CN113717857A - 含有伪空胞的浮游藻类的制备方法 - Google Patents
含有伪空胞的浮游藻类的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种含有伪空胞的浮游藻类的制备方法和应用。所述含有伪空胞的浮游藻类在制备口服超声造影剂的应用。含有伪空胞的浮游藻类作为口服超声造影剂后,其具有伪空胞的生物气囊能够有效起到散射介质作用,使胃肠壁结构能在二维超声及造影模式下清晰显影,造影模式下能直观地发现胃内占位性病变,二维超声下则成为成像介质,清晰显示肿物及胃肠道壁结构及与周围器官的毗邻关系,而且所述含有伪空胞的浮游藻类生物安全性高。基于所述浮游藻类的应用,本发明提供了一种含有所述浮游藻类的口服超声造影剂。所述浮游藻类的培养方法能够有效提高所述浮游藻的增殖速率,而且能够使得浮游藻细胞中生长更多的胞内伪空胞气囊结构,提高了其成像效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种医疗检测试剂技术领域,具体涉及一种含有伪空胞的浮游藻类的制备方法和其应用。
背景技术
胃肠道疾病主要包括急、慢性胃肠炎,急、慢性结肠炎,消化性溃疡及胃癌大肠癌等恶性疾病,发病率约占全国人口的20%。其中胃肠道间质瘤、胃癌等恶性疾病不但会严重影响患者及其家人的生活,更会对其生命造成威胁。有资料显示早期未发生扩散转移的胃癌经手术切除后5年生存率可达到80%左右。由此可见早期诊断和及时的手术治疗对疾病的转归至关重要。
目前用于胃肠道疾病早期诊断的胃肠道钡餐或碘油造影和胃肠道内窥镜检查在临床诊断胃肠道疾病已经有较广泛的应用,尤其钡餐造影因其方法简便更是作为首选检查。但消化道钡餐造影因其放射线对人体的危害让不少患者有所顾虑,并且该检查只能观察到胃肠道壁是否有病变及其大致形态,却不能显示肿物对胃肠壁的浸润情况及其与周围器官的毗邻关系。胃肠道内窥镜附加腔内超声探头的检查虽可解决上述问题,但是检查步骤繁琐,价格昂贵,检查时患者痛苦,这使得很多患者望而却步,得不到及时的诊断。
近年来,随着科学技术的发展,医学影像已经成为医生诊断和治疗疾病的重要辅助手段。其中,超声造影技术以其独特的优势广泛地应用于医疗诊断、治疗以及治疗后监测等各个环节。其优点包括:安全、无创、价格低廉;操作简单方便、无放射性污染、无电离辐射;成像速度快,能够实时地对组织器官的变化进行动态图像采集等。超声造影(ultrasonic contrast)又称声学造影(acoustic contrast),是将与人体组织声学特性不同的物质引入体内,以改善超声成像条件,增强组织回声对比,提高多普勒信号强度使超声应用范围增加并提高检查的灵敏性和特异性。随着仪器性能的改进和新型声学造影剂的出现,超声造影已能有效的增强心肌、肝、肾等实质性器官的二维超声影像和血流多普勒信号,反映和观察正常组织和病变组织的血流灌注情况,已成为超声诊断的一个十分重要的发展方向。
超声造影技术的关键是造影剂,常规超声造影剂一般为包裹有气体的微泡。目前临床上常用的优选造影剂为声诺维(SonoVue),又名注射用六氟化硫微泡,微米级气泡中包裹六氟化硫气体,其与溶液介质的接触界面可作为超声波的反射介质,在超声探查下与周围组织之间形成较好的对比度。然而,由于行人体胃肠道造影检查时需要充盈胃和肠腔来消除胃肠气体对超声波的干扰,以此来改善胃肠超声环境,所以检查时通常检查者需要饮用250-500ml的造影剂方能对整个胃肠道有较全面的显示,如此大量的微泡造影剂饮用,有可能在微泡破裂后造成患者的胃肠胀气等不适反应,并且声诺维目前价格仍较昂贵,可能给患者带来不必要的经济负担。因为上述诸多原因,声诺维虽然广泛应用于血池造影,但在空腔脏器的超声造影上并无应用。
为实现胃肠造影剂的经济化及实用性,研究者们目前开发出了新型可食用胃肠超声造影剂,在临床上获得了广泛的应用,使在无创条件下更全面地探查胃肠道病变成为可能。如在国内公开的一份专利(申请公告号CN1231927)中公开了一种速溶颗粒胃肠道造影制剂,其配方由含脂植物性蛋白、米麦淀粉类、山药、米仁、陈皮、矫味剂组成。虽然其药食两用中药成分能够行气消胀,化湿健脾,但其制备方法需要经过多次复杂的熟化、过筛、研磨过程,制作工序繁琐。近年来出现的新开发胃肠道超声造影剂多以完全中药成分为主,如在国内公开的一份专利(申请公告号CN104740657A)中,研究者使用了硅油消泡剂、甘露醇及猴头菌、金银花、姜黄等十余味中药研磨制成,虽然其造影效果理想,但称量、制备过程繁琐,使用二甲基硅油与消泡活性剂通过物化方法组合合成的硅油消泡剂,以排除胃肠道内气体,减少伪像,该材料并不是天然来源,生物安全性差,对人体是否有不良影响仍不明确。而且使用植物淀粉及中药等作为造影时,医生仍多是在二维成像模式下进行观察和诊断,相比在造影模式下难以鉴别本身胃内容物及肿物。因此,提供一种完全安全或者直接可食的材料作为造影介质,同时达到超声成像图质量的最优化和生物安全性一直是本领域研发者努力试图解决的技术难题。
另外,传统培养浮游藻类如含伪空胞的浮游藻类方法多采用透气封口膜,而不会给藻类无菌有氧通气,这导致静置浮游藻细胞繁殖慢且细胞内气囊伪空胞含量低。并且在静置提取含伪空胞优势藻类时,由于浮游藻细胞在静置状态下有先下沉再缓慢上浮的特点,浮游藻细胞在体积较小的分液漏斗底部狭小三角处堆积,不但使静置的藻类容易结团、不宜上浮,而且容易使下部的浮游藻细胞无法获得充足的空气和养分,易导致浮游藻细胞衰亡变质。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种含有伪空胞的浮游藻类一种应用方法和一种口服超声造影剂,以解决现有胃肠造影剂成像质量不理想和/或存在生物安全性差、成本高的技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种含有伪空胞的浮游藻类的培养方法,以解决现有浮游藻类培养方法效率低、细胞内气囊伪空胞含量低且易导致细胞死亡的技术问题。
为了实现上述发明目的,本发明的一方面,提供了一种含有伪空胞的浮游藻类的应用。所述含有伪空胞的浮游藻类在制备口服超声造影剂的应用。
本发明的另一方面,提供了一种口服超声造影剂。所述口服超声造影剂含有用于超声显影的浮游藻类,且所述浮游藻含有伪空胞结构。
本发明的又一方面,提供了一种含有伪空胞的浮游藻类的培养方法。所述含有伪空胞的浮游藻类的培养方法包括如下步骤:
将含有伪空胞的浮游藻接种至浮游藻原代培养基中,并向所述浮游藻原代培养基中通入无菌含氧气体进行无菌有氧培养处理;
待所述浮游藻被培养至对数生长期后,将对数生长期的所述浮游藻接种至浮游藻扩大培养基进行无菌有氧扩大培养处理;
将经所述无菌有氧扩大培养处理的浮游藻进行静置处理,后将漂浮于所述浮游藻扩大培养基表面的藻层从所述浮游藻培养基表面导出收集。
与现有技术相比,本发明具有以下的技术效果:
含有伪空胞的浮游藻类作为口服超声造影剂后,其具有伪空胞的生物气囊能够有效起到散射介质作用,使胃肠壁结构能在二维超声及造影模式下清晰显影,造影模式下能直观地发现胃内占位性病变,二维超声下则成为成像介质,清晰显示肿物及胃肠道壁结构及与周围器官的毗邻关系。而且所述含有伪空胞的浮游藻类生物安全性高。
本发明口服超声造影剂由于含有伪空胞的浮游藻类,因此,所述口服超声造影剂能够有效作为胃肠道超声造影剂,在超声成像时所述浮游藻类所含的伪空胞结构生物气囊能够有效起到散射介质作用,使胃肠壁结构能在二维超声及造影模式下清晰显影,造影模式下能直观地发现胃内占位性病变,二维超声下则成为成像介质,清晰显示肿物及胃肠道壁结构及与周围器官的毗邻关系。而且所述含有伪空胞的浮游藻细胞稳定,生物安全性高。在对该种可食用生物造影剂进行定量的时候我们采用光密度法,取代了传统的细胞计数法,这种方法更加简便、易于操作,适用于大量制备和产业化。
本发明含有伪空胞的浮游藻类的培养方法采用分段培养,能够有效提高所述浮游藻的增殖速率,而且能够使得浮游藻细胞中生长更多的胞内伪空胞气囊结构。另外,将浮游藻最后静置形成藻层并从浮游藻培养基表面导出收集,有效保证了浮游藻细胞的成活率,提高了其成像效果。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明,附图中:
图1为本发明实施例含有伪空胞的浮游藻类制备方法工艺流程示意图;
图2为本发明实施例1中水华鱼腥藻停滞期、对数生长期和静止期各培养阶段状态照片;
图3为本发明实施例1中水华鱼腥藻阳光下静置形成漂浮藻株藻层的照片;
图4为本发明实施例1中水华鱼腥藻400倍光学显微镜下结构图;
图5为由本发明实施例3中配制的对照组、OD500值=0.2、0.5、0.8的口服造影剂照片。
图6为本发明实施例3配制的OD500值=0.2、0.5、0.8的口服造影剂和对比组体外琼脂仿体于18MHz条件下B-mode模式下及Contrast模式下超声造影图;
图7为本发明实施例3配制的OD500值=0.2、0.5、0.8的口服造影剂和对比组体外琼脂仿体的a,u值折线图;
图8为本发明实施例3配制的OD500值=0.2、0.5、0.8的口服造影剂和对比组小鼠体内超声造影成像图;其中,图8-A为40MHZ二维高频条件下食管及胃贲门部、胃体部、胃幽门部成像图;图8-B为40MHZ二维高频条件下胃壁成像图;图8-C为二维条件下造影剂充填胃腔与肝脏、肾脏的回声图;图8-D为Contrast成像模式下成像图;
图9为本发明实施例3配制的OD500值=0.2、0.5、0.8的口服造影剂和对比组小鼠体内a,u值折线图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例说明书中所提到的各组分的质量不仅仅可以指代各组分的具体含量,也可以表示各组分间质量的比例关系,因此,只要是按照本发明实施例说明书各组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地,本发明实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
发明人在研发超声显影剂中发现含有伪空胞生物气囊结构的浮游藻类具有优异的显影效果。基于该发现,本发明实施例提供了下文中的含有伪空胞的浮游藻类作为超声造影剂的应用,基于所述含有伪空胞的浮游藻类的应用,本发明实施例还提供了一种口服超声造影剂,同时提出了所述含有伪空胞的浮游藻类的一种培养方法。
一方面,本发明实施例提供了含有伪空胞(gas vesicle)的浮游藻类在超声显影剂领域中的应用。发明人在研究中发现,直接将所述含有伪空胞结构的浮游藻类作为超声造影剂后,在超声成像时,所述浮游藻细胞内存在的伪空胞气囊结构在超声波的作用下,超声波遇见由壳蛋白包裹气体形成的所述伪空胞气囊时就会发生散射,使胃肠道内散射增强,出现云雾状的回声,此现象不但能成为良好的成像介质,使胃肠壁结构能在二维超声条件下清晰显像,并且能在造影Contrast模式下可直观地显示胃肠壁的轮廓,与周围器官回声对比明显,且能有效消除气体干扰所产生的伪像。当造影条件下发现充盈缺损时,可以立即在二维模式下鉴别胃内肿物性质,大大增加了胃内肿物的发现率。因此,所述含有伪空胞的浮游藻类可以直接作为口服超声造影剂,因此,其可以在制备口服超声造影剂中的应用。也即是在本发明实施例中,所述含有伪空胞的浮游藻类是不需要经过细胞裂解去提纯藻细胞内的伪空胞气囊结构,而是直接将浮游藻株或浮游藻细胞作为超声造影剂使用。
由于在本发明实施例中是希望含有伪空胞的浮游藻类用于医疗诊断临床中的超声成像以提高成像效果,因此,上述的含有伪空胞的浮游藻类应该理解的是对人体和动物是安全的浮游藻类,如能够被医学接受的无毒或低毒浮游藻类。在一实施例中,所述含有伪空胞的浮游藻类为蓝藻。在具体实施例中,所述蓝藻包括鱼腥藻、束丝藻、微囊藻和颤藻中的至少一种。选用的该些浮游藻类不仅具有丰富伪空胞的气囊结构,而且是安全无毒、生物相容性高的藻株。
另一方面,基于上文含有伪空胞的所述浮游藻类作为口服超声造影剂的应用,本发明实施例还提供了一种口服超声造影剂(也可以称为可食用的胃肠超声造影剂,或口服生物超声造影剂)。所述口服超声造影剂含有用于超声显影的浮游藻类,且所述浮游藻含有伪空胞结构。也即是所述口服超声造影剂含有上文所述的含有伪空胞的浮游藻类。这样,基于上文含有伪空胞的浮游藻类应用中所述的含有伪空胞浮游藻类具有高质量超声成像和高生物安全性特效,因此,所述口服超声造影剂有效作为胃肠道超声造影剂,在超声成像时所述浮游藻类所含的伪空胞生物气囊结构能够有效起到散射介质作用,使胃肠壁结构能在二维超声及造影模式下清晰显影,造影模式下能直观地发现胃内占位性病变,二维超声下则成为成像介质,清晰显示肿物及胃肠道壁结构及与周围器官的毗邻关系。而且所述含有伪空胞的浮游藻细胞稳定,可以直接口服,使用方便,安全无毒。另外,由于含有伪空胞的所述浮游藻类如蓝藻与人日常食用的紫菜、海带等相似,且无特殊气味,容易被患者接受,服用后可通过正常代谢途径排出,生物安全性高。
在一实施例中,所述口服超声造影剂中所含所述浮游藻类的含量也即是浓度可以控制为光密度法OD500=0.5及以上,因所用浮游藻的种类不同造影优势浓度有一定差异。通过控制所述浮游藻类的浓度,以提高所述口服超声造影剂的超声成像效果。其中,所述口服超声造影剂的溶剂可以是符合医用要求的等渗溶液,如生理盐水、PBS(磷酸盐缓冲液)中的至少一种。
再一方面,本发明实施例还提供了上文各实施例中含有伪空胞的所述浮游藻类的一种制备方法。含有伪空胞的所述浮游藻类的筛选扩大培养方法工艺流程如图1所示,其包括如下步骤:
步骤S01:将含有伪空胞的浮游藻接种至浮游藻原代培养基中,并向所述浮游原代藻培养基中通入无菌含氧气体进行无菌有氧培养处理;
步骤S02:待所述浮游藻被培养至对数生长期后,将对数生长期的所述浮游藻接种至浮游藻扩大培养基进行无菌有氧扩大培养处理;
步骤S03:将经所述无菌有氧扩大培养的浮游藻进行静置处理,后将漂浮于所述浮游藻扩大培养基表面的藻层从所述浮游藻培养基表面导出收集。
其中,在所述步骤S01中,所述无菌有氧培养处理优选按照如下步骤进行:
步骤S011:将所述浮游藻接种至所述浮游藻原代培养基中后,置于光照与避光交替变换的环境中进行无菌有氧培养直至所述浮游藻原代培养基由淡绿色变为浅绿色时,再加入新鲜的浮游藻原代培养基液继续进行无菌有氧培养;
步骤S012:待培养至所述浮游藻原代培养基由浅绿色加深至青苹果绿时,再次加入新鲜的浮游藻原代培养基或将原浮游藻进行分瓶,加入新鲜原代浮游藻培养基,继续进行无菌有氧培养直至所述浮游藻原代培养基颜色加深至青苹果绿。
通过上述优选的无菌有氧培养处理,以缩短接种的所述浮游藻停滞期的时间,通过分瓶扩大培养以在同样时间内筛选出更多含大量伪空胞的漂浮优势藻株。其中,所述步骤S011中的所述浮游藻可以是含有伪空胞的浮游藻的冻干粉末或事先培育的所述浮游藻。如果是冻干粉末,则需要先于室温下进行无菌环境下放置一天复温,然后在接种至所述浮游藻原代培养基。在一实施例中,所述原代培养基可以是但不仅仅为BG11培养基。
将所述浮游藻接种至所述浮游藻原代培养基中的量可以按照常规浮游藻的接种量进行接种,如在具体实施例中,可以但不仅仅按照所述浮游藻与所述浮游藻原代培养基体积比为1:50的比例进行接种。在该步骤S011中的所述光照与避光交替变换的环境中,光照时间可以为12-16h,具体的可以是14h;避光时间为可以为8-12h,具体的可以是10h。
另外,该步骤S011中所述浮游藻原代培养基由淡绿色变为浅绿色的时间大约6天,步骤S012中的所述浮游藻原代培养基由浅绿色加深至青苹果绿的时间大约4天。也即是说步骤S01的无菌有氧培养处理的时间一共大约10天。当然由于培养规模和搅拌以及通气量的不同,所述无菌有氧培养处理各个阶段的所述浮游藻原代培养基颜色的变化时间也有一定的差异。
待步骤S012的所述浮游藻原代培养基颜色浅绿色加深至青苹果绿时,所述浮游藻原代培养基中的所述浮游藻进入对数生长期,也即是待步骤S01培养之后,更改培养基,进入扩大培养即能生产大量含较多伪空胞的优势浮游藻。因此,所述步骤S02中的无菌有氧扩大培养处理后,能够获得量大且含有较多伪空胞的优势浮游藻。
在一实施例中,所述步骤S02中的所述无菌有氧扩大培养处理的方法可以按照如下的两种方法进行培养。
所述无菌有氧扩大培养方法一包括如下步骤:
待经步骤S01中无菌有氧培养处理的所述浮游藻被培养至对数生长期后,将含有对数生长期浮游藻的所述浮游藻原代培养基分成至少两份,并分别加入浮游藻扩大培养基进行无菌有氧扩大培养处理,直至所述浮游藻扩大培养基呈现翠绿色时,再次将翠绿色的所述浮游藻扩大培养基分成至少两份,再次加入新鲜的浮游藻扩大培养基并进行无菌有氧培养,直至所述浮游藻培养基呈现翠绿色。
所述无菌有氧扩大培养方法二包括如下步骤:
待所述浮游藻被培养至对数生长期后,将含所述浮游藻的原代培养基于阳光处静置处理,将漂浮于所述原代培养基表面的浮游藻取出并接种至浮游藻扩大培养基中进行无菌有氧培养处理。
当然,所述无菌有氧扩大培养方法二还可以包括的步骤有:待无菌有氧培养直至所述浮游藻培养基呈现翠绿色时,再次将翠绿色的所述浮游藻分成至少两份,再次加入新鲜的浮游藻扩大培养基并进行无菌有氧培养,直至所述浮游藻培养基呈现翠绿色。
所述无菌有氧扩大培养方法一和所述无菌有氧扩大培养方法二均可以实现含有伪空胞的浮游藻的大量生长,相对而言,所述无菌有氧扩大培养方法二是先对原代含有伪空胞的浮游藻进行筛选,并针对筛选的含有伪空胞浮游藻进行扩大培养,因此,所述无菌有氧扩大培养方法二获得含有伪空胞浮游藻的效率相对高。其中,所述无菌有氧扩大培养方法一和所述无菌有氧扩大培养方法二中,从加入所述浮游藻扩大培养基至所述浮游藻扩大培养基呈现翠绿色的时间大约4-7天时间。另外,分瓶培养的次数可以是多次的,如至少两次,具体如2-3次。最后,当所述浮游藻扩大培养基经过无菌有氧培养处理后颜色变为呈现翠绿色时,并且继续培养两天颜色没有明显加深时,说明所述浮游藻已经进入了生长停滞期,继续培养可能会影响藻类的质量,应及时终止培养并收集,此时可以实现对经无菌有氧培养处理的所述浮游藻进行收集处理,如进行所述步骤S03处理。
整个步骤S02对的所述浮游藻进行无菌有氧扩大培养处理的时间可能根据分浮游藻扩大培养基进行扩大培养的次数不同而不同,每次分浮游藻扩大培养基进行扩大培养的时间约4天,当然由于培养规模和搅拌以及通气量的不同,所述无菌有氧培养处理各个阶段的所述浮游藻培养基颜色的变化时间也有一定的差异。所述浮游藻扩大培养基可以是但不仅仅为G625培养基。
另外,在上述步骤S01中具体如步骤S011和S012中的所述无菌有氧培养和步骤S02中的无菌有氧扩大培养的过程中优选伴随有搅拌处理和通入无菌含氧气体如空气于所述浮游藻培养基中,以增强培养基中氧气的含量和光照的均匀性,在具体实施例中,所述搅拌处理的转速可以但不仅仅为100rpm,其中,该搅拌可以用摇床实现。当刚接种培养时,转速不应过高,光照不应过强,否则可能导致藻类复苏不良,生长受限。在上述步骤S01中具体如步骤S011和S012中的所述无菌有氧培养和步骤S02中的无菌有氧扩大培养的过程中温度可以是室温,如温度为25℃。
所述步骤S03中的静置处理是利用所述浮游藻经过步骤S01和步骤S02的培养后,细胞内生成较多的伪空胞气囊结构,因此,其能够很好的漂浮特性,而且在静置处理过程中能够很快的漂浮于所述浮游藻培养基的表面形成的藻层。为了提高静置处理效率,在一实施例中,所述浮游藻静置处理的方法包括如下步骤:将经所述有氧扩大培养的所述浮游藻于阳光照射环境中进行有氧静置处理。在具体实施例中,可以置于正常阳光照射的室温下静置4小时。
将经步骤S03中静置处理所形成的所述藻层从所述浮游藻培养基表面导出收集的方法优选包括如下步骤:采用吸附的方式将所述藻层直接从所述浮游藻培养基表面导出收集。这样,由于采用吸附的方式将所述藻层直接导出并收集,能够充分的保证浮游藻细胞充分与氧接触,且保证了养分,因此,该导出藻层的方法能够保证浮游藻细胞的生物活性,状态更佳,胞内伪空胞的气囊结构保存的更好,从而将所述浮游藻用于超声造影剂时,其成像效果也更理想。
经步骤S03中导出收集的浮游藻如暂不需要用于造影,可将所述浮游藻加入足量培养液放置在4℃环境内进行保存,浓度应小于1:100,该温度下保存可以保存约1年的时间。
由于所述含有伪空胞的浮游藻类的培养方法培养含有伪空胞的所述浮游藻是为了直接作为超声造影剂使用,因此,上述步骤S01至S03中在培养过程中各个环节应该是保证无菌的,如步骤S01中的所述无菌有氧培养处理、步骤S02的扩大培养处理和步骤S03中的静置处理和所述藻层的导出收集均应该保证无菌环境进行处理。用于接种的所述浮游藻类和用于培养所述浮游藻的是浮游藻培养基也应该保证是无菌的。优选的在培养过程中通入培养基中的含有气体如空气也应该是无菌的。通过该些无菌的培养处理,保证获得的浮游藻安全,能够直接用于超声造影剂使用。
另外,上述所述培养方法各实施例中所用于接种的所述浮游藻类如上文所述的可以是对人体和动物是安全的浮游藻类,如能够被医学接受的无毒或低毒浮游藻类。在一实施例中,所述含有伪空胞的浮游藻类为蓝藻。在具体实施例中,所述蓝藻包括鱼腥藻、束丝藻、微囊藻和颤藻中的至少一种。选用的该些浮游藻类不仅具有丰富伪空胞的气囊结构,而且安全无毒。当然,还可以是其他含有伪空胞结构的其他适于医药领域的其他浮游藻类。
由上文所述的含有伪空胞的浮游藻类的培养方法采用分段培养,能够有效提高所述浮游藻的增殖速率,而且能够使得浮游藻细胞中生长更多的胞内伪空胞气囊结构,如图4所示。而且将浮游藻最后静置形成藻层并从浮游藻培养基表面导出收集,有效保证了浮游藻细胞的成活率,提高了其成像效果。另外,所述培养方法所使用的含有伪空胞的浮游藻类为无毒藻株,而且在无菌环境下培养,而且生物安全性高。其次,所述培养方法条件易控,培养工艺有效被简化,所述浮游藻类繁殖速度快,有效提高了浮游藻类的增值效率,有效降低了培养的成本,可以实现企业规模化培养。
以下通过多个具体实施例来举例说明本发明实施例含有伪空胞的浮游藻类的应用和培养方法。
实施例1:含有伪空胞的浮游藻类的培养方法
本实施例提供了一种含有伪空胞的浮游藻类的培养方法,包括如下步骤:
S11:水华鱼腥藻停滞期的培养(约10天):打开水华鱼腥藻冻干粉末(购于美国生物标准品收藏中心ATCC)盖子,在室温无菌环境下放置一天复温,将冻干粉末倒入50ml锥形瓶中,按照1:50的体积比加入蓝藻BG11培养基,摇匀,锥形瓶内插入通气导管接通气泵,用灭菌棉花填塞锥形瓶口后,用封口条(paraflim)密封,保持瓶内为无菌环境;培养光照时间为14h光照/10h黑暗,温度25℃,摇床转速100rpm,培养约6天后培养液从初始的如图2-A所示的淡绿色变为浅绿色时,加入等量新鲜培养液继续培养,待培养液绿色加深至如图2-B所示的青苹果绿时换为250ml锥形瓶培养,并加入新鲜培养基至终体积约150ml,继续培养约4天至瓶内液体再次变为青苹果绿;
S12:对数生长期培养(约4天):将步骤S11中培养至青苹果绿的培养基等分为2份,分别倒入500ml锥形瓶内加入G625培养基至250ml终体积继续培养,因此期细胞繁殖加快,约4天即可见培养液颜色变为翠绿色,此时可以继分瓶继续大量培养,当瓶中藻呈现如图2-C所示的翠(墨)绿色时,说明已再次进入生长停滞期(静止期),可以进行下述步骤S13分离处理;
S13:将步骤S12培养的水华鱼腥藻培养液倒入高温蒸汽灭菌后的500ml锥形瓶中,瓶口覆盖滤菌膜,在正常阳光照射室温(约23℃)下静置约4小时即可见液面漂浮深绿色藻层,如图3所示;使用1ml移液枪,枪头贴着漂浮藻层表面慢慢吸取漂浮蓝藻,收集于15ml离心管,静置至藻与培养液完全分层,移液枪尽量吸尽上层培养液。如暂不需要用于造影,可将藻液放置在4℃环境内。经实验得知,该温度下保存的时间约1年。
将培养获得的水华鱼腥藻于进行400倍光学显微镜下观察,其照片如图4所示。由图4可知,所示水华鱼腥藻含有丰富的气囊结构。
实施例2:含有伪空胞的浮游藻类的培养方法
本实施例提供了一种含有伪空胞的浮游藻类的培养方法,包括如下步骤:
S11:微囊藻停滞期的培养(约10天):将微囊藻倒入50ml锥形瓶中,按照1:50的体积比加入蓝藻BG11培养基,摇匀,锥形瓶内插入通气导管接通气泵,用灭菌棉花填塞锥形瓶口后,用封口条(paraflim)密封,保持瓶内为无菌环境;培养光照时间为14h光照/10h黑暗,温度25℃,摇床转速100rpm,培养约6天后培养液从初始的无色透明变为浅绿色时,加入等量新鲜BG11培养液继续培养,待培养液绿色加深至青苹果绿时换为250ml锥形瓶培养,并加入新鲜培养基至终体积约150ml,继续培养约4天至瓶内液体再次变为青苹果绿;
S12:对数生长期培养(约6天):将步骤S11中培养至将青苹果绿的培养基等分为2份,分别倒入500ml锥形瓶内加入新鲜BG11培养基至250ml终体积继续扩大培养直至青苹果绿时,说明已再次进入生长停滞期(静止期),可以进行下述步骤S13分离处理;
S13:将步骤S12培养的微囊藻培养液倒入高温蒸汽灭菌后的500ml锥形瓶中,瓶口覆盖滤菌膜,在正常阳光照射室温(约23℃)下静置约4小时即可见液面漂浮深绿色藻层,如图3所示;使用1ml移液枪,枪头贴着漂浮藻层表面慢慢吸取漂浮蓝藻,收集于15ml离心管,静置至藻与培养液完全分层,移液枪尽量吸尽上层培养液。如暂不需要用于造影,可将藻液放置在4℃环境内。经实验得知,该温度下保存的时间约1年。
实施例3:含有伪空胞的浮游藻类的培养方法
本实施例提供了一种含有伪空胞的浮游藻类的培养方法,包括如下步骤:
S11:颤藻停滞期的培养(约10天):将颤藻倒入50ml锥形瓶中,按照1:50的体积比加入蓝藻BG11培养基,摇匀,锥形瓶内插入通气导管接通气泵,用灭菌棉花填塞锥形瓶口后,用封口条(paraflim)密封,保持瓶内为无菌环境;培养光照时间为14h光照/10h黑暗,温度25℃,摇床转速100rpm,直至瓶内液体再次变为青苹果绿,获得上层浮游藻;
S12:对数生长期培养(约4天):将步骤S11中获得浮游藻等分为3份,分别倒入500ml锥形瓶内加入新鲜BG11培养基至250ml终体积继续培养,因此期细胞繁殖加快,约4天即可见培养液颜色变为翠绿色,此时可以继分瓶继续大量培养,当瓶中藻呈现如图2-C所示的翠(墨)绿色时,说明已再次进入生长停滞期(静止期),可以进行下述步骤S13分离处理;
S13:将步骤S12培养颤藻培养液倒入高温蒸汽灭菌后的500ml锥形瓶中,瓶口覆盖滤菌膜,在正常阳光照射室温(约23℃)下静置约4小时即可见液面漂浮深绿色藻层,如图3所示;使用1ml移液枪,枪头贴着漂浮藻层表面慢慢吸取漂浮蓝藻,收集于15ml离心管,静置至藻与培养液完全分层,移液枪尽量吸尽上层培养液。如暂不需要用于造影,可将藻液放置在4℃环境内。经实验得知,该温度下保存的时间约1年。
实施例4:含有伪空胞的浮游藻类的优选培养方法:
本实施例提供了一种含有伪空胞的浮游藻类的培养方法,包括如下步骤:
S11:水华鱼腥藻停滞期的培养(约10天):打开水华鱼腥藻冻干粉末(购于美国生物标准品收藏中心ATCC)盖子,在室温无菌环境下放置一天复温,将冻干粉末倒入50ml锥形瓶中,按照1:50的体积比加入蓝藻BG11培养基,摇匀,锥形瓶内插入通气导管接通气泵,用灭菌棉花填塞锥形瓶口后,用封口条(paraflim)密封,保持瓶内为无菌环境;培养光照时间为14h光照/10h黑暗,温度25℃,摇床转速100rpm,培养约6天后培养液从初始的如图2-A所示的淡绿色变为浅绿色时,加入等量新鲜培养液继续培养,待培养液绿色加深至如图2-B所示的青苹果绿时换为250ml锥形瓶培养,并加入新鲜培养基至终体积约150ml,继续培养约4天至瓶内液体再次变为青苹果绿;
S12:对数期的扩大培养:待所述浮游藻被培养至对数生长期后,将含所述浮游藻的BG11培养基于阳光处静置处理,将漂浮于所述BG11培养基表面的浮游藻取出并接种至浮游藻G625培养基中进行无菌有氧培养处理,再次培养至对数期后,将G625培养基等分为2份,分别倒入500ml锥形瓶内加入G625培养基至250ml终体积继续培养,因此期细胞繁殖加快,约4天即可见培养液颜色变为翠绿色,此时可以继分瓶继续大量培养,当瓶中藻呈现如图2-C所示的翠(墨)绿色时,说明已再次进入生长停滞期(静止期),可以进行下述步骤S13分离处理;
S13:将步骤S12培养的水华鱼腥藻培养液倒入高温蒸汽灭菌后的500ml锥形瓶中,瓶口覆盖滤菌膜,在正常阳光照射室温(约23℃)下静置约4小时即可见液面漂浮深绿色藻层,如图3所示;使用1ml移液枪,枪头贴着漂浮藻层表面慢慢吸取漂浮蓝藻,收集于15ml离心管,静置至藻与培养液完全分层,移液枪尽量吸尽上层培养液。如暂不需要用于造影,可将藻液放置在4℃环境内。经实验得知,该温度下保存的时间约1年。
实施例5:口服超声造影剂实施例
本实施例提供一种口服超声造影剂,具体的按照下述方法提供:
将实施例施1中收集的水华鱼腥藻与适量PBS等渗溶液混合处理,调定浓度,设置3个浓度梯度的口服超声造影剂。
将获得的3个浓度梯度的口服超声造影剂用等渗液1:10稀释后(因未经稀释的造影剂浓度过高,酶标仪无法测出其浓度),使用酶标仪(波长设定500nm)测定OD值,并用PBS等渗溶液作为对照。经测得经稀释后3个浓度梯度的口服超声造影剂的OD值分别为0.2/0.5/0.8,各浓度的照片如图5所示。当然所述口服超声造影剂浓度还可以使用显微镜下计数或颗粒细胞计数仪等方式来定量。
实施例6:口服超声造影剂体外模拟超声成像实验
将上述实施例3中提供的OD500值分别为0.2/0.5/0.8的口服超声造影剂分别进行体外超声造影的实验,具体实验方法为:使用Vevo2100超声成像仪对装满藻的琼脂仿体孔进行造影,探头对准加样孔。分别在4个孔内加入200μL藻类样品,第1孔内加入PBS作为空白对照,第2-4孔内分别加入实施例3中制备的OD值为0.2、0.5、0.8的造影剂混悬液,加样前充分振荡摇匀,并在二维超声模式下及造影模式下观察其造影情况及测定其回声信号强度(探头设定:二维模式40MHZ、成像模式18HMZ)。
实验结果:OD500=0.2、0.5、0.8的造影剂体外仿体18MHz超声成像如图6。测得的a,u值折线如图7所示。由图6和图7所示的结果表明,PBS对照孔内在二维及造影模式下都无明显回声,平均回声强度a,u为192.6。OD500=0.2、0.5、0.8的造影剂在两个模式下都能清晰成像,平均回声强度a,u随着浓度的增加而提高,分别为641.5、1262.8、1732.8,其中以OD值=0.5及0.8的成像效果较理想。
实施例7:口服超声造影剂体内超声成像实验
将上述实施例3中提供的OD值分别为0.2/0.5/0.8的口服超声造影剂分别进行小鼠胃肠造影体内实验,具体实验方法为:随机选取4只健康8周龄的BALB/c小鼠,约23g,SPF级,实验前禁食不禁水处理12小时,异氟烷气体麻醉小鼠后保定在鼠板上,对腹部进行剃毛备皮。使用vevo 2100在小鼠左上腹部探查,观察实验前的超声成像情况。充分摇匀3个浓度梯度的造影剂混悬液后,抽取0.2ml样品分别给3只小鼠灌胃处理,灌胃后马上进行超声成像,在二维高频探头分别观察食管及胃贲门部、胃体部、胃幽门部,对比胃腔信号及肝肾信号,于造影模式下观察其造影情况并测定其回声强度。空白对照组小鼠使用等量生理盐水灌胃。
实验结果:空白对照组和实验组小鼠在40MHZ二维高频条件下食管及胃贲门部、胃体部、胃幽门部成像图如图8-A所示,空白对照组和实验组小鼠在二维高频条件下胃壁成像图如图8-B所示,空白对照组和实验组小鼠在二维条件下造影剂充填胃腔与肝脏、肾脏的回声成像图如图8-C所示,Contrast成像模式下成像对比图8-D所示,测得的a,u值折线如图9所示,。由图8和图9所示的结果表明,PBS对照组成像可见胃泡内积气较多,胃腔及胃壁结构无法清晰显示,造影条件下平均a,u值为161.2。灌入不同浓度的口服藻类超声成像造影剂的小鼠,二维成像可见造影剂均匀充填胃腔、排空胃内空气,对比明显,且胃壁结构回声可清晰显示。造影模式下见造影剂强回声均匀充填胃腔,胃腔轮廓清晰显示回声强度平均a,u值随着浓度的增加而提高,分别为641.5、4731.7、5559.8。以OD500=0.8浓度的造影剂混悬液成像效果最佳,造影模式下胃腔充填显示较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种含有伪空胞的浮游藻类的培养方法,包括如下步骤:
将含有伪空胞的浮游藻接种至浮游藻原代培养基中,并向所述浮游藻原代培养基中通入无菌含氧气体进行无菌有氧培养处理;
待所述浮游藻被培养至对数生长期后,将对数生长期的所述浮游藻接种至浮游藻扩大培养基进行无菌有氧扩大培养处理;
将经所述无菌有氧扩大培养处理的浮游藻进行静置处理,后将漂浮于所述浮游藻扩大培养基表面的藻层从所述浮游藻培养基表面导出收集。
2.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,将所述藻层从所述浮游藻培养基表面导出收集的方法包括如下步骤:
采用吸附的方式将所述藻层直接从所述浮游藻扩大培养基表面导出收集。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法,其特征在于,所述浮游藻静置处理的方法包括如下步骤:将经所述有氧扩大培养的所述浮游藻于阳光照射环境中进行有氧静置处理。
4.根据权利要求1或2所述的培养方法,其特征在于,所述无菌有氧原代培养处理方法包括如下步骤:
将所述浮游藻接种至所述浮游藻原代培养基中后,置于光照与避光交替变换的环境中进行无菌有氧培养直至所述浮游藻原代培养基由淡绿色变为浅绿色时,再加入新鲜的浮游藻原代培养基液继续进行无菌有氧培养;
待培养至所述浮游藻原代培养基由浅绿色加深至青苹果绿时,再次加入新鲜的浮游藻原代培养基或对原浮游藻液进行分瓶并补充新鲜的浮游藻原代培养基,继续进行无菌有氧培养直至所述浮游藻培养基颜色加深至青苹果绿。
5.根据权利要求1或2所述的培养方法,其特征在于,所述无菌有氧扩大培养处理的方法包括如下步骤:
待所述浮游藻被培养至对数生长期后,将含有对数生长期浮游藻的所述浮游藻原代培养基分成至少两份,并分别加入新鲜浮游藻扩大培养基进行无菌有氧培养处理,直至所述浮游藻扩大培养基呈现翠绿色时,再次将翠绿色的所述浮游藻扩大培养基分成至少两份,再次加入新鲜的浮游藻扩大培养基并进行无菌有氧培养,直至所述浮游藻培养基呈现翠绿色;
或
待所述浮游藻被培养至对数生长期后,将含所述浮游藻的原代培养基于阳光处静置处理,将漂浮于所述原代培养基表面的浮游藻取出并接种至浮游藻扩大培养基中进行无菌有氧培养处理。
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