正相硅胶柱上，依次用300-500mL的环己烷、环己烷-乙酸乙酯混合液(体积比为1:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇混合液(体积比为5:1、2:1、1:1)和甲醇进行梯度洗脱I，通过琼脂扩散法进行抑菌试验追踪出活性成分所在的抑菌组分A；
(4)将步骤(3)得到的抑菌组分A用旋转蒸发仪蒸干后，重新溶解于15mL甲醇中，经离心、过滤除去杂质后得到抑菌组分A滤液，将抑菌组分A滤液上样于葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱上，采用甲醇进行梯度洗脱II，共收集50-80个组分，通过琼脂扩散法进行抑菌试验追踪出活性成分所在的抑菌组分B；
(5)将步骤(4)得到的抑菌组分B用旋转蒸发仪蒸干后，重新溶解于15mL甲醇中，经离心、过滤除去杂质后得到抑菌组分B滤液，将抑菌组分B滤液上样于半制备色谱柱进行分离纯化，半制备柱子型号为Agilent ZORBAXSB-C18(9.4×250mm，5μm)，检测波长为310nm，仪器型号为Agilent 1260，进样量为500μL，采用40-95体积％的甲醇-水混合液为流动相进行梯度洗脱III，流动相的流速为3mL/min，出峰时间为27.4-28.4min之间，重复多次后，共收集淡黄白色粉末约10mg，得到活性成分C。
活性成分C的鉴定分析
将活性成分C采用Agilent 6545Quadrupole-Time of Flight(Q-TOF)highresoloution mass spectrometer进行高分辨质谱分析，色谱柱为C18反向柱(Agilent，Eclipse Plus，1.8μm，50x 2.1mm)，流动相为含有0.1体积％甲酸-水混合液和乙腈，流速为0.3mL/min，梯度为2-12min内乙腈浓度由5％升至95％，进样量2μL；检测结果见图1。
将活性成分C溶解在氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)中，采用瑞士Bruker公司的700MHzAvance III(Ascend)进行核磁共振分析，结果见表1和图2至图6。
将活性成分C采用Thermo Nicolet iS10红外光谱分析仪进行红外光谱分析，结果见图7；将活性成分C进行紫外光谱分析，结果见图8。
表1活性成分C的核磁数据1H(600MHz)，13C(150MHz)，DMSO-d6
Figure BDA0003225117740000111
Figure BDA0003225117740000121
通过上述检测及解析，确定活性成分C的所有碳原子和氢原子的归属，得到了活性成分C的化合物结构如式(I)所示：
Figure BDA0003225117740000131
其化学名称为：
23-((4-氨基-4,5-二去氧-β-D-吡喃甘露糖))-氧苷-)-13-(1E)-1-甲基-1-丙烯基)-14,18-二甲基-15,17,19,21-四烯-11-酮基-26-羧基-1,3,27,28-四羟基-6,9,12,29-四氧四环[23.3.1.05,7.08,10]二十九烷；
英文名称为：
23-((4-Amino-4,5-dideoxy-β-D-mannopyranosyl))oxy)-13-(1E)-1-methyl-1-propenyl)-1,3,27,28-tetrahydroxy-14,18-dimethyl-11-oxo-6,9,12,29-tetraoxatetracyclo[23.3.1.05,7.08,10]nonacosa-15,17,19,21-tetraene-26-carboxylic acid。
实施例2活性成分C对人体病原真菌的活性测试及MIC值测定
a.采用琼脂扩散法测定实施例1中含有活性成分C的抑菌组分B对常见人体病原真菌的抑菌圈大小。
供试菌株为白色念珠菌Candida albicans、新生隐球菌Cryptococcusneoformans及酿酒酵母Saccharomyces.cerevisiae，分别用接种环从甘油保藏管中挑取少许菌液划线于平板上过夜培养活化菌株，挑取单菌落接种于适量PDB培养基中获得生长状态良好的培养液，再涂布于PDA培养基上，晾干后，在平板正中央打孔，加入约80μL实施例1中含有活性成分C的抑菌组分B，过夜培养，次日上午测定抑菌圈的直径并拍照，结果见表2和图9。
b.采用微量肉汤二倍稀释法测定实施例1获得的活性成分C的MIC浓度。
参照欧洲抗菌药物敏感试验委员会制定的标准文件7.2和9.3进行MIC测定，MIC定义为指示菌生长完全被抑制时的最低抗生素浓度。以白色念珠菌Candida albicans、新生隐球菌Cryptococcus neoformans及酿酒酵母Saccharomyces.cerevisiae作为指示菌，分别用接种环从甘油保藏管中挑取少许菌液划线于平板上过夜培养活化菌株，挑取单菌落接种于适量PDB培养基中获得生长状态良好的培养液；将培养液以接种量为5×105cfu/mL接种于PDB培养基中，按照200μL每孔平行分装于96孔板中，并向其中添加溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的实施例1获得的活性成分C，通过倍比稀释使活性成分C的浓度梯度在0-32μg/mL之间；将96孔板置于30℃培养箱中培养24h后，测定96孔板中各小孔内菌株的OD595吸光度；指示菌的生长完全被抑制的孔对应的浓度记录为MIC浓度，每个处理设置3个重复。以抗生素两性霉素B、匹马霉素作为药物对照组，其它的操作与活性成分C一致；以空白培养基为阴性对照，以仅接种供试菌株的为阳性对照；MIC浓度测定的结果见表3。
实施例3活性成分C对植物病原真菌的活性测试及MIC值测定
a.采用琼脂扩散法或对峙培养法检测实施例1中含有活性成分C的抑菌组分B对丝状植物病原真菌的抑菌圈直径。
供试菌株为小麦赤霉病原菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum时，采用对峙培养法：将小麦赤霉病原菌禾谷镰刀菌在PDA平板上培养2-3d，再用打孔器在菌丝生长外缘打若干孔，用接种针将菌丝块取出，放置在一个新的PDA平板中央，在距离中央3cm处用接种环接种实施例1中的放线动孢菌突变株，在温度为28℃的条件下培养3-5d，观察并测量抑菌圈大小。
供试菌株为西瓜枯萎病病原菌菌茄病镰刀菌Fusariums solani、辣椒炭疽病病原菌辣椒刺盘孢菌Colletotrichum capsici、辣椒白绢病病原菌齐整小核菌Sclerotiumrolfsi、烟草赤星病病原菌链格孢菌Alternaria alternate Fries Keisslar及水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kuhn时，采用琼脂扩散法，具体步骤为：供试菌株分别用接种环从甘油保藏管中挑取少许菌液划线于平板上过夜培养活化菌株，挑取单菌落接种于适量PDB培养基中获得生长状态良好的培养液，再涂布于PDA培养基上，晾干后，在平板正中央打孔(测试立枯丝核菌时，孔打在四周，据正中约3cm，正中接种立枯丝核菌菌核)，加入80μL实施例1中含有活性成分C的抑菌组分B，在温度为28℃的条件下培养3-5d，测定抑菌圈的直径并拍照，结果见表2和图10。
表2
病原真菌 抑菌圈的直径(mm)
酿酒酵母 28
白色念珠菌 31
新生隐球菌 34
茄病镰刀菌 25
齐整小核菌 23
禾谷镰刀菌 20
辣椒刺盘孢菌 14
链格孢菌 30
立枯丝核菌 20
b.采用微量肉汤二倍稀释法测定实施例1获得的活性成分C的MIC浓度。
以禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、茄病镰刀菌Fusariums solani、链格孢菌Alternaria alternate Fries Keisslar、辣椒刺盘孢菌Colletotrichum capsici作为指示菌时，分别从生长良好的指示菌平板上挑取相应的菌丝，接种至RPMI 1640培养基，制备孢子浓度为0.4×104-5×104CFU/mL的孢子悬浮液，按照200μL每孔平行分装于96孔板中，并向其中添加溶解在DMSO中的实施例1获得的活性成分C，通过倍比稀释使活性成分C的浓度梯度在0-80μg/mL之间；将96孔板置于30℃培养箱中培养24-72h后，观察各小孔内菌的生长情况；指示菌的生长完全被抑制的孔对应的浓度记录为MIC浓度，每个处理设置3个重复。
以齐整小核菌Sclerotium rolfsi、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici作为指示菌时，从生长良好的指示菌平板上挑取相应的菌丝，接种至PDA培养基，制备孢子浓度为0.4×104-5×104CFU/mL的孢子悬浮液，按照200μL每孔平行分装于96孔板中，并向其中添加溶解在DMSO中的实施例1获得的活性成分C，通过倍比稀释使活性成分C的浓度梯度在0-80μg/mL之间；将96孔板置于30℃培养箱中培养24-72h后，观察各小孔内菌的生长情况；指示菌的生长完全被抑制的孔对应的浓度记录为MIC浓度，每个处理设置3个重复。
以抗生素两性霉素B、匹马霉素作为药物对照组，其它的操作与活性成分C一致；以空白培养基为阴性对照，以仅接种供试菌株的为阳性对照；MIC浓度测定的结果见表3。
表3
Figure BDA0003225117740000171
通过表2和表3的结果表明，实施例1中分离、鉴定获得的活性成分C，即式(I)所示的多烯大环内酯类化合物，具有广谱的抗真菌活性，不仅可用于制备抗白色念珠菌、新生隐球菌及酿酒酵母等感染的药物，还可以应用于制备防治植物真菌病害的试剂、农药等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种多烯大环内酯类化合物，其特征在于，该多烯大环内酯类化合物的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003225117730000011
2.一种制备多烯大环内酯类化合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将放线动孢菌进行发酵培养得到发酵液，将所述发酵液经分离纯化得到所述多烯大环内酯类化合物；
其中，所述多烯大环内酯类化合物的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003225117730000012
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离纯化的过程包括：
(1)将所述发酵液经浸提、浓缩得到浸提物，将所述浸提物经溶解、固液分离得到浸提物溶液；
(2)将步骤(1)得到的浸提物溶液利用硅胶柱层析I进行梯度洗脱I，经抑菌试验得到抑菌组分A；
(3)将步骤(2)得到的抑菌组分A利用硅胶柱层析II进行梯度洗脱II，经抑菌试验得到抑菌组分B，将所述抑菌组分B利用半制备柱层析进行梯度洗脱III，得到所述多烯大环内酯类化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸提采用的浸提溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和丙酮中的至少一种，所述溶解采用的溶剂为选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种；
所述固液分离的过程包括：将所述溶解得到的溶液离心后进行过滤。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述硅胶柱层析I采用100-200目正向硅胶柱；
所述梯度洗脱I依次采用环己烷、环己烷-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇混合液和甲醇作为洗脱剂，所述环己烷、所述环己烷-乙酸乙酯混合液、所述乙酸乙酯、所述乙酸乙酯-甲醇混合液、所述甲醇各自与所述浸提物的体积质量比为6-15:1。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述硅胶柱层析II采用葡聚糖Sephadex LH-20柱；
所述梯度洗脱II和所述梯度洗脱III的流动相分别独立地采用低级有机醇-水溶液；
所述半制备柱层析采用Agilent ZORBAXSB-C18柱。
7.根据权利要求1所述的多烯大环内酯类化合物、根据权利要求2至6中任意一项所述的方法制得的多烯大环内酯类化合物在防治植物真菌病害中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病害为茄病镰刀菌、链格孢菌、辣椒刺盘孢菌、立枯丝核菌、齐整小核菌、辣椒疫霉菌和禾谷镰刀菌中的至少一种引起的植物真菌病害。
9.根据权利要求1所述的多烯大环内酯类化合物、根据权利要求2至6中任意一项所述的方法制得的多烯大环内酯类化合物在制备抗真菌药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗真菌药物为抑制酿酒酵母、白色念珠菌和新生隐球菌中的至少一种的药物。
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