CN113693033B - 一种基于人工接种评价水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于人工接种评价水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病的方法，包括采集和饲养白背飞虱、获得无毒白背飞虱群体、准备毒源、准备参鉴水稻、白背飞虱饲毒、人工接种、调查、计算发病率等步骤，本发明的方法优化了传毒介体白背飞虱的饲养传毒条件和评价体系，确定了人工接种饲毒时间、接种苗龄、时间、强度等关键技术指标，制定了水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病人工接种鉴定技术规程，为规范开展水稻品种抗病性鉴定评价提供参考，为进一步挖掘抗病基因、加快抗病育种进程和进行病害绿色综合防控奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗性鉴定技术领域，特别涉及一种基于人工接种评价水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病的方法。
背景技术
南方水稻黑条矮缩病(水稻南方黑条矮缩病)病原为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)，主要由迁飞性害虫白背飞虱以持久增殖的方式进行传毒，水稻各生育期均能感染为害，感病后植株矮缩，叶片浓绿卷曲，茎秆出现蜡条等，严重的无法正常抽穗结实，产量损失30％～50％。该病2001年首次在广东省阳西县发现，短短几年间，已给我国南方稻区及越南北部等水稻生产造成极大危害。2009年，广西、广东、海南等9省区普遍发病，约33.33万hm2晚稻严重受害，基本失收面积0.67万hm2。2010年，发病范围扩展至长江以南大部分稻区，全国累计发病120万hm2以上，2017年该病害在广西、广东等地晚稻再次引起严重损失。2020年，南方水稻黑条矮缩病被农业农村部列入严重威胁我国水稻生产和粮食安全的《一类农作物病虫害名录》。
推广种植抗(耐)病品种是经济环保有效的防治措施之一，由于该病毒出现时间不长，尚缺乏统一的抗病性鉴定技术操作规程，水稻品种对病害的抗病性缺乏有效评价。人工接种鉴定在可控条件下开展，能确保鉴定的准确性和可比性，且能克服田间鉴定中难以规避的问题，拓宽鉴定时间。
目前，本领域尚缺乏能够模拟水稻在自然环境中感染南方水稻黑条矮缩病的抗性鉴定方法。中国专利申请CN104542114A公开了一种南方水稻黑条矮缩病品种抗性鉴定方法，该方法存在专业性不强、难以标准化操作的缺点。因此，发明一种新的鉴定水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病抗性的方法极为重要。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对上述技术问题，发明一种基于人工接种评价水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病的方法。
本发明的方法包括以下步骤：
(1)采集白背飞虱：从田间采集白背飞虱若虫或成虫，进行人工饲养，得到待产卵的白背飞虱雌成虫；
(2)获得无毒白背飞虱群体：使步骤(1)采集的单头待产卵白背飞虱雌成虫在水稻苗上产卵，孵化出白背飞虱后代若虫群体，一个后代若虫群体指的是单头白背飞虱雌成虫产卵孵化出来的后代群体，每群体选取10头～20头若虫，对选取出来的若虫和产卵白背飞虱雌成虫都进行南方水稻黑条矮缩病毒的带毒检测，选取产卵白背飞虱雌成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒白背飞虱群体；
(3)准备毒源：采集患南方水稻黑条矮缩病的水稻植株，在隔离条件下，利用白背飞虱在病株上饲毒后接种水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源；
(4)白背飞虱饲毒：将步骤(2)得到的1龄～2龄的无毒白背飞虱群体和步骤(3)得到的作为毒源的病株放入隔离条件中进行饲毒，饲毒1d～3d之后将虫移出继续饲养，度过循回期后，每群体随机取出25头～35头白背飞虱高龄若虫或成虫进行南方水稻黑条矮缩病毒检测，计算白背飞虱群体的带毒率，带毒率＞60％即可用于下一步的试验；
(5)参鉴水稻的准备：将参鉴水稻的种子浸种、催芽，选取25粒～35粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的人工培养容器中进行育苗，每品种重复3次；
(6)接种：选取步骤(4)中已饲毒且度过循回期的白背飞虱成虫群体，在隔离条件下，将白背飞虱接种到1.5叶～2叶龄期的参鉴水稻秧苗上，2d后将白背飞虱移出或用杀虫剂将接种用的白背飞虱全部扑杀；
其中，白背飞虱的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/株计，按照以下公式计算：
IVS＝N×PVS
在公式中：IVS为白背飞虱的有效接种虫量，N为单株水稻接种白背飞虱的数量，PVS为白背飞虱的带毒率；
在本步骤中，确保IVS的范围为1头/株～2头/株；
(9)调查发病情况：接种20d后调查参鉴水稻植株的发病情况，苗期发病症状：
a)秧苗叶色浓绿，叶片短小僵直，心叶扭曲，或现锯齿叶；
b)植株矮化不明显，叶背沿叶脉有纵向不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色；
c)植株矮小，叶色稍浓绿；
出现a)或b)症状的植物直接记为南方水稻黑条矮缩病病株；出现c)症状的植株进行检测确认是否为南方水稻黑条矮缩病；
(10)计算发病率：发病率用Ri表示，数值以％计，按以下公式计算发病率：
Ri＝ni/nt×100％
在公式中，Ri为发病率，ni为病株数，nt为总株数；
(9)抗性分级标准：按照如下标准对参鉴水稻的抗性进行分级：
a)0级，发病率为0，免疫；
b)1级，发病率为0.1％～5％，高抗；
c)3级，发病率为5.1％～15％，中抗；
d)5级，发病率为15.1％～30％，中感；
e)7级，发病率为30.1％～60％，感病；
f)9级，发病率大于60.1％，高感。
其中，所述循回期为饲毒后1d～11d，饲毒后超过11d即为度过循回期。
其中，步骤(1)中进行人工饲养的条件为：温度(26±1)℃,相对湿度80％～90％，光照L:D＝12h:12h；
其中，步骤(2)中，将怀卵的单头白背飞虱成虫移至1.5叶期的水稻苗上产卵，3d后取出成虫，水稻苗继续培养7d～10d，孵化出白背飞虱后代若虫群体，每群体选取10头～20头2龄或3龄若虫，对选取出来的若虫和产卵白背飞虱成虫都进行南方水稻黑条矮缩病毒的带毒检测，选取产卵白背飞虱成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒白背飞虱群体。
其中，步骤(3)中，从田间采集表现南方水稻黑条矮缩病疑似症状的分蘖期水稻植株，保留经检测确认感染南方水稻黑条矮缩病毒的病株，在隔离条件下，利用白背飞虱在病株上饲毒后接种其他水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源。
其中，步骤(4)中，饲毒2d后将虫移出继续饲养，度过循回期后，每群体随机取出30头白背飞虱高龄若虫或成虫进行南方水稻黑条矮缩病毒的带毒检测，计算白背飞虱群体的带毒率。
其中，步骤(5)中，选取30粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的人工培养容器中进行育苗。
其中，步骤(6)中，在将白背飞虱接种到1.5叶～2叶龄期的水稻秧苗上之后，保持培养温度为(26±1)℃，每天上午和下午各赶虫一次，使白背飞虱分布均匀，2d后将白背飞虱移出或用杀虫剂将接种用的白背飞虱全部扑杀，将水稻秧苗在无白背飞虱、温度为15℃～30℃的条件下继续培育，常规管理。
其中，步骤(7)中，每隔7d～10d调查一次，每品种有3个重复，每个重复调查3次；取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异均不超过1个等级，则认定本次鉴定准确；若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异超过1个等级，则认定本次鉴定不准确。
其中，本方法使用易感南方水稻黑条矮缩病的水稻品种作为对照组；在步骤(7)中，对照组每隔7d～10d调查一次，进行3个重复，每个重复调查3次；在每个重复的3次调查中，取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据发病率均＞30％，则认定本次鉴定有效；若3个重复中抗性级别最高的调查数据里有至少1个发病率≤30％，则认定本次鉴定无效。
其中，所述易感南方水稻黑条矮缩病的水稻品种为水稻品种TN1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的鉴定方法优化了传毒介体白背飞虱的饲养传毒条件和鉴定体系，确定了人工接种饲毒时间、接种苗龄、时间、强度等关键技术指标，制定了水稻品种抗南方黑条矮缩病人工接种鉴定技术规程，为规范开展水稻品种抗病性鉴定评价提供参考，为进一步挖掘抗病基因、加快抗病育种进程和进行病害绿色综合防控奠定基础。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、实际若无特殊说明，皆为市售所得。
实施例一鉴定不同水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病的抗性
水稻品种：特优582、黔两优58、深两优1173、H两优991、恒丰优3550、恒丰优777、TN1；
南方水稻黑条矮缩病毒的检测方法：按照《南方水稻黑条矮缩病测报技术规范》(NY/T 2631)的附录C或《南方水稻黑条矮缩病防治技术规程》(NY/T 2918)的附录A进行；
(1)采集白背飞虱：从田间采集白背飞虱若虫或成虫，在养虫室内用水稻品种TN1进行人工饲养，得到待产卵的白背飞虱雌成虫；养虫室的条件为：温度(26±1)℃,相对湿度80％～90％，光照L:D＝12h:12h；
(2)获得无毒白背飞虱群体：将水稻品种TN1的种子用水浸种24h后，纱布覆盖，在恒温箱(32±2)℃催芽24h～48h，选取发芽良好的种子30粒均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯中，塑料杯内径为80mm～100mm，大约6d～7d后，待苗长至1.5叶期时，将单头待产卵的白背飞虱雌成虫移入杯中产卵，3d后取出成虫，将产卵雌成虫至于-20℃保存待检，水稻苗继续培养7d～10d，孵化出白背飞虱后代若虫群体，一个后代若虫群体指的是单头白背飞虱雌成虫产卵孵化出来的后代群体，每个群体约有100头若虫，每群体选取10头～20头2龄或3龄若虫，对选取出来的若虫和产卵白背飞虱成虫都进行南方水稻黑条矮缩病毒的带毒检测，选取产卵白背飞虱成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒白背飞虱群体；
(3)准备毒源：从田间采集表现南方水稻黑条矮缩病疑似症状的分蘖期水稻植株种植在防虫网笼中的塑料桶中，保留经检测确认感染南方水稻黑条矮缩病毒的病株，在隔离条件下，利用白背飞虱在病株上饲毒后接种水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源；
(4)白背飞虱饲毒：将毒源病株种于大烧杯内(内径100mm～110mm)中，土面覆盖滤纸，将适量1龄～2龄的无毒白背飞虱移入其中进行饲毒，平均每丛病株上放280头～320头若虫，并用60目防虫网封口。饲毒2d之后将虫移入塑料杯(内径80mm～110mm，预先育有白背飞虱喜食的水稻品种TN1秧苗)中饲养，度过循回期(11d)后，每批随机取出30头白背飞虱高龄若虫或成虫，检测群体带南方水稻黑条矮缩病毒的情况，计算白背飞虱群体的带毒率；
(5)参鉴水稻的准备：将参鉴水稻(包括对照组的水稻品种TN1)的种子用水浸种24h后，纱布覆盖，恒温箱(32±2)℃催芽(24h～48h)，每个参鉴水稻选取30粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯(80mm～110mm)中进行育苗，每品种重复3次；
(6)接种：选取步骤(4)中已饲毒且度过循回期的白背飞虱成虫群体，从中随机抽取≥50头虫，测定带毒率，计算接虫数量后接入已育有参鉴品种的塑料杯中，接种苗龄为1.5叶～2叶龄期，接种时间为2d，接种温度为(26±1)℃，每天上午和下午各赶虫一次，使白背飞虱分布均匀，2d后用杀虫剂将接种用的白背飞虱全部扑杀，将秧苗移出塑料杯，种植在防虫网室水泥池中，在15～30℃的条件下继续培育，常规管理；
其中，白背飞虱的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/株计，按照以下公式计算：
IVS＝N×PVS
在公式中：IVS为白背飞虱的有效接种虫量，N为单株水稻接种白背飞虱的数量，PVS为白背飞虱的带毒率；
在本实施例中，PVS为80％，N为2头，IVS为1.6头/株；(7)调查发病情况：接种20d后调查参鉴水稻植株的发病情况，每隔7d～10d调查一次，共调查3次，苗期发病症状：
a)秧苗叶色浓绿，叶片短小僵直，心叶扭曲，或现锯齿叶；
b)植株矮化不明显，叶背沿叶脉有纵向不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色；
c)植株矮小，叶色稍浓绿；
出现a)或b)症状的植物直接记为南方水稻黑条矮缩病病株；出现c)症状的植株进行检测确认是否患南方水稻黑条矮缩病；
(8)计算发病率：发病率用Ri表示，数值以％计，按以下公式计算发病率：
Ri＝ni/nt×100％
在公式中，Ri为发病率，ni为病株数，nt为总株数；
(9)抗性分级标准；按照如下标准对参鉴水稻的抗性进行分级：
a)0级，发病率为0，免疫；
b)1级，发病率为0.1％～5％，高抗；
c)3级，发病率为5.1％～15％，中抗；
d)5级，发病率为15.1％～30％，中感；
e)7级，发病率为30.1％～60％，感病；
f)9级，发病率大于60.1％，高感；
每参鉴品种有3个重复，每个重复调查3次；取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异均不超过1个等级，则认定本次鉴定准确；若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异超过1个等级，则认定本次鉴定不准确；在对照组的3个重复(每个重复调查3次)调查中，每个重复取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据发病率均＞30％，则认定本次鉴定有效；若3个重复中抗性级别最高的调查数据里有至少1个发病率≤30％，则认定本次鉴定无效。
本实施例的抗性分级结果如表1所示：
表1不同水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定结果
从表1可以看出，参鉴品种有3个重复，每个重复调查3次，3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异均不超过1个等级，说明本次鉴定准确。对照组3个重复(每个重复调查3次)调查中，每个重复中抗性级别最高的调查数据发病率均＞30％，认定本次鉴定有效。
从表1的调查数据可以看出，特优582、黔两优58、深两优1173、H两优991、恒丰优3550、恒丰优777这6个水稻品种都是南方水稻黑条矮缩病的高感品种。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种基于人工接种评价水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集白背飞虱：从田间采集白背飞虱若虫或成虫，进行人工饲养，得到待产卵的白背飞虱雌成虫；
(2)获得无毒白背飞虱群体：使步骤(1)采集的单头待产卵白背飞虱雌成虫在水稻苗上产卵，孵化出白背飞虱后代若虫群体，一个后代若虫群体指的是单头白背飞虱雌成虫产卵孵化出来的后代群体，每群体选取10头～20头若虫，对选取出来的若虫和产卵白背飞虱雌成虫都进行南方水稻黑条矮缩病毒的带毒检测，选取产卵白背飞虱雌成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒白背飞虱群体；
(3)准备毒源：采集患南方水稻黑条矮缩病的水稻植株，在隔离条件下，利用白背飞虱在病株上饲毒后接种水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源；
(4)白背飞虱饲毒：将步骤(2)得到的1龄～2龄的无毒白背飞虱群体和步骤(3)得到的作为毒源的病株放入隔离条件中进行饲毒，饲毒1d～3d之后将虫移出继续饲养，度过循回期后，每群体随机取出25头～35头白背飞虱高龄若虫或成虫进行南方水稻黑条矮缩病毒检测，计算白背飞虱群体的带毒率，带毒率＞60％即可用于下一步的试验；
(5)参鉴水稻的准备：将参鉴水稻的种子浸种、催芽，选取25粒～35粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的人工培养容器中进行育苗，每品种重复3次；
(6)接种：选取步骤(4)中已饲毒且度过循回期的白背飞虱成虫群体，在隔离条件下，将白背飞虱接种到1.5叶～2叶龄期的参鉴水稻秧苗上，2d后将白背飞虱移出或用杀虫剂将接种用的白背飞虱全部扑杀；
其中，白背飞虱的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/株计，按照以下公式计算：
IVS＝N×PVS
在公式中：IVS为白背飞虱的有效接种虫量，N为单株水稻接种白背飞虱的数量，PVS为白背飞虱的带毒率；IVS的范围为1头/株～2头/株；
(7)调查发病情况：接种20d后调查参鉴水稻植株的发病情况，苗期发病症状：
a)秧苗叶色浓绿，叶片短小僵直，心叶扭曲，或现锯齿叶；
b)植株矮化不明显，叶背沿叶脉有纵向不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色；
c)植株矮小，叶色稍浓绿；
出现a)或b)症状的植物直接记为南方水稻黑条矮缩病病株；出现c)症状的植株进行检测确认是否为南方水稻黑条矮缩病；
(8)计算发病率：发病率用Ri表示，数值以％计，按以下公式计算发病率：
Ri＝ni/nt×100％
在公式中，Ri为发病率，ni为病株数，nt为总株数；
(9)抗性分级标准：按照如下标准对参鉴水稻的抗性进行分级：
a)0级，发病率为0，免疫；
b)1级，发病率为0.1％～5％，高抗；
c)3级，发病率为5.1％～15％，中抗；
d)5级，发病率为15.1％～30％，中感；
e)7级，发病率为30.1％～60％，感病；
f)9级，发病率大于60.1％，高感；
其中，步骤(2)中，将怀卵的单头白背飞虱成虫移至1.5叶期的水稻苗上产卵，3d后取出成虫，水稻苗继续培养7d～10d，孵化出白背飞虱后代若虫群体，每群体选取10头～20头2龄或3龄若虫，对选取出来的若虫和产卵白背飞虱成虫都进行南方水稻黑条矮缩病毒的带毒检测，选取产卵白背飞虱成虫及其后代若虫均不带毒的群体作为无毒白背飞虱群体；
其中，步骤(7)中，每隔7d～10d调查一次，每品种有3个重复，每个重复调查3次；取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异均不超过1个等级，则认定本次鉴定准确；若3个重复中抗性级别最高的调查数据之间的差异超过1个等级，则认定本次鉴定不准确；
其中，本方法使用易感南方水稻黑条矮缩病的水稻品种TN1作为对照组；在步骤(7)中，对照组每隔7d～10d调查一次，进行3个重复，每个重复调查3次；在每个重复的3次调查中，取抗性级别最高的1次调查数据，若3个重复中抗性级别最高的调查数据发病率均＞30％，则认定本次鉴定有效；若3个重复中抗性级别最高的调查数据里有至少1个发病率≤30％，则认定本次鉴定无效。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述循回期为饲毒后1d～11d，饲毒后超过11d即为度过循回期。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中进行人工饲养的条件为：温度(26±1)℃,相对湿度80％～90％，光照L:D＝12h:12h。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，从田间采集表现南方水稻黑条矮缩病疑似症状的分蘖期水稻植株，保留经检测确认感染南方水稻黑条矮缩病毒的病株，在隔离条件下，利用白背飞虱在病株上饲毒后接种其他水稻秧苗，纯化并扩繁病株作为毒源。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，饲毒2d后将虫移出继续饲养，度过循回期后，每群体随机取出30头白背飞虱高龄若虫或成虫进行南方水稻黑条矮缩病毒的带毒检测，计算白背飞虱群体的带毒率。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中，选取30粒发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的人工培养容器中进行育苗。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)中，在将白背飞虱接种到1.5叶～2叶龄期的水稻秧苗上之后，保持培养温度为26±1℃，每天上午和下午各赶虫一次，使白背飞虱分布均匀，2d后将白背飞虱移出或用杀虫剂将接种用的白背飞虱全部扑杀，将水稻秧苗在无白背飞虱、温度为15℃～30℃的条件下继续培育，常规管理。
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