CN113651687B

CN113651687B - 一种从草果中提取抗氧化活性物质的方法

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Publication number: CN113651687B
Application number: CN202111127294.0A
Authority: CN
Inventors: 黄锁义; 郑皓元; 黎威林; 刘丁; 陈石梅; 李童; 谢欣; 莫斯锐; 凌博; 雷智冬
Original assignee: Chengdu Push Bio Technology Co ltd; Youjiang Medical University for Nationalities
Current assignee: Chengdu Push Bio Technology Co ltd; Youjiang Medical University for Nationalities
Priority date: 2021-09-26
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2041-09-26
Also published as: CN113651687A

Abstract

本发明公开了一种从草果中提取抗氧化活性物质的方法，以草果药材为原料，对其水提取物中抗氧化活性成分进行分离、纯化得到抗氧化活性单体化合物原儿茶酸，由此为研究草果水提取物抗氧化活性提供物质基础，并为草果的综合开发利用提供理论指导作用。

Description

一种从草果中提取抗氧化活性物质的方法

技术领域

本发明是一种从草果中提取抗氧化活性物质的方法，具体涉及一种从草果中提取抗氧化活性物质原儿茶酸的方法，属于中草药提取技术领域。

背景技术

草果（学名：Amomum tsaoko Crevost et Lemarie）是姜科，豆蔻属多年生草本植物，主要分布于中国云南、广西、贵州等省区。草果是药食两用中的药材大宗品种之一，主要作为香料应用于食品加工领域，也应用于中药和其他领域。目前，随着天然产物开发的不断兴起，草果作为重要的药食两用植物，由于具备广泛的生物学活性和药理作用，因此，对草果天然产物的开发利用将会进一步加大。

现有研究表明，草果的提取物具有一定的抗氧化活性，例如：代敏等在“草果的化学成分及其药理作用研究进展”（《中药与临床》，2011，2（4），55-59）中分别记载了草果挥发油及水提物、草果油、草果加热回流提取物、草果乙醇提取物在提高大鼠胃粘膜SOD活性、清除超氧阴离子、清除过氧化氢、清除自由基DPPH方面的作用，证明草果提取物具备抗氧化活性，但现有研究并未阐明其抗氧化活性的物质基础，因此，为进一步的提高草果在抗氧化活性方面的综合开发及利用，如何实现草果提取物中抗氧化活性成分的分离、纯化、鉴定及检测是关键。

发明内容

本发明提供了一种从草果中提取抗氧化活性物质的方法，可实现草果药材中抗氧化活性单体化合物的提取，并经MS、NMR等现代波谱技术和光谱技术对该活性单体化合物进行结构鉴定，确认为原儿茶酸，由此为研究草果水提取物抗氧化活性提供物质基础，并有利于草果的进一步综合开发利用。

本发明通过下述技术方案实现：一种从草果中提取抗氧化活性物质的方法，包括以下步骤：

A.以草果药材为原料，粉碎后用乙醇回流提取，再经减压浓缩后得到浓缩液；

B.将浓缩液稀释后分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水提取物，浓缩水提取物制得水提取物浸膏；

C.取水提取物浸膏，经溶解、过滤、C18柱分离后，得到原儿茶酸。

所述步骤A中，用质量浓度为95%的乙醇回流提取2～3次，每次回流提取时间控制在1.5～2h。

所述步骤A中，将回流提取得到的提取液在55～60℃下减压浓缩至无醇后，得到所述浓缩液。

所述步骤B中，将浓缩液加水稀释2～3倍后，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取一次，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，取其萃取后的水相混合后，得到水提取物。

所述步骤B中，将水提取物在60℃下减压浓缩制得水提取物浸膏。

所述步骤C中，按水提取物浸膏：水=1g︰3mL计算，将水提取物浸膏用水溶解。

所述步骤C中，溶解时采用纳米有机膜进行过滤。

所述步骤C中，C18柱进行分离时，采用体积比为15︰85为甲醇-0.1% PA为流动相，紫外光为260nm。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明提供了一种从草果中提取抗氧化活性单体化合物的方法，通过乙醇回流提取浓缩液经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取的水相作为提取得到的抗氧化活性物质，再经分离、纯化后得即可得到活性单体化合物。

（2）本发明为研究草果提取物的抗氧化活性提供了物质基础，经MS、NMR等现代波谱技术和光谱技术对本发明提取得到的活性单体化合物进行结构鉴定，确定该活性单体化合物为原儿茶酸。

（3）本发明为进一步实现草果的综合开发和利用奠定了基础，在对本发明提取得到的活性单体化合物原儿茶酸进行抗氧化活性实验时，依次通过DPPH自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验、羟基自由基清除实验、亚铁离子的螯合实验、三价铁离子的还原实验发现，原儿茶酸对这些自由基及铁离子均具有一定的清除能力，说明原儿茶酸具有一定的抗氧化能力，其抗氧化活性与单体化合物结构有关，抗氧化作用机理主要是通过清除自由基来避免氧化损伤。

综上所述，本发明在现有草果抗氧化活性研究的基础上，首次提出了从草果中提取活性单体化合物的方法，并对其提取得到的活性单体化合物进行鉴定和实验验证，充分证明了草果中抗氧化活性物质原儿茶酸的抗氧化性能，为草果的进一步综合开发利用提供研究基础。

附图说明

图1为实施例1所述单体化合物的质谱图。

图2为单体化合物对DPPH自由基的清除能力图。

图3为单体化合物对ABTS自由基的清除能力图。

图4为单体化合物对超氧阴离子自由基的清除能力图。

图5为单体化合物对羟基自由基的清除能力图。

图6为单体化合物对螯合亚铁离子的能力图。

图7为单体化合物对Fe³⁺的还原能力图。

具体实施方式

下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

刘小玲等在“香辛料草果中化学成分的定性研究”（《中国调味料》，2011年第1期总第36卷，104-106）中通过水提取、乙醇提取、石油醚提取等提取方法对草果中的化学成分进行较全面的定性研究，表明了草果中含有糖类、蛋白质、氨基酸、酚类、鞣质、有机酸、皂苷、黄酮、蒽醌、香豆素、内酯、强心苷、甾体、萜类、挥发油、油脂、花青素等多种化学成分。由此可以知道，草果具有丰富的化学成分，而现有的草果提取物抗氧化活性物质的研究，通常针对草果中某一类提取物而进行，但这些现有研究中并未阐明草果抗氧化活性的物质基础。例如袁园等在“草果总黄酮的提取及DPPH自由基清除活性研究”中采用超声波辅助法提取草果总黄酮，并通过试验证明草果总黄酮的DPPH自由清除率为80.5%。又如李志君等在“草果多酚物质提取及LC-MS/MS分析”（《食品工业科技》，2017年第08期，294-334）中采用提油后的草果粉末进行多酚物质提取，经试验证明，该草果多酚具有一定的DPPH、ABTS自由基清楚能力，且多酚浓度与其抗氧化活性正相关。

因此，有必要设计一种新从草果提取抗氧化活性单体化合物的方法，该方法不仅能够分离得到所需的抗氧化活性物质，还能通过结构鉴定，确定其抗氧化活性的物质基础，为草果进一步的综合开发利用奠定基础。

下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，当然，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。以下实施例中涉及的百分数均为质量份数，使用的仪器、药品与试剂如下：

仪器：

BC-R501CA型5L旋蒸机组（上海贝凯生物化学有限公司）；BC-R2012B型20L旋蒸机组（上海贝凯生物化学有限公司）；DLSB-30/130型低温冷却循环泵（郑州金育科贸有限公司）；BK-1000B型超声波清洗机（济南巴克超声波科技有限公司）；LPG-5型离心喷雾干燥器（四川万泰机械设备有限公司）；VFD-1000型VDF冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；BIOBASE BK-FD10P型冷冻干燥机（山东博科生物产业有限公司）；HC-5002S型超声仪（昆山慧超自动化设备有限公式）；X85-2S型恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造公司）；HH-Z4型数显恒温水浴锅（金坛市城东光芒仪器厂）；100*200mm硅胶薄层板（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）；200-300目硅胶（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）；Waters2695型制备液相色谱仪（Waters）；安捷伦1100型分析液相色谱仪（安捷伦）；制备液相静态压缩柱50MM（成都市武侯区虹禹药机设备厂）；2500mL抽滤瓶（成都振源玻璃仪器有限公司）。

药品与试剂：

草果药材购自广西玉林市，经鉴定为姜科豆蔻属多年生草本植物草果（A. tsao- ko Crevost et Lemarie）的干燥果实。将其粉碎成粗粉，于通风干燥条件下贮存，备用。二氯甲烷、乙腈、95%乙醇、甲醇、无水乙醇、磷酸、正丁醇（以上试剂均来自成都市科隆化学品有限公司 AR）；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，上海晶纯试剂有限公司，优级纯）；DPPH、ABTS（上海金穗生物科技有限公司 AR）；FeCl3·6H2O（上海实意化学试剂有限公司）。

实施例1：从草果中提取原儿茶酸

选取草果药材38kg进行粉碎，95%乙醇回流提取3次，每次1.5h，55℃减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液后，加水稀释2倍，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，取上述提取物的水相，混合后得到水提取物。取水提取物在60℃下减压浓缩制得水提取物浸膏，按水提取物浸膏：水=1g︰3mL计算，将水提取物浸膏用水完全溶解，溶解完全后用纳米有机膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，以甲醇-0.1% PA（15︰85）为流动相，λ=260nm，得到目标成分，经50℃浓缩，冷冻干燥、40℃鼓风干燥，得到一种单体化合物Ⅰ（225 mg），得率为0.59%（mg/g）。

实施例2：

选取草果药材38kg进行粉碎，95%乙醇回流提取2次，每次2h，60℃减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液后，加水稀释3倍，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，取上述提取物的水相，混合后得到水提取物。取水提取物在60℃下减压浓缩制得水提取物浸膏，按水提取物浸膏：水=1g︰3mL计算，将水提取物浸膏用水完全溶解，溶解完全后用纳米有机膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，以甲醇-0.1% PA（15︰85）为流动相，λ=260nm，得到目标成分，经50℃浓缩，冷冻干燥、40℃鼓风干燥，得到一种单体化合物Ⅱ（221mg），得率为0.58%（mg/g）。

实施例3：

选取草果药材38kg进行粉碎，95%乙醇回流提取2次，每次1.5h，60℃减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液后，加水稀释2倍，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，取上述提取物的水相，混合后得到水提取物。取水提取物在60℃下减压浓缩制得水提取物浸膏，按水提取物浸膏：水=1g︰3mL计算，将水提取物浸膏用水完全溶解，溶解完全后用纳米有机膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，以甲醇-0.1% PA（15︰︰85）为流动相，λ=260nm，得到目标成分，经50℃浓缩，冷冻干燥、40℃鼓风干燥，得到一种单体化合物Ⅲ（218mg），得率为0.57%（mg/g）。

实施例4

选取草果药材38kg进行粉碎，95%乙醇回流提取3次，每次1.5h，55℃减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液后，加水稀释2倍，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，取上述提取物的水相，混合后得到水提取物。取水提取物在60℃下减压浓缩制得水提取物浸膏，按水提取物浸膏：水=1g︰3mL计算，将水提取物浸膏用水完全溶解，溶解完全后用纳米有机膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，以甲醇-0.1% PA（15︰85）为流动相，λ=260nm，得到目标成分，经50℃浓缩，冷冻干燥、40℃鼓风干燥，得到一种单体化合物Ⅳ（212mg），得率为0.56%（mg/g）。

实施例5：

选取草果药材38kg进行粉碎，95%乙醇回流提取2次，每次2h，60℃减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液后，加水稀释2倍，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，取上述提取物的水相，混合后得到水提取物。取水提取物在60℃下减压浓缩制得水提取物浸膏，按水提取物浸膏：水=1g︰3mL计算，将水提取物浸膏用水完全溶解，溶解完全后用纳米有机膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，以甲醇-0.1% PA（15︰85）为流动相，λ=260nm，得到目标成分，经50℃浓缩，冷冻干燥、40℃鼓风干燥，得到一种单体化合物Ⅴ（208mg），得率为0.55%（mg/g）。

实施例6：单体化合物Ⅰ的结构鉴定

将上述所得的单体化合物Ⅰ进行核磁共振（¹H-NMR 和 ¹³C-NMR）、质谱（MS）等测试。

（1）核磁共振氢谱（¹H NMR）：

此化合物的核磁共振氢谱信号归属为：¹H NMR（DMSO-d₆, 300 MHz）δ: 7.35（1H,d, J=2.0, H-2），7.30（1H, dd, J=8.2, 2.1, H-5），6.79（1H, d, J=8.2, H-6），属于3个苯环氢信号，说明该化合物的苯环上面直接连接有3个氢，见下表1。

表1 核磁共振氢谱的信号归属（¹H NMR）

（2）核磁共振碳谱（¹³C NMR）：

此化合物的核磁共振碳谱信号归属为：¹³C NMR（DMSO-d₆, 75 MHz）δ：117（C-1）,118.4（C-2），123.5（C-3），123.7（C-4），146.7（C-5），151.8（C-6），169.2（C-7）。其中117、118.4、123.5、123.7、146.7、151.8属于6个苯环碳信号，说明该化合物存在一个苯环结构，见下表2。

表2核磁共振碳谱的信号归属（¹³C NMR）

（3）质谱：

质谱ESI+中给出的准分子离子峰[M+Na]⁺：m/z 177.01；[M+K]⁺：m/z 193；两倍峰[2M+Na]⁺：m/z 331.04；三倍峰[3M+Na]⁺：m/z 485.36。说明该化合物分子量M=154.12。参见图1。

（4）结构式：

综上，根据核磁共振（¹H NMR、¹³C NMR）与质谱结果，再与现有文献（王剑丽等“花生衣化学成分的分离与结构鉴定”，《天津中医药大学学报》，2019，38(2):175-179）对照，确定其结构为原儿茶酸（3,4-二羟基苯甲酸），属于酚酸类化合物。白色粉末，分子式为C₇H₆O₄，分子量为154.12。具体结构式如下式（1）。

（1）

实施例7：单体化合物Ⅰ的体外抗氧化活性测定

取单体化合物Ⅰ及对照品BHT，制备成浓度为：5、10、20、30、40 μg/mL 的系列工作溶液，于4℃低温保存，备用。

（1）DPPH自由基清除能力的测定

取单体化合物Ⅰ以及BHT工作溶液分别进行DPPH自由基的清除试验。单体化合物及BHT均设置11个具塞比色管，编为0～10号：在0号比色管中加入0.1 mmol/L DPPH工作溶液2mL和无水乙醇2 mL，作为空白管；在1～5号比色管中分别加入0.1 mmol/L DPPH工作溶液2mL和相应药物的系列工作液（5、10、20、30、40 μg/mL）各2 mL，作为试验管；在6～10号管中分别加入无水乙醇2 mL和相应药物的系列工作液（5、10、20、30、40 μg/mL）各2 mL，作为对照管。各比色管混匀后，在30℃水浴下避光反应30 min。以无水乙醇进行调零，采用紫外-可见分光光度计在517 nm波长处测定各反应溶液的吸光度（A）值，按公式计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率（％）＝[1－（A试验－A对照）/A 空白]×100％。

A空白: 2 mL DPPH工作液+ 2 mL 无水乙醇；

A试验: 2 mL DPPH工作液+2 mL 相应药物的系列工作液；

A对照: 2mL无水乙醇+2 mL 相应药物的系列工作液。

测定结果如图2所示，在一定的样品浓度范围内，DPPH自由基清除能力与样品浓度成正比，随着样品浓度的增大，DPPH自由基清除能力也增大。与对照品BHT相比，原儿茶酸在设定的浓度范围内对DPPH自由基清除能力强于BHT。

（2）ABTS自由基清除能力的测定

取单体化合物Ⅰ以及BHT工作溶液分别进行超氧阴离子自由基清除试验。单体化合物及BHT均设置11个具塞比色管，编为0～10号：0号比色管加入6 mL ABTS工作液和0.6 mL无水乙醇作为空白管， 1～5号比色管加入6 mL ABTS工作液和相应药物的系列工作液（5、10、20、30、40 μg/mL）各0.6 mL，作为试验管；6～10号比色管加入6 mL 无水乙醇和相应药物的系列工作液（5、10、20、30、40 μg/mL）各 0.6 mL，作为对照管。各比色管混匀后，室温避光反应1h，以无水乙醇进行调零，采用紫外-可见分光光度计在734 nm波长处测定各反应溶液的吸光度（A）值，按公式计算ABTS自由基清除率：ABTS自由基清除率（％）＝[1－（A试验－A对照）/A空白]×100％。

A空白：6 mL ABTS 工作液+0.6 mL 无水乙醇；

A试验：6 mL ABTS 工作液+0.6 mL相应药物的系列工作液；

A对照：6 mL无水乙醇+0.6 mL相应药物的系列工作液。

测定结果如图3所示，在设定的浓度范围内，ABTS自由基清除能力随着样品浓度的增大而增大，当样品浓度达到20µg/mL以后，其清除能力增长缓慢，清除能力均接近100%。与对照品BHT相比，原儿茶酸对ABTS自由基清除明显强于BHT。

（3）超氧阴离子自由基清除能力的测定

取单体化合物Ⅰ以及BHT工作溶液分别进行超氧阴离子自由基清除试验。单体化合物及BHT均设置11个具塞比色管，编为0～10号：0号比色管加入1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）4 mL、2.5 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL和无水乙醇1 mL，作为空白管；1～5号比色管加入1 mol/L Tris-HCl缓冲液4 mL、2.5mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL和相应药物的系列工作液（5、10、20、30、40 μg/mL）各1 mL，作为试验管；6～10号比色管加入1 mol/L Tris-HCl 缓冲液4 mL、蒸馏水0.4 mL和相应药物的系列工作液（5、10、20、30、40 μg/mL）各1 mL，作为对照管。各比色管混匀后，在室温下反应5 min，然后加入8 mmol/L HCl溶液1 mL终止反应。以蒸馏水进行调零，采用紫外-可见分光光度计在320 nm波长处测定各反应溶液的A值，按公式计算超氧阴离子清除率：超氧阴离子清除率（％）＝[1－（A试验－A对照）/A空白]×100％。

A空白：4 mL Tris-HCl+ 1 mL无水乙醇+ 0.4 mL邻苯三酚+1 mL 8 mmol/L HCl的吸光度值；

A试验：4 mL Tris-HCl + 1 mL 相应药物的系列工作液+ 0.4 mL 邻苯三酚+1 mL8 mmol/L HCl的吸光度值；

A对照：4 mL Tris-HCl + 1 mL 相应药物的系列工作液+ 0.4 mL 蒸馏水+1 mL 8mmol/L HCl的吸光度值。

测定结果如图4所示，在设定的浓度范围内，随着样品浓度的增大，原儿茶酸对超氧阴离子自由基的清除能力逐渐增大，其清除超氧阴离子的能力明显比阳性对照品BHT强。

（4）羟基自由基清除能力的测定

取单体化合物Ⅰ以及BHT工作溶液分别进行羟基自由基清除试验。单体化合物及BHT均设置6个具塞比色管，编为0～5号：0号比色管加入1 mL FeSO₄溶液、1 mL水杨酸－乙醇溶液、1 mL蒸馏水、1 mL H₂O₂溶液，作为空白管，1～5号比色管加入1 mL FeSO₄溶液、1 mL水杨酸－乙醇溶液、1 mL H₂O₂溶液和相应药物的系列工作液（5、10、20、30、40 μg/mL）各1mL，作为试验管，以蒸馏水进行调零，采用紫外-可见分光光度计在510 nm波长处测定各反应溶液的A值，按公式计算羟基自由基清除率：羟基自由基清除率（％）＝[A空白－A试验/A空白]×100％。

A空白：1 mL FeSO₄溶液+1 mL水杨酸－乙醇溶液+1 mL蒸馏水+1 mL H₂O₂溶液；

A试验：1 mL FeSO₄溶液+1 mL水杨酸－乙醇溶液+1 mL H₂O₂溶液+1 mL相应药物的系列工作液。

测定结果如图5所示，在设定的浓度范围内，原儿茶酸和阳性对照品BHT对羟基自由基的清除能力随浓度的增大而增大，且两者对羟基自由基的清除能力不相上下，原儿茶酸对羟基自由基的清除能力稍强。

（5）与金属离子(Fe²⁺)螯合能力的测定

取单体化合物Ⅰ以及BHT工作溶液分别进行Fe²⁺螯合能力试验。单体化合物及BHT均设置6个具塞比色管，编为0～5号：0号比色管加入0.1 mL FeCl₂、0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪、5mL蒸馏水，作为空白管，1～5号比色管加入0.1 mL FeCl₂、0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪、3 mL蒸馏水和相应药物的系列工作液（5、10、20、30、40μg/mL）各2 mL，作为试验管，以蒸馏水进行调零，反应10 min后，采用紫外-可见分光光度计在562 nm波长处测定各反应溶液的A值，吸光度越低表示金属螯合能力越高。按公式计算亚铁离子螯合能力：亚铁离子螯合能力（％）＝[A空白－A试验/A空白]×100％。

A空白：5 mL蒸馏水+0.1 mL FeCl₂+0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪；

A试验：3 mL蒸馏水+0.1 mL FeCl₂+0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪+2 mL相应药物的系列工作液。

测定结果如图6所示，在设定的浓度范围内，原儿茶酸对Fe²⁺螯合能力随浓度的增大而增大，在浓度为20-30µg/mL之间，原儿茶酸对Fe²⁺螯合能力不太明显，增长趋势缓慢，在30µg/mL时，对照品BHT对Fe²⁺螯合能力比原儿茶酸强。

（6） Fe³⁺还原能力的测定

取单体化合物Ⅰ以及BHT工作溶液分别进行Fe³⁺还原试验。单体化合物及BHT均设置15 mL离心管5支，分别加入相应药物的系列工作溶液（5、10、20、30、40 μg/mL）各1 mL、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.6）2.5 mL和1％铁氰化钾溶液2.5 mL。各离心管在50℃水浴中加热反应20 min后，加入10％三氯乙酸溶液2.5 mL终止反应，然后以3000 r/min离心10min；取上清液2.5 mL于具塞比色管中，加入蒸馏水2.5 mL 和0.1％FeCl₃溶液0.5 mL，混匀，静置反应10 min。以蒸馏水进行调零，采用紫外-可见分光光度计在波长700 nm处测定各反应溶液的A值。以A值表示待测药物对Fe³⁺的还原能力，A值越大，则表示药物的还原能力越强。

A样品：[1 mL 样品+2.5 mL pH 6.6 的磷酸盐缓冲液+2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液]水浴20 min+三氯乙酸溶液 2.5 mL终止反应（离心）取上清2.5 mL+2.5 mL 蒸馏水+0.5 mL 0. 1%的FeCl₃溶液

A对照：[1 mL BHT+2.5 mL pH 6.6 的磷酸盐缓冲液+2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液]水浴20 min+三氯乙酸溶液2.5 mL终止反应（离心）取上清2.5 mL+2.5 mL 蒸馏水+0.5 mL0.1%的FeCl₃溶液。

测定结果参见图7。吸光度值越大，说明还原能力越大，即还原能力越强，说明抗氧化能力越强，由图7所示，在设定的浓度范围内，吸光度值随着样品浓度的增大而增大。与对照品BHT相比，原儿茶酸的吸光度值大于BHT，说明原儿茶酸对Fe³⁺的还原能力强于BHT。

基于上述实施例，本发明提供了一种提取草果中单体化合物原儿茶酸的方法。原儿茶酸属于酚酸类化合物，现有研究发现酚酸类化合物的抗氧化作用与羟基数量和取代基位置有关，具有强的抗氧化作用^[1]。原儿茶酸对不同的自由基清除能力不同，可能是与化合物的结构特征有关，包括：空间结构、羟基的位置、羟基的数量、苯环上的酚羟基等^[2]。

通过DPPH自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验、羟基自由基清除实验、亚铁离子的螯合实验、三价铁离子的还原实验发现，原儿茶酸对这些自由基及铁离子均具有一定的清除能力，说明原儿茶酸具有一定的抗氧化能力，其抗氧化活性与单体化合物结构有关，抗氧化作用机理主要是通过清除自由基来避免氧化损伤。

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[2] 赵雪巍, 刘培玉, 刘丹, 等. 黄酮类化合物的构效关系研究进展[J]. 中草药, 2015, 46(21):3264-3271.

实施例8：

对上述实施例1-5中从草果中提取抗氧化活性物质的方法进行考察，其方法学验证过程如下：

(1)精密度试验：精密吸取原儿茶酸溶液10µL进样1次，记录色谱图。结果：峰面积的 RSD值为0.16%，说明仪器精密度良好。

(2)稳定性试验：精密吸取原儿茶酸溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积，结果原儿茶酸峰面积的RSD值为0.48%，说明草果素溶液在24h内稳定。

(3)重复性试验：取原儿茶酸样品6份，每份约1mg，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按色谱条件测定。结果：原儿茶酸含量为0.59%（mg/g），RSD 值为0.92%，说明方法重复性良好。

(4)加样回收率试验：取已测定的原儿茶酸约0.5 mg，精密称定，平行称取5份，置具塞锥形瓶中，按标准品与供试品含量比为0.5︰1、1︰1、1.5︰1分别加入标准品，每个比例配置3份，制备供试品溶液。各供试品溶液进样体积 10 μL，测定峰面积，计算回收率。结果：原儿茶酸平均回收率为100.32%，RSD为1.46%，结果表明方法回收率良好。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从草果中提取抗氧化活性物质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

A.以草果药材为原料，粉碎后用质量浓度为95%的乙醇回流提取2～3次，每次回流提取时间控制在1.5～2h，将回流提取得到的提取液在55～60℃下减压浓缩至无醇后，得到浓缩液；

B.将浓缩液稀释加水稀释2～3倍后，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取一次，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，取其萃取后的水相混合后，得到水提取物，将水提取物在60℃下减压浓缩制得水提取物浸膏；

C. 按水提取物浸膏：水=1g︰3mL计算，将水提取物浸膏用水溶解后，采用纳米有机膜过滤，然后采用C18柱分离，采用体积比为15︰85为甲醇-0.1% PA为流动相，紫外光为260nm，得到原儿茶酸。