CN113736703A - 一种培养基及其在分离纯化培养氨氧化细菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培养基及其在分离纯化培养氨氧化细菌中的应用，该培养基含有磷酸二氢钾0.1～0.2g/L，硫酸镁0.01～0.05g/L，碳酸钙4～5g/L，碳酸氢钠0.2～0.4g/L，氯化铵0.25～0.55g/L；培养基中钠离子浓度不高于136.23mg/L，钾离子不高于57.35mg/L，镁离子不高于4.93mg/L。本发明提供的培养基成分简单、无机盐浓度低，降低了成本，同时避免了Na、K、Mg金属离子对氨氧化细菌的抑制作用，从而显著缩短氨氧化细菌分离过程中的培养周期和使氨氧化细菌菌落形态更大，向胞外释放大量H⁺溶解碳酸钙产生透明圈指示菌落位置，解决了固体平板上氨氧化细菌形态微小不易识别的问题。

Description

一种培养基及其在分离纯化培养氨氧化细菌中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种培养基及其在分离纯化培养氨氧化细菌中的应用。

背景技术

当下，含氮物污染愈发严重。氨氧化反应是硝化作用的第一个步骤，也是限速步骤，氨氮向亚硝酸盐氮的转化是生物脱氮的关键，控制着硝化作用的整个过程。氨氧化菌越来越受到广泛的关注，目前，氨氧化化细菌的研究主要集中在富集培养、异养氨氧化细菌的分离纯化培养和混合菌群的多样性研究方面，而在废水生物脱氮中起主要作用的是化能自养型硝化细菌，关于其分离培养的报道不多，主要原因有如下三点：

1、自养型硝化细菌生长速率缓慢，生长代时普遍10小时以上，在固体平板上培养时间长以月计，分离培养后期平板易干裂、长霉菌；

2、菌落形态极其微小，难于观察，富集物中含有较多的异养型伴生菌，需要频繁传代转接以减少伴生菌的数量和种类，且伴生菌数量远大于化能自养氨氧化细菌、生长快于自养氨氧化细菌，会掩蔽目标菌群，难以从中识别和分离出自养型氨氧化细菌；

3、自养型氨氧化细菌对环境因子变化非常敏感，温度、pH、金属离子、游离氨、溶氧等因素都容易给自养型氨氧化细菌的深入研究带来困难。

鉴于上述特性的氨氧化细菌难于在实验室纯化培养，且目前筛选自养型氨氧化细菌的方法仍为传统的固体平板法：

1、琼脂平板：接种富集物，长出的菌落种类丰富，含有较多的异养微生物。该培养基选择性不强，琼脂中不可避免含有杂质，杂菌生长多且快，容易屏蔽氨氧化细菌，但相较于硅胶平板，培养氨氧化细菌时间要短。

2、水洗洋菜平板：容易生长杂菌，杂菌生长速度快，菌落大，影响目的菌落观察，造成平板污染。

3、硅胶平板：硅胶平板是稀酸和水玻璃中和形成的凝胶，该平板不含有机物，适合培养自养菌。硅胶平板上长出的氨氧化细菌菌落小如针尖，呈透明或黄色，杂菌少，选择性较强，但制作工序复杂，培养时间更长，菌落太小，平板易于干裂、变薄变脆。

发明内容

为了解决现有方法中分离氨氧化细菌时间长、菌落形态微小不易识别的问题，本发明的目的在于提供一种培养基及其在分离纯化培养氨氧化细菌中的应用，其成分更简单，较之于通用培养基，无需添加氯化钠、氯化钾，并降低了硫酸镁浓度，排除了过量金属离子对氨氧化细菌的抑制作用，可以显著缩短氨氧化细菌分离过程中的培养周期和使氨氧化细菌菌落形态更大。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种培养基，含有磷酸二氢钾0.1～0.2g/L，硫酸镁0.01～0.05g/L，碳酸钙4～5g/L，碳酸氢钠0.2～0.4g/L，氯化铵0.25～0.55g/L，微量元素溶液1mL/L；培养基中钠离子浓度不高于136.23mg/L，钾离子浓度不高于57.35mg/L，镁离子浓度不高于4.93mg/L；

所述的微量元素溶液含有EDTA-Na₂ 195g/L，FeSO₄·7H₂O 50g/L，H₃BO₃ 0.062g/L，CuCl₂·2H₂O 0.017g/L，MnC1₂·4H₂O 0.100g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.036g/L，ZnCl₂ 0.070g/L，CoCl₂·6H₂O 0.190g/L和NiCl₂·6H₂O 0.024g/L；

制备固体平板时，加入琼脂粉作为凝固剂；

所述琼脂粉的加入量优选16～20g/L；

优选地，所述的培养基含有磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.03g/L，碳酸钙5g/L，碳酸氢钠0.21g/L，氯化铵0.265g/L，微量元素1mL/L。

上述培养基的配制包括以下步骤：先配制只含有磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙、琼脂的培养基，高压蒸汽灭菌后，再添加用0.22μm滤膜过滤的碳酸氢钠、氯化铵、微量元素，混匀后制成培养基平板。

优选地，培养基平板中培养基厚度为培养皿高度的1/2～3/4。

本发明上述的培养基可以用于分离、纯化、培养氨氧化细菌；

将含有氨氧化细菌的富集液涂布在上述培养基平板上，用保鲜膜包裹平板，倒置避光保存于30-37℃环境中；培养13-15天后，培养基平板上长出湿润、橘黄色的圆点状氨氧化细菌菌落；

所述的保鲜膜优选聚乙烯材质保鲜膜。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的培养基成分简单、无机盐浓度低，降低了成本，同时避免了Na、K、Mg金属离子对氨氧化细菌的抑制作用，从而显著缩短氨氧化细菌分离过程中的培养周期和使氨氧化细菌菌落形态更大，氨氧化细菌活性旺盛，向胞外释放大量H⁺溶解碳酸钙产生透明圈指示菌落位置，解决了固体平板上氨氧化细菌形态微小不易识别的问题，使氨氧化细菌的分离纯化过程更简单、快速、高效；平板中倒入大体积固体培养基以及外层包裹保鲜膜的制作工序，解决了培养周期长而失水干裂的问题。本发明中的培养基及方法在氨氧化细菌的分离纯化中不仅效率高，而且重复性好。

附图说明

图1是氯化钠对氨氧化细菌氨氧化活性的影响。

图2是氯化钾对氨氧化细菌氨氧化活性的影响。

图3是磷酸二氢钾对氨氧化细菌氨氧化活性的影响。

图4是七水硫酸镁对氨氧化细菌氨氧化活性的影响。

图5是水沟样品氨氧化细菌富集液在固体培养基上长出菌落并形成透明圈。

图6是水沟样品氨氧化细菌富集液在对照组培养基上长出菌落情况(圆圈内为氨氧化细菌)。

图7是基于实施例2-实施例5分离纯化氨氧化细菌16S rDNA构建的系统发育树。

图8是泥塘污泥样品氨氧化细菌富集液在固体培养基上长出菌落并形成透明圈。

图9是泥塘污泥样品氨氧化细菌富集液在对照组培养基上长出菌落情况(圆圈内为氨氧化细菌)。

图10是菜地土壤样品氨氧化细菌富集液在固体培养基上长出菌落并形成透明圈。

图11是菜地土壤样品氨氧化细菌富集液在对照组培养基上长出菌落情况(圆圈内为氨氧化细菌)。

图12是码头水样品氨氧化细菌富集液在固体培养基上长出菌落并形成透明圈。

图13是码头水样品氨氧化细菌富集液在对照组培养基上长出菌落情况(圆圈内为氨氧化细菌)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

基础培养基：七水硫酸镁0.03g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，碳酸钙1g/L，碳酸氢钠0.21g/L、氯化铵0.265g/L、微量元素1mL/L。

在基础培养基的基础上，设置梯度浓度氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁进行单因素实验，分别探究其对氨氧化细菌活性的影响：

(1)NaCl梯度浓度添加量：0、0.3、0.6、1.0、1.5、2.0g/L；

(2)KCl梯度浓度添加量：0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5g/L；

(3)KH₂PO₄梯度浓度添加量：0、0.1、0.2、0.3、0.4g/L；

(4)MgSO₄·7H₂O梯度浓度添加量：0、0.03、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L；

将AOB菌液以6％体积比接种入培养基，于30℃、150r·min^-1条件的振荡培养箱避光培养；每隔12h检测氨氮的含量。

从单因素实验的结果(图1-4)可以看出，NaCl浓度为0g/L、KCl浓度为0g/L、KH₂PO₄浓度为0.1g/L、MgSO₄·7H₂O浓度为0.03g/L时氨氧化细菌反应速率最快；当NaCl浓度高于0g/L、KCl浓度高于0g/L、KH₂PO₄浓度高于0.1g/L、MgSO₄·7H₂O浓度高于0.03g/L时，氨氧化细菌反应速率都显著抑降低，即过高的Na⁺、K⁺、Mg²⁺对氨氧化细菌有毒害抑制作用，统计此时培养基中Na⁺、K⁺、Mg²⁺浓度应该分别不超过：

(1)Na⁺(EDTA-Na₂ 195mg/L、NaHCO₃ 0.21g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.036mg/L，)：总计136.23mg/L；

(2)K⁺(KH₂PO₄ 0.1g/L)：总计57.35mg/L；

(3)Mg²⁺(MgSO₄·7H₂O 0.03g/L)：总计4.93mg/L。

实施例2

一种氨氧化细菌的配制及其在氨氧化细菌分离纯化培养中的应用

在1L水中加入碳酸钙5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.03g、琼脂粉16g，115℃高压蒸汽灭菌20分钟，降温至不烫手后，再添加用0.22μm滤膜过滤除菌的碳酸氢钠0.21g、氯化铵0.265g、微量元素1mL，自然pH；总计Na⁺92.223mg/L、K⁺28.658mg/L、Mg²⁺2.958mg/L。

微量元素组成为：EDTA-Na₂ 195g/L，FeSO₄·7H₂O 50g/L，H₃BO₃ 0.062g/L，CuCl₂·2H₂O 0.017g/L，MnC1₂·4H₂O 0.100g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.036g/L，ZnCl₂ 0.070g/L，CoCl₂·6H₂O 0.190g/L和NiCl₂·6H₂O 0.024g/L；

以上培养基为实验组，同时设置未经优化的培养基作为对照组。

对照组培养基与实验组的区别在于：碳酸钙4g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.48g/L、氯化钠1g/L、氯化钾0.5g/L，其他组分和做法同实验组。总计Na⁺485.385mg/L、K⁺347.542mg/L、Mg²⁺47.324mg/L。

趁热混匀培养基，倒入平板中，固体培养基厚度为培养皿高度的2/3，冷却凝固备用。

取水沟水样离心除杂，接种10mL到体积为90mL的本实施例实验组液体培养基中，于振荡培养箱中30℃、150r·min^-1条件下培养，每隔2天检测一次氨氮浓度，当氨氮消耗量超过初始值95％时，即获得氨氧化细菌富集液。

稀释涂布水沟氨氧化细菌富集液至固体平板上，用聚乙烯保鲜膜严密包裹平板，倒置避光保存于30℃生化培养箱；培养13天后，观察到选择培养基平板上长出湿润、橘黄色的圆点状氨氧化细菌菌落，直径为0.5～1.5mm，氨氧化细菌生长过程中产生大量H⁺水解碳酸钙，菌落周围呈现明显透明圈(见图5)，以此为指标分离纯化出一株氨氧化细菌，命名为SG；而对照组平板第23天才长出氨氧化细菌菌落，菌落直径不超过0.5mm，透明圈微弱不明显(见图6)。

提取实验组细菌DNA进行16S rDNA PCR，送生物技术公司测序，将得到的16S rDNA序列进行Blast比对并构建系统发育进化树(见图7)；分离纯化出的氨氧化细菌为Nitrosomonas。

实施例3

一种氨氧化细菌的配制及其在氨氧化细菌分离纯化培养中的应用

在每1L水中加入碳酸钙4g、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.04g、琼脂粉18g，115℃高压蒸汽灭菌20分钟，降温至不烫手后，再添加用0.22μm滤膜过滤除菌的碳酸氢钠0.25g、氯化铵0.265g、微量元素1mL，自然pH；总计Na⁺103.175mg/L、K⁺57.315mg/L、Mg²⁺3.944mg/L。

微量元素组成同实施例2；

以上培养基为实验组，同时设置未经优化的培养基作为对照组。

对照组培养基与实验组的区别在于：碳酸钙2g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.48g/L、氯化钠1g/L、氯化钾0.5g/L，其他组分和做法同实验组。总计Na⁺485.385mg/L、K⁺347.542mg/L、Mg²⁺47.324mg/L。

趁热混匀培养基，倒入平板中，固体培养基厚度为培养皿高度的1/2，冷却凝固备用。

取泥塘水样离心除杂，接种10mL到体积为90mL的本实施例实验组液体培养基中，于振荡培养箱中30℃、150r·min^-1条件下培养，每隔2天检测一次氨氮浓度，当氨氮消耗量超过初始值95％时，即获得氨氧化细菌富集液。

稀释涂布泥塘氨氧化细菌富集液至固体平板上，用聚乙烯保鲜膜严密包裹平板，倒置避光保存于30℃生化培养箱；培养13天后，观察到选择培养基平板上长出湿润、橘黄色的圆点状氨氧化细菌菌落，直径为0.5～1.5mm，氨氧化细菌生长过程中产生大量H⁺水解碳酸钙，菌落周围呈现明显透明圈(见图8)，以此为指标分离纯化出2株氨氧化细菌，命名为NT1和NT2；而对照组平板第23天才长出氨氧化细菌菌落，菌落直径不超过0.5mm，透明圈微弱不明显(见图9)。

提取细菌DNA进行16S rDNA PCR，送生物技术公司测序，将得到的16SrDNA序列进行Blast比对并构建系统发育进化树(见图7)；分离纯化出的氨氧化细菌为Nitrosomonas。

实施例4

一种氨氧化细菌的配制及其在氨氧化细菌分离纯化培养中的应用

在每1L水中加入碳酸钙4.5g、磷酸二氢钾0.15g、硫酸镁0.03g、琼脂粉16g，115℃高压蒸汽灭菌20分钟，降温至不烫手后，再添加用0.22μm滤膜过滤除菌的碳酸氢钠0.21g、氯化铵0.3g、微量元素1mL，自然pH；总计Na⁺92.223mg/L、K⁺42.986mg/L、Mg²⁺2.958mg/L。

微量元素组成同实施例2；

以上培养基为实验组，同时设置未经优化的培养基作为对照组。

对照组培养基与实验组的区别在于：碳酸钙0g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.48g/L、氯化钠1g/L、氯化钾0.5g/L，其他组分和做法同实验组。总计Na⁺485.385mg/L、K⁺347.542mg/L、Mg²⁺47.324mg/L。

趁热混匀培养基，倒入平板中，固体培养基厚度为培养皿高度的3/4，冷却凝固备用。

取菜地土样接种5g到体积为90mL的本实施例实验组液体培养基中，于振荡培养箱中30℃、150r·min^-1条件下培养，每隔2天检测一次氨氮浓度，当氨氮消耗量超过初始值95％时，即获得氨氧化细菌富集液。

稀释涂布菜地土壤氨氧化细菌富集液至固体平板上，用聚乙烯保鲜膜严密包裹平板，倒置避光保存于30℃生化培养箱；培养15天后，观察到选择培养基平板上长出湿润、橘黄色的圆点状氨氧化细菌菌落，直径为0.5～1mm，氨氧化细菌生长过程中产生大量H⁺水解碳酸钙，菌落周围呈现明显透明圈(见图10)，以此为指标分离纯化出一株氨氧化细菌，命名为CD；而对照组平板第23天才长出氨氧化细菌菌落，菌落直径不超过0.5mm，透明圈微弱不明显(见图11)。

提取细菌DNA进行16S rDNA PCR，送生物技术公司测序，将得到的16SrDNA序列进行Blast比对并构建系统发育进化树(见图7)；分离纯化出的氨氧化细菌为Nitrosomonas。

实施例5

一种氨氧化细菌的配制及其在氨氧化细菌分离纯化培养中的应用

在每1L水中加入碳酸钙5g、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.05g、琼脂粉20g，115℃高压蒸汽灭菌20分钟，降温至不烫手后，再添加用0.22μm滤膜过滤除菌的碳酸氢钠0.21g、氯化铵0.5g、微量元素1mL，自然pH；总计Na⁺92.223mg/L、K⁺57.315mg/L、Mg²⁺4.930mg/L。

微量元素组成同实施例2；

以上培养基为实验组，同时设置未经优化的培养基作为对照组。

对照组培养基与实验组的区别在于：碳酸钙4g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.48g/L、氯化钠1g/L、氯化钾0.5g/L，其他组分和做法同实验组。总计Na⁺485.385mg/L、K⁺347.542mg/L、Mg²⁺47.324mg/L。

趁热混匀培养基，倒入平板中，固体培养基厚度为培养皿高度的3/4，冷却凝固备用。

取码头水样离心除杂，接种10mL到体积为90mL的本实施例实验组液体培养基中，于振荡培养箱中30℃、150r·min^-1条件下培养，每隔2天检测一次氨氮浓度，当氨氮消耗量超过初始值95％时，即获得氨氧化细菌富集液。

稀释涂布码头水样氨氧化细菌富集液至固体平板上，用聚乙烯保鲜膜严密包裹平板，倒置避光保存于30℃生化培养箱；培养15天后，观察到选择培养基平板上长出湿润、橘黄色的圆点状氨氧化细菌菌落，直径为0.5～1.5mm，氨氧化细菌生长过程中产生大量H⁺水解碳酸钙，菌落周围呈现明显透明圈(见图12)，以此为指标分离纯化出一株氨氧化细菌，命名为MT；而对照组平板第23天才长出氨氧化细菌菌落，菌落直径不超过0.5mm，透明圈微弱不明显(见图13)。

提取细菌DNA进行16S rDNA PCR，送生物技术公司测序，将得到的16S rDNA序列进行Blast比对并构建系统发育进化树(见图7)；分离纯化出的氨氧化细菌为Nitrosomonas。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种培养基，其特征在于含有磷酸二氢钾0.1～0.2g/L，硫酸镁0.01～0.05g/L，碳酸钙4～5g/L，碳酸氢钠0.2～0.4g/L，氯化铵0.25～0.55g/L，微量元素溶液1mL/L；培养基中钠离子浓度不高于136.23mg/L，钾离子浓度不高于57.35mg/L，镁离子浓度不高于4.93mg/L。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：含有磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.03g/L，碳酸钙5g/L，碳酸氢钠0.21g/L，氯化铵0.265g/L，微量元素1mL/L。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述的微量元素溶液含有EDTA-Na₂195g/L，FeSO₄·7H₂O 50g/L，H₃BO₃ 0.062g/L，CuCl₂·2H₂O 0.017g/L，MnC1₂·4H₂O 0.100g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.036g/L，ZnCl₂ 0.070g/L，CoCl₂·6H₂O 0.190g/L和NiCl₂·6H₂O0.024g/L。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于加入琼脂粉，以制作培养基平板。

5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述琼脂粉的加入量为16～20g/L。

6.权利要求1-5任一项所述培养基的配制方法，其特征在于包括以下步骤：先配制含有磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙、琼脂的培养基，灭菌后，再添加用0.22μm滤膜过滤的碳酸氢钠、氯化铵、微量元素，混匀后制成培养基平板。

7.根据权利要求6所述的配制方法，其特征在于：所述培养基平板中培养基厚度为培养皿高度的1/2～3/4。

8.权利要求1-5任一项所述培养基在分离、纯化、培养氨氧化细菌中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

将含有氨氧化细菌的富集液涂布在上述培养基平板上，用保鲜膜包裹平板，倒置避光保存于30-37℃环境中；培养13-15天后，培养基平板上长出湿润、橘黄色的圆点状氨氧化细菌菌落。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的保鲜膜为聚乙烯材质保鲜膜。

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