JP5347506B2

JP5347506B2 - Ｄｈａ高濃度化方法

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Publication number: JP5347506B2
Application number: JP2008546425A
Authority: JP
Inventors: マルシアク、フロランス; スレル、マチュー; フライス、ベルナール
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2026-12-19
Also published as: US20110124728A1; WO2007071670A1; CA2633770A1; US20090036532A1; EP1979450B1; CA2633770C; EP1979450A1; HUE030753T2; US7906666B2; FR2894772B1; FR2894772A1; JP2010513570A; PL1979450T3; ES2589803T3

Description

本発明は、天然脂肪酸エチルエステル類（魚油）の溶液を、ドコサヘキサエン酸（通称：ＤＨＡ）という特定の脂肪酸について高濃度化（富化）するのを工業的に可能にする方法に関する。

海洋生物から得られる油は多価不飽和脂肪酸の天然の豊富な供給源である。最も有益な多価不飽和脂肪酸は具体的には下記の構造を有している。

これらの脂肪酸は、人体の正確な機能に必要であるにもかかわらず、体内で自然には合成されない。従って、その摂取は日常の食物摂取に伴って行われる。多価不飽和脂肪酸類の食物供給源は、植物油（本質的にω−６及びω−９型の脂肪酸）並びに魚油であり、魚油は特に多量のω−３型脂肪酸を含有する。後者は、健康（心血管疾患、自己免疫疾患、炎症等）に対して有益な効果があることは非常によく知られている。

多価不飽和脂肪酸は、末端メチル官能基からの最初の二重結合の位置に応じて分類される。即ち、ω−ｘ又はｎ−ｘという命名において、ｘはこの最初の不飽和結合の位置に対応する。生物学的に興味ある多価不飽和脂肪酸の大部分はω−６（アラキドン酸）又はω−３（ＥＰＡ，ＤＨＡ）の群に属する。また、命名には連鎖を形成する炭素の数も表示される。従って、ＥＰＡはＣ２０：５と表記され、ＤＨＡはＣ２２：６と表記される。数字５及び６は、それぞれＥＰＡ及びＤＨＡが示す炭素鎖不飽和数に対応する。魚油はω−３型脂肪酸を単離及び濃縮するために本質的に使用される。

従来の魚油富化方法（V.K. Mishra et al.による論文, Food Research International, 1993, 26, 217-226）は、油類を構成する脂肪酸の鎖長とそれらの不飽和度に関する選択性に基づいている。最も普通に使用されている富化方法は、脂肪酸又は対応エステル類に対して下記手段によって行われる：
−晶析（結晶化）
−向流抽出
−分子蒸留
−吸収クロマトグラフィー。

たいていは、高度の富化を得る目的で異なる方法を組み合わせる。また、これらの各方法には次のような欠点がある。
高温で行われる方法（蒸留）は、脂肪酸の多様な熱分解生成物（異性化、過酸化、オリゴマー化）を生ずる。そのため、低温、有利には１００℃以下の温度で実施することが推奨される。

クロマトグラフィー法の欠点は、毒性であることが多い溶剤を大量に使用することに起因する。また、かかる方法に基づいて大量生産することは容易ではない。
これらの理由から別の方法が開発された。それらは下記の超臨界流体の使用に基づく方法である：
−超臨界ＣＯ₂分留（精留）法、
−超臨界クロマトグラフィー。

超臨界ＣＯ₂を用いた脂肪酸エチルエステルの分留法は文献に既に広く記載されている。しかし、これまでに言及された方法の大部分は、ＤＨＡではなく、ω−３であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の富化（高濃度化）を説明するものである。

超臨界ＣＯ₂分留法の操業パラメータの１つは超臨界ＣＯ₂のレベルである。このレベルは、注入された脂肪酸溶液の流量に対するＣＯ₂流量の比により定義される。従って、超臨界ＣＯ₂のレベルが高いと、選択性は増大するが、収率は低下する。超臨界ＣＯ₂のレベルが低いと、収率には有利であるが、選択性は低下する。

これに関して、Nilssonら (JAOCS 1988, 65(1), 109-117) は、ＥＰＡ及びＤＨＡがそれぞれ富化された複数の留分（０.１〜０.２ｇ）を得ることができるバッチ法について記載している。このためには、著者らは２２０×１０⁵Ｐａ〜２５０×１０⁵Ｐａの圧力で実験した。また、彼らは内部還流を生じさせるように塔内に温度勾配（塔底の２０℃から塔頂の１００℃まで）を形成した。規定された超臨界ＣＯ₂のレベルは１００〜５００程度という非常に高いものである。

一部の試験では、尿素で予備処理されたエチルエステルから、超臨界ＣＯ₂のレベルは５００であるが、９０％程度のＤＨＡ含有量を有する留分を得ることが可能である。
未処理のエチルエステルを使用した場合には、超臨界ＣＯ₂のレベルは３００〜４００程度であるが、著者らはＤＨＡ富化留分（含有量は５３〜６０％）を記載している。

従って、この方法は下記の欠点を有する。まず、バッチ（回分）法からなることである。使用した超臨界ＣＯ₂のレベルは非常に高く、従ってこの方法の収率は低いに違いなく、工業的には使用できない。実際、これは追加のエネルギーコストを伴い、従って生産性が低い。塔頂の１００℃という温度は脂肪酸の分解・劣化を誘発しうる。しかし、これが著者らが推奨する温度なのである。使用する圧力も非常に高く、それを低下させると、超臨界ＣＯ₂のレベルの増大を伴うであろう。さらに、この論文は、分離、従って富化を向上させるために、塔内における温度勾配、特に内部還流の使用を推奨している。しかし、そのような還流の存在はこの方法の生産性を低下させる。

賀戸ら（特開２００５−２５５９７１号公報）は、魚油エチルエステルをＥＰＡ及びＤＨＡにより富化する方法を記載している。特許請求されている温度及び圧力範囲は３５〜２００℃及び１００×１０⁵Ｐａ〜５００×１０⁵Ｐａである。著者らは、高い含有量を得るために２回の連続抽出を推奨している。第１の抽出は原材料に対し行われ、第２の抽出は第１の操作の残留液（塔底液）に対して行われる。使用するカラムは、高さ３ｍ、内径５０ｍｍである。それは６つの別個の加熱チャンバーを備える。２回の連続抽出は方法を複雑にし、工業的に適用不可能にしてしまう。

高いＤＨＡ含有量を得るために使用される超臨界ＣＯ₂のレベルは高い（１２７程度）。従って、ＤＨＡの収率は低い。さらに、著者らは塔内に温度勾配の適用（それは精留効果を得るのを可能にする）を推奨している。従って、生産性も制限される。

Lucien ら (Australasian biotechnology, 1993, 3(3), 143-147) は、１７／１２（ＥＰＡ／ＤＨＡ）イワシ油からＥＰＡ及びＤＨＡエチルエステル富化抽出液を得るための方法を記載している。達成される含有量は塔頂に配置された加熱チャンバーにより発生させた内部還流によって改善することができ、それぞれ４２％及び５４％のＥＰＡ及びＤＨＡ含有量を得ることができる。この配置での最善の操業条件は、塔内が１５０×１０⁵Ｐａ、４０℃で、還流温度が１００℃である。使用した超臨界ＣＯ₂のレベルは明記されていない。次表は得られた結果を含んでいる。

従って、この方法には下記の欠点がある。塔頂の１００℃という温度は、脂肪酸の劣化・分解を誘発する恐れがある。しかし、これが著者が推奨する温度である。さらに、この論文は、分離、従って富化を向上させるために、塔内における温度勾配、特に内部還流の使用を推奨している。しかし、そのような還流の存在はこの方法の生産性を低下させる。

最後に、Zhu ら (第３回超臨界流体国際シンポジウム講演集、ストラスブール、1994) は、それぞれＥＰＡ及びＤＨＡが富化している留分を得るための脂肪酸エチルエステル抽出／分留法を記載している。このために、抽出器内に収容されている脂肪酸エステルをＣＯ₂流で抽出し、このエステルを含有させたＣＯ₂流を次いで塔内で分留する。試験化合物に対する選択性を向上させるため、温度勾配及び圧力プログラミングが塔内で行われる。このバッチ法では、使用したＤＨＡの１２％を占める留分を５０％より高い純度で分離することができる。

従って、この方法には次の欠点がある。まずバッチ法からなり、そのために、圧力プログラミングを含むことがある。使用する超臨界ＣＯ₂のレベルは非常に高く（２１１）、従ってこの方法の収率は低くなるに違いなく、工業的に利用不可能である。実際、この方法は追加のエネルギーコストを伴い、従って生産性が低い。さらに、この論文は、分離、従って富化を向上させるために、塔内における温度勾配、特に内部還流の使用を推奨している。しかし、そのような還流の存在はこの方法の生産性を低下させる。
Nilsson et al, JAOCS 1988, 65(1), 109-117 Lucien et al., Australasian biotechnology, 1993, 3(3), 143-147 Zhu et al., 第３回超臨界流体国際シンポジウム講演集、ストラスブール、1994 特開２００５−２５５９７１号公報

従って、文献に記載されている方法の大部分は、高いレベルの超臨界ＣＯ₂を使用し、それによりＤＨＡ収率が低くなり、従って工業的に実施可能ではない方法となる。また、工業的に実施可能な方法にとって、操業圧力が極めて高い圧力とはならないことも必要である。しかし、圧力が低下すると、密度が低下し、従って、同じＤＨＡ含有量を得るのに超臨界ＣＯ₂のレベルを増大させることが必要となる。従って、有益なＤＨＡの富化、即ち、少なくとも５０％の含有量を得るためには、圧力と超臨界ＣＯ₂のレベルと収率との間で妥協展を見いだす必要がある。さらに、工業的観点からは連続法だけが興味がある。

最後に、脂肪酸、特にＤＨＡの分解・劣化を防止するには、低い温度、即ち、１００℃未満の温度、特に７０℃以下の温度で処理を行うことが得策である。
また、尿素による脂肪酸の予備処理を必要とせずに、単一（１回）の向流分留工程を使用するだけで脂肪酸溶液をＤＨＡで富化することができる方法を見いだすことも有利である。

かくして、本発明者らは、７０℃以下の温度、１００×１０⁵Ｐａ〜１６０×１０⁵Ｐａの圧力、かつ３０〜７０の超臨界ＣＯ₂のレベルが、単一の超臨界ＣＯ₂向流分留工程の一部として、尿素による予備処理を行わずに、溶液の全脂肪酸又はその誘導体に対するＤＨＡ含有量が５０％未満の脂肪酸又はその誘導体の溶液から少なくとも５０％へのＤＨＡ高濃度化を得ることを可能にすることを予想外にも発見した。

よって、本発明は、溶液中の全脂肪酸又はその誘導体に対するＤＨＡ含有量が５０％未満である脂肪酸又はその誘導体の溶液のＤＨＡ高濃度化のための連続方法に関し、該方法は下記工程を含む：
(ａ)７０℃以下の温度及び１００×１０⁵Ｐａ〜１６０×１０⁵Ｐａ、有利には１２０×１０⁵Ｐａ〜１４０×１０⁵Ｐａの圧力で、超臨界ＣＯ₂の流れと前記脂肪酸又はその誘導体の溶液の流れとを分留塔に同時に向流注入し、ここで、超臨界ＣＯ₂のレベルは３０から７０、有利には３０から４０の間であり、そして
(ｂ)残留液中の全脂肪酸又はその誘導体に対するＤＨＡの含有量が５０％以上である残留液（塔底液）を回収し、ここでＤＨＡ収率は６０％以上である。

特に指定しない限り、全脂肪酸又はその誘導体に対するＤＨＡ（又はＥＰＡ）の％は、面積％として表される。実際、これらの値は、ＤＨＡ（又はＥＰＡ）に帰属されるピーク面積を溶液又は残留液中に存在する脂肪酸に帰属される全てのピーク面積の合計で除した値に相当する。これらのピークは、本明細書の実験部分で説明する方法に従ってガスクロマトグラフィーによって得られ、その面積は得られたクロマトグラム上で測定される。

本発明によると、「脂肪酸誘導体」なる用語は、脂肪酸エステル、特にメチル又はエチルエステルを意味する。有利には、それはエチルエステルを意味する。
有利には、使用する脂肪酸又はその誘導体の溶液は未処理溶液、即ち、尿素による予備処理を受けていない溶液であり、従って脂肪酸及びその誘導体は尿素と複合体を形成していない。有利には、それはエチルエステル溶液からなる。

有利には、使用する脂肪酸又はその誘導体の溶液は、溶液中の全脂肪酸又はその誘導体に対して少なくとも２０％、有利には少なくとも２５％のＤＨＡを含有する。
本発明の特定の１態様において、脂肪酸又はその誘導体の溶液は魚油又は海藻油であり、有利には魚油である。特に、それはまぐろ油又はたら肝油からなる。

特に、この油は、油中の全脂肪酸又はその誘導体に対して少なくとも２０％、有利には少なくとも２５％のＤＨＡを含有する。具体的には、たら肝油はその主要脂肪酸に関して下記組成を有する。

有利には、使用するまぐろ油（ツナオイル）はＥＰＡ５５％とＤＨＡ２６.６％とを含有する。有利には、実施例において後述する方法を用いてガスクロマトグラフィーにより得られたそのクロマトグラムは図１に示される。

有利には、まぐろ油はＰＯＬＡＲＩＳ社またはＰＲＯＮＯＶＡＢＩＯＣＡＲＥ社により市販されている25ＤＨＡまぐろ油からなる。
本発明によると、「超臨界ＣＯ₂のレベル」とは脂肪酸又はその誘導体の溶液の流量に対する超臨界ＣＯ₂の流量の比を意味する。

従って、本発明に係る方法は、脂肪酸又はその誘導体の溶液と超臨界ＣＯ₂とを分留塔に同時に向流注入することからなる。後者の超臨界ＣＯ₂は塔底に注入され、脂肪酸又はその誘導体の溶液は、塔のより高い位置に注入される。ＣＯ₂の流れには、抽出された揮発性がより高い化合物が徐々に満たされていく。これらの揮発性化合物は、圧力低下後にサイクロン分離装置内で回収される。

本発明の特定の１態様において、塔底の温度は塔頂の温度より低い。従って、塔（カラム）内には温度勾配が存在する。有利には、塔頂の温度は５５〜７０℃の範囲内であり、塔底の温度は３５〜５０℃の範囲内である。

この勾配の存在により、方法の生産性は低下するが、ＤＨＡ収率は増大する。実際、温度勾配は塔の閉塞を引き起こすことがある内部還流を誘発する。従って、より低い溶液流量で操作する必要がある。

本発明の別の態様では、工程(a)の温度は塔内で一定である。従って、塔内に温度勾配は存在しない。有利には、この温度は４０〜７０℃の範囲内である。この勾配の不存在は生産性を高めるが、ＤＨＡ収率は低下する。

有利な１態様において、分留塔は、長さが少なくとも１.５ｍ、内径は少なくとも２０ｍｍであり、有利には長さが少なくとも８ｍ、内径は少なくとも１２６ｍｍである
別の態様では、塔内に用いる圧力が１３５×１０⁵Ｐａである。

従って、本発明に係る方法により、残留液の全脂肪酸又はその誘導体に対して少なくとも５０％のＤＨＡ、有利には５０〜７０％のＤＨＡを含有する残留液を得ることが可能となる。この残留液は、塔底から連続的に抜き出される。有利には、この残留液は残留液の全脂肪酸又はその誘導体に対して少なくとも５２％のＤＨＡ、有利には少なくとも５５％のＤＨＡ、より有利には少なくとも６０％のＤＨＡを含有する。

有利には、本発明に係る方法のＤＨＡ収率は少なくとも６０％であり、有利には少なくとも６５％であり、より有利には少なくとも７０％である。塔内に温度勾配が存在する場合には、この収率はより有利には少なくとも８０％である。

本発明はまた、本発明に係る方法によって得ることができる、少なくとも５０％のＤＨＡを含有する脂肪酸又はその誘導体の溶液に関する。
本発明はまた、医薬品として使用するための本発明に係る脂肪酸又はその誘導体の溶液にも関する。

最後に、本発明は、アルツハイマー病のような神経変性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患及び／又は炎症を治療するための医薬品として使用するための本発明に係る脂肪酸又はその誘導体の溶液にも関する。

本発明は、図面と以下の実施例とを考慮するとよりはっきり理解されよう。
富化（高濃度化処理）された溶液と最初のまぐろ油の分析手順は次の通りである。
富化された溶液と最初のまぐろ油の組成を、下記手法に従ってガスクロマトグラフィーによって分析する：
装置：フレームイオン化検出器を備えたガスクロマトグラフィー装置；
操作条件：

方法：
対照溶液調製：
5.0 mlのフラスコに、ドコサヘキサエン酸ＳＣＲ (ＤＨＡ) エチルエステル30 mg、エイコサペンタエン酸ＳＣＲ (ＥＰＡ) エチルエステル45 mgを入れる。トリメチルペンタンＲ中の50 mg/l ブチルヒドロキシトルエン溶液Ｒ中に溶解し、同じ溶液で所定容積にする。

試験溶液調製 (２試験)：
10.0 mlのフラスコに試験物質0.5 gを入れる。トリメチルペンタンＲ中の50 mg/l ブチルヒドロキシトルエン溶液Ｒ中に溶解し、同じ溶液で所定容積にする。

結果の処理：
試験溶液中のエイコサペンタエン酸 (ＥＰＡ) エチルエステル及びドコサヘキサエン酸 (ＤＨＡ) エチルエステルの面積率（％）を記録する。

以下の実施例を非制限的な表示として示す。
（実施例１）
高さ1.5 m、内径20 mmの実験室用充填塔に、POLARISなる名称で市販されている、5.5％のＥＰＡと26.6％のＤＨＡとを含有する、25ＤＨＡまぐろ油 (そのクロマトグラムを図１に示す) 1520ｇを注入する。全注入時間は４時間である。

操作パラメータは次の通りである：
−塔(カラム)内の圧力及び温度：135×10⁵ Pa、60℃;
−溶液注入流量：280 g/hr;
−ＣＯ₂流量：19 kg/hr。

従って、超臨界ＣＯ₂のレベルは67.8である。
富化された溶液を塔底から連続的に抜き出す。こうして、全脂肪酸又はその誘導体に対して55.0％のＤＨＡを含有する脂肪酸エチルエステルの溶液534 gが回収される。ＤＨＡ回収収率は77％である。
（実施例２）
高さ8 m、内径126 mmの工業用充填塔に、POLARISなる名称で市販されている、5.5％のＥＰＡと26.6％のＤＨＡとを含有する、25ＤＨＡまぐろ油 (そのクロマトグラムを図１に示す) 210.6 kgを注入する。全注入時間は９時間である。

操作パラメータは次の通りである：
−塔内の圧力及び温度：135×10⁵ Pa、60℃;
−溶液注入流量：23 kg/hr;
−ＣＯ₂流量：900 kg/hr。

従って、超臨界ＣＯ₂のレベルは39.1である。
富化された溶液を塔底から連続的に抜き出す。こうして、全脂肪酸又はその誘導体に対して63.7％のＤＨＡを含有する脂肪酸エチルエステルの溶液63.3 kgが回収される。ＤＨＡ回収収率は64％である。
（実施例３）
高さ8 m、内径126 mmの工業用充填塔に、POLARISなる名称で市販されている、5.5％のＥＰＡと26.6％のＤＨＡとを含有する、25ＤＨＡまぐろ油 (そのクロマトグラムを図１に示す) 203.0 kgを注入する。全注入時間は8.5時間である。

操作パラメータは次の通りである：
−塔内の圧力及び温度：135×10⁵ Pa、60℃;
−溶液注入流量：24 kg/hr;
−ＣＯ₂流量：800 kg/hr。

従って、超臨界ＣＯ₂のレベルは33.3である。
富化された溶液を塔底から連続的に抜き出す。こうして、全脂肪酸又はその誘導体に対して53.5％のＤＨＡを含有する脂肪酸エチルエステルの溶液85.4 kgが回収される。ＤＨＡ回収収率は75％である。
（実施例４）
高さ1.5 m、内径20 mmの実験室用充填塔に、POLARISなる名称で市販されている、5.5％のＥＰＡと26.6％のＤＨＡとを含有する、25ＤＨＡまぐろ油 (そのクロマトグラムを図１に示す) 333ｇを注入する。全注入時間は１時間45分である。

操作パラメータは次の通りである：
−塔内の圧力及び温度：135×10⁵ Pa;
−塔内の温度勾配：塔底45℃、塔頂65℃;
−溶液注入流量：220 g/hr;
−ＣＯ₂流量：15 kg/hr。

従って、超臨界ＣＯ₂のレベルは68である。
富化された溶液を塔底から連続的に抜き出す。こうして、全脂肪酸又はその誘導体に対して50％のＤＨＡを含有する脂肪酸エチルエステルの溶液166 gが回収される。ＤＨＡ回収収率は88％であり、生産性は95 g/hrである。

（実施例５）
高さ1.5 m、内径20 mmの実験室用充填塔に、POLARISなる名称で市販されている、5.5％のＥＰＡと26.6％のＤＨＡとを含有する、25ＤＨＡまぐろ油 (そのクロマトグラムを図１に示す) 800ｇを注入する。全注入時間は１時間50分である。

操作パラメータは次の通りである：
−塔内の圧力及び温度：135×10⁵ Pa、60℃;
−溶液注入流量：440 g/hr;
−ＣＯ₂流量：29 kg/hr。

従って、超臨界ＣＯ₂のレベルは65.9である。
富化された溶液を塔底から連続的に抜き出す。こうして、全脂肪酸又はその誘導体に対して51.0％のＤＨＡを含有する脂肪酸エチルエステルの溶液272 gが回収される。ＤＨＡ回収収率は65％である。生産性は160 g/hrである。

実施例で用いたまぐろ油のガスクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを示す。実施例１で得られた富化された残留液についてガスクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを示す。

Claims

溶液中の全脂肪酸又はその誘導体に対するＤＨＡ含有量が５０％未満である脂肪酸又はその誘導体の溶液のＤＨＡ高濃度化のための連続方法であって、下記工程を含む方法：
(ａ) ７０℃以下の温度及び１００×１０⁵Ｐａ〜１６０×１０⁵Ｐａの圧力で超臨界ＣＯ₂の流れと、前記脂肪酸又はその誘導体の溶液の流れ、とを分留塔に同時に向流注入し、ここで超臨界ＣＯ₂のレベルは３０から７０の間であり、そして
(ｂ) 残留液中の全脂肪酸又はその誘導体に対するＤＨＡ含有量が５０％以上の残留液を回収し、ここでＤＨＡ収率は６０％以上である。
分留塔の塔底の温度が塔頂の温度より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
分留塔の塔頂温度が５５〜７０℃の範囲内、塔底温度が３５〜５０℃の範囲内であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
工程 (ａ) の温度が塔内で一定であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
工程 (ａ) の温度が４０〜７０℃の範囲内であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
工程 (ａ) を１２０×１０⁵Ｐａ〜１４０×１０⁵Ｐａの圧力で行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
脂肪酸又はその誘導体の溶液が魚油の溶液であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
魚油の溶液が、まぐろ油又はたら肝油の溶液であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
魚油溶液が、魚油溶液の全脂肪酸又はその誘導体に対して２０％以上のＤＨＡを含有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
脂肪酸又はその誘導体の溶液が脂肪酸エチルエステル溶液であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
工程 (ａ) の超臨界ＣＯ₂のレベルが３０〜４０であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。