CN113773292A - 一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针及其制备方法和应用，在免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的结构中引入具有较好脂溶性和较强给电子能力的香豆素和二苯胺结构单元，制备了一种香豆素类衍生物，其具有明显的AIE性质和较大的斯托克斯位移，可在免洗的情况下快速靶向细胞内的脂滴部位，并可实时动态的监测细胞内脂滴的迁移过程以及细胞内脂滴的数量变化。

Description

一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针及其制备方法和应用，具体涉及一种具有聚集诱导发光性质、较低的生物毒性、靶向脂滴的AIEgen荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

脂滴不仅仅是细胞内重要的储能场所，也是一个复杂的、活动旺盛、动态变化的多功能亚细胞器，它参与了许多重要的细胞过程，包括脂质代谢、膜运输、细胞激活和凋亡以及蛋白质降解等。脂滴水平的异常与许多疾病有着密不可分的关系，如肥胖、II型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病、癌症、中性脂贮存性疾病及Niemann Pick C疾病。根据文献报道，癌细胞中脂滴的数量高于正常细胞是因为癌细胞需要更多的脂滴提供的能量来加速细胞增殖。所以，脂滴的数量可作为一种潜在的肿瘤诊断指标。

目前检测脂滴的方法有免疫组织法、核磁法、拉曼散射法和荧光成像法。与其它方法相比，荧光成像法因其操作简便、灵敏度高、易于直接观察等优势，受到越来越多科研工作者的青睐。因此，利用荧光探针实时、原位的监测生物体内脂滴的数目变化对于揭示脂滴相关疾病的发生和发展起着非常重要的作用。目前已经商业化的脂滴染料有HCS LipidTOX系列和BODIPY系列等，但在实际使用过程中，这些商业化的染料还存在着孵化时间长、斯托克斯位移小、清洗过程繁琐、聚集诱导荧光淬灭(ACQ)等劣势。

近年来，新兴起的聚集诱导发光(AIE)材料可以很好的解决ACQ问题，AIE材料已经被广泛用于生物传感、生物成像和生物医药等领域。但是现有的聚集诱导发光(AIE)材料的结构及合成路线复杂。因此，开发具有AIE性质、结构简单、合成方便的具有较大斯托克斯位移的免洗型脂滴靶向的荧光探针仍具有挑战性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针及其制备方法和应用，其具有明显的AIE性质和较大的斯托克斯位移，可在免洗的情况下快速靶向细胞内的脂滴部位，并可实时动态的监测细胞内脂滴的迁移过程以及细胞内脂滴的数量变化。

本发明采取的技术方案如下：

一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针，所述AIEgen荧光探针的结构式为：

本发明还提供了所述免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将化合物M溶解于溶剂中，然后依次加入乙酰乙酸乙酯和哌啶，回流反应5-5.5h，结束后经浓缩、过滤、重结晶，即可制备得到所述免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针；

所述化合物M的结构式为：

所述化合物M、乙酰乙酸乙酯、哌啶的摩尔比为1：1.5～1.6：0.6～0.8。

所述溶剂为无水乙醇，化合物M在无水乙醇中的浓度为0.05-0.1mmol/mL。

所述重结晶为使用无水乙醇进行重结晶。

本发明还提供了所述免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针在定位细胞内脂滴中的应用，其可在1min之内靶向在细胞内的脂滴部位。

本发明还提供了所述免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针在靶向追踪细胞内脂滴融合和迁移过程中的应用。

本发明还提供了所述免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针在监测细胞内脂滴的数量变化中的应用。

本发明提供的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针，在其结构中引入具有较好脂溶性和较强给电子能力的香豆素和二苯胺结构单元，制备了一种香豆素类衍生物，其具有明显的AIE性质和较大的斯托克斯位移，以其作为免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针，可在免洗的情况下快速靶向细胞内的脂滴部位，并可实时动态的监测细胞内脂滴的迁移过程以及细胞内脂滴的数量变化。

本发明还在体外探究了免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针在脂滴环境下的荧光行为，结果发现免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针与O/W乳剂作用后，展现出明显的荧光增强现象。可见免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针作为免洗型脂滴特异性靶向荧光探针用于监测细胞内脂滴的动态变化具有重要的研究价值。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的结构和制备方法简单，制备过程中的反应条件温和，后处理简单，原料简单易得。

2.本发明提供的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针能够快速定位在细胞内的脂滴部位，并能实时监测脂滴融合和迁移的过程。

3.本发明提供的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针可监测细胞内脂滴的数量变化。

4.与商业化的脂滴探针相比，本发明提供的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针具有较大的斯托克斯位移，其激发波长为442nm，发射波长为578nm，斯托克斯位移为136nm，可降低背景干扰。

5.本发明提供的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针与细胞作用后，无需清洗即可用于显影测试。

附图说明

图1为免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的结构式；

图2为免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的红外光谱图；

图3为免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的氢谱核磁图；

图4为免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的碳谱核磁图；

图5是化合物L与不同体积分数乙醇/水混合溶液中的荧光发射光谱。插图为在365nm紫外灯照射下，化合物L在无水乙醇(水含量为0％)和体积分数为1％的乙醇水溶液(水含量为99％)中的荧光照片；

图6是化合物L与HepG2细胞作用后的共聚焦显微成像结果；

图7是化合物L与不同的商业染料(包括脂滴商染、线粒体商染和溶酶体商染)的共定位结果：图A1-A4化合物L显影图；图B1-B4分别对应不同商业染料的显影结果；图C1-C4分别对应图A1-A4与图B1-B4的叠加结果；图D1-D4分别对应共定位结果的皮尔森系数值；

图8是化合物L与HepG2细胞共培养20min后，每间隔1min拍摄的细胞成像图；

图9是用不同浓度的油酸刺激Hela细胞6h后，然后加入化合物L后的细胞成像图(A)；及用100μM油酸刺激Hela细胞不同的时间，然后加入化合物L后的细胞成像图(B)；

图10是化合物L与细胞作用不同时间点的显影图；

图11是化合物L与脂滴环境和其它分析物作用后的荧光发射光谱图，包括O/W乳剂、脂质体、ADP、ATP、BSA、Cys、DNA、GSH、RNA、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和组蛋白。

图12为对比例1中的化合物LC2的氢谱核磁图；

图13为对比例1中的化合物LC2的碳谱核磁图；

图14为对比例1中的化合物LC2在不同体积分数乙醇/水混合溶液中的荧光发射光谱。插图为在365nm紫外灯照射下，化合物L在无水乙醇(水含量为0％)和体积分数为20％的乙醇水溶液(水含量为80％)中的荧光照片；

图15是对比例1中的化合物LC2与HepG2细胞作用后的共聚焦显微成像结果；

图16是对比例1中的化合物LC2与细胞作用不同时间点的显影图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针，其结构式为：

所述免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的制备方法及合成路线如下：

在100mL圆底烧瓶中，加入化合物M(0.43g,1.5mmol)，用20mL乙醇使其完全溶解，然后依次加入乙酰乙酸乙酯(0.29g,2.25mmol)和100μL哌啶，回流反应5h后，减压蒸出大部分溶剂后，冷却至室温，有固体析出，减压抽滤，粗产物用乙醇重结晶，得黄色固体化合物L0.37g，产率:69％。其红外、氢谱、碳谱如图2、3、4所示。

IR(KBr,cm^-1)selected bands:3063,2362,1718,1675,1614,1579,1491,1432,1358,1348,1338,1288,1276,1215,1202,1135,1074,977,856,753,694,640,504.

¹H NMR(600MHz,d₆-DMSO)δ:8.54(s,1H),7.73(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(t,J＝7.8Hz,4H),7.31(m,6H),6.72(m,1H),6.46(d,J＝1.7Hz,1H),2.53(s,3H).

¹³C NMR(151MHz,d₆-DMSO)δ194.97,169.68,159.50,157.30,153.90,147.77,145.19,132.55,130.70,127.41,126.89,119.16,115.36,111.29,102.83,69.14,30.55,16.92.

ESI-MS:356.1281([M+1]⁺).

将化合物L分散到不同体积分数的乙醇/水混合溶液中，测试在442nm激发波长下的荧光发射光谱，如图5所示，从图中可以看出，在含水量为99％的乙醇水溶液(体积分数为1％的乙醇水溶液)中，化合物L在578nm具有较强的荧光发光强度，可见，化合物L具有明显的AIE性质。

实施例2

免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的生物学研究

1.脂滴靶向研究

将实施例1制备的化合物L用二甲基亚砜溶解配成浓度为10^-2M的母液，用培养基稀释至10μM，待用。可传代的人肝癌细胞(HepG2)接种于激光共聚焦小皿(NEST货号：801002)上，每孔接种5×10⁵个细胞，待皿中细胞密度涨至50％时即可使用。首先移去皿中的培养基，加入上述待用的化合物L溶液1mL，在含有95％空气和5％CO₂气体的培养箱中于37℃下作用20分钟，设置如下两组实验：(1)用PBS缓冲溶液洗涤2遍；(2)不用PBS缓冲溶液洗涤。在Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜设备上观察结果，设置激发波长为442nm；如图5所示，从图中可以看出，化合物L与细胞着色后，清洗与未经清洗的细胞成像结果基本一致，说明化合物L与细胞作用后，无需清洗即可用于显影测试化合物L可在不用清洗的情况下可靶向在细胞内的脂滴部位。

为了证明本发明中的化合物能够靶向在细胞内的脂滴部位，按照上述培养细胞的方法，将四组人肝癌细胞(HepG2 cell)与1mL 10μM化合物L在37℃下作用20min，用PBS缓冲溶液洗涤2遍后，在442nm的激发波长下进行激光共聚焦显影，实验结果如图6中A1-A4所示；

然后分别与商业染料BODIPY 493/503(脂滴商染)、HCS LipidTOX Deep Red(脂滴商染)、Mitotracker Red(线粒体商染)和Lysotracker Red(溶酶体商染)共培养20min，用PBS缓冲溶液洗2遍，分别在488nm、633nm、579nm和577nm的激发波长之下进行激光共聚焦显影，显影结果如图7中B1-B4所示；图C1-C4分别对应图A1-A4与图B1-B4的叠加结果；图D1-D4分别对应共定位结果的皮尔森系数值。由图3可证明化合物L能够靶向在细胞内的脂滴部位。

2.脂滴融合、迁移过程的研究

按照脂滴靶向研究中的实验方法培养细胞，将人肝癌细胞(HepG2 cell)与1mL 10μM化合物L在37℃下培养20min，用PBS缓冲溶液洗2遍后加入新鲜的培养基，在442nm的激发波长下进行激光共聚焦显影，如图8所示，从图中可以看出，化合物L可实时监测脂滴融合和迁移的过程。

3.监测细胞内脂滴的数量变化

油酸可以诱导细胞产生脂滴，而且人宫颈癌(Hela)细胞中的脂滴数量比人肝癌细胞中的脂滴数量低，所以以Hela细胞为模型，用化合物L来监测由油酸刺激的脂滴变化。设置如下两组实验：(1)将Hela细胞分成四组，在皿中分别加入1mL不同浓度的油酸(0、25、50、100μM)与Hela细胞共培养6h，移去皿中的培养基，加入1mL新鲜的含有10μM化合物L的培养基(DMEM高糖培养基，含有10％的血清和1％的双抗)，继续培养20min，用PBS缓冲溶液洗涤2遍；(2)将Hela细胞分成四组，在皿中分别加入1mL浓度为100μM的油酸，与Hela细胞共同培养不同的时间，培养时间分别为0、2、4、6h，移去皿中的培养基，加入1mL新鲜的含有10μM化合物L的培养基(DMEM高糖培养基，含有10％的血清和1％的双抗)，继续培养20min，用PBS缓冲溶液洗涤2遍；在442nm的激发波长下进行激光共聚焦显影，如图9所示。从图5A和5B中可以看出，无论用不同浓度的油酸刺激细胞还是用同一浓度的油酸刺激细胞不同的时间，细胞内脂滴的数量都在不断增加，所以细胞内的荧光强度也在不断增强，说明化合物L可用于监测细胞内脂滴的数量变化。

4.进入脂滴的时间研究

将人肝癌细胞(HepG2 cell)接种于共聚焦小皿中，待细胞密度涨至50％时即可使用。将HepG2细胞置于激光共聚焦显微镜下，设置激发波长为442nm，选择区域进行拍摄，然后加入1mL 10μM化合物L，每间隔1min进行拍摄，实验结果如图10所示，从图中可以看出，化合物L能在1min之内靶向在细胞内的脂滴部位，说明化合物L可快速定位脂滴部位。

5.识别机理研究

利用荧光发射光谱检测了化合物L在脂滴环境和其它分析物存在下的荧光行为。选用O/W乳剂来模拟脂滴环境，其它分析物选用脂质体、二磷酸腺苷(ADP)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、牛血清白蛋白(BSA)、半胱氨酸(Cys)、小牛胸腺DNA、谷胱甘肽(GSH)、核糖核酸(RNA)、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组蛋白。O/W乳剂的配制：在100mL圆底烧瓶中依次加入63.9mg甘油三油酸酯、0.0025mM十六烷基三甲基溴化铵和50mL的PBS缓冲溶液，室温下剧烈搅拌6h后待用。脂质体的配制：称取75.8mg的脂质体溶于20mL氯仿中，在37℃下减压除去溶剂，冷却至室温后，加入50mL的PBS缓冲溶液，室温下剧烈搅拌2h后待用。ADP、ATP、BSA、DNA、RNA和组蛋白的母液浓度为5mg/mL，Cys、GSH、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的母液浓度为10^-2mol/L。化合物L的母液浓度为10^-3mol/L，溶剂为二甲基亚砜。用移液枪分别移取50μL化合物L的母液，置于14个5mL的容量瓶中，1号容量瓶作为对照，用PBS缓冲溶液定容至5mL，2号和3号容量瓶分别用脂质体和O/W乳剂定容至5mL，其余容量瓶中分别加入200μL上述分析物，并用PBS缓冲溶液定容至5mL。设置仪器参数为442nm，狭缝宽度均为5nm，电压为500V，实验结果见图11所示，从图中可以看出，化合物L在O/W乳剂中的荧光强度高于其它分析物，说明化合物L中的亲酯部分使其更容易渗入到O/W乳剂中的封闭囊泡中，限制了分子中单键的旋转，从而使得荧光强度增强。

对比例1

化合物LC2，其结构式如下：

所述化合物LC2的制备方法如下：

在100mL圆底烧瓶中，加入化合物M(0.43g,1.5mmol)，用20mL乙醇使其完全溶解，然后依次加入4-丁氧基苯乙腈(0.57g,3.0mmol)和100μL哌啶，回流反应24h后，向反应液中加入10mL 4mol/L的盐酸溶液，继续反应24h，反应结束后，冷却至室温，倒入200mL的冰水混合物中，用二氯甲烷萃取3次，收集有机层，无水硫酸镁干燥过夜，蒸出大部分溶剂，经硅胶柱层析分离提纯(石油醚/乙酸乙酯＝40/1)，得黄绿色固体LC2 0.11g，产率：16％

该对比例制备得到的化合物LC2的氢谱、碳谱分别如图12、13所示。

¹H NMR(600MHz,d₆-DMSO)δ:8.07(s,1H),7.73(m,1H),7.68-7.63(m,3H),7.57(d,J＝8.6Hz,1H),7.42(t,J＝7.7Hz,4H),7.20(t,J＝7.7Hz,4H),6.99(t,J＝7.0Hz,2H),6.81(d,J＝12.0Hz,1H),6.63(s,1H),4.00(t,J＝12.0Hz,2H),1.76-1.69(m,2H),1.45(m,2H),0.95(t,J＝7.5Hz,3H).

¹³C NMR(151MHz,d₆-DMSO)δ:167.42,160.24,159.16,154.40,150.69,146.23,132.19,131.97,130.44,129.95,129.12,126.43,125.63,116.52,114.62,113.35,105.67,67.57,65.48,31.19,30.48,19.19,19.11,14.14,13.99.

将化合物LC2分散到不同体积分数的乙醇/水混合溶液中，测试在400nm激发波长下的荧光发射光谱，如图14所示，从图中可以看出，在含水量为80％的乙醇水溶液(体积分数为20％的乙醇水溶液)中，化合物LC2在505nm具有较强的荧光发光强度，可见，化合物LC2具有明显的AIE性质。

将该对比例制备的化合物LC2用二甲基亚砜溶解配成浓度为10^-2M的母液，用培养基稀释至10μM，待用。可传代的人肝癌细胞(HepG2)接种于激光共聚焦小皿(NEST货号：801002)上，每孔接种5×10⁵个细胞，待皿中细胞密度涨至50％时即可使用。首先移去皿中的培养基，加入上述待用的化合物LC2溶液1mL，在含有95％空气和5％CO₂气体的培养箱中于37℃下作用20分钟，设置如下两组实验：(1)用PBS缓冲溶液洗涤2遍；(2)不用PBS缓冲溶液洗涤。在Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜设备上观察结果，设置激发波长为405nm；如图15所示，从图中可以看出，化合物LC2可以靶向在细胞内的脂滴部位。未经清洗的细胞成像效果不如清洗后的细胞成像效果好，说明化合物LC2与细胞作用后，需要清洗才能用于细胞内脂滴的成像。

将人肝癌细胞(HepG2 cell)接种于共聚焦小皿中，待细胞密度涨至50％时即可使用。将HepG2细胞置于激光共聚焦显微镜下，设置激发波长为405nm，选择区域进行拍摄，然后加入1mL 10μM化合物LC2，每间隔10min进行拍摄，实验结果如图16所示，从图中可以看出，化合物LC2要在10min才能进入细胞靶向脂滴部位，而且在细胞以外的区域背景噪音较高，说明化合物LC2是一个非免洗型的靶向脂滴的荧光探针。

上述参照实施例对一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针及其制备方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针，其特征在于，所述AIEgen荧光探针的结构式为：

2.如权利要求1所述的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将化合物M溶解于溶剂中，然后依次加入乙酰乙酸乙酯和哌啶，回流反应5-5.5h，结束后经浓缩、过滤、重结晶，即可制备得到所述免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针；

所述化合物M的结构式为：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物M、乙酰乙酸乙酯、哌啶的摩尔比为1：1.5～1.6：0.6～0.8。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为无水乙醇，化合物M在无水乙醇中的浓度为0.05-0.1mmol/mL。

5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述重结晶为使用无水乙醇进行重结晶。

6.如权利要求1所述的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针在定位细胞内脂滴中的应用。

7.如权利要求1所述的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针在靶向追踪细胞内脂滴融合和迁移过程中的应用。

8.如权利要求1所述的免洗型靶向脂滴的AIEgen荧光探针在监测细胞内脂滴的数量变化中的应用。

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