CN106489564A - 一种水稻抗齿叶矮化病鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，该鉴定方法步骤如下：（a）、大田采集褐飞虱并纯化筛选出4-5龄褐飞虱若虫；（b）、繁育并分离出大量整齐一致的2龄褐飞虱若虫；（c）、将褐飞虱若虫饲毒；（d）、计量褐飞虱若虫；（e）、将待测水稻品种与带毒褐飞虱若虫定量共育传毒；（f）、将待测水稻移栽入大田防虫网室，40天后调查统计齿叶矮化病发病率，即可准确鉴定出待测水稻品种的抗病能力。本发明的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法克服了抗性鉴定中排趋的干扰，解决了抗性鉴定对褐飞虱量的要求和褐飞虱饲养难之间的矛盾，实现了定量而强化的水稻抗齿叶矮化病接种鉴定，能够准确地评价水稻品种对齿叶矮化病的抗性水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，属于农业科学技术领域。
背景技术
水稻是禾本科稻属—年生的植物，是中国最主要的粮食作物，年种植面积约占粮食作物种植面积的1/3，稻谷总产量占粮食总产量的45%。稻谷年均总产量为全世界第一，由于受水稻病害的影响，每年造成全世界水稻产量损失达到10%～15%，并且严重损害稻米的品质。
水稻齿叶矮化病是由褐飞虱传播的病毒病，其病原为水稻齿叶矮化病毒（Rice ragged
stunt dwarf virus，RRSV），也称水稻齿叶矮缩病。水稻齿叶矮化病于1976年在印度尼西亚和1977年在菲律宾被发现，随后在日本、印度等几个国家也被出现，最后演变成了世界各个稻区常见的水稻病毒病。在我国水稻齿叶矮化病是由福建农学院谢联辉等人于1978年在福建沙县首次发现的，此后在福建、广东、台湾、江西、湖南和浙江多个省份先后发生，但发病面积小，多属个别稻区发病。水稻齿叶矮化病发病田块一般减产10%～20%，严重的减产可达80%以上，甚至田块绝收，给农民经济造成重大损失，给国家粮食生产带来巨大影响。水稻齿叶矮化病已经成为水稻主要病害之一，引起了国家粮食生产部门的高度关注。
水稻齿叶矮化病毒病的症状主要表现为病株浓绿矮缩，分孽增多，叶尖旋卷，叶缘有锯齿状缺刻，叶鞘和叶片基部常有长短不一的线状脉肿，长度达到0.1～0.85cm以上，多发生在叶片基部的叶鞘上，但亦有发生在叶片的基部。水稻齿叶矮化病的病害症状在不同生育期、不同水稻品种中表现不同。水稻在分蘖期前发病的，不能抽穗；后期发病的，抽穗不完全，谷粒不充实等症状，发病植株生长延迟，导致产量下降。在自然环境下，RRSV只侵染亚洲栽培稻、宽叶野生稻及泥瓦拉野生稻，但人工接种后，还可侵染大麦、小麦、看麦娘、燕麦、棒头草、稗草、甘蔗、李氏禾、蟋蟀草、水蜈蚣和玉米等多种植物。
褐飞虱是水稻齿叶矮化病的唯一传播介体，其传毒方式是持久性增殖型，不经卵传播，也不能通过机械摩擦、土壤、花粉和种子传播。褐飞風传毒具有间歇性，蜕皮时介体仍可以传毒。褐飞虱的若虫蜕皮但不失毒，对稻苗的传毒率为2.6%～42.1%，病毒在虫体中的分布以唾液腺中含量最高。褐飞虱最短的获毒时间为0.5h，获毒率为2%；饲毒48h，获毒率最高，可达42%；24.1℃条件下接种，循回期为5～23d，平均10.7d，通过循回期后能终生传毒。褐飞虱若虫比成虫传毒效率更高，长翅型和短翅型、雌虫和雄虫传毒效率相同。水稻感染病毒后，需9～32d潜育期才显症状，不同月份病毒潜育期不同，其长短与温度高低有关，温度高潜伏期会短。
防治水稻齿叶矮化病最传统的方法是利用常用的化学农药杀虫剂对传毒介体进行防治。但是随着这些杀虫剂的使用年限增加，昆虫对杀虫剂产生了高抗药性。此外，农药杀虫剂一般都是高毒，高残留的化学药剂，会造成很严重的污染。因此控制水稻齿叶矮化病的发生应以作物为中心，以控害减损保产为目标，大力推广应用绿色防控技术，降低化学农药用量，最大限度控制病虫危害损失，杜绝使用高毒农药，保护稻米质量安全和稻田生态环境。
选育和推广水稻齿叶矮化病抗病品种是最经济也是最有效的防治方法。因地制宜选用水稻抗齿叶矮化病的水稻品种，淘汰抗性差、易感病品种，并加强抗病品种的鉴定和筛选，是预防水稻病害最有效、最经济、最简便的措施。
筛选抗病资源应用于水稻齿叶矮化病抗病育种是首要环节，目前筛选水稻齿叶矮化病抗病品种、抗病基因定位均采用田间自然发病鉴定，待鉴定水稻以小区形式种植于大田，常规栽培管理，传毒介体自然传毒，显病症后调查待鉴定水稻的穴发病率，以此为标准鉴别水稻材料的齿叶矮化病抗感能力的差异。然而，不同水稻对褐飞虱排趋性的差异使其表现出对褐飞虱取食偏向的差异，通过自然鉴定方法鉴定得到的抗病水稻，可能实际上是抗虫（排趋性强）水稻而并非抗病水稻。然而，假若以该抗虫不抗病水稻育成品种进行病害区规模种植后，规模种植导致传毒介体被迫选择而使得假抗病表现消失，将可能给水稻生产带来较大的损失。
为排除排趋性对抗病鉴定的影响，对水稻进行人工定量接种带毒介体成为一种必然。然而，进行水稻品种资源的抗性鉴定需要大量的传毒介体褐飞虱，褐飞虱人工饲养规模量小，饲养成本很高，难以满足品种抗性鉴定的规模量的需求，限制了人工定量接种鉴定的推广应用。
褐飞虱重灾区大田生态系统内每年的褐飞虱数量均非常巨大，人工获取也比较容易，而实验室饲养褐飞虱用于品种资源抗性鉴定难以满足规模量的要求，若能够设计一种方法利用大田生态系统规模量的褐飞虱进行定量强化水稻接种鉴定从而实现对水稻品种资源的齿叶矮化病抗性评价将是一种可行的选择。为实现对水稻品种资源的准确评价，需要实验室提供作物昆虫互作研究的稳定而适宜的生态环境，模拟大田生态系统内褐飞虱与水稻的互作关系、利用大田生态系统解决规模褐飞虱的获取难题、定量并强化水稻齿叶矮化病接种鉴定从而实现对水稻品种资源的准确评价正是本发明的根本思路。
利用本方法评价水稻品种对水稻齿叶矮化病的抗性水平，既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又可以克服品种抗性鉴定所需褐飞虱规模量的难题，实现了定量而强化的水稻齿叶矮化病接种鉴定。这一鉴定方法除了可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研究等众多领域。
发明内容
本发明的目的是针对水稻齿叶矮化病田间自然鉴定中存在的排趋性干扰难题和室内人工接种鉴定的褐飞虱规模量获取难题，提供一种水稻齿叶矮化病抗性的规模化接种鉴定方法，该鉴定方法既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又解决了品种抗性鉴定所需褐飞虱规模量的难题，实现了定量而强化的水稻齿叶矮化病接种鉴定，最终实现了对水稻齿叶矮化病抗性的准确评价。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述的鉴定方法步骤如下：
（a）、采用盘托法从田间采集褐飞虱后通过纯化筛选装置获取大量4-5龄褐飞虱若虫；
（b）、将筛选获得的4-5龄褐飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上共育并繁育下一代褐飞虱若虫，并进一步利用调整的纯化筛选装置分离获取大量整齐一致的2龄褐飞虱若虫；
（c）、将筛选获得的2龄褐飞虱若虫移入栽有水稻齿叶矮化病重灾区取材的水稻病株上进行饲毒；
（d）、通过精密电子天平称重获得单头2龄褐飞虱若虫的重量，根据确定的虫/苗比例计算所需褐飞虱总重，进而称重定量；
（e）、根据确定的虫/苗比例将饲毒后的定量2龄褐飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内栽培的待测水稻幼苗上共育传毒；
（f）、待褐飞虱半数死亡后将待测水稻移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，40天后调查统计齿叶矮化病穴发病率，并根据齿叶矮化病穴发病率准确鉴定出待测水稻品种的抗病能力。
所述步骤（a）中的褐飞虱收集时间为每年九月中下旬水稻田由青转黄期。
所述步骤（a）中的纯化筛选装置使用时，采用孔径为16目和18目的分样筛组合以有效分离出4-5龄褐飞虱若虫。
所述步骤（b）中的4-5龄褐飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上时，与褐飞虱若虫共育的水稻为4-6叶期。
所述步骤（b）中的作物昆虫共育箱的培养温度控制在29℃、光12h/暗12h。
所述步骤（b）中的作物昆虫共育箱内繁育下一代褐飞虱若虫后，此时筛选装置翻转90°将垂直的趋光方向改变为水平方向，采用孔径为22目和26目的分样筛组合以有效分离获得大量整齐一致的2龄褐飞虱若虫。
所述步骤（c）中的水稻病株为当年春季自水稻齿叶矮化病重灾区取材后于-20℃的冰箱冷藏的，待病株自然解冻后将根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽方式垂直固定于作物昆虫共育箱内，然后移入2龄褐飞虱若虫饲毒不低于48h。
所述步骤（d）中的2龄褐飞虱若虫饲毒后采用趋光分离毛刷刷离褐飞虱若虫时夹杂的杂质和死虫，然后转移20-30头褐飞虱若虫进称量瓶，通过精密电子天平称重，去皮计算瓶内褐飞虱若虫的总重后根据瓶内褐飞虱若虫的数量，计算得到单头褐飞虱若虫的重量，根据待测水稻株数和接种强度确定饲毒所需褐飞虱若虫数目，进而计算接种所需饲毒褐飞虱若虫的总重并称重定量。
所述步骤（e）中的待测水稻生长处于2-3叶期，且按照20cm2/株的比例留取长势健康均匀的稻苗。
所述步骤（e）中的待测水稻按照5-12虫/苗的比例接种饲毒后的2龄褐飞虱若虫，作物昆虫共育箱内29℃、光12h/暗12h共育传毒至接种的褐飞虱自然衰老死亡。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明通过纯化筛选装置获得大量的大田来源的4-5龄褐飞虱若虫，进而通过作物昆虫共育箱共育出大量的2龄褐飞虱若虫，并再次通过纯化筛选装置获得大量整齐一致的2龄褐飞虱若虫，然后通过2龄褐飞虱若虫共育饲毒、待测水稻定量共育接种传毒的方式使得待测水稻发病，最后通过调查水稻齿叶矮化病发病率即可准确鉴定出待测水稻品种的抗齿叶矮化病能力。
本发明的强化接种鉴定方法既可以去除排趋性对鉴定结果的干扰，又可以克服品种抗性鉴定所需褐飞虱规模量的难题，并且实现了定量而强化的水稻齿叶矮化病接种鉴定，能够准确地评价水稻品种对水稻齿叶矮化病的抗性水平；该鉴定方法除了可以应用于水稻抗齿叶矮化病品种资源发掘、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研究等众多领域，故适宜推广使用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述的鉴定方法步骤如下：（a）、每年九月中下旬水稻田由青转黄期采用盘托法从田间采集褐飞虱后将纯化筛选装置选用孔径为16目和18目的分样筛组合以有效分离出大量4-5龄褐飞虱若虫；（b）、将筛选获得的4-5龄褐飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的4-6叶期水稻上，控制作物昆虫共育箱温度29℃、光12h/暗12h，共育并繁育下一代褐飞虱若虫后，筛选装置翻转90°将垂直的趋光方向改变为水平方向，采用孔径为22目和26目的分样筛组合以有效分离获得大量整齐一致的2龄褐飞虱若虫；（c）、将当年春季自水稻齿叶矮化病重灾区取材后于-20℃的冰箱冷藏的水稻病株自然解冻，后将根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽方式垂直固定于作物昆虫共育箱内，然后将筛选获得的2龄褐飞虱若虫移入饲毒不低于48h；（d）、2龄褐飞虱若虫饲毒后采用趋光分离毛刷刷离褐飞虱若虫时夹杂的杂质和死虫，然后转移20-30头褐飞虱若虫进称量瓶，通过精密电子天平称重，去皮计算瓶内褐飞虱若虫的总重后根据瓶内褐飞虱若虫的数量，计算得到单头褐飞虱若虫的重量，根据待测水稻株数和接种强度确定饲毒所需褐飞虱若虫数目，进而根据确定的虫/苗比例计算接种所需饲毒褐飞虱若虫的总重并称重定量；（e）、作物昆虫共育箱内栽培的待测水稻生长处于2-3叶期时，按照20cm2/株的比例留取长势健康均匀的稻苗，按照5-12虫/苗的比例将饲毒后的定量2龄褐飞虱若虫接种于待测水稻上，控制作物昆虫共育箱内温度29℃、光12h/暗12h共育传毒；（f）、待测水稻大田显症统计：待褐飞虱半数死亡后将待测水稻移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，40天后调查统计齿叶矮化病发病率，并根据齿叶矮化病发病率准确鉴定出待测水稻品种的抗病能力。水稻齿叶矮化病毒病的症状主要表现为病株浓绿矮缩，分孽增多，叶尖旋卷，叶缘有锯齿状缺刻，叶鞘和叶片基部常有长短不一的线状脉肿，长度达到0.1～0.85cm以上，多发生在叶片基部的叶鞘上，但亦有发生在叶片的基部。
实施例1
2014年，采用重灾区取材的冷冻水稻齿叶矮化病病株作为毒源，采用本方法进行接种鉴定，采用人工饲养的2龄无毒灰飞虱若虫做对照，其他处理相同。饲毒时间定为48h，接种强度均为10头/株，显症后调查水稻齿叶矮化病发病率。
由表1可以发现，大田采集褐飞虱繁育的下一代2龄若虫与无毒褐飞虱2龄若虫传播水稻齿叶矮化病的发病率差异均不显著，表明褐飞虱传播水稻齿叶矮化病不受遗传携带的杂毒干扰。
目前水稻齿叶矮化病的鉴定中自然鉴定法中无法克服排趋性的干扰，而人工筛选无毒褐飞虱人工饲养规模量小，饲养成本很高，难以满足品种抗性鉴定的规模量的需求，限制了该方法的推广应用。而本实施例发现利用大田来源褐飞虱成虫繁育一代若虫饲毒并接种传毒的效果与无毒褐飞虱接种效果并无显著性差异，并且突破了无毒褐飞虱人工饲养难以规模化的技术难题，证明了本鉴定技术的可行性和进步性。
实施例2
2014年采用本方法鉴定了四个水稻品种，同期在水稻齿叶矮化病重灾区采用自然发病鉴定法鉴定这四个品种，水稻齿叶矮化病发病率和其它品种相对于广陆矮的相对抗感比表现如表2。
四个水稻品种通过采用本方法鉴定与重灾区自然发病鉴定水稻齿叶矮化病发病率、其它品种发病率相对于广陆矮的相对抗感比可以发现，不同水稻品种通过本技术鉴定和重灾区自然发病鉴定的相对抗感比不相同，个别品种差异显著，可能是不同水稻品种的排趋性差异造成的。
为研究不同鉴定技术鉴定的水稻品种抗病能力差异的原因，我们做了不同水稻品种对褐飞虱的排趋性鉴定实验。将催芽后的水稻种子播于65cm×44cm×14cm的塑料周转箱内，每个品种1行，每行10株。待幼苗长至2.5～3叶，按每株10头接入3～4龄的褐飞虱若虫，每天上午8时、下午4时调查每个单株上的虫数，每次调查后进行驱虫，使其尽量均匀分布。环境温度保持在29±2℃，自然光照。5天后计算每个品种每个单株上的平均虫数，作为排驱性测验值，鉴定结果如表3。
由表3可以发现，四个水稻品种对褐飞虱的排趋性由强到弱依次为IR36>矮脚南特>广陆矮>连粳4号。可以确定，大田自然鉴定鉴定到的水稻齿叶矮化病中抗品种IR36的抗病表现主要来自该品种对褐飞虱的强排趋性，但种质自身抗病能力却极感病。通过表2和表3也可以发现采用大田自然发病鉴定的不同水稻品种的水稻齿叶矮化病发病表现受品种间褐飞虱排趋性的干扰较大。
通过本实施例可以发现，本技术对种质资源水稻齿叶矮化病抗病能力的鉴定结果可以排除排趋性的影响，其结果比大田自然鉴定更加准确，值得进一步推广利用。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述的鉴定方法步骤如下：
（a）、采用盘托法从田间采集褐飞虱后通过纯化筛选装置获取大量4-5龄褐飞虱若虫；
（b）、将筛选获得的4-5龄褐飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上共育并繁育下一代褐飞虱若虫，并进一步利用调整的纯化筛选装置分离获取大量整齐一致的2龄褐飞虱若虫；
（c）、将筛选获得的2龄褐飞虱若虫移入栽有水稻齿叶矮化病重灾区取材的水稻病株上进行饲毒；
（d）、通过精密电子天平称重获得单头2龄褐飞虱若虫的重量，根据确定的虫/苗比例计算所需褐飞虱总重，进而称重定量；
（e）、根据确定的虫/苗比例将饲毒后的定量2龄褐飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内栽培的待测水稻幼苗上共育传毒；
（f）、待褐飞虱半数死亡后将待测水稻移栽至大田隔虫网室，常规栽培管理，40天后调查统计齿叶矮化病穴发病率，并根据齿叶矮化病穴发病率准确鉴定出待测水稻品种的抗病能力。
2.根据权利要求1所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（a）中的褐飞虱收集时间为每年九月中下旬水稻田由青转黄期。
3.根据权利要求1所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（a）中的纯化筛选装置使用时，采用孔径为16目和18目的分样筛组合以有效分离出4-5龄褐飞虱若虫。
4.根据权利要求1所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（b）中的4-5龄褐飞虱若虫接种到作物昆虫共育箱内培育的水稻上时，与褐飞虱若虫共育的水稻为4-6叶期。
5.根据权利要求1或4所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（b）中的作物昆虫共育箱的培养温度控制在29℃、光12h/暗12h。
6.根据权利要求1所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（b）中的作物昆虫共育箱内繁育下一代褐飞虱若虫后，此时筛选装置翻转90°将垂直的趋光方向改变为水平方向，采用孔径为22目和26目的分样筛组合以有效分离获得大量整齐一致的2龄褐飞虱若虫。
7.根据权利要求1所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（c）中的水稻病株为当年春季自水稻齿叶矮化病重灾区取材后于-20℃的冰箱冷藏的，待病株自然解冻后将根用浸水脱脂棉包裹并用塑料布包扎结实模拟大田移栽方式垂直固定于作物昆虫共育箱内，然后移入2龄褐飞虱若虫饲毒不低于48h。
8.根据权利要求1所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（d）中的2龄褐飞虱若虫饲毒后采用趋光分离毛刷刷离褐飞虱若虫时夹杂的杂质和死虫，然后转移20-30头褐飞虱若虫进称量瓶，通过精密电子天平称重，去皮计算瓶内褐飞虱若虫的总重后根据瓶内褐飞虱若虫的数量，计算得到单头褐飞虱若虫的重量，根据待测水稻株数和接种强度确定饲毒所需褐飞虱若虫数目，进而计算接种所需饲毒褐飞虱若虫的总重并称重定量。
9.根据权利要求1或8所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（e）中的待测水稻生长处于2-3叶期，且按照20cm2/株的比例留取长势健康均匀的稻苗。
10.根据权利要求9所述的水稻抗齿叶矮化病鉴定方法，其特征在于：所述步骤（e）中的待测水稻按照5-12虫/苗的比例接种饲毒后的2龄褐飞虱若虫，作物昆虫共育箱内29℃、光12h/暗12h共育传毒至接种的褐飞虱自然衰老死亡。
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