CN113652428B - 核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用 - Google Patents

核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，具体包括步骤1)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物，构建慢病毒载体；步骤2)、体外慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；步骤3)、体内慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预。本发明将LBR(核膜蛋白)用于抑制干细胞的分裂，促进干细胞的分化；神经干细胞移植后会可能存在较强的分裂能力，存在潜在致癌性。核膜蛋白敲降后，细胞分裂能力显著降低，因此该方法可广泛用于干细胞移植带来的致癌性问题。

Description

核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用
技术领域
本发明涉及核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，属于干细胞移植领域。
背景技术
干细胞移植已成为再生领域的重要议题，然而其存在明显的致癌风险。常见的手段包括(i)化学治疗，(ii)基因治疗，和(iii)免疫治疗。免疫治疗存在高成本、批次之间的差异、非特异性抗体结合，和副作用大等缺陷。化学小分子的治疗则效率相对低下，目前难以满足临床的需求。基因治疗通常针对重编程转录因子，然而对重编程因子进行改造，容易导致细胞状态发生严重损害，不利于干细胞分化。
中枢神经系统损伤后，除原发性机械损伤直接造成的神经元死亡外，继发性损伤也会导致神经元持续性的凋亡、坏死，由此出现不同程度的轴突缺失及功能障碍。另一方面，成年哺乳动物的脊髓区域干细胞数量有限，且损伤后主要向胶质细胞而非神经元转化。因此，在哺乳动物受损区域补充新生神经元及修复上下行神经通路，对神经损伤修复具有重要意义。常见的方法是外源干细胞的移植使其在体内分化为神经元。但神经干细胞的增殖能力较强，存在严重的致癌风险，目前对其调控手段仍极为有限。
发明内容
本发明提供了一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，将LBR(核膜蛋白)用于抑制干细胞分裂，促进其分化，可广泛用于干细胞移植带来的致癌性问题。
本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：
一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，包括以下步骤：
步骤1)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物，引物序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，构建慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2；
步骤2)、体外慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；
21)神经干细胞的获取及传代：取分离的大鼠神经干细胞在培养基中进行传代，原代培养物生长5天，神经干细胞每4天传代一次，取第2-4代的神经干细胞用于所有实验；
22)取步骤1)所构建的慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2，其MOI＝10，分别对步骤21)获取的第2-4代的神经干细胞进行转染；12小时后加入500μl完全培养基；病毒转染后72小时，检测神经干细胞中的GFP表达以确定病毒滴度；
步骤3)、体内慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；
31)在小鼠脊髓损伤后1-2周分别注射步骤22)经病毒转染后的神经干细胞10万-100万个；
32)在神经干细胞体内移植后的2-8周内，利用慢病毒介导的核膜蛋白敲降，即通过微量注射泵进行慢病毒载体的注射，注射浓度为106-108/μL，注射体积为0.5μL-4μL；
33)损伤后6周对小鼠灌流固定，取相应脊髓节段，30μm连续切片，每个样品随机取3张切片进行免疫组化，对神经干细胞的分裂分化进行鉴定。
进一步的，所述步骤1)包括以下步骤：
11)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物，引物序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示，并合成相关引物；
12)、正反义寡核苷酸链退火；按以下体系配制退火反应体系：
1ug/μl正义寡核苷酸链5μl；
1ug/μl反义寡核苷酸链5μl；
ddH2O 15μl；
反应条件：95℃，反应5分钟，后缓慢降至室温，得到退火后的寡核苷酸双链；
其中，lbr-shRNAi-1的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.3所示；对应的反义寡核苷酸链SEQ ID No.4所示；
lbr-shRNAi-2的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.5所示；对应的反义寡核苷酸链SEQID No.6所示；
13)、用AgeI和EcoRI双酶切线性化质粒GV112，得到改造后的线性化载体；酶切体系是：
反应条件：37度3小时
14)、连接步骤12)退火形成的寡核苷酸双链与步骤13)所得改造后的线性化载体，得到重组质粒；按照以下体系配制连接反应体系：
反应条件：4℃过夜；
15)、转化及鉴定
将步骤14)连接所得的重组质粒导入感受态的大肠杆菌体内，以从含有抗生素的LB平板上挑取单菌落，进行测序；
16)、将上述连接重组的质粒和包装辅助质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0，转染到293T细胞中产生复制缺陷型慢病毒；收集上清液，并离心浓缩，纯化得到慢病毒载体；通过测量共表达的GFP确定病毒滴度。
进一步的，所述步骤15)中鉴定包括以下步骤：
151)配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心；
ddH2O 9.2ul
2×Taq Plus Master Mix 10ul
上游引物：10μM，0.4ul；序列如SEQ ID No.7所示；
下游引物：10μM，0.4ul；序列如SEQ ID No.8所示；
单菌落–
PCR反应条件：94℃，3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s共22cycles；72℃3min；4℃∞；
152)在超净工作台中，用无菌的枪头挑单个菌落至20μL至鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应，反应体系共20ul；
153)将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序，测序引物如SEQ ID No.8所示；若测序结果含SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2则成功。
进一步的，所述步骤21)中培养基包括：DMEM/F12、1X B27、1X PS、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF。
进一步的，所述步骤22)中完全培养基包括：DMEM/F12、1X B27、1XPS、50ng/ml EGF和50ng/ml bFGF。
有益效果
目前已知的方法效率较低，本发明可在抑制分裂及促进分化中起到双重作用，而且效果非常显著。
1.可促进神经干细胞的分化。该方法有助于神经元的形成，以此改善神经系统疾病，如阿尔兹海默症及脊髓损伤的修复等。
2.可抑制干细胞的致癌性。神经干细胞移植后会可能存在较强的分裂能力，存在潜在致癌性。LBR敲降后，细胞分裂能力显著降低。
附图说明
图1为通过慢病毒携带的LBR shRNA敲降在神经干细胞移植中抑制其致瘤性的示意图；
图2为Western blot验证慢病毒携带的LBR shRNA的敲降效果示意图；
图3为本发明实施例中LBR敲降后，神经干细胞分化形成神经元的示意图；其中图3A为转染对照组的shRNA(scrambled RNA)；其中图3B右侧转染LBR的shRNA；
图4为本发明实施例中神经干细胞转染LBR shRNA后，神经干细胞分化为神经元(β-III tubulin)的示意图；
图5为CCK8显示LBR敲降后不同靶点的细胞增殖能力变化示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：
一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，包括以下步骤：
步骤1)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物，构建慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2；
11)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物，序列分别为SEQ ID No.1：CAGCTTTACACTGTGAAGTAT和SEQ ID No.2：CACCAGAGGACCTGTACCTTT，并合成相关引物；
12)、正反义寡核苷酸链退火；按以下体系配制退火反应体系：
1ug/μl正义寡核苷酸链5μl；
1ug/μl反义寡核苷酸链5μl；
ddH2O 15μl；
反应条件：用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，放入PCR仪中，95℃，反应5分钟，后缓慢降至室温，得到退火后的寡核苷酸双链；
其中，lbr-shRNAi-1的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.3所示；对应的反义寡核苷酸链SEQ ID No.4所示；
SEQ ID No.3：
ccggCAGCTTTACACTGTGAAGTATctcgagATACTTCACAGTGTAAAGCTGtttttg
SEQ ID No.4：
aattcaaaaaCAGCTTTACACTGTGAAGTATctcgagATACTTCACAGTGTAAAGCTG；
lbr-shRNAi-2的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.5所示；对应的反义寡核苷酸链SEQID No.6所示；
SEQ ID No.5：
ccggCACCAGAGGACCTGTACCTTTctcgagAAAGGTACAGGTCCTCTGGTGtttttg
SEQ ID No.6：
aattcaaaaaCACCAGAGGACCTGTACCTTTctcgagAAAGGTACAGGTCCTCTGGTG；
13)、用AgeI和EcoRI双酶切线性化质粒GV112，得到改造后的线性化载体；按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心。
反应条件：37度反应3小时；对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。
14)、连接步骤12退火形成的寡核苷酸双链与步骤13所得改造后的线性化载体，得到重组质粒；按照以下体系配制连接反应体系：
反应条件：用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心4℃过夜；
15)、转化及鉴定
将步骤14)连接所得的重组质粒导入感受态的大肠杆菌体内，以从含有抗生素的LB平板上挑取单菌落，进行测序；
151)配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心；
ddH2O 9.2ul
2×Taq Plus Master Mix 10ul
上游引物：10μM，0.4ul；序列如SEQ ID No.7所示：CCATGATTCCTTCATATTTGC；
下游引物：10μM，0.4ul；序列如SEQ ID No.8所示：GTAATACGGTTATCCACGCG；
单菌落–
PCR反应条件：94℃，3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s共22cycles；72℃3min；4℃∞；
152)在超净工作台中，用无菌的枪头挑单个菌落至20μL至鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应，反应体系共20ul；
153)将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序，测序引物为SEQ ID No.7：CCATGATTCCTTCATATTTGC；若测序结果含SEQ ID No.1：CAGCTTTACACTGTGAAGTAT和SEQ ID No.2：CACCAGAGGACCTGTACCTTT则成功。
16)、将上述连接重组的质粒和包装辅助质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0，转染到293T细胞中产生复制缺陷型慢病毒；收集上清液，并离心浓缩，纯化得到慢病毒载体；通过测量共表达的GFP确定病毒滴度。
步骤2)、体外慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；
21)神经干细胞的获取及传代：一只怀孕大约14天的成年雌性SD大鼠被异氟醚吸入深度麻醉，并通过颈椎溶解术实施安乐死。切除胎鼠的大脑，置于冰冷的PBS中，小心地解剖出大脑皮层。皮层用移液管研磨几分钟，通过40μM过滤器获得单细胞悬液，在培养基中进行传代，培养基为：DMEM/F12(Corning，10-092-CV)、1X B27(Gibco,17504-044)、1X PS(Beyotime，C0222)、20ng/mL EGF(Peprotech，AF-100-15-100)和20ng/mL bFGF(Novus，NBP2-35152)。神经干细胞每4天传代一次，取第2-4代的神经干细胞用于所有实验；
22)取步骤1)所构建的慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2，其MOI＝10，分别对步骤21)获取的第2-4代的神经干细胞进行转染；12小时后加入500μl完全培养基；病毒转染后72小时，检测神经干细胞中的GFP表达以确定病毒滴度；完全培养基为DMEM/F12、1XB27、1XPS、50ng/ml EGF和50ng/ml bFGF。
步骤3)、体内慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预，如图1所示；
将小鼠俯卧在保温垫上，麻醉后进行T10椎板摘除术，暴露脊髓。用No.5Dumont镊子(尖端磨成0.5mm的宽度,中间不加垫片)从左右两侧挤压脊髓5秒。术后腹腔注射生理盐水补充体液，每天手工按压膀胱帮助排尿。损伤2天后筛选排除后肢有刺激反应的小鼠，将剩余小鼠随机分成两组，每组6只以上。脊髓损伤后1-2周分别注射步骤22)经病毒转染后的神经干细胞10万-100万个(用5μl微型注射器在损伤部位附近缓缓注入)。神经干细胞转移体内2-8周后，使其在体内环境扩增后进行慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2(108/μl*0.5μl)的注射。损伤后6周对小鼠灌流固定，取相应脊髓节段，30μm连续切片，每个样品随机取3张切片进行免疫组化，对神经干细胞的分裂分化进行鉴定。
如图2所示，采用慢病毒介导的LBR shRNA，LBR的表达量显著下降；
如图3所示，LBR敲降后，神经球消失，取而代之的是分化的细胞形态；
如图4所示，神经干细胞转染LBR shRNA后，神经干细胞可分化为神经元(β-IIItubulin)，该方法可促进神经干细胞的分化，因此有助于神经元的形成，以此改善神经系统疾病，如阿尔兹海默症及脊髓损伤的修复等。
如图5所示，神经干细胞移植后会可能存在较强的分裂能力，存在潜在致癌性。LBR敲降后，细胞分裂能力显著降低。
序列表
<110> 南通大学
<120> 核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagctttaca ctgtgaagta t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccagagga cctgtacctt t 21
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggcagctt tacactgtga agtatctcga gatacttcac agtgtaaagc tgtttttg 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattcaaaaa cagctttaca ctgtgaagta tctcgagata cttcacagtg taaagctg 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggcaccag aggacctgta cctttctcga gaaaggtaca ggtcctctgg tgtttttg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aattcaaaaa caccagagga cctgtacctt tctcgagaaa ggtacaggtc ctctggtg 58
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccatgattcc ttcatatttg c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtaatacggt tatccacgcg 20

Claims (4)

1.一种核膜蛋白敲降在体外对神经干细胞增殖分化进行干预的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA，所述siRNA序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示，构建慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2；
步骤2)、体外慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；
21)神经干细胞的获取及传代：取分离的大鼠神经干细胞在培养基中进行传代，原代培养物生长5天，神经干细胞每4天传代一次，取第2-4代的神经干细胞用于所有实验；
22)取步骤1)所构建的慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2，其MOI＝10，分别对步骤21)获取的第2-4代的神经干细胞进行转染；12小时后加入500μL完全培养基；病毒转染后72小时，检测神经干细胞中的GFP表达以确定病毒滴度；
所述步骤1)包括以下步骤：
11)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA，所述siRNA序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示；
12)、正反义寡核苷酸链退火；按以下体系配制退火反应体系：
1μg/μL正义寡核苷酸链5μL；
1μg/μL反义寡核苷酸链5μL；
ddH2O 15μL；
反应条件：95℃，反应5分钟，后缓慢降至室温，得到退火后的寡核苷酸双链；
其中，lbr-shRNAi-1的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.3所示；对应的反义寡核苷酸链SEQ ID No.4所示；
lbr-shRNAi-2的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.5所示；对应的反义寡核苷酸链SEQ IDNo.6所示；
13)、用AgeI和EcoRI双酶切线性化质粒GV112，得到改造后的线性化载体；酶切体系是：
反应条件：37度3小时；
14)、连接步骤12)退火形成的寡核苷酸双链与步骤13)所得改造后的线性化载体，得到重组质粒；按照以下体系配制连接反应体系：
反应条件：4℃过夜；
15)、转化及鉴定
将步骤14)连接所得的重组质粒导入感受态的大肠杆菌体内，以从含有抗生素的LB平板上挑取单菌落，进行测序；
16)、将上述连接重组的质粒和包装辅助质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0，转染到293T细胞中产生复制缺陷型慢病毒；收集上清液，并离心浓缩，纯化得到慢病毒载体；通过测量共表达的GFP确定病毒滴度。
2.根据权利要求1所述核膜蛋白敲降在体外对神经干细胞增殖分化进行干预的应用，其特征在于，所述步骤15)中鉴定包括以下步骤：
151)配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心；
ddH2O 9.2μL；
2×Taq Plus Master Mix 10μL；
上游引物：10μM，0.4μL；序列如SEQ ID No.7所示；
下游引物：10μM，0.4μL；序列如SEQ ID No.8所示；
152)在超净工作台中，用无菌的枪头挑单个菌落至20μL至鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应，反应体系共20μL；
153)将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序，测序引物如SEQ ID No.8所示；若测序结果含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2则成功。
3.根据权利要求1所述核膜蛋白敲降在体外对神经干细胞增殖分化进行干预的应用，其特征在于，所述步骤21)中培养基包括：DMEM/F12、1X B27、1X PS、20ng/mL EGF和20ng/mLbFGF。
4.根据权利要求1所述核膜蛋白敲降在体外对神经干细胞增殖分化进行干预的应用，其特征在于，所述步骤22)中完全培养基包括：DMEM/F12、1X B27、1XPS、50ng/ml EGF和50ng/ml bFGF。
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Citations (2)

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CN103865956A (zh) * 2013-06-09 2014-06-18 南通大学 利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法
CN105200059A (zh) * 2015-10-22 2015-12-30 山西医科大学 靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA及其表达载体的构建

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Title
Mechanotransduction at the nuclear envelop:the role of forces in facilitating embryonic stem cell fate decision;Wylde;《Deposit and Copying of Dissertation Declaration》;20171020;第2.7节以及图5 *

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