CN113698290A

CN113698290A - 一种纯化dha纯化制备方法

Info

Publication number: CN113698290A
Application number: CN202010442217.3A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 郭志谋; 金高娃; 丁俊杰
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2021-11-26

Abstract

本发明涉及一种将气相纯度60％以上的乙酯型DHA原料纯化至气相纯度98％以上的液相色谱纯化方法。所述方法采用的C18反相硅胶是经过乙酯型DHA样品保留与载样量测试优化后的一系列不同碳含量的C18反相硅胶。优化后的C18反相硅胶填料对甲醇水流动相体系下分离的乙酯型DHA样品有较高的载样量与回收率，适用于大批量生产化的需要。

Description

一种纯化DHA纯化制备方法

技术领域

本发明属于高纯度ω-3不饱和脂肪酸的分离纯化与精制技术领域，是一种高纯度DHA-EE的纯化制备方法。

背景技术

DHA，二十二碳六烯酸，俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的不饱和脂肪酸，属于ω-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分。DHA其主要作用有促进胎儿大脑发育，促进视网膜光感细胞的成熟，增进大脑细胞发育，改善老人痴呆，延长妊娠期预防早产，促进PS(磷脂酰丝氨酸)的吸收，抗衰老等。

瑞典科学家发现，深海鱼中所富含的ω-3脂肪酸和二十二碳六烯酸(DHA)及其衍生物在机体中能够杀死神经母细胞瘤癌细胞。这项发现或许为多种癌症——如神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等提供新的治疗方法，未来可根据DHA及其衍生物研制一类新的抗癌药物。近年随着对其研究与应用领域不断深化、扩展，作为原料药和医药中间体，也被提出更高的质量要求，从纯度大于90％发展至96％甚至98％、99％以上。

目前多不饱和脂肪酸的纯化方法有尿素包合法、低温冷冻法、金属盐沉淀法、真空蒸馏法、超临界萃取法、高效液相色谱法及层析法等，这些方法中，一部分是针对粗提物中色素、胆固醇、饱和脂肪酸等杂质进行初步分离；一部分是正相硅胶层析法的介绍，也有采用C18反相硅胶模式的介绍，但未针对不同种类的C18选择方法与提纯、提产DHA-EE效果做出关联性优化工艺。基于可产业化制备纯度达到98％以上DHA-EE的质量要求，需要筛选出较适用的特定C18及色谱条件。

发明内容

本发明针对不同种类的C18选择方法与提纯、提产DHA-EE效果做出关联性优化工艺，其目的在于筛选出较适用的特定C18及色谱条件，用于可产业化制备高纯度DHA-EE的方法。

筛选适用的特定C18填料的原理是硅胶表面键合的十八烷基链的键合密度对增大载样量情况下的非线性色谱吸附作用不同，表现出高载样量条件下峰宽与峰形的有差别，进而影响分离纯化的效果。不同的待分离纯化的样品中，目标峰附近的杂质不尽相同，通过测试不同键合量C18填料的对不同样品的分离情况，可以更有针对性的选择出适用的C18填料来实现不同样品的分离纯化需要。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现。

一种C18反相硅胶纯化DHA的方法，包括以下步骤：

1)取乙酯型DHA为纯化原料；

2)溶解步骤1)中的样品，配置成样品浓度20～800mg/mL的上样液；

3)在径高比为1:5～1:10的C18制备柱上进样步骤2)配置上样液；

4)采用甲醇水或甲醇溶液流动相洗脱分离步骤3)中C18制备柱上的样品，进行纯化制备；

5)步骤4)制备后目标产品馏分浓缩后萃取，干燥，得产物。

所述步骤1)中，原料可来源于鱼油、藻油、鱿鱼提取物等，经过各种分离纯化方式的处理，使待精制的乙酯型DHA样品气相色谱峰面积归一化纯度到达60％以上，优选大于90％以上。

所述步骤2)中，样品溶剂选用80～100％甲醇水或甲醇溶液，更优选98～100％甲醇溶液。

所述步骤2)中，上样液的浓度为20～800mg/mL，更优选200～500mg/mL。

所述步骤3)中，C18柱采用十八烷基键合硅胶填料，整个填料中碳的质量含量为12～18％，填料粒径5～30微米，孔径7～20nm。更优选填料粒径7～15微米，填料中碳的质量含量为14％～16％。

所述步骤3)中，C18柱的填料是在规格为4.6×50mm分析柱上经评价测试，结果为DHA-EE色谱峰为为从中间向左右均匀对称扩展的峰形，且在进样纯化原料与填料质量比为1‰时，纯化原料中主峰(DHA-EE)峰宽小于3min。

所述步骤3)中，上样液体积为0.05倍柱体积～0.3倍柱体积，上样过程线性流速30cm/h～180cm/h，上样样品量为填料质量的1～10％。更优选上样线性流速36cm/h～100cm/h，上样样品量为填料质量的3～8％。

所述步骤4)中，C18纯化制备柱的径高比为1:5～1:10，所用流动相为70～100％甲醇水或甲醇溶液(优选85％～95％甲醇水)，制备过程线性流速为36cm/h～180cm/h，温度为20～40℃，所用的流动相体积为3～10倍柱体积。更优选制备线性流速为50～120cm/h。

所述步骤5)中萃取溶剂用乙酸乙酯和正己烷中的一种或两种，更优选在萃取后的产品层中按质量体积比0.1g/mL加入硅胶或无水硫酸镁脱水剂除水。

本发明上述纯化制备DHA-EE的方法优点为：选择优选的C18填料，对DHA-EE在载样量高的情况下，依然可以保持较好的峰形，减少与主峰附近杂质的交叉，更有利于根据产能需要提高载样量，实现工业化生产。针对目前使用色谱法进行高纯度DHA-EE的分离纯化，该方法分离选择性更好、分离效率更高，制备重复性好。

附图说明

图1为C18填料装填分析柱测试时，进样体积1μL的谱图，表明分析柱测试C18填料时，样品色谱峰扩展的峰形特征。

图2为C18填料装填分析柱测试时，进样体积20μL的谱图，表明分析柱测试C18填料时，样品色谱峰扩展的峰形特征。

图3为C18填料装填分析柱测试时，进样体积100μL的谱图，表明分析柱测试C18填料时，样品色谱峰扩展的峰形特征。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

取来源鱼油的DHA原料3g(DHA-EE气相色谱峰面积归一化纯度60％)，溶于0.05倍柱体积纯甲醇中，配置成200mg/mL的上样液。上样过程以线性流速36cm/h全部进样，即进样样品占填料质量1％的样品量。使用填料中碳的质量含量为15％的C18填料填装规格为50×250mm(即径高比1:5)的制备色谱柱。此C18柱的填料平均粒径10μm，平均孔径10nm，填料质量300g。

此C18柱的填料在分析柱上评价测试过程与结果如下：

色谱条件

仪器：高效液相色谱仪；

样品：甲醇溶解配置20mg/mL DHA-EE；

色谱柱：C18(4.6×50mm，0.6g)；

流动相：90％甲醇；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

检测：UV(210nm)；

进样体积：1μL，20μL，100μL；

谱图见图1，图2，图3。结果显示DHA-EE色谱峰为从中间向左右均匀对称扩展的峰形，且在进样纯化原料与填料质量比为1‰(即进样体积20μL)时，纯化原料中主峰(DHA-EE)峰宽小于3min。

此C18制备柱进行样品分离纯化过程中，洗脱溶剂为93％甲醇水(V/V)，制备过程控制柱温30℃，以线性流速75cm/h洗脱9倍柱体积，收集目标产品馏分浓缩至300mL，加入100mL乙酸乙酯与50mL正己烷，萃取分层；将下层溶液再加100mL乙酸乙酯和50mL正己烷进行二次萃取；萃取后的上层(乙酸乙酯正己烷)过30g硅胶柱脱水，无水乙酸乙酯洗脱液浓缩干燥，得到气相色谱峰面积归一化纯度98％以上的高纯度DHA-EE，目标峰回收率为98％。

实施例2

其它条件与实施例1相同，不同之处在于上样量3％，得到气相色谱峰面积归一化纯度98％以上的高纯度DHA-EE，目标峰回收率为85％。

实施例3

其它条件与实施例1相同，不同之处在于样品为藻类提取的原料DHA-EE纯度66％。纯化处理后得到色谱峰面积归一化纯度98％以上的高纯度DHA-EE，目标峰回收率为82％。

对比例1

其它条件与实施例1相同，不同之处在于，使用填料中碳的质量比为19％的C18填料，得到气相色谱峰面积归一化纯度96％以上的高纯度DHA-EE，目标峰回收率为75％。

对比例2

其它条件与实施例1相同，不同之处在于，使用填料中碳的质量比为11％的C18填料，得到气相色谱峰面积归一化纯度96％以上的高纯度DHA-EE，目标峰回收率为73％。

Claims

1.一种C18反相硅胶纯化DHA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取乙酯型DHA(DHA-EE)为纯化原料；

3)在径高比为1:5～1:10的C18制备柱上进样步骤2)配置上样液；

5)步骤4)制备后目标产品馏分浓缩后萃取，干燥，得产物。

2.按照权利要求1所述，其特征在于，步骤1)中的原料为乙酯型DHA的气相色谱峰面积归一化纯度到达60％以上，优选大于90％以上。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中的溶剂为体积比为80～100％的甲醇水或甲醇溶液，优选98～100％甲醇溶液。

4.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤2)中上样液的浓度为20～800mg/mL，优选200～500mg/mL。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中的C18柱采用十八烷基键合硅胶填料，整个填料中碳的质量含量为12～18％，填料粒径5～30微米、孔径7～20nm，更优选填料中碳的质量含量为14％～16％，填料粒径7～15微米。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中的C18柱的填料是在规格为4.6×50mm分析柱上经评价测试，结果为DHA-EE色谱峰为从中间向左右均匀对称扩展的峰形，且在进样纯化原料与填料质量比为1‰时，纯化原料中主峰(DHA-EE)主峰峰宽小于3min，优选峰宽小于2min。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中的上样液体积为0.05倍柱体积～0.3倍柱体积，上样过程线性流速为30cm/h～180cm/h(优选上样线性流速36cm/h～100cm/h)，上样样品量为填料质量的1～10％，优选3～8％。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中C18纯化制备柱的径高比为1:5～1:10，所用流动相为70～100％甲醇水或甲醇溶液(优选85％～95％甲醇水)，制备线性流速为36cm/h～180cm/h(优选50cm/h～120cm/h)，温度为20～40℃，所用的流动相体积为3～10倍柱体积。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中萃取溶剂用乙酸乙酯和正己烷中的一种或两种。

10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，在萃取后的产品层中按质量体积比0.1g/mL加入硅胶或无水硫酸镁脱水剂除水。