CN113648456B

CN113648456B - 鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶制备

Info

Publication number: CN113648456B
Application number: CN202110961259.2A
Authority: CN
Inventors: 莫奕雯; 杨最素; 郑佳文; 田笑笑; 李航婷; 金明月; 田静; 李诺营
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Xi'an Huaqi Zhongxin Technology Development Co ltd
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113648456A

Abstract

本发明提供了一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白‑壳聚糖‑复合海藻酸钠水凝胶的方法。本发明通过单因素试验及响应面优化得到酸法提取鳗鱼鱼鳔胶原蛋白的最佳条件为醋酸浓度0.42mol/L、酸解时间21h、液料比为58ml/g。本发明从鳗鱼鱼鳔中分离的酸溶性胶原蛋白可以作为合适的药物载体系统，是良好的药用生物材料，同时具体有独特的多孔纤维结构，可以用来吸收大量水分，支撑肌肤表面，对保湿和抗皱有着重要作用；可作为创伤赋形剂或药物载体，对小鼠皮肤伤口具有促愈合作用，在生物医学工程和医学上具有巨大的应用潜力。

Description

鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶制备

技术领域

本发明属于生物提取领域，具体涉及一种鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的制备

背景技术

皮肤是人体最大的感觉器官，工作中容易意外受到损伤，在伤口愈合时，需要上皮组织的再生、肉芽组织的形成与增生、瘢痕结缔组织形成等的复杂组合，胶原蛋白的沉积和血管形成是创伤愈合的关键。传统伤口敷料主要是使用脱脂棉纱布、纱布条等天然纤维材料，可使伤口干燥及物理隔离功能等，但换药时容易撕拉伤口，引起再出血等不利于愈合。

我国鳗鱼业发展磅礴，鳗鱼肉质鲜美，营养价值高，除日常鲜食外，常被加工成鳗鱼干、烤鳗鱼片等，因此在加工过程中会产生大量的加工副产物。其中鱼鳔除被少量食用外，大量鱼鳔以废弃物丢弃，既浪费了资源，也污染了环境。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明以鳗鱼鱼鳔胶原蛋白为主，与Ca²⁺分别交联的壳聚糖和海藻酸钠为配料制备水凝胶，研究了其对小鼠皮肤伤口的促愈合作用，填补了鳗鱼胶原蛋白-壳聚糖-海藻酸钠复合水凝胶方面的空缺。

一种制备鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，具体步骤如下：

1)预处理：将新鲜鳗鱼鱼鳔清洗干净，除去鱼鳔上覆盖的非鱼鳔组织，血管，脂肪以及表层的膜，去离子水清洗干净后剪成0.5×0.5cm小块，用氢氧化钠溶液在20℃左右条件下浸泡并搅拌48小时，以除去鱼鳔中的杂蛋白，每6h更换氢氧化钠溶液1次，然后将鱼鳔用蒸馏水清洗直至鱼鳔呈现中性；再将鱼鳔放入正丁醇溶液中，同样在20℃左右条件下浸泡并搅拌48小时，以除去鱼鳔中的脂质，每6h更换正丁醇溶液1次，再用蒸馏水将鱼鳔中的正丁醇清洗干净；将清洗好的鳗鱼鱼鳔置于-20℃保存，备用；

2)取经过预处理后的鳗鱼鱼鳔，放入乙酸溶液中，在24℃恒温摇床上进行酸解处理21h；取纱布过滤未酸解完全的鱼鳔，取滤液；将滤液装入透析袋置于纯水中透析3天，每天更换透析液(纯水)2次，透析过程中对透析液温和搅拌，直到透析液pH显中性；然后对透析过的胶原蛋白进行冷冻干燥处理，即得酸溶性胶原蛋白，置于-20℃冰箱储存备用；

3)凝胶液的制备：取步骤2)制备得到的胶原蛋白，卡波姆，海藻酸钠；胶原蛋白用0.50mol/L的乙酸溶液超声溶解均匀，置于纯化水中透析至中性，取出胶原蛋白为原料液1；卡波姆加入纯化水和甘油，于60℃水浴锅中溶胀40min，再用0.01mol/L的NaOH溶液调节其PH为6.5-7，充分搅拌得原料液2；海藻酸钠加入纯化水充分溶胀，搅拌均匀得原料液3；将原料液1、2、3全部混合，充分搅拌均匀，放入4℃冰箱脱泡2h，由于溶胀使得凝胶液体积增大，共制得200ml凝胶液；

4)交联液制备:制备CaCl₂溶液和壳聚糖溶液，将两种溶液混合均匀，即得交联液，密封保存备用；

5)CCA水凝胶交联:将步骤3)制备得到的凝胶液倒入培养皿中，平铺均匀薄薄一层即可，放入4℃冰箱冷存2h后取出，将交联剂溶液倒入上述培养皿中，使之充分交联后，即得鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶，取出水凝胶片，用蒸馏水冲洗干净后，备用。

作为优选，所述步骤1)中氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L。

作为优选，所述步骤1)中正丁醇溶液的浓度为10％，单位g/ml。

作为优选，所述步骤2)中乙酸溶液的浓度为0.42mol/L。

作为优选，所述步骤2)中乙酸溶液与预处理后的鳗鱼的液料比为58ml/g。

作为优选，所述步骤3)中胶原蛋白与卡波姆的重量比为4:3；所述胶原蛋白与海藻酸钠的重量比为1:3；所述胶原蛋白与甘油的重量比为1:1；所述海藻酸钠与蒸馏水的重量体积比g/ml为1:50。

作为优选，所述步骤3)中原料液1的配制中胶原蛋白与乙酸溶液的重量体积比g/ml为1：65；所述原料液2的配制中卡波姆与纯化水的重量体积比g/ml为1:40，所述原料液2的配制中甘油与纯化水的重量体积比g/ml为1:30，所述原料液3的配制中，海藻酸钠与纯化水的重量体积比g/ml为3:55。

作为优选，所述步骤4)中CaCl₂溶液的浓度为0.01g/ml，壳聚糖溶液的浓度为0.0075g/ml。

作为优选，所述步骤4)中CaCl₂溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:1。

作为优选，所述步骤5)中凝胶液与交联剂溶液的体积比1:1。

本发明的有益效果：

1.本发明提供了一种较为高效的鳗鱼鱼鳔胶原蛋白的提取方法，该方法简单，易于实施；

2.本发明从鳗鱼鱼鳔中分离的酸溶性胶原蛋白可以作为合适的药物载体系统，是良好的药用生物材料，同时具体有独特的多孔纤维结构，可以用来吸收大量水分，支撑肌肤表面，对保湿和抗皱有着重要作用；

3.本发明方法制备的鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶，可作为创伤赋形剂或药物载体，对小鼠皮肤伤口具有促愈合作用，在生物医学工程和医学上具有巨大的应用潜力。

说明书附图

图1为实施例1中醋酸浓度和酸解时间对ASC提取率影响的响应面和等高线图。

图2为实施例1醋酸浓度和液料比对ASC提取率影响的响应面和等高线图。

图3为实施例1酸解时间和液料比对ASC提取率影响的响应面。

图4为实施例2紫外全波长扫描(UV)图。

图5为实施例2傅里叶红外光谱(FTIR)图。

图6为实施例2中SDS-PAGE凝胶电泳图。

图7为实施例2中酸溶胶原蛋白的SEM图像分析。

A：×100；B：250；C：×1000；D：×2500

图8为实施例3中的CCA水凝胶的SEM图。

A：×100；B：250；C：×1000；D：×2500

图9为实施例4中小鼠伤口及伤口愈合率图。

9-A在第0、3、7和14天的用药效果图；9-B在第3、7和14天的伤口愈合率(％)。*，表示与对照组相比有显著差异(p<0.05)，n＝3

图10为皮肤切口3天HE染色结果。

A1对照组切口边缘(×100)，A2对照组切口边缘(×200)；B1水凝胶组切口边缘(×100)，B2水凝胶组切口边缘(×200)；C1对照组切口处(×100)，C2对照组切口处(×200)；D1水凝胶组切口处(×100)，D2水凝胶组切口处(×200)

图11为皮肤切口7d与14d HE染色结果。

E1对照组7d切口(×100)，E2对照组7d切口(×200)；F1水凝胶组7d切口(×100)，F2水凝胶组7d切口(×200)；G1对照组14d切口(×100)，G2对照组14d切口(×200)；H1水凝胶组14d切口(×100)，H2水凝胶组14d切口(×200)

图12为CCA对小鼠血清抗氧化活性的影响图。

(A)SOD、(B)GSH-Px和、(C)CAT、(D)MDA和(E)T-AOC(n＝3)。*，表示与对照组相比有显着差异(p<0.05)

图13为CCA水凝胶对小鼠血清炎症因子的影响。

(A)IL-1β,(B)IL-6和(C)TNF-α(n＝3)。*，表示与对照组相比有显着差异(p<0.05

具体实施方式

下列实施例用于进一步解释说明本发明，但是，它们并不构成对本发明范围的限制或限定。

实施例1鳗鱼鱼鳔胶原蛋白最佳提取工艺确定

1)预处理：将新鲜鳗鱼鱼鳔清洗干净，除去鱼鳔上覆盖的非鱼鳔组织，血管，脂肪以及表层的膜，去离子水清洗干净后剪成0.5×0.5cm小块，用0.1mol/L的氢氧化钠(1:10w/v)在20℃左右条件下浸泡并搅拌48小时，以除去鱼鳔中的杂蛋白，每6h更换氢氧化钠溶液1次，然后将鱼鳔用蒸馏水清洗直至鱼鳔呈现中性；再将鱼鳔放入10％的正丁醇溶液(1:10w/v)，同样在20℃左右条件下浸泡并搅拌48小时，以除去鱼鳔中的脂质，每6h更换正丁醇溶液1次，再用蒸馏水将鱼鳔中的正丁醇清洗干净；将清洗好的鳗鱼鱼鳔置于-20℃保存，备用。

2)单因素试验

根据羟脯氨酸(HYP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书，使用羟脯氨酸标品配制100μg/ml标准溶液。分别吸取100μg/ml标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，放置50ml容量瓶中定容。配制成羟脯氨酸标准溶液，浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/ml。然后各取1ml上述溶液，按照说明书加入试剂一0.5ml混匀，室温静置10分钟。加入试剂二0.5ml，室温静置5分钟。加入试剂三0.5ml，混匀，置于60℃水浴锅中水浴15分钟，冷却后，3500转/分离心10分钟，取上清液在550nm处测吸光度。横坐标为羟脯氨酸浓度，纵坐标为所测得的OD值，绘制羟脯氨酸标准曲线并建立线性回归方程。

在前期试验基础上，设定醋酸浓度0.5mol/L、提取时间25h、液料比为55ml/g的条件下，进行单因素试验研究醋酸浓度0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L；提取时间15、20、25、30、35h；液料比35、45、55、65、75ml/g对鳗鱼鱼鳔胶原蛋白提取率的影响。

最佳酸解参数为：醋酸浓度0.5mol/L、酸解时间20h、液料比55ml/g。取解冻的鳗鱼鱼鳔0.4g和过滤后的胶原蛋白酸解液各2ml，分别加入6mol/L的盐酸2ml，在100℃的烘箱中高温水解5h。冷却至室温后，鱼鳔和胶原蛋白水解液均按照羟脯氨酸(HYP)测定试剂盒说明书的方法进行羟脯氨酸的含量测定。以所测得的标准曲线的线性回归方程和所测得的吸光度为根据，计算鳗鱼鱼鳔中羟脯氨酸的含量以及胶原蛋白的提取率。胶原蛋白的提取率＝(1g鱼鳔所得酸解液中羟脯氨酸的总质量)/(1g鱼鳔中羟脯氨酸的总质量)

根据每组的最高ASC提取率选取酸浓度为0.3、0.5、0.7mol/L，酸解时间15、20、25h，料比为45、55、65ml/g进行响应面试验。

3)响应面试验

根据单因素试验确定各因素的取值范围，结合Box-Behnken试验原理，以冰醋酸浓度、酸解时间和液料比为自变量，以ASC为响应值进行响应面优化试验，Box-Behnken设计因素水平及编码如表1所示。

表1Box-Behnken设计因素水平及编码

根据Box-Behnken中心组合设计响应面实验，结果如表2所示。利用DesignExpert8.0.6对数据进行拟合，得到醋酸浓度(A)、酸解时间(B)、液料比(C)对鳗鱼鱼鳔ASC提取率的标准回归方程

Y＝62.5-2.95A+5.84B+5.97C-3.37AB+0.83AC+4.07BC-9.36A²-14.32B²-4.35C²。

表2Box-Behnken实验设计及结果

表3回归模型的方差分析

(注：P<0.0001表示影响极其显著，0.0001<P<0.01表示影响较为显著，0.01<P<0.05表示有显著影响，P>0.05表示影响不显著。)

如表3显示在方程中，A(P＝0.0379)、B(P＝0.0026)、C(P＝0.0024)对提取率有显著影响。各因素交互作用分析；由图1-3可知，随着醋酸浓度的增加，ASC的提取率先增大后减小而ASC提取率随着酸解时间的延长和液料比增大逐渐增大。通过等高线可以看出，酸解时间和液料比的交互作用比较明显。

4)验证试验

优化酸法提取鳗鱼鱼鳔胶原蛋白的工艺最佳条件为醋酸浓度0.42mol/L、酸解时间20.99h、液料比为57.79ml/g。在此条件下，鳗鱼鱼鳔胶原蛋白提取率的理论预测值为65.54％。为了方便应用于实际操作，对最佳工艺条件进行修正：醋酸浓度0.42mol/L、酸解时间21h、液料比为58ml/g。

实施例2最佳工艺制备得到的ASC的性质分析

为了验证最佳提取条件下的预测产量，进行了三个重复性实验。实验测得鳗鱼鱼鳔胶原蛋白的提取率平均为65.32％，与预测值非常吻合。同时对所提取出鳗鱼鱼鳔ASC性质的进行了测定：

1)鳗鱼鱼鳔ASC紫外全波长扫描(UV)分析

将ASC溶于0.5mol/L乙酸溶液,配制得1mg/ml的ASC溶液，并以0.5mol/L乙酸溶液作为空白对照，使用紫外分光光度计对其进行190-400nm范围内的紫外波长扫描。

如图4可知，在波长为225nm处有一个尖锐强烈吸收峰，说明鱼鳔胶原蛋白溶液中可能存在羟脯氨酸和脯氨酸，而且225nm处的吸收峰表明鳗鱼鱼鳔胶原蛋白符合I型胶原蛋白紫外特征吸收峰；在280nm处的吸收峰很弱，说明鱼鳔胶原蛋白溶液不存在苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸这些芳香族氨基酸，与胶原蛋白氨基酸组成一致，综上所述，鳗鱼鱼鳔胶原蛋白是I型胶原蛋白。

2)鳗鱼鱼鳔ASC傅里叶红外光谱仪(FTIR)分析

采用溴化钾压片法对胶原蛋白进行傅里叶红外光谱分析。取适量样品加入150mg左右干燥后的KBr中，在干燥的玛瑙研钵中按一个方向研细，取适量放入擦拭干净的模具，置于真空压片机中压制成片，用空白的KBr压片扫描作为背景，将样品KBr压片置于傅里叶红外分析仪进行400到4000cm^-1波长的扫描。

如图5所示为酸溶性胶原蛋白(ASC)的傅里叶红外光谱仪(FTIR)分析光谱结果。ASC的红外光谱范围在400-4000cm^-1之间,其中，在4000-2500cm^-1的氢键区内，3434cm^-1处的强吸收证明鱼鳔胶原蛋白存在酰胺A，因为酰胺A的N-H伸缩振动与氢键的存在，会使其在3400-3440cm^-1范围内显示强吸收峰；3092cm^-1、2927cm^-1附近处的弱吸收与酰胺B中的C-N伸缩振动、CH2不对称伸缩的特征吸收峰一致，证明鱼鳔胶原蛋白存在酰胺B；其中2927cm^-1是胶原蛋白分子不同于其他一般蛋白质分的特征吸收峰。在2000-1500cm^-1的双键区，在1644cm^-1处的强吸收峰证明酰胺I的存在，是由C＝O伸缩振动和N-H的振动共同作用引起，特征吸收波长在1600-1700cm^-1之间；1555cm^-1、1454cm^-1、1394cm^-1处的吸收峰证明酰胺II带的存在，主要是由N-H弯曲振动和C-N伸缩振动共同作用出现不同的吸收峰，同时还有C-H弯曲以及COO-对称伸缩振动共同作用，振动组成比较多但是主要受肽链的影响，肽链侧基无关；1341cm^-1、1241cm^-1、1166cm^-1、1077cm^-1处的吸收峰证明酰胺III带的存在，其中1241cm^-1是酰胺III带的主要特征吸收峰，酰胺III带主要由同相N-H弯曲振动、C-N伸缩振动、C-O面内弯曲振动和C-C伸缩振动共同引起的，振动组成比较复杂，会受到胶原蛋白侧链结构的影响。

这些吸收峰对应五个主要的酰胺带：酰胺A、酰胺B、酰胺I带、酰胺II带和酰胺III带，这些吸收峰的氨基酸组成、脯氨酸和羟脯氨酸的比例明显高于其他胶原蛋白分子。其中，酰胺A和酰胺I带对蛋白质三螺旋结构都非常敏感，对判断胶原蛋白的三螺旋结构完整性具有有重要作用，但是酰胺II带对蛋白质的三螺旋结构不敏感；酰胺I带和酰胺II带的吸收峰取决于鱼鳔胶原蛋白中肽链的结构，不受肽链上侧链结构的影响，而酰胺III带振动组成比较复杂，侧链结构对其吸收峰也有一定的影响；酰胺I带和酰胺III带与蛋白质的二级结构紧密相关，可通过这两个酰胺带预测鱼鳔胶原蛋白的二级结构。

本次胶原蛋白傅里叶红外光谱仪(FTIR)分析光谱结果显示，酰胺I带和酰胺III带的存在证明了胶原蛋白二级结构的存在并可以预测出鱼鳔胶原蛋白的二级结构，酰胺A和酰胺I带存在且处于正常的波长范围内，证明酸溶性鱼鳔胶原蛋白的三螺旋结构完整。3)鳗鱼鱼鳔ASC SDS-PAGE凝胶电泳分析

配制1mg/mL的胶原蛋白样品和标品溶液，进行SDS-PAGE电泳。分离胶浓度8％，浓缩胶浓度5％，采用直流恒压电源，电压80V，电泳时间40min，后换用120V电压电泳2h，用考马斯亮蓝染色45min后脱色，直到蓝色背景消失出现清晰明显的条带。由图6可知鳗鱼鳔胶原蛋白含有两条α链和一条β链，其中两条α链的亚基分别是α1、α2，其分子质量均在90-130kDa之间，β链的分子质量略高于200kDa。

4)鳗鱼鱼鳔ASC扫描电镜(SEM)分析

利用高分辨率扫描电子显微镜研究了不同电镜倍数下的酸溶性胶原蛋白(ASC)的形态特征，制备1mg/ml的胶原蛋白溶液，取30μL置于干净的载玻片上，37℃孵育过夜。所得标本用去离子水冲洗数次，用2.5％(v/v)戊二醛固定2小时。然后，将样品用50％(v/v)乙醇脱水并用冷冻干燥机干燥。给干燥的样品涂一层薄薄的金，并在5kV的加速电压下进行SEM观察，观察倍数为×100、250、×1000、×2500。如图7所示是纯化后冻干的酸溶性胶原蛋白(ASC)使用高分辨率扫描电子显微镜，以×100，×250，×1000和×2500放大倍数观察样品图像的形态。在×100，×250倍镜下观察到多孔三维胶原纤维海绵，呈现均匀致密的纤维网络结构；在×1000，×2500倍镜下ASC是由复杂的胶原纤维组成，胶原纤维大多是直的，相互交叉，从而形成光滑紧密的网络结构。特别是在分辨率为×2000下观察到ASC具有规则的丝状网状结构，呈裂隙状。

实施例3鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的制备

1)预处理：将新鲜鳗鱼鱼鳔清洗干净，除去鱼鳔上覆盖的非鱼鳔组织，血管，脂肪以及表层的膜，去离子水清洗干净后剪成0.5×0.5cm小块，用0.1mol/L的氢氧化钠(1:10w/v)在20℃左右条件下浸泡并搅拌48小时，以除去鱼鳔中的杂蛋白，每6h更换氢氧化钠溶液1次，然后将鱼鳔用蒸馏水清洗直至鱼鳔呈现中性。再将鱼鳔放入10％的正丁醇溶液(1:10w/v)，同样在20℃左右条件下浸泡并搅拌48小时，以除去鱼鳔中的脂质，每6h更换正丁醇溶液1次，再用蒸馏水将鱼鳔中的正丁醇清洗干净。将清洗好的鳗鱼鱼鳔置于-20℃保存，备用。

2)根据实施例1酸法提取鳗鱼鱼鳔ASC最佳工艺，取出适量的经过预处理后的鳗鱼鱼鳔2.0g，放入浓度为0.42mol/L的乙酸溶液，液料比为58ml/g，在24℃恒温摇床上进行酸解处理21h。取纱布过滤未酸解完全的鱼鳔，取滤液。将滤液装入透析袋置于纯水中透析3天，每天更换透析液2次，透析过程中对透析液温和搅拌，直到透析液pH显中性。然后对透析过的胶原蛋白进行冷冻干燥处理，即得酸溶性胶原蛋白，置于-20℃冰箱储存备用。

3)胶凝液的制备：称取凝胶液原料胶原蛋白1.0g，卡波姆0.75g，海藻酸钠3.0g。胶原蛋白用0.50mol/L的乙酸溶液65ml超声溶解均匀，置于纯化水中透析至中性，取出胶原蛋白为原料液1；卡波姆加入30ml纯化水和1g甘油，于60℃水浴锅中溶胀40min，再用0.01mol/L的NaOH溶液调节其PH为6.5-7，充分搅拌得原料液2；海藻酸钠加入55ml纯化水充分溶胀，搅拌均匀得原料液3；将原料液1、2、3全部混合，充分搅拌均匀，放入4℃冰箱脱泡2h，由于溶胀使得凝胶液体积增大，共制得200ml凝胶液；

4)交联液制备:称取交联液原料无水氯化钙1.0g，壳聚糖0.75g。无水氯化钙加入100ml纯化水溶解，壳聚糖加入100ml纯化水，并滴加少量醋酸溶液促进壳聚糖溶解，将无水氯化钙溶液和壳聚糖溶液全部混合，搅拌均匀后的得200ml交联液。

5)CCA水凝胶交联：将200ml凝胶液平均分为10ml/份，分别置于20个半径为5cm的培养皿中，使得凝胶液均匀平铺在模具上，厚度约为3.0mm，倒入10ml交联液充分交联40min，交联完成后取出水凝胶，用纯水清洗后用于后续实验。水凝胶置于纯水放入4℃冰箱保存。

将制备得到的CCA水凝胶进行扫描电镜(SEM)分析，将水凝胶样品冷冻干燥后切割成7mm的直径大小，在20kv加速电压下，溅射镀金250s后，在扫描电镜下观察其超微结构。使用image J(2015版)和Origin Pro 2021软件(Origin Lab)，通过分析每张图像共20个随机点，统计毛孔的平均直径。

图8是胶原蛋白-壳聚糖-海藻酸盐(CCA)复合水凝胶使用高分辨率扫描电子显微镜，以×100，×250，×1000和×2500放大倍数观察样品图像的形态。在×100，×250倍镜下观察到水凝胶上具有高度多孔的结构，具有互连的孔，这些孔可能是胶原蛋白冻干过程中分离产生的，也有可能是壳聚糖与胶原蛋白之间、胶原蛋白与海藻酸钠之间、海藻酸钠和Ca²⁺之间相互交联，产生的多孔结构；在×1000，×2500倍镜下可以清楚的观察到水凝胶分子之间相互交联，形成连续密集的小孔，根据ImageJ(2015版)的测量，通过分析每个图像总共20个随机点来统计计算毛孔的平均直径，孔径在1-175μm之间，计算得水凝胶的孔隙率为84％±5.46％。

分析结果表明多孔的CCA水凝胶有利于细胞的附着和迁移，利于新生组织的生长。有文献表示，孔隙率和孔隙结构是设计合适的水凝胶剂型的关键因素。因此用于伤口愈合的水凝胶应具有良好的多孔结构，为细胞附着、增殖和分化提供支点。并且已经证明当支架的孔隙趋于更大时，细胞密度和细胞代谢活性显着增加。总之，具有三重网络结构的多孔CCA水凝胶可以作为促进伤口愈合使用的理想材料。

实施例4小鼠皮肤伤口愈合实验

1)26只雄性ICR小鼠(22-24g)适应性饲养一周后随机分为两组：对照组和CCA水凝胶组。各组小鼠经4％的水合氯醛麻醉后，剃去背毛，经常规皮肤消毒，用无菌外科剪刀剪出1cm直径的伤口区域。对照组伤口区域仅用0.9％盐水处理，CCA水凝胶组小鼠的伤口区域用水凝胶完全覆盖，CCA水凝胶在使用前紫外线照射灭菌。使用数码相机在第0、3、7和14天拍摄照片以评估伤口愈合状态，并使用Image J软件计算伤口面积。伤口愈合率的公式(％)如下：

2)H&E免疫组化检测

在第3、7和14天，处死各组小鼠后，小心取下每只小鼠伤口区域皮肤。将收集到的伤口组织固定在4％的多聚甲醛中，嵌入石蜡中，切成厚度为6mm大小的切片，再通过脱蜡、再水化、苏木素-伊红(H&E)染液染色的获得样品切片，每个伤口样本制备3个切片，使用Masson三色染色盒染色分析胶原蛋白，然后在光学显微镜下放大100倍和400倍观察每组伤口组织的形态学变化。

3)血清抗氧化水平检测

在第3、7和14天，处死每组小鼠前，进行摘眼球取血。离心(4℃，5000rpm，5分钟)收集血清，使用试剂盒测量血清中MAD、CAT、SOD、T-AOC、GSH-Px的含量。

4)血清炎症因子检测

在第3、7和14天，处死每组小鼠前，进行摘眼球取血。离心(4℃，5000rpm，5分钟)收集血清，使用试剂盒测量血清中IL-6、IL-1β以及TNF-α的含量。

小鼠伤口愈合分析，结果如图9所示：

如图9所示，CCA水凝胶组伤口愈合明显优于对照组。通过软件image J(2015版)测量伤口面积大小和SPSS Statistics 23处理数据，计算伤口愈合率，三个时间段对照组的伤口愈合率分别为(2.50±0.82)％，(39.70±1.15)％和(97.49±0.45)％，水凝胶组伤口愈合率分别为(29.18±0.93)％，(82.66±0.66)％和(99.48±0.39)％，二组相比具有统计学意义。作图如9-B。

观察图9-A小鼠伤口愈合的图片，明显观察到3天的对照组小鼠伤口出现红肿、炎症情况较为严重，伤口几乎没有开始愈合，此时的CCA水凝胶组小鼠伤口红肿、炎症情况较为轻微，伤口愈合较为明显。7天的对照组的小鼠伤口炎症情况有所好转，伤口开始愈合，此时的CCA水凝胶组小鼠伤口几乎愈合，炎症情况消失。14天后两组的小鼠伤口均愈合，但是可以发现对照组伤口愈合的皮肤疤痕比CCA水凝胶组的疤痕明显。由此证明CCA水凝胶有促进伤口愈合的作用，在伤口愈合初期还有有一定的抗炎作用，大大加快的伤口愈合的速率，最后伤口愈合后皮肤疤痕较小，皮肤组织恢复较为完整。

4)皮肤切口HE染色及结果

在第3d、7d和14d，处死小鼠后小心取下伤口区域皮肤，4％多聚甲醛固定24h后石蜡包埋，切片、脱蜡、水化、HE染色后在光学显微镜下观察皮肤伤口的组织学结构。

3d对照组与水凝胶组皮肤切口的HE染色结果如图10所示，对照组切口边缘(图A1、A2)一侧可见表皮上方有大量的炎症细胞浸润，表皮与真皮交界处也可见炎症细胞，一侧表皮缺失，切口上炎症细胞大量聚集，并见血痂组织及渗出物。水凝胶组切口边缘(图B1、B2)一侧也可见表皮上方有大量的炎症细胞浸润，但表皮与真皮交界处未见炎症细胞，另一侧表皮缺失，切口上炎症细胞聚集，比对照组稍少，也见血痂组织及渗出物。对照组切口中间(图C1、C2)可见切口最上面有染成红色的渗出物，真皮及与皮下组织交界处有大量的炎症细胞浸润，真皮结构疏松，水肿。水凝胶组切口中间(图D1、D2)也可见切口最上面有染成红色的渗出物，真皮及与皮下组织交界处有炎症细胞浸润，但比对照组稍少，真皮结构疏松，水肿。这些变化说明水凝胶组可减少炎症细胞的浸润。

7d和14d对照组与水凝胶组皮肤切口的HE染色结果如图11所示，对照组7d(图E1、E2)切口表面可见染色红色的结构形成，可见已形成1-2层的表皮细胞，真皮内有胶原纤维、成纤维细胞与血管，即肉芽组织形成；真皮内见汗腺，未见皮脂腺的形成。水凝胶组7d(图F1、F2)切口已形成2-3层的表皮细胞，真皮内有胶原纤维、成纤维细胞与血管，即肉芽组织形成；并见新生的皮脂腺、汗腺及导管。对照组切口14d(图G1、G2)切口表面形成2-3层的表皮细胞，真皮内有大量的胶原纤维、少量的皮脂腺，汗腺及导管已较明显。水凝胶组14d(图H1、H2)切口表面已形成复层扁平上皮，可见基底层、棘层、颗粒层、透明层及少量的角质层细胞，真皮与表皮之间有明显的乳头层，网状层中内有大量的胶原纤维、成纤维细胞与血管，皮脂腺、汗腺及导管明显增多。这些变化说明，不同时间段的二组皮肤相比，水凝胶能减轻伤口的出血现象，减轻炎症反应，促进皮肤及附属器官的再生。

6)血清抗氧化水平检测分析

在第3、7和14天，处死每组小鼠前，进行摘眼球取血。离心(4℃，5000rpm，5分钟)收集血清，使用SOD、GSH-Px、MAD、CAT、T-AOC试剂盒(南京建成生物工程研究所)测量血清中MAD、CAT、SOD、T-AOC、GSH-Px的含量，结果如图12所示。

谷胱甘肽(GSH)是一种含有生殖基础的非蛋白化合物，是细胞抗氧化应激机制的主要成分之一。GSH可以直接或通过谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)清除活性氧(ROS)而达到抗氧化作用。如图B所示，对照组与CCA水凝胶组的GSH-Px活性线随着伤口愈合时间的增加而增加。因为CCA水凝胶中的胶原蛋白具有抗氧化作用，从而使得各个时间段的GSH-Px水平高于对照组，即使在正常组织中，GSH-Px水平在伤口愈合的晚期也远高于对照组(P<0.05)。

丙二醛(MDA)含量可间接反映组织的氧化损伤水平，因为过量的活性氧(ROS)会导致脂质过氧化作用，从而导致对细胞膜的氧化损伤和细胞死亡，脂质过度氧化的最终产物是戊二醛。如图D所示，在第3天，所有组的MDA含量随着伤口愈合时间的增加而降低，CCA水凝胶组的MDA含量均低于对照组(P<0.05)，第7天两组差距尤其明显，说明CCA水凝胶可保护伤口减小氧化损伤。

如图A、图C和图E所示，对照组和CCA水凝胶组的SOD的活性和CAT的活性，都是随着时间伤口愈合程度增加，活性水平也随之增加。由于水凝胶的抗氧化能力有助于减少炎症，在3天、7天和14天中，CCA水凝胶组的SOD和CAT活性水平均出现不同程度地增加，活性也始终高于对照组(P<0.05)，说明CCA水凝胶较好的抗氧化作用，可以明显得提高超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶的活性，可明显促进伤口愈合。

如图E所示，实验组与对照组的总抗氧化能力(T-AOC)的均随伤口愈合率的增大而逐渐增加，伤口愈合过程中，CCA水凝胶组的总抗氧化能力优于对照组，特别是7天和14天尤为明显，CCA水凝胶组小鼠伤口在7天后以及明显愈合，愈合率达到80％以上。因此可通过总抗氧化能力(T-AOC)推测判断伤口愈合的趋势，T-AOC水平越高，伤口愈合越快。

7)血清炎症因子检测分析

在第3、7和14天，处死每组小鼠前，进行摘眼球取血。离心(4℃，5000rpm，5分钟)收集血清，使用IL-6、IL-1β和TNF-α试剂盒(武汉伊莱瑞特公司)测量血清中IL-6、IL-1β以及TNF-α的含量。结果如图13所示。

IL-6的表达受到活性氧(ROS)的影响，ROS含量越多，则会促进IL-6的表达，而IL-6的表达又会促进促炎细胞因子TNF-α的表达，使得TNF-a的水平上升。因此TNF-a的水平与IL-6的趋势相似。如图13所示，TNF-a的水平与IL-6的走势大致相同，受CCA水凝胶的影响较大，与对照组有较为明显的差异。整体来看CCA水凝胶组的血清炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α水平均低于对照组。从而说明CCA水凝胶用于伤口愈合，可抑制促炎细胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α的表达，其中对IL-6和TNF-α的作用较为明显。

综上，在本实验利用单因素试验和响应面优化得到最佳提取工艺，条件为醋酸浓度0.42mol/L、酸解时间21h、液料比为58ml/g。通过紫外全波长扫描和红外光谱扫描初步可判断所提胶原蛋白类型为Ⅰ型且三螺旋结构没有被破坏；通过SDS-PAGE凝胶电泳推测酸法提取的胶原蛋白纯度较高；通过扫描电镜可知所得鳗鱼鱼鳔胶原蛋白电镜扫描图像呈现纤维状结构，这是胶原蛋白分子以一种特殊的方式排列聚集而形成的,通过这一特点可以判断所提的胶原蛋白具有三螺旋结构。经紫外全波长扫描、SDS-PAGE凝胶电泳、FT-IR和SEM分析证实提取的胶原为I型胶原蛋白，具有完整的三螺旋结构。这些性质决定了胶原蛋白的功能用途广泛。

本发明以鳗鱼鱼鳔胶原蛋白为主药，复合壳聚糖和海藻酸盐，用Ca²⁺交联制备水凝胶，SEM图像显示水凝胶具有高度多孔的结构。水凝胶结合了胶原蛋白伤口愈合功效，壳聚糖的抗菌功效，以及海藻酸盐与钙离子结合的凝胶性质，可使伤口处于湿润、透气、抗菌的微环境，能促进细胞增殖和迁移，从而促进伤口愈合。并通过小鼠实验证实了用鳗鱼鱼鳔胶原蛋白制备的CCA水凝胶敷料明显促进伤口愈合，减轻伤口红肿和炎症，皮肤修复完整疤痕较小，说明CCA复合水凝胶是是值得开发利用的用于促进伤口愈合的理想候选材料。

Claims

1.一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于包括如下步骤：

2)取经过预处理后的鳗鱼鱼鳔，放入乙酸溶液中，在24℃恒温摇床上进行酸解处理21h；取纱布过滤未酸解完全的鱼鳔，取滤液；将滤液装入透析袋置于纯水中透析3天，每天更换透析液2次，透析过程中对透析液温和搅拌，直到透析液pH显中性；然后对透析过的胶原蛋白进行冷冻干燥处理，即得酸溶性胶原蛋白，置于-20℃冰箱储存备用；

3)取步骤2制备得到的胶原蛋白，卡波姆，海藻酸钠；胶原蛋白用0.50mol/L的乙酸溶液超声溶解均匀，置于纯化水中透析至中性，取出胶原蛋白为原料液1；卡波姆加入纯化水和甘油，于60℃水浴锅中溶胀40min，再用0.01mol/L的NaOH溶液调节其PH为6.5-7，充分搅拌得原料液2；海藻酸钠加入纯化水充分溶胀，搅拌均匀得原料液3；将原料液1、2、3全部混合，充分搅拌均匀，放入4℃冰箱脱泡2h，由于溶胀使得凝胶液体积增大，共制得200ml凝胶液；

5)CCA水凝胶交联:将步骤3)制备得到的凝胶液倒入培养皿中，平铺均匀薄薄一层即可，放入4℃冰箱冷存2h后取出，将交联剂溶液倒入上述培养皿中，使之充分交联后，即得鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶，取出水凝胶片，用蒸馏水冲洗干净后，备用；

所述步骤2)中乙酸溶液的浓度为0.42mol/L；

所述步骤2)中乙酸溶液与预处理后的鳗鱼鱼鳔的液料比为58ml/g。

2.根据权利要求1所述一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于所述步骤1)中氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L。

3.根据权利要求1所述一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于所述步骤1)中正丁醇溶液的浓度为10％，单位g/ml。

4.根据权利要求1所述一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于所述步骤3)中胶原蛋白与卡波姆的重量比为4:3；所述胶原蛋白与海藻酸钠的重量比为1:3；所述胶原蛋白与甘油的重量比为1:1；所述海藻酸钠与蒸馏水的重量体积比g/ml为1:50。

5.根据权利要求1所述一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于所述步骤3)中原料液1的配制中胶原蛋白与乙酸溶液的重量体积比g/ml为1：65；所述原料液2的配制中卡波姆与纯化水的重量体积比g/ml为1:40，所述原料液2的配制中甘油与纯化水的重量体积比g/ml为1:30，所述原料液3的配制中，海藻酸钠与纯化水的重量体积比g/ml为3:55。

6.根据权利要求1所述一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于所述步骤4)中CaCl₂溶液的浓度为0.01g/ml，壳聚糖溶液的浓度为0.0075g/ml。

7.根据权利要求1所述一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于所述步骤4)中CaCl₂溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:1。

8.根据权利要求1所述一种制备鳗鱼鱼鳔胶原蛋白-壳聚糖-复合海藻酸钠水凝胶的方法，其特征在于所述步骤5)中凝胶液与交联剂溶液的体积比1:1。