CN113647602B - 酱油及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酱油及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：以禾本科植物的果实为原料，加水混合后进行酶法液化和糖化，制得糖化液和含蛋白的固体；将所述含蛋白的固体和水按1：(1～3)的质量比混合得第一混合液，在所述第一混合液中加入酱油曲和蛋白酶，在无盐条件下第一次发酵，得到第一发酵液，所述酱油曲的加入量为所述原料重量的4％～10％，所述蛋白酶的加入量为所述原料重量的0.1％～0.5％；以及将酱油曲和所述第一发酵液按1：(1～3)的质量比混合得第二混合液，在所述第二混合液中加入盐，进行第二次发酵，所述盐的加入量占所述第二混合液总重量的8％～13％；在第二次发酵过程中，加入所述糖化液和酒精。
Description
技术领域
本发明涉及调味品生产技术领域，特别是涉及一种酱油及其制备方法。
背景技术
酱油是以大豆、小麦为主要原料经微生物发酵制成的调味品。其中氨基酸态氮和谷氨酸含量是酱油品质的主要指示性指标之一，氨基酸提供酱油的鲜美味口感，其中的谷氨酸是主要呈味物质。但现有的酱油生产工艺下，曲料酶系在高盐发酵环境下酶活会被抑制导致酱油原料中的部分谷氨酰胺转化不够彻底，发酵程度不高。氨基酸态氮和谷氨酸含量仅为1.0g/100ml左右，酱油鲜味不足。
目前传统技术主要从四个方面来提高蛋白原料的发酵程度，以提升氨基酸态氮和谷氨酸含量：第一，补入外源酶制剂，例如以大豆、小麦等为主要原料在发酵过程中额外添加外源酶制剂如肽酶、谷氨酰胺酶、纤维素酶、果胶酶等，来提高酱油发酵过程蛋白类物质的酶解程度，进而提高氨基酸态氮含量，谷氨酸含量，增加酱油鲜度，从而得到香味鲜美、营养丰富的酱油。第二，多菌种发酵共同作用，利用多菌种共同发酵作用将原料中的蛋白质及淀粉类物质充分分解，进一步提高酱油发酵过程中大分子蛋白质和淀粉类物质的降解程度，在不添加味精的前提下提高酱油的氨基酸态氮和还原糖含量，有助于丰富酱油风味。第三，多菌种发酵共同作用结合补入外源酶制剂，采用米曲酶和黑曲霉混合制曲，然后制曲结束后加入碱性蛋白酶水解成曲，促进多肽的生成，发酵时再通过添加谷氨酰胺酶、乳酸菌、酵母菌混合发酵，增加酱油风味产生的微生物菌种，最后通过磁场作用，促进酱油中的风味物质的生成。第四，其他方式，例如通过对黄豆进行预处理来提高酱油氨基酸得率，或者，通过对发酵工艺、调配、灭菌等环节进行优化，来提高原料的利用率和氨基酸生成率。
但是，传统技术生产的酱油中风味物质尤其是谷氨酸含量仍比较低，影响酱油的香气。
发明内容
基于此，有必要提供能够一种酱油及其制备方法，显著提升酱油制备中的谷氨酸得率。
本发明的一个方面，提供了一种酱油的制备方法，包括以下步骤：
以禾本科植物的果实为原料，加水混合后进行酶法液化和糖化，制得糖化液和含蛋白的固体；
将所述含蛋白的固体和水按1：(1～3)的质量比混合得第一混合液，在所述第一混合液中加入酱油曲和蛋白酶，在无盐条件下第一次发酵，得到第一发酵液，所述酱油曲的加入量为所述原料重量的4％～10％，所述蛋白酶的加入量为所述原料重量的0.1％～0.5％；以及
将酱油曲和所述第一发酵液按1：(1～3)的质量比混合得第二混合液，在所述第二混合液中加入盐，进行第二次发酵，所述盐的加入量占所述第二混合液总重量的8％～13％；
在第二次发酵的过程中，加入所述糖化液和酒精。
在其中一个实施例中，所述原料和水的质量比为1：(2～4)。
在其中一个实施例中，所述酶法液化和糖化的方法包括：
70℃～95℃条件下，在所述原料和水的混合液中加入0.1wt％～0.3wt％的液化酶和CaCl2酶解1h～3h，降温至40℃～70℃，加入0.1wt％～0.3wt％的糖化酶酶解1h～3h。
在其中一个实施例中，第一次发酵中，发酵温度为30℃～50℃，发酵时间为18h～24h。
在其中一个实施例中，所述蛋白酶为风味蛋白酶和复合蛋白酶的组合物，所述风味蛋白酶和复合蛋白酶的质量比为1:(1～3)。
在其中一个实施例中，在第二次发酵的第1～12天内，加入一次所述糖化液，加入的所述糖化液的总量为发酵体系总重量的2wt％～5wt％。
在其中一个实施例中，在第二次发酵过程中，加入的酒精由所述糖化液发酵产生。
在其中一个实施例中，在第二次发酵过程中，每隔6天加入一次酒精，加入次数为3～5次，加入的酒精总量为发酵体系总重量的1wt％～3wt％。
在其中一个实施例中，第二次发酵中，发酵温度为30℃～50℃，发酵时间为14天～17天。
本发明的又一个方面，还提供一种由所述酱油的制备方法制备得到的酱油。
与现有技术相比，本发明具有如下的技术效果：
本发明提供的酱油的制备方法，利用酱油曲通过无盐发酵和低盐发酵两次发酵的方式将原料中的谷氨酸充分发酵出来，极大地发挥了酱油曲酶系作用，提高了蛋白质和淀粉的酶解程度，显著提升了谷氨酸得率，得到高谷氨酸含量的酱油，同时缩短了发酵周期。
附图说明
图1为一实施方式的酱油的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
除了在操作实施例中所示以外或另外表明之外，所有在说明书和权利要求中表示成分的量、物化性质等所使用的数字理解为在所有情况下通过术语“约”来调整。例如，因此，除非有相反的说明，否则上述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均是近似值，本领域的技术人员能够利用本文所公开的教导内容寻求获得的所需特性，适当改变这些近似值。用端点表示的数值范围的使用包括该范围内的所有数字以及该范围内的任何范围，例如，1至5包括1、1.1、1.3、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等等。
本发明实施例提供一种酱油的制备方法，包括如下步骤：
S10，以禾本科植物的果实为原料，加水混合后进行酶法液化和糖化，制得糖化液和含蛋白的固体；
S20，将所述含蛋白的固体和水按1：(1～3)的质量比混合得第一混合液，在所述第一混合液中加入酱油曲和蛋白酶，在无盐条件下第一次发酵，得到第一发酵液，所述酱油曲的加入量为原料重量的4wt％～10wt％，所述蛋白酶的加入量为原料重量的0.1wt％～0.5wt％；以及
S30，将酱油曲和所述第一发酵液按1：(1～3)的质量比混合得第二混合液，在所述第二混合液中加入盐，进行第二次发酵，所述盐的加入量占所述第二混合液总重量的8％～13％；
在第二次发酵的过程中，加入所述糖化液和酒精。
本发明实施例提供的酱油的制备方法，首先利用酱油曲本身酶系在无盐条件下将原料蛋白质中的谷氨酸充分发酵出来，并且复合强化使用一定比例的外源蛋白酶来提升蛋白酶解及呈味效果，充分发挥体系中的酶系作用促进多肽、氨基酸、谷氨酸等生成，尤其是谷氨酸的得率得到显著提升，酱油曲自身酶系也非常丰富，避免了使用纯品酶制剂成本高、酶切位点局限等劣势。
然后，将无盐条件下发酵得到的第一发酵液再与酱油曲混合进行低盐条件下的发酵，并在发酵过程中补加糖化液及酒精，提升酱油整体香气、色泽、风味及防腐能力，获得一种富含谷氨酸的风味酱油。
本发明实施例提供的酱油的制备方法，利用酱油曲通过无盐发酵和低盐发酵两次发酵的方式将原料中的谷氨酸充分发酵出来，极大地发挥了酱油曲酶系作用，提高了蛋白质和淀粉的酶解程度，显著提升了谷氨酸得率，得到高谷氨酸含量的酱油，同时缩短了发酵周期。
所述禾本科植物果实可以包括但不限于高梁、大米、小麦以及它们的组合。
所述原料和水的质量比可以为1：(2～4)之间的任意值，例如还可以为1：2.5，1:3，1:3.5。
在一些实施方式中，步骤S10中，所述酶法液化和糖化的方法包括：
70℃～95℃条件下，在所述原料和水的混合液中加入0.1wt％～0.3wt％的液化酶和CaCl2酶解1h～3h，降温至40℃～70℃，加入0.1wt％～0.3wt％的糖化酶酶解1h～3h。
通过上述酶法液化和糖化方法，可以使原料中的葡萄糖充分液化糖化，得到富含葡萄糖的糖化液。
所述液化酶和糖化酶均为食品级酶制剂。
在一些实施方式中，步骤S10之前还包括，将禾本科植物的果实进行预处理的步骤。所述预处理的步骤包括将禾本科植物的果实进行炒制，炒制温度可以为80℃～110℃，炒制时间可以为20min～50min。
原料经过酶法液化和糖化后，得到富含葡萄糖的糖化液和富含蛋白的固体的混合物，通过固液分离分别得到糖化液和含蛋白的固体。固液分离可以包括任意常规的技术手段，例如过滤、离心、静置沉淀等。
在一些实施方式中，步骤S20中所述蛋白酶为风味蛋白酶和复合蛋白酶的组合物。优选地，所述风味蛋白酶和复合蛋白酶的质量比为1:(1～3)。所述风味蛋白酶又称为风味酶，是由米曲霉菌株发酵提纯、复配而成的酶制剂。所述复合蛋白酶是枯草杆菌(Bsubtilis)深层液体发酵产生，经浓缩提取精制复合而成，是为水解蛋白质而研制的杆菌蛋白酶复合体。
步骤S20中所述酱油曲的加入量还可以独立选自5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％。
步骤S20中所述蛋白酶的加入量还可以独立选自0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％。
在一些优选实施方式中，步骤S20中，第一次发酵温度为30℃～50℃，发酵时间为18h～24h；
步骤S20中第一次发酵温度还可以独立选自35℃、40℃、45℃，第一次发酵时间还可以独立选自19h、20h、21h、22h、23h。
步骤S30中所述酱油曲以黄豆(或豆粕)和小麦为原料，按照常规酱油制曲方法制备得到。
步骤S30中酱油曲和所述第一发酵液的质量比还可以为1：1.5，1:2，1:2.5。
步骤S30中所述盐的加入量还可以为8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％。步骤S30中发酵过程为低盐发酵，盐的加入量超过13wt％，则会导致谷氨酸得率降低。所述盐的重量百分比以第二混合液的总重量计。
在一些实施方式中，在步骤S30第二次发酵的第1～12天内，加入一次所述糖化液，加入的所述糖化液的总量为发酵体系总重量的2wt％～5wt％。
在一些优选实施方式中，在步骤S30第二次发酵过程中，加入的酒精由所述糖化液发酵产生。通过源自原料的自产酒精进行防腐，可以提高原料利用率，同时缩短发酵时间。
在一些优选实施方式中，在步骤S30第二次发酵过程中，每隔6天加入一次酒精，加入次数为3～5次，加入的酒精的总量为发酵体系总重量的1wt％～3wt％。
在一些优选实施方式中，所述步骤S30中，第二次发酵温度为30℃～50℃，第二次发酵时间为14天～17天；
步骤S30中第二次发酵温度还可以独立选自35℃、40℃、45℃，第二次发酵时间还可以独立选自15天、16天。
本发明的还一方面，提供一种由上述酱油的制备方法制备得到的酱油。
以下为具体实施例。旨在对本发明做进一步的详细说明，以帮助本领域技术及研究人员进一步理解本发明，有关技术条件等并不构成对本发明的任何限制。在本发明权利要求范围内所做的任何形式的修改，均在本发明权利要求的保护范围之内。以下实施例和对比例用到的试剂为：
液化酶，购自：诺维信高温淀粉酶SC；
糖化酶，购自：诺维信精制糖化酶Amylase AG；
风味蛋白酶，购自：诺维信风味蛋白酶Flavourzyme；
复合蛋白酶，购自：诺维信复合蛋白酶Protamex；
干酵母，购自：安琪酿酒活性干酵母；
酱油曲，以黄豆和小麦粉为原料，按常规酱油制曲方法制得酱油曲。
请参阅图1，对本发明制备酱油的一种技术方案进行说明。本发明制备酱油的一种技术方案中，包括无盐发酵和有盐发酵两步发酵，低盐发酵过程中补入糖化液和酒精，且糖化液和酒精均源自原料小麦。以下对制备实施例1～5进行说明。
实施例1
1、原料预处理
取小麦100份，将小麦粉进行炒制，温度105℃左右，炒制30min。
2、酶法液化和糖化
取炒好的小麦与水按照1:3的质量比进行混合，加热至90℃，加入0.2％液化酶、0.15％CaCl2，反应1.5h。然后降温至65℃，加入0.15％糖化酶，反应3h。
3、固液分离
酶法液化和糖化结束后，反应液进行离心分离，得到富含葡萄糖的糖化液和富含蛋白的固体。
4、糖化液发酵产酒精
取部分糖化液加入0.3wt％(占糖化液重量百分比)的干酵母进行发酵，产生酒精。
5、无盐发酵
将含蛋白的固体与水按照1:2的质量比进行混合，添加5份酱油曲，0.030份风味蛋白酶，和0.070份复合蛋白酶，在45℃温度下反应22h。
6、低盐发酵
将酱油曲和步骤5中的发酵液按照1:2的质量比进行混合，得到混合液，再加入10wt％(发酵体系重量百分比)的食盐，40℃条件下发酵。
发酵的第1d，补加3wt％(发酵体系重量百分比)糖化液和1wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第5天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第11天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。
发酵17天后放油获得澄清酱油。
实施例2
1、原料预处理
取小麦100份，将小麦粉进行炒制，温度105℃左右，炒制30min。
2、酶法液化和糖化
取炒好的小麦与水按照1:3的质量比进行混合，加热至90℃，加入0.2％液化酶、0.15％CaCl2，反应1.5h。然后降温至65℃，加入0.15％糖化酶，反应3h。
3、固液分离
酶法液化和糖化结束后，反应液进行离心分离，得到富含葡萄糖的糖化液和富含蛋白的固体。
4、糖化液发酵产酒精
取部分糖化液加入0.3wt％(占糖化液重量百分比)的干酵母进行发酵，产生酒精。
5、无盐发酵
将含蛋白的固体与水按照1:2的质量比进行混合，添加7份酱油曲，0.075份风味蛋白酶和0.125份复合蛋白酶，在50℃温度下反应18h。
6、低盐发酵
将酱油曲和步骤5中的发酵液按照1:2的质量比进行混合，得到混合液，再加入10wt％(发酵体系重量百分比)的食盐，45℃条件下发酵。
发酵的第1d，补加3wt％(发酵体系重量百分比)糖化液和1wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第5天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第11天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。
发酵14天后放油获得澄清酱油。
实施例3
1、原料预处理
取小麦100份，将小麦粉进行炒制，温度105℃左右，炒制30min。
2、酶法液化和糖化
取炒好的小麦与水按照1:3的质量比进行混合，加热至90℃，加入0.2％液化酶、0.15％CaCl2，反应1.5h。然后降温至65℃，加入0.15％糖化酶，反应3h。
3、固液分离
酶法液化和糖化结束后，反应液进行离心分离，得到富含葡萄糖的糖化液和富含蛋白的固体。
4、糖化液发酵产酒精
取部分糖化液加入0.3wt％(占糖化液重量百分比)的干酵母进行发酵，产生酒精。
5、无盐发酵
将含蛋白的固体与水按照1:2的质量比进行混合，添加10份酱油曲，0.030份风味蛋白酶和0.070份复合蛋白酶，在30℃温度下反应24h。
6、低盐发酵
将酱油曲和步骤5中的发酵液按照1:2的质量比进行混合，得到混合液，再加入13wt％(发酵体系重量百分比)的食盐，30℃条件下发酵。
发酵的第1d，补加3wt％(发酵体系重量百分比)糖化液和1wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第5天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第11天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。
发酵17天后放油获得澄清酱油。
实施例4
1、原料预处理
取小麦100份，将小麦粉进行炒制，温度105℃左右，炒制30min。
2、酶法液化和糖化
取炒好的小麦与水按照1:3的质量比进行混合，加热至90℃，加入0.2％液化酶、0.15％CaCl2，反应1.5h。然后降温至65℃，加入0.15％糖化酶，反应3h。
3、固液分离
酶法液化和糖化结束后，反应液进行离心分离，得到富含葡萄糖的糖化液和富含蛋白的固体。
4、糖化液发酵产酒精
取部分糖化液加入0.3wt％(占糖化液重量百分比)的干酵母进行发酵，产生酒精。
5、无盐发酵
将含蛋白的固体与水按照1:2的质量比进行混合，添加4份酱油曲，0.125份风味蛋白酶和0.375份复合蛋白酶，在50℃温度下反应18h。
6、低盐发酵
将酱油曲和步骤5中的发酵液按照1:2的质量比进行混合，得到混合液，再加入8wt％(发酵体系重量百分比)的食盐，50℃条件下发酵。
发酵的第1d，补加3wt％(发酵体系重量百分比)糖化液和1wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第5天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第11天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。
发酵14天后放油获得澄清酱油。
实施例5
1、原料预处理
取小麦100份，将小麦粉进行炒制，温度105℃左右，炒制30min。
2、酶法液化和糖化
取炒好的小麦与水按照1:3的质量比进行混合，加热至90℃，加入0.2％液化酶、0.15％CaCl2，反应1.5h。然后降温至65℃，加入0.15％糖化酶，反应3h。
3、固液分离
酶法液化和糖化结束后，反应液进行离心分离，得到富含葡萄糖的糖化液和富含蛋白的固体。
4、糖化液发酵产酒精
取部分糖化液加入0.3wt％(占糖化液重量百分比)的干酵母进行发酵，产生酒精。
5、无盐发酵
将含蛋白的固体与水按照1:2的质量比进行混合，添加5份酱油曲，0.030份风味蛋白酶和0.070份复合蛋白酶，在50℃温度下反应16h。
6、低盐发酵
将酱油曲和步骤5中的发酵液按照1:2的质量比进行混合，得到混合液，再加入8wt％(发酵体系重量百分比)的食盐，50℃条件下发酵。
发酵的第1d，补加3wt％(发酵体系重量百分比)糖化液和1wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第5天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第11天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。
发酵14天后放油获得澄清酱油。
对比例1
1、原料预处理
取小麦100份，将小麦粉进行炒制，温度105℃左右，炒制30min。
2、酶法液化和糖化
取炒好的小麦与水按照1:3的质量比进行混合，加热至90℃，加入0.2％液化酶、0.15％CaCl2，反应1.5h。然后降温至65℃，加入0.15％糖化酶，反应3h。
3、固液分离
酶法液化和糖化结束后，反应液进行离心分离，得到富含葡萄糖的糖化液和富含蛋白的固体。
4、糖化液发酵产酒精
取部分糖化液加入0.3wt％(占糖化液重量百分比)的干酵母进行发酵，产生酒精。
5、蛋白质酶解
将含蛋白的固体与水按照1:2的质量比进行混合，添加风味蛋白酶0.3份和复合蛋白酶0.7份，在45℃温度下反应18h，得到酶解液。
6、低盐发酵
将酱油曲和步骤5中的酶解液按照1:2的质量比进行混合，得到混合液，再加入18wt％(发酵体系重量百分比)的食盐，25℃条件下发酵。
发酵的第1d，补加3wt％(发酵体系重量百分比)糖化液和1wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第5天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。发酵的第11天，补加0.5wt％(发酵体系重量百分比)的酒精。
发酵30天后放油获得澄清酱油。
实施例1～5及对比例1的制备方法中的工艺参数列表如下表1：
表1
测试实施例1～5酱油制备过程中步骤5无盐发酵阶段结束后的相关风味物质指标以及对比例1中酱油制备过程中步骤5蛋白质酶解阶段结束后的相关风味物质指标，结果列于表2中：
其中，相关风味物质的测定方法如下：
(1)总酸、氨基氮：参照GB/T 5009.39-2003测得。
(2)谷氨酸：使用SBA-40X三通道生物传感分析仪测定。
表2
将实施例1～5以及对比例1最终制得的酱油进行相关风味物质指标的测定，测试结果如下表3所示：
其中，相关风味物质的测定方法如下：
(1)总酸、氨基氮：参照GB/T 5009.39-2003测得。
(2)谷氨酸：使用SBA-40X三通道生物传感分析仪测定。
表3
根据表2和表3可知，实施例1～5通过无盐发酵和有盐发酵两步发酵，获得的酱油的风味更鲜甜协调，而对比例1只进行低盐发酵一步发酵获得的酱油的风味鲜度一般，且口味稍咸。而且，通过实施例1～5的对比发现，实施例1～4获得的酱油口感比实施例5获得的酱油的口感更佳，说明，无盐发酵阶段，当酱油曲的加入量和蛋白酶的加入量在一定范围内，优选地，无盐发酵阶段发酵时间为18h～24h。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (3)
1.一种酱油的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以禾本科植物的果实为原料，加水混合后进行酶法液化和糖化，制得糖化液和含蛋白的固体，所述原料和水的质量比为1：(2～4)；
将所述含蛋白的固体和水按1：(1～3)的质量比混合得第一混合液，在所述第一混合液中加入酱油曲和蛋白酶，在无盐条件下第一次发酵，得到第一发酵液，所述酱油曲的加入量为所述原料重量的4％～10％，所述蛋白酶的加入量为所述原料重量的0.1％～0.5％，所述蛋白酶为风味蛋白酶和复合蛋白酶的组合物，所述风味蛋白酶和所述复合蛋白酶的质量比为1:(1～3)；以及
将酱油曲和所述第一发酵液按1：(1～3)的质量比混合得第二混合液，在所述第二混合液中加入盐，进行第二次发酵，所述盐的加入量占所述第二混合液总重量的8％～13％；
其中，所述酶法液化和糖化的方法包括：
70℃～95℃条件下，在所述原料和水的混合液中加入0.1wt％～0.3wt％的液化酶和CaCl2酶解1h～3h，降温至40℃～70℃，加入0.1wt％～0.3wt％的糖化酶酶解1h～3h；
第一次发酵中，发酵温度为30℃～50℃，发酵时间为18h～24h；
在第二次发酵的第1～12天内，加入一次所述糖化液，加入的所述糖化液的总量为发酵体系总重量的2wt％～5wt％，在第二次发酵过程中，每隔6天加入一次酒精，加入次数为3～5次，加入的酒精总量为发酵体系总重量的1wt％～3wt％；
第二次发酵中，发酵温度为30℃～50℃，发酵时间为14天～17天。
2.根据权利要求1所述的酱油的制备方法，其特征在于，在第二次发酵过程中，加入的酒精由所述糖化液发酵产生。
3.一种由权利要求1～2任一项所述酱油的制备方法制备得到的酱油。
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