CN113697146B - 细胞建库过程中细胞分装的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞建库过程中细胞分装的方法，其包括以下步骤：组装分液器灭菌消毒组件；分液器灭菌消毒组件包装灭菌密封袋并进行高压灭菌；分液器灭菌消毒组件和带包装袋的细胞培养摇瓶进行紫外照射消毒；将细胞扩增并离心收集，使用培养基将细胞悬液调节至所需的密度；在生物安全柜中，拆除分液器灭菌消毒组件和细胞培养摇瓶的包装，将细胞悬液转移至细胞培养摇瓶中，然后将分液器取下并将分液器与细胞培养摇瓶连接，组成细胞悬液分装系统；打开分液器的控制阀，设置分装体积，将细胞悬液分装于细胞冻存管中，盖上管盖，于‑80℃预冻存24 h，次日转入液氮中长期储存。本发明能用极低的成本实现细胞的分装，使分装细胞满足均一性和一致性。

Description

细胞建库过程中细胞分装的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞建库过程中细胞分装的方法。
背景技术
根据相关法规，用于生物制药生产的细胞基质需至少建立主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB），其数量通常达200支以上以维持药物的整个生命周期。基于药物法规要求，所建立的细胞库应遵循“同一批”要求，所分装的细胞也要维持“均一性”和“一致性”。
目前，细胞库建库过程中的细胞分装通常为手动移液管分装，均一性和一致性极大依赖人员的操作稳定性，而且还存在“亚批”的概念。目前，还可以借助自动化设备进行细胞分装，用自动化设备分装可以较好的维持细胞分装的“均一性”和“一致性”，且可以一次分装完（同一批），然而设备价格高昂，耗材也非常昂贵，只有少数公司可以承担其费用并且购买，而且该自动化设备还需配备专有的生物安全柜（BSC）等硬件以维持一定的洁净度，而且在进行细胞分装时还要消耗大量的电力资源，因此，行业大多数均采用移液管“多人同时分装”和“单人多次分装”的操作，这是极其不严谨的策略，不仅不符合药物生产相关要求，也容易造成偏差，因而，需要设计一种新的细胞分装方法，已解决上述的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的细胞分装方法存在的问题，提供一种能够解决前述问题的细胞建库过程中细胞分装的方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：细胞建库过程中细胞分装的方法，其特点是：其包括以下步骤：
S1、组装分液器灭菌消毒组件，将分液器量程调节到最大，将可伸缩式吸管装在分液器的下端，然后将可伸缩式吸管伸入所需容量的支持容器中，分液器的下端开口与支持容器连接，将空气过滤器通过鲁尔接头与分液器的通气口连接；
S2、将步骤S1组装好的分液器灭菌消毒组件放入灭菌密封袋中，并使用高压灭菌锅进行高压灭菌；
S3、灭菌完毕后，将组装的分液器灭菌消毒组件和带包装袋的细胞培养摇瓶放入生物安全柜中，紫外照射消毒；
S4、将细胞扩增至目标数量后离心收集细胞，然后使用培养基将细胞悬液调节至所需的密度；
S5、在生物安全柜运行条件下，拆除分液器灭菌消毒组件的灭菌密封袋和细胞培养摇瓶的包装袋，将准备完毕的细胞悬液转移至细胞培养摇瓶中，然后将分液器与支持容器分开，将可伸缩式吸管放入细胞培养摇瓶中，分液器的下端开口与细胞培养摇瓶连接，组成细胞悬液分装系统；
S6打开分液器的控制阀，调节设置好分装体积，以连续分液的方式将细胞悬液分装于细胞冻存管中，分装过程中间断式的摇晃细胞培养摇瓶以维持细胞悬液的均一性；
S7盖上细胞冻存管的管盖并拧紧后贴上标签，放入温度梯度冻存盒后于-80℃预冻存24 h，次日转入液氮中长期储存，液氮中储存24 h后，随机取若干支细胞冻存管进行复苏和传代培养，观察细胞复苏后的生长状态。
作为上述细胞建库过程中细胞分装的方法的进一步改进，所述的步骤S4中，培养基中含有细胞冻存液。细胞冻存液为二甲基亚砜或其他细胞冻存液，二甲基亚砜能作为细胞冷冻保护剂，使冷冻保存的细胞在复苏后，具有较好的活性。
作为上述细胞建库过程中细胞分装的方法的进一步改进，所述的步骤S1中，分液器通过转接盖与支持容器连接。通过转接盖使分液器能与不同口径的支持容器连接。
作为上述细胞建库过程中细胞分装的方法的进一步改进，所述的步骤S2中，高压灭菌锅的温度为120-150℃，高压灭菌时间为20-60分钟。通过高压灭菌锅内部的高温和高压，能对组装的分液器灭菌消毒组件进行灭菌。
作为上述细胞建库过程中细胞分装的方法的进一步改进，调节细胞悬液密度为1.0×107/mL-2.0×107/mL。细胞悬液的密度根据实际需要进行设置，通常为1.5×107/mL。
作为上述细胞建库过程中细胞分装的方法的进一步改进，步骤S6所述的分装过程，在最短的时间内完成，以保障细胞悬液的一致性。分装的时间越短，细胞悬液的一致性就越好，因而，必须要在最短的时间内完成分装过程，通常207支一批的细胞冻存管，要在30min内完成分装。
作为上述细胞建库过程中细胞分装的方法的进一步改进，所述分液器为瓶口分液器。分液器选用瓶口分液器，操作简单，而且瓶口分液器能够很好的实现细胞的分装，并保证分装细胞的均一性。
作为上述细胞建库过程中细胞分装的方法的进一步改进，所述支持容器为玻璃瓶。
本发明的具有以下优点：1）本发明的细胞分装的方法，利用了分液器的精度高和可连续分液的特点，首先将分液器与支持容器组配成可高压灭菌的分液器灭菌消毒组件，支持容器可以选用玻璃瓶，因为玻璃瓶与分液器的连接密封性比较低，而且玻璃瓶能耐高温高压，适合进行高压灭菌，所以能在高压灭菌锅内进行高压灭菌，高压灭菌完成后可以去掉玻璃瓶，然后在生物安全柜中将高压灭菌后的分液器与无菌的细胞培养摇瓶组配成细胞分装系统，因为分液器与细胞培养摇瓶之间的密封性好，所以细胞培养摇瓶可以用于细胞分装时储存细胞悬液的容器，可实现快速而高效的细胞悬液分装，因为细胞培养摇瓶的容量通常为250ml或500ml，而细胞悬液的分装体积通常为1ml，所以可以一次完成一个批次几百份的细胞悬液的分装，且分装的每管细胞具有良好的“一致性”和“均一性”，而且整个组件的费用也非常低廉；2）本发明的细胞分装方法，具有通用性，能用于各种细胞的分装，例如CHO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞以及其他常用哺乳动物细胞和微生物细胞。
附图说明
图1为本发明的分液器与细胞培养摇瓶的连接结构示意图。
图中，分液器1，细胞培养摇瓶2，可伸缩式吸管3，空气过滤器4，转接盖5，控制阀6，排液口7。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种细胞建库过程中细胞分装的方法，其包括以下步骤：
S1、组装分液器灭菌消毒组件，将分液器1量程调节到最大，例如将分液器1量程调节为5ml，将可伸缩式吸管3装在分液器的下端，然后将可伸缩式吸管3伸入所需容量的支持容器中，根据需要支持容器的容量通常可以选择250ml或500ml，分液器1的下端开口与支持容器连接，将空气过滤器4通过鲁尔接头与分液器1的通气口连接；支持容器通常可以选用250ml或500ml玻璃瓶；将分液器1量程调节到最大能使分液器内部能与细胞悬液接触的地方在后续的高压灭菌中能最大可能的高压灭菌，使高压灭菌更彻底；
S2、将步骤S1组装好的分液器灭菌消毒组件放入灭菌密封袋中，并使用高压灭菌锅进行高压灭菌，高压灭菌锅的温度设置为120-130℃，灭菌时间为30min，灭菌的温度和时间可以根据需要进行调节；
S3、灭菌完毕后，将组装的分液器灭菌消毒组件和带包装袋的细胞培养摇瓶2放入生物安全柜中，紫外照射消毒，细胞培养摇瓶2的容积为250ml或500ml；
S4、将细胞扩增至目标数量后离心收集细胞，然后使用培养基将细胞悬液调节至所需的密度，培养基中含有细胞冻存液，通常可以选用二甲基亚砜作为细胞冻存液，通常调节细胞悬液密度为1.5×107/mL；
S5、在生物安全柜运行条件下，拆除分液器灭菌消毒组件的灭菌密封袋和细胞培养摇瓶2的包装袋，将准备完毕的细胞悬液转移至细胞培养摇瓶2中，然后将分液器1与支持容器分开，将可伸缩式吸管3放入细胞培养摇瓶2中，分液器1的下端开口与细胞培养摇瓶2连接，组成细胞悬液分装系统；
S6打开分液器的控制阀6，调节设置好分装体积，通常分装体积设置为1ml，然后以连续分液的方式使细胞悬液从分液器的排液口7流出，分装于细胞冻存管中，分装过程中间断式的摇晃细胞培养摇瓶以维持细胞悬液的均一性，分装过程要在最短的时间内完成，以保障细胞悬液的一致性，通常207支一批的细胞冻存管，要在30min内完成分装；
S7盖上细胞冻存管的管盖并拧紧后贴上标签，放入温度梯度冻存盒后于-80℃预冻存24 h，次日转入液氮中长期储存，液氮中储存24 h后，随机取若干支细胞冻存管进行复苏和传代培养，观察细胞复苏后的生长状态。
通过实验可以确定，采用本发明的分装方法，细胞复苏后细胞状态良好，且分装的细胞具备所需的一致性和均一性。
作为优选实施例，所述分液器为瓶口分液器。分液器与支持容器连接时，可以根据瓶口尺寸更换GL35、GL38、GL40和GL45等不同尺寸的转接盖将分液器与支持容器连接起来。
本发明的细胞分装方法，能一次性完成一个批次的细胞分装，并且通过实验检测可知，分装的细胞具有良好的“一致性”和“均一性”。
本发明的细胞分装方法，利用的组件的费用非常低廉，与自动化分装设备相比，成本极低，与传统的手动分装方法相比，分装效率大幅度提高，且分装的细胞具备良好的一致性和均一性。
本发明的细胞分装方法，具有通用性，能用于各种细胞的分装，例如CHO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞以及其他常用哺乳动物细胞和微生物细胞。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种细胞建库过程中细胞分装的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
S1、组装分液器灭菌消毒组件，将分液器量程调节到最大，将可伸缩式吸管装在分液器的下端，然后将可伸缩式吸管伸入所需容量的支持容器中，分液器的下端开口与支持容器连接，将空气过滤器通过鲁尔接头与分液器的通气口连接；
S2、将步骤S1组装好的分液器灭菌消毒组件放入灭菌密封袋中，并使用高压灭菌锅进行高压灭菌；
S3、灭菌完毕后，将组装的分液器灭菌消毒组件和带包装袋的细胞培养摇瓶放入生物安全柜中，紫外照射消毒；
S4、将细胞扩增至目标数量后离心收集细胞，然后使用培养基将细胞悬液调节至所需的密度；
S5、在生物安全柜运行条件下，拆除分液器灭菌消毒组件的灭菌密封袋和细胞培养摇瓶的包装袋，将准备完毕的细胞悬液转移至细胞培养摇瓶中，然后将分液器与支持容器分开，将可伸缩式吸管放入细胞培养摇瓶中，分液器的下端开口与细胞培养摇瓶连接，组成细胞悬液分装系统；
S6、打开分液器的控制阀，调节设置好分装体积，以连续分液的方式将细胞悬液分装于细胞冻存管中，分装过程中间断式的摇晃细胞培养摇瓶以维持细胞悬液的均一性；
S7、盖上细胞冻存管的管盖并拧紧后贴上标签，放入温度梯度冻存盒后于-80℃预冻存24 h，次日转入液氮中长期储存，液氮中储存24 h后，随机取若干支细胞冻存管进行复苏和传代培养，观察细胞复苏后的生长状态；
所述的步骤S2中，高压灭菌锅的温度为120-150℃，高压灭菌时间为20-60分钟；
调节细胞悬液密度为1.5×107/mL。
2.根据权利要求1所述的细胞建库过程中细胞分装的方法，其特征在于：所述的步骤S4中，培养基中含有细胞冻存液。
3.根据权利要求1所述的细胞建库过程中细胞分装的方法，其特征在于：所述的步骤S1中，分液器通过转接盖与支持容器连接。
4.根据权利要求1所述的细胞建库过程中细胞分装的方法，其特征在于：所述分液器为瓶口分液器。
5.根据权利要求1所述的细胞建库过程中细胞分装的方法，其特征在于：所述支持容器为玻璃瓶。
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