CN113693032A - 一种基于人工接种评价水稻品种抗水稻齿叶矮缩病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于人工接种评价水稻品种抗水稻齿叶矮缩病的方法，包括采集和饲养褐飞虱、获得无毒褐飞虱群体、准备毒源、准备参鉴水稻、褐飞虱饲毒、人工接种、调查、计算发病率等步骤，本发明的方法优化了传毒介体褐飞虱的饲养传毒条件和评价体系，确定了人工接种饲毒时间、接种苗龄、时间、强度等关键技术指标，制定了水稻品种抗抗水稻齿叶矮缩病人工接种鉴定技术规程，为规范开展水稻品种抗病性鉴定评价提供参考，为进一步挖掘抗病基因、加快抗病育种进程和进行病害绿色综合防控奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗性鉴定技术领域，特别涉及一种基于人工接种评价水稻品种抗水稻齿叶矮缩病的方法。
背景技术
水稻齿叶矮缩病病原为水稻齿叶矮缩病毒(Riceragged stunt virus,RRSV)，主要由迁飞性害虫褐飞虱以持久增殖的方式进行传毒，水稻各生育期均能感染为害，感病后植株矮小、高位分蘖、分蘖增多、叶尖扭曲、叶色深绿、叶缘有锯齿状缺刻、叶鞘和叶片出现脉肿等，严重的无法正常抽穗结实。1978年，我国的福建省发现并报道该病，随后广东、江西等地也陆续有报道。该病害曾于上世纪爆发成灾，后趋于零星发生。直至2006年以后，该病在越南北部稻区爆发成灾。我国福建省的沙县、长汀、上杭、永定、三明市、龙岩市等地的水稻同样受到严重危害，发病田块约8万hm2。近年来，华南稻区普遍存在水稻齿叶矮缩病，且常与SRBSDV复合侵染，危害严重。
推广种植抗(耐)病品种是经济环保有效的防治措施之一，由于该病毒出现时间不长，尚缺乏统一的抗病性鉴定技术操作规程，水稻品种对病害的抗病性缺乏有效评价。人工接种鉴定在可控条件下开展，能确保鉴定的准确性和可比性，且能克服田间鉴定中难以规避的问题，拓宽鉴定时间。目前，本领域尚缺乏能够模拟水稻在自然环境中感染水稻齿叶矮缩病毒的抗性鉴定方法。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对上述技术问题，发明一种基于人工接种评价水稻品种抗水稻齿叶矮缩病的方法。
本发明的方法包括以下步骤：
(1)采集褐飞虱：从田间采集褐飞虱若虫或成虫，进行人工饲养，得到待产卵的褐飞虱雌成虫；
(2)获得无毒褐飞虱群体：使步骤(1)采集的单头待产卵褐飞虱雌成虫在水稻苗上产卵，孵化出褐飞虱后代若虫群体，一个后代若虫群体指的是单头褐飞虱雌成虫产卵孵化出来的后代群体，每群体选取10头～20头若虫，对选取出来的若虫和产卵褐飞虱雌成虫都进行水稻齿叶矮缩病毒的带毒检测，选取产卵褐飞虱雌成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒褐飞虱群体；
(3)准备毒源：采集患水稻齿叶矮缩病的水稻植株，在隔离条件下，利用褐飞虱在病株上饲毒后接种水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源；
(4)褐飞虱饲毒：将步骤(2)得到的1龄～2龄的无毒褐飞虱群体和步骤(3)得到的作为毒源的病株放入隔离条件中进行饲毒，饲毒1d～3d之后将虫移出继续饲养，度过循回期后，每群体随机取出25头～35头褐飞虱高龄若虫或成虫进行水稻齿叶矮缩病毒检测，计算褐飞虱群体的带毒率，带毒率＞60％即可用于下一步的试验；
(5)参鉴水稻的准备：将参鉴水稻的种子浸种、催芽，选取25粒～35粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的人工培养容器中进行育苗，每品种重复3次；
(6)接种：选取步骤(4)中已饲毒且度过循回期的褐飞虱成虫群体，在隔离条件下，将褐飞虱接种到1.5叶～2叶龄期的参鉴水稻秧苗上，2d后将褐飞虱移出或用杀虫剂将接种用的褐飞虱全部扑杀；
其中，褐飞虱的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/株计，按照以下公式计算：
IVS＝N×PVS
在公式中：IVS为褐飞虱的有效接种虫量，N为单株水稻接种褐飞虱的数量，PVS为褐飞虱的带毒率；
在本步骤中，确保IVS的范围为1头/株～2头/株；
(7)调查发病情况：接种20d后调查参鉴水稻植株的发病情况，苗期发病症状：
a)植株浓绿矮缩，分蘖增多，新叶叶尖扭曲呈螺旋状，部分叶片叶缘出现锯齿状缺刻，或叶鞘和叶片基部出现长短不一的线状脉肿；
b)植株矮缩，叶色稍浓绿；
出现a)症状的植物直接记为水稻齿叶矮缩病病株；出现b)症状的植株进行检测确认是否患水稻齿叶矮缩病；
(8)计算发病率：发病率用Ri表示，数值以％计，按以下公式计算发病率：
Ri＝ni/nt×100％
在公式中，Ri为发病率，ni为病株数，nt为总株数；
(9)抗性分级标准：按照如下标准对参鉴水稻的抗性进行分级：
a)0级，发病率为0，免疫；
b)1级，发病率为0.1％～5％，高抗；
c)3级，发病率为5.1％～15％，中抗；
d)5级，发病率为15.1％～30％，中感；
e)7级，发病率为30.1％～60％，感病；
f)9级，发病率大于60.1％，高感。
其中，所述循回期为饲毒后1d～11d，饲毒后超过11d即为度过循回期。
其中，步骤(1)中进行人工饲养的条件为：温度(28±1)℃,相对湿度80％～90％，光照L:D＝12h:12h；
其中，步骤(2)中，将怀卵的单头褐飞虱成虫移至1.5叶期的水稻苗上产卵，3d后取出成虫，水稻苗继续培养7d～10d，孵化出褐飞虱后代若虫群体，每群体选取10头～20头2龄或3龄若虫，对选取出来的若虫和产卵褐飞虱成虫都进行水稻齿叶矮缩病毒的带毒检测，选取产卵褐飞虱成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒褐飞虱群体。
其中，步骤(3)中，从田间采集表现水稻齿叶矮缩病疑似症状的水稻植株，保留经检测确认感染水稻齿叶矮缩病毒的病株，在隔离条件下，利用褐飞虱在病株上饲毒后接种其他水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源。
其中，步骤(4)中，饲毒2d后将虫移出继续饲养，度过循回期后，每群体随机取出30头褐飞虱高龄若虫或成虫进行水稻齿叶矮缩病毒的带毒检测，计算褐飞虱群体的带毒率。
其中，步骤(5)中，选取30粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的人工培养容器中进行育苗。
其中，步骤(6)中，在将褐飞虱接种到1.5叶～2叶龄期的水稻秧苗上之后，保持培养温度为(28±1)℃，每天上午和下午各赶虫一次，使褐飞虱分布均匀，2d后将褐飞虱移出或用杀虫剂将接种用的褐飞虱全部扑杀，将水稻秧苗在无褐飞虱、温度为20℃～35℃的条件下继续培育，常规管理。
其中，步骤(7)中，每隔7d～10d调查一次，每品种有3个重复，每个重复调查3次；在每个重复中取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异均不超过1个等级，则认定本次鉴定准确；若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异超过1个等级，则认定本次鉴定不准确。
其中，本方法使用易感水稻齿叶矮缩病的水稻品种作为对照组；在步骤(7)中，对照组每隔7d～10d调查一次，进行3个重复，每个重复调查3次；在每个重复的3次调查中，取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据发病率均＞30％，则认定本次鉴定有效；若3个重复中抗性级别最高的调查数据里有至少1个发病率≤30％，则认定本次鉴定无效。
其中，所述易感水稻齿叶矮缩病的水稻品种为水稻品种日本晴。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的鉴定方法优化了传毒介体褐飞虱的饲养传毒条件和鉴定体系，确定了人工接种饲毒时间、接种苗龄、时间、强度等关键技术指标，制定了水稻品种抗水稻齿叶矮缩病人工接种鉴定技术规程，为规范开展水稻品种抗病性鉴定评价提供参考，为进一步挖掘抗病基因、加快抗病育种进程和进行病害绿色综合防控奠定基础。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、实际若无特殊说明，皆为市售所得。
实施例一鉴定不同水稻品种抗水稻齿叶矮缩病的抗性
1、水稻品种：特优63、油占8号、日本晴、广野稻、广恢998
2、水稻齿叶矮缩病毒的检测方法：
(1)提取待测水稻叶片或待测褐飞虱虫的RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行PCR检测；
(2)PCR的引物为：RRSV-F:5'-GCCTTTCGTGCAATTCCC-3'，RRSV-R:5'-GCGTCATCA CCAAAGTTAGCC-3'；
(3)PCR的反应条件为：50℃，30min；94℃，4min，94℃，30s；56℃，30s；72℃45s；35个循环；72℃延伸10min，12℃保存；
(4)所得PCR产物经1％的琼脂糖凝胶检测，扩增出预期条带895bp的样品定性为阳性样品，未扩增出条带的为阴性样品。
3、鉴定水稻齿叶矮缩病的抗性
(1)采集褐飞虱：从田间采集褐飞虱若虫或成虫，在养虫室内用水稻品种TN1进行人工饲养，得到待产卵的褐飞虱雌成虫；养虫室的条件为：温度(28±1)℃,相对湿度80％～90％，光照L:D＝12h:12h；
(2)获得无毒褐飞虱群体：将水稻品种TN1的种子用水浸种24h后，纱布覆盖，在恒温箱(32±2)℃催芽24h～48h，选取发芽良好的种子30粒均匀播于盛有自然肥力土壤的无孔塑料花盆(上口径20cm，高14cm，下同)中，大约50d后水稻进入分蘖期，将单头待产卵的褐飞虱雌成虫移入水稻苗中产卵，3d后取出成虫，将产卵雌成虫至于-20℃保存待检，水稻苗继续培养7d～10d，孵化出褐飞虱后代若虫群体，一个后代若虫群体指的是单头褐飞虱雌成虫产卵孵化出来的后代群体，每个群体约有100头若虫，每群体选取10头～20头2龄或3龄若虫，对选取出来的若虫和产卵褐飞虱成虫都进行水稻齿叶矮缩病毒的带毒检测，选取产卵褐飞虱成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒褐飞虱群体；
(3)准备毒源：从田间采集表现水稻齿叶矮缩病疑似症状的水稻植株种植在防虫网笼中的无孔塑料花盆中，保留经检测确认感染水稻齿叶矮缩病毒的病株，在隔离条件下，利用褐飞虱在病株上饲毒后接种水稻品种TN1秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源；
(4)褐飞虱饲毒：将毒源病株种于大烧杯内(内径10cm～20cm)中，土面覆盖滤纸，将适量1龄～2龄的无毒褐飞虱移入其中进行饲毒，平均每丛病株上放280头～320头若虫，并用60目防虫网封口。饲毒2d之后将虫移入防虫笼内无孔塑料花盆的水稻苗(TN1)上饲养，度过循回期(11d)后，每批随机取出30头褐飞虱高龄若虫或成虫，检测群体带水稻齿叶矮缩病毒的情况，计算褐飞虱群体的带毒率；
(5)参鉴水稻的准备：将参鉴水稻(包括对照组的水稻品种日本晴)的种子用水浸种24h后，纱布覆盖，恒温箱(32±2)℃催芽(24h～48h)，每个参鉴水稻选取30粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯(80mm～110mm，下同)中进行育苗，每品种重复3次；
(6)接种：选取步骤(4)中已饲毒且度过循回期的褐飞虱成虫群体，从中随机抽取50头虫，测定带毒率，计算接虫数量后接入已育有参鉴品种与对照组的塑料杯中，接种苗龄为1.5叶～2叶龄期，接种时间为2d，接种温度为(28±1)℃，每天上午和下午各赶虫一次，使褐飞虱分布均匀，2d后用杀虫剂将接种用的褐飞虱全部扑杀，将秧苗移出塑料杯，种植在防虫网室水泥池中，在20～35℃的条件下继续培育，常规管理；
其中，褐飞虱的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/株计，按照以下公式计算：
IVS＝N×PVS
在公式中：IVS为褐飞虱的有效接种虫量，N为单株水稻接种褐飞虱的数量，PVS为褐飞虱的带毒率；
在本实施例中，PVS为75％，N为2头，IVS为1.5头/株；
(7)调查发病情况：接种20d后调查参鉴水稻植株的发病情况，每隔7d～10d调查一次，共调查3次，苗期发病症状：
a)植株浓绿矮缩，分蘖增多，新叶叶尖扭曲呈螺旋状，部分叶片叶缘出现锯齿状缺刻，或叶鞘和叶片基部出现长短不一的线状脉肿；
b)植株矮缩，叶色稍浓绿；
出现a)症状的植物直接记为水稻齿叶矮缩病病株；出现b)症状的植株进行检测确认是否患水稻齿叶矮缩病；
(8)计算发病率：发病率用Ri表示，数值以％计，按以下公式计算发病率：
Ri＝ni/nt×100％
在公式中，Ri为发病率，ni为病株数，nt为总株数；
(9)抗性分级标准；按照如下标准对参鉴水稻的抗性进行分级：
a)0级，发病率为0，免疫；
b)1级，发病率为0.1％～5％，高抗；
c)3级，发病率为5.1％～15％，中抗；
d)5级，发病率为15.1％～30％，中感；
e)7级，发病率为30.1％～60％，感病；
f)9级，发病率大于60.1％，高感；
每参鉴品种有3个重复，每个重复调查3次；在每个重复中，取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异均不超过1个等级，则认定本次鉴定准确；若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异超过1个等级，则认定本次鉴定不准确；在对照组的3个重复(每个重复调查3次)调查中，每个重复取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据发病率均＞30％，则认定本次鉴定有效；若3个重复中抗性级别最高的调查数据里有至少1个发病率≤30％，则认定本次鉴定无效。
本实施例的抗性分级结果如下一页的表1所示：
表1不同水稻品种抗水稻齿叶矮缩病抗性鉴定结果
从表1可以看出，参鉴品种有3个重复，每个重复调查3次，3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异均不超过1个等级，说明本次鉴定准确。对照组3个重复的(每个重复调查3次)调查中，每个重复中抗性级别最高的调查数据发病率均＞30％，认定本次鉴定有效。
从表1的调查数据可以看出，特优63、油占8号、日本晴、广野稻、广恢998这5个水稻品种都是水稻齿叶矮缩病的高感品种。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种基于人工接种评价水稻品种抗水稻齿叶矮缩病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集褐飞虱：从田间采集褐飞虱若虫或成虫，进行人工饲养，得到待产卵的褐飞虱雌成虫；
(2)获得无毒褐飞虱群体：使步骤(1)采集的单头待产卵褐飞虱雌成虫在水稻苗上产卵，孵化出褐飞虱后代若虫群体，一个后代若虫群体指的是单头褐飞虱雌成虫产卵孵化出来的后代群体，每群体选取10头～20头若虫，对选取出来的若虫和产卵褐飞虱雌成虫都进行水稻齿叶矮缩病毒的带毒检测，选取产卵褐飞虱雌成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒褐飞虱群体；
(3)准备毒源：采集患水稻齿叶矮缩病的水稻植株，在隔离条件下，利用褐飞虱在病株上饲毒后接种水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源；
(4)褐飞虱饲毒：将步骤(2)得到的1龄～2龄的无毒褐飞虱群体和步骤(3)得到的作为毒源的病株放入隔离条件中进行饲毒，饲毒1d～3d之后将虫移出继续饲养，度过循回期后，每群体随机取出25头～35头褐飞虱高龄若虫或成虫进行水稻齿叶矮缩病毒检测，计算褐飞虱群体的带毒率，带毒率＞60％即可用于下一步的试验；
(5)参鉴水稻的准备：将参鉴水稻的种子浸种、催芽，选取25粒～35粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的人工培养容器中进行育苗，每品种重复3次；
(6)接种：选取步骤(4)中已饲毒且度过循回期的褐飞虱成虫群体，在隔离条件下，将褐飞虱接种到1.5叶～2叶龄期的参鉴水稻秧苗上，2d后将褐飞虱移出或用杀虫剂将接种用的褐飞虱全部扑杀；
其中，褐飞虱的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/株计，按照以下公式计算：
IVS＝N×PVS
在公式中：IVS为褐飞虱的有效接种虫量，N为单株水稻接种褐飞虱的数量，PVS为褐飞虱的带毒率；
在本步骤中，确保IVS的范围为1头/株～2头/株；
(7)调查发病情况：接种20d后调查参鉴水稻植株的发病情况，苗期发病症状：
a)植株浓绿矮缩，分蘖增多，新叶叶尖扭曲呈螺旋状，部分叶片叶缘出现锯齿状缺刻，或叶鞘和叶片基部出现长短不一的线状脉肿；
b)植株矮缩，叶色稍浓绿；
出现a)症状的植物直接记为水稻齿叶矮缩病病株；出现b)症状的植株进行检测确认是否患水稻齿叶矮缩病；
(8)计算发病率：发病率用Ri表示，数值以％计，按以下公式计算发病率：
Ri＝ni/nt×100％
在公式中，Ri为发病率，ni为病株数，nt为总株数；
(9)抗性分级标准：按照如下标准对参鉴水稻的抗性进行分级：
a)0级，发病率为0，免疫；
b)1级，发病率为0.1％～5％，高抗；
c)3级，发病率为5.1％～15％，中抗；
d)5级，发病率为15.1％～30％，中感；
e)7级，发病率为30.1％～60％，感病；
f)9级，发病率大于60.1％，高感。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述循回期为饲毒后1d～11d，饲毒后超过11d即为度过循回期。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中进行人工饲养的条件为：温度(28±1)℃,相对湿度80％～90％，光照L:D＝12h:12h。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，将怀卵的单头褐飞虱成虫移至1.5叶期的水稻苗上产卵，3d后取出成虫，水稻苗继续培养7d～10d，孵化出褐飞虱后代若虫群体，每群体选取10头～20头2龄或3龄若虫，对选取出来的若虫和产卵褐飞虱成虫都进行水稻齿叶矮缩病毒的带毒检测，选取产卵褐飞虱成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒褐飞虱群体。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，从田间采集表现水稻齿叶矮缩病疑似症状的水稻植株，保留经检测确认感染水稻齿叶矮缩病毒的病株，在隔离条件下，利用褐飞虱在病株上饲毒后接种其他水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，饲毒2d后将虫移出继续饲养，度过循回期后，每群体随机取出30头褐飞虱高龄若虫或成虫进行水稻齿叶矮缩病毒的带毒检测，计算褐飞虱群体的带毒率。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中，选取30粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的人工培养容器中进行育苗。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中，在将褐飞虱接种到1.5叶～2叶龄期的水稻秧苗上之后，保持培养温度为28±1℃，每天上午和下午各赶虫一次，使褐飞虱分布均匀，2d后将褐飞虱移出或用杀虫剂将接种用的褐飞虱全部扑杀，将水稻秧苗在无褐飞虱、温度为20℃～35℃的条件下继续培育，常规管理。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(7)中，每隔7d～10d调查一次，每品种有3个重复，每个重复调查3次；在每个重复中取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异均不超过1个等级，则认定本次鉴定准确；若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异超过1个等级，则认定本次鉴定不准确。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：本方法使用易感水稻齿叶矮缩病的水稻品种日本晴作为对照组；
在步骤(7)中，对照组每隔7d～10d调查一次，进行3个重复，每个重复调查3次；在每个重复的3次调查中，取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据发病率均＞30％，则认定本次鉴定有效；若3个重复中抗性级别最高的调查数据里有至少1个发病率≤30％，则认定本次鉴定无效。
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