CN113750008A

CN113750008A - 一种茉莉花酶解发酵物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113750008A
Application number: CN202111020884.3A
Authority: CN
Inventors: 金立峰; 梁彬霞
Original assignee: Shenzhen Haohan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Liying Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2041-09-01
Also published as: CN113750008B

Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了一种茉莉花酶解发酵物及其制备方法和应用。本发明所述茉莉花酶解发酵物由茉莉花经黑曲霉和米曲霉的酶液预处理后，再经乳酸菌和酵母菌发酵制得。本发明以米曲霉和黑曲霉的酶液对茉莉花酶解预处理，然后选择对适合于茉莉花发酵的菌种进行了筛选，以特定的乳酸菌和酵母菌对其发酵，能够显著提高其抗氧化活性，同时粗多糖以及总黄酮含量也得到了明显提高，为其在化妆品领域中的应用提供了更好的基础。

Description

一种茉莉花酶解发酵物及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种茉莉花酶解发酵物及其制备方法和应用。

背景技术

茉莉花(学名：Jasminum sambac(L.)Ait)为木樨科素馨属常绿灌木。原产波斯湾一带，汉代以前,随着中外经济和文化的交流而传入中国。茉莉因其花香芬芳馥郁,优雅纯正，深受人们喜爱，从明代起,茉莉开始作为药用植物。著名药物学家李时珍在《本草纲目》中，曾对茉莉的性状、栽培和利用，作了较为详细的描述,指出茉莉花“辛热无毒”，可“蒸油取液，作面脂头泽，长发润燥香肌”。茉莉花提取物在化妆品中的主要作用是抗氧化、美白祛斑以及促进皮肤渗透，能消除自由基，同时有很强的渗透力，帮助其他营养成分被皮肤吸收；有一定的酪氨酸酶抑制作用，可辅助美白。由于其气味清香，在化妆品中常用于香精香料的配制。

茉莉花作为中国的天然植物资源之一，含有多糖、黄酮、挥发油等多种活性物质，目前，对茉莉花中有效成分的提取主要是醇回流提取技术、超声波提取技术以及用解吸-热提两步法等物理和化学提取手段，利用微生物发酵技术对活性成分进行提取报道较少。申请号为201911028356.5的专利报道了一种茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法及产物的应用；采用酵母和植物乳杆菌对茉莉花进行了发酵，具有良好的抗衰老效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种茉莉花酶解发酵物及其制备方法，使得所制备的茉莉花酶解发酵物能够显著提高抗氧化能力；

本发明的另外一个目的在于提供一种茉莉花酶解发酵物及其制备方法，使得所制备的茉莉花酶解发酵物能够显著提高粗多糖含量；

本发明的另外一个目的在于提供一种茉莉花酶解发酵物及其制备方法，使得所制备的茉莉花酶解发酵物能够显著提高总黄酮含量；

本发明的另外一个目的在于提供上述制备的茉莉花酶解发酵物在制备化妆品中的应用。

为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述技术问题，本发明提供了一种茉莉花酶解发酵物，由茉莉花经黑曲霉和米曲霉的酶液预处理后，再经乳酸菌和酵母菌发酵制得。

在本发明具体实施方式中，所述酵母菌为马克鲁维酵母，可购自于中国工业微生物菌种保藏中心，编号为CICC 1218。所述乳酸菌为植物乳杆菌，具体为植物乳杆菌植物亚种，编号为CICC 20242。本发明酶解预处理阶段的黑曲霉和米曲霉同样可以购自于中国工业微生物菌种保藏中心，编号为CICC 2039和CICC 2005。

作为优选，所述黑曲霉的酶液由黑曲霉在包含碳源、氮源、无机盐和茉莉花的培养基中进行固体发酵后获得。其中，碳源和氮源为柑橘果皮和麸皮，无机盐可选用MS、HB、LS、White等培养基中的无机盐，例如(NH₄)₂SO₄、K₂HPO₄、KCl、MgSO₄、Na₂SO₄、FeSO₄等或它们的水合物。

作为优选，所述米曲霉的酶液由米曲霉在糯米和水的混合物中进行固体发酵后获得。

与其他不同菌种以及不同制备工艺的发酵物和茉莉花醇提物相比，本发明获得的茉莉花酶解发酵物在DPPH清除率、ABTS清除率、羟基自由基清除率和超氧阴离子清除率显著提高，并且在粗多糖和总黄酮含量上也明显提高。基于此，本发明提出了所述茉莉花酶解发酵物在制备化妆品中的应用，所述化妆品为对额外增加或提高美白、祛斑、抗衰老、抗氧化等效果有需求的化妆品。

同时，本发明还提供了所述茉莉花酶解发酵物的制备方法，包括：

步骤1、黑曲霉和米曲霉接种至产酶培养基中进行固体发酵获得酶液；

步骤2、茉莉花用黑曲霉和米曲霉的酶液酶解预处理；

步骤3、酶解预处理液用乳酸菌和酵母菌发酵，获得所述茉莉花酶解发酵物。

作为优选，步骤1为：

黑曲霉接种至包含碳源、氮源、无机盐和茉莉花的培养基中进行固体发酵，发酵完成后液添加柠檬酸缓冲液(优选1:20质量体积比)冰浴提取，离心取上清获得黑曲霉酶液；进一步优选地，该培养基包含柑橘果皮、麸皮、茉莉花、(NH₄)2SO₄、K₂HPO₄、KCl、MgSO₄、Na₂SO₄、FeSO₄；在具体的实施方式中，该培养基每1L中组分如下：

柑橘果皮2.5g，麸皮1g，茉莉花1g，(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.04g，KCl 0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，Na₂SO₄ 0.02g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，调节pH值至4.5，添加适量纯化水定容1L，121℃灭菌20min。

米曲霉接种至糯米和水的混合物中进行固体发酵，发酵完成后液添加柠檬酸缓冲液(优选1:20质量体积比)冰浴提取，离心取上清获得米曲霉酶液。进一步优选地，糯米：水＝30：36(质量比)；自然pH，100℃灭菌60min；柠檬酸缓冲液pH4.8；

作为优选，步骤2中酶解预处理在酶液适宜温度范围内，例如50℃±5℃进行酶解；酶解时间3h。

作为优选，步骤3为：

酶解预处理液先接种乳酸菌进行第一阶段的发酵，发酵完成后接种酵母菌进行第二阶段的发酵，发酵液离心的上清液为所述茉莉花酶解发酵物。进一步优选地，两个阶段发酵的时间为7d，乳酸菌接种比例为5％，酵母菌接种比例为1％，发酵环境选择菌种的适宜环境即可，在本发明具体实施中给出了37±5℃的温度范围。

由以上技术方案可知，本发明以米曲霉和黑曲霉的发酵酶液对茉莉花酶解预处理，然后选择对适合于茉莉花发酵的菌种进行了筛选，以特定的乳酸菌和酵母菌对其发酵，能够显著提高其抗氧化活性，同时粗多糖以及总黄酮含量也得到了明显提高，为其在化妆品领域中的应用提供了更好的基础。

具体实施方式

本发明公开了一种茉莉花酶解发酵物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述工艺、应用和产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述工艺、应用和产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”、“步骤1”和“步骤2”以及“(1)”和“(2)”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

在本发明对比实验中，除去各组应有的差异外，其他未特别说明的实验环境、工艺参数、原料来源批次等保持一致，保证实验结果的可对比性。

1、本发明中茉莉花酶解预处理的酶液制备(黑曲霉酶液：米曲霉酶液＝2:1)

(1)黑曲霉产酶方法：

黑曲霉CICC 2039，中国工业微生物菌种保藏中心；

产酶培养基：柑橘果皮2.5g,麸皮1g，茉莉花1g，(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 0.04g，KCl0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，Na₂SO4 0.02g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，调节pH值至4.5，添加适量纯化水定容1L，121℃灭菌20min。

将活化后的黑曲霉种子液接种到产酶培养基中，30℃下190r/min恒温培养72h。进行固体发酵，发酵完成后液添加柠檬酸缓冲液(1:20质量体积比)冰浴提取，离心取上清获得发酵，发酵液离心取上清获得黑曲霉酶液。

(2)米曲霉产酶方法：

米曲霉CICC 2005，中国工业微生物菌种保藏中心；

产酶培养基：糯米∶水＝30∶36(质量比)；自然pH，100℃灭菌60min。

将活化后的米曲霉种子液按照10 ⁶个孢子/g糯米接种到糯米固体产酶培养基中，30℃下静置培养72h。配置pH4.8的柠檬酸缓冲液，按照1:20(质量体积比)加入柠檬酸缓冲液，冰浴过夜后离心，取上清液即为米曲霉酶液。

(3)红曲霉产酶方法：

红曲霉CICC40941中国工业微生物菌种保藏中心；方法同黑曲霉。

2、发酵菌种及其活化

乳酸菌：植物乳杆菌(植物乳杆菌植物亚种CICC 20242)；

酵母菌：酿酒酵母(BNCC188427，北纳生物，对比用菌株)，马克鲁维酵母(马克斯克鲁维酵母CICC 1218)；

酵母菌：将菌种接种于YPD培养基中，于30℃恒温培养36-48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×10⁷CFU/mL以上；

乳酸菌：将菌种接种于MRS培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×10⁸CFU/mL以上。

3、指标检测方法

(1)粗多糖含量的检测：参照SN/T 4260-2015测定发酵液和提取液中的粗多糖的总含量。

(2)总黄酮含量检测：参照GB/T 12143-2008附录G中方法测定发酵液和提取液中总黄酮的含量。

(3)DPPH自由基清除能力的测定：

实验组加入1ml样液+1ml 0.2mmol/L的DPPH。对照组加入1ml无水乙醇+1ml样液。空白组加入1ml无水乙醇+1ml 0.2mmol/L的DPPH，混匀室温(25℃)下静置30min。517nm下，吸取300ul，测定实验组吸光度，记为Ai。测定对照组吸光度，记为Aj。记空白组为A0。每个样品测3次平行。

DPPH清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％

(4)超氧阴离子自由基清除能力测定：

在10mL试管中加入5.7mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.2)，加入0.2mL样品进行混合之后放置在25℃保温箱中，10min后取出，再加0.1mL(10mmol/L)邻苯三酚溶液(已预热)，快速混匀后用多功能酶标仪测定320nm波长1min内吸光值的增加值(Aj)，线性范围内算出每1min吸光度的增加值，另取如上试剂，用等体积水替代样品，测定在320nm波长下，1min内吸光度的增加值(Ai)。

超氧阴根离子自由基清除率(％)＝(Ai-Aj)/Ai×100％

(5)羟基自由基(·OH)清除能力测定：

羟基自由基(·OH)清除测试方法参照Fenton反应方法，在试管中依次加入硫酸亚铁溶液(6mmol/L)、过氧化氢溶液(6mmol/L)、样品各2mL后静放置10min，之后再加入2mL水杨酸溶液(6mmol/L)，静放30min后在510nm处测定吸光度A0，用蒸馏水代替样品溶液同样处理，测定吸光值Ax。

羟基自由基(·OH)清除率(％)＝(1-A0/Ax)×100％

(6)ABTS清除力的测定：

0.2mL 7.4mmoL/L ABTS与0.2mL 2.6mmoL/L K2S2O8混合，在室温条件黑暗处反应12h，反应完成后用95％乙醇(pH＝7.4磷酸盐缓冲液，95％乙醇或甲醇)稀释40-50倍，使得混合液在734nm光度下吸收值处于0.68-0.72(工作液)。

配置并吸取浓度为0μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL、20μg/mL的Vc标准液0.2mL于2mL离心管中，加入0.8mL稀释后的工作液，混合均匀后静置反应6-8min，迅速测定734nm波长处的吸光值。对以标准液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。将不同处理酵素样品稀释后，分别吸取0.2mL，加入0.8mL稀释后的工作液，混合均匀后静置反应6-8min，迅速测定734nm波长处的吸光值。每个样品测3次平行。

实施例1：不同酶解发酵方式的抗氧化能力以及总黄酮、粗多糖含量的对比

将以下各种不同处理的酶解发酵方式进行对比，分组方案如下(各组茉莉花干粉均为5g)：

(1)茉莉花酶解预处理

黑曲霉和米曲霉发酵获得的酶液：茉莉花干粉＝20:1的比例，50℃提取3小时，离心取上清用于指标检测。

(2)茉莉花醇回流提取

称量茉莉花干粉5g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入50-90％乙醇50mL，于80℃温度下回流提取，每隔1h取出液体，过滤，残渣继续加入50-90％乙醇50mL回流提取，重复上述步骤3次。

(3)茉莉花直接发酵(乳酸菌+酿酒酵母)

取茉莉花干粉，按照1:100质量体积比加水，分装在250mL的蓝盖试剂瓶中(200mL/瓶)，灭菌后(115℃，30min)准备发酵。首先按接种量5％的比例接入活化好的乳酸菌菌种，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵7d后按照1％比例接种酿酒酵母，发酵7天后，9000r/min离心15min得到茉莉花发酵物用于指标检测。

(4)茉莉花直接发酵(乳酸菌+马克鲁维酵母)

同第(3)组工艺，酵母菌选用马克鲁维酵母；

(5)茉莉花酶解预处理(米曲霉+黑曲霉)+发酵

黑曲霉和米曲霉发酵获得的酶液：茉莉花干粉＝20:1的比例，50℃酶解3小时后，加入4倍体积的水，分装在250mL的蓝盖试剂瓶中(200mL/瓶)，灭菌后(115℃，30min)准备发酵。首先按接种量5％的比例接入活化好的乳酸菌菌种，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵7d后按照1％比例接种马克鲁维酵母菌，发酵7天后，9000r/min离心15min得到茉莉花发酵物用于指标检测。

(6)茉莉花所有菌种一起发酵

取茉莉花干粉，按照1:100质量体积比加水，分装在250mL的蓝盖试剂瓶中(200mL/瓶)，灭菌后(115℃，30min)准备发酵。首先按接种量5％的比例接入活化好的米曲霉和黑曲霉菌种，置于28℃培养箱中培养7天后，按接种量5％的比例接种乳酸菌菌种，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵7d后按照1％比例接种酿酒酵母，30℃发酵7天后，9 000r/min离心15min得到茉莉花发酵物用于指标检测。

(7)茉莉花酶解预处理(米曲霉)+发酵

参照第(5)组工艺，区别是全部使用米曲霉；

(8)茉莉花酶解预处理(黑曲霉)+发酵

参照第(5)组工艺，区别是全部使用黑曲霉；

(9)茉莉花酶解预处理(米曲霉+红曲霉)+发酵

参照第(5)组工艺，区别是黑曲霉用红曲霉替换；

各组指标检测的结果见表1；

表1

根据表1结果可以看出，先由米曲霉和黑曲霉产酶进行预处理后再进行发酵可以获得较高的抗氧化能能力、粗多糖含量和总黄酮含量，而参照现有技术中的一些方式或类似微生物菌株设置的对照组，其虽具有一定的抗氧化能力，但是明显不如本发明的酶解发酵物(第5组工艺)，而且茉莉花的醇提取物在整体上是不如微生物发酵工艺的。

此外，本发明针对第(5)组工艺的DPPH清除率进行了原液和稀释50倍的检测，DPPH清除率分别为99％和95％左右。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种茉莉花酶解发酵物，其特征在于，由茉莉花经黑曲霉和米曲霉的酶液预处理后，再经乳酸菌和酵母菌发酵制得。

2.根据权利要求1所述茉莉花酶解发酵物，其特征在于，所述酵母菌为马克鲁维酵母。

3.根据权利要求1所述茉莉花酶解发酵物，其特征在于，所述乳酸菌为植物乳杆菌。

4.根据权利要求1所述茉莉花酶解发酵物，其特征在于，所述黑曲霉的酶液由黑曲霉在包含碳源、氮源、无机盐和茉莉花的培养基中进行固体发酵后获得。

5.根据权利要求1所述茉莉花酶解发酵物，其特征在于，所述米曲霉的酶液由米曲霉在糯米和水的混合物中进行固体发酵后获得。

6.权利要求1-5任意一项所述茉莉花酶解发酵物在制备化妆品中的应用。

7.权利要求1所述茉莉花酶解发酵物的制备方法，其特征在于，包括：

步骤2、茉莉花用黑曲霉和米曲霉的酶液酶解预处理；

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，步骤1为：

黑曲霉接种至包含碳源、氮源、无机盐和茉莉花的培养基中进行固体发酵，发酵后通过柠檬酸缓冲液提取，离心取上清获得黑曲霉酶液；米曲霉接种至糯米和水的混合物中进行固体发酵，发酵后通过柠檬酸缓冲液提取，离心取上清获得米曲霉酶液。

9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，步骤3为：

酶解预处理液先接种乳酸菌进行第一阶段的发酵，发酵完成后接种酵母菌进行第二阶段的发酵，发酵液离心的上清液为所述茉莉花酶解发酵物。