CN113640234A - 一种蝙蝠草多糖的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蝙蝠草多糖的含量测定方法，先使用甲醇水溶液进行低功率超声处理蝙蝠草粉末，去除还原糖、蛋白质等物质，避免还原糖等物质在测定多糖含量时对测定结果造成干扰，提高测定方法的精确性，再用水作为溶剂高功率超声处理，得到多糖，最后再用苯酚‑硫酸测定多糖含量；本发明的供试品溶液制备方法，步骤简单，仅通过甲醇水溶液超声处理，即可获得纯度较高的多糖；本发明的测定方法能够精确地检测蝙蝠草多糖的含量，专属性强，能够保证用蝙蝠草制备的药品质量可控，为建立蝙蝠草质量标准奠定基础，为蝙蝠草质量控制提供参考，而且本发明的蝙蝠草多糖的含量测定方法，操作简单、方便、科学。
Description
技术领域
本发明涉及中药化学分析技术领域，特别涉及一种蝙蝠草多糖的含量测定方法。
背景技术
蝙蝠草(学名：Christia vespertilionis(L.f.)Bahn.f.)，是豆科、蝙蝠草属多年生直立草本，是我国壮族的传统民族草药，主要分布于我国广西、广东和海南岛。该种全草可入药，味甘、微辛，平，具有舒筋活血，调经祛瘀等作用，可用于治疗痛经，跌打损伤，风湿骨痛，毒蛇咬伤，痈疮。当地民间以其全草代茶饮，有养生保健功效，用水煎服主治肺结核、支气管炎、扁桃体炎和痈肿疮毒。
多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，多糖是生命活动的基本物质，所有动植物生命体都含有多糖，不能准确测定多糖的含量，就无法在生产和使用中保证药材产品的质量，药材制品的疗效也就得不到保证。
2016年《沈阳药科大学学报》第2期记载由范海涛等人撰写的《蝙蝠草多糖的提取和分离及其活性测定》，公开了蝙蝠草多糖具有一定的清除DPPH自由基的能力和免疫促进作用。但蝙蝠草中目前对蝙蝠草多糖的研究少，现有文献还没有蝙蝠草多糖含量测定的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提出一种蝙蝠草多糖的含量测定方法。
本发明所述一种蝙蝠草多糖的含量测定方法，包括以下步骤:
S1.对照品溶液的制备：精密称定D-无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.1016mg D-无水葡萄糖的对照品溶液；
S2.供试品溶液的制备：精密称定蝙蝠草粉末，置具塞锥形瓶中，加入甲醇水溶液，密塞，低功率超声处理10-15min，离心，弃上清，取沉淀置具塞锥形瓶中，向沉淀中加水，密塞，高功率超声处理10-30min，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
S3.测定：取供试品溶液，采用苯酚-硫酸法，在485-495nm波长处进行测定吸光度；
S4.标准曲线的绘制：取对照品溶液按照步骤S3的方法，采用序列进样法依次进样，以进样浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线；
S5.多糖含量的计算：根据步骤S4所得的标准曲线，计算步骤S3中供试品的多糖含量。
进一步的，所述蝙蝠草粉末为采收新鲜蝙蝠草，去除杂质，干燥粉碎所得或将蝙蝠草干燥全草粉碎所得。
进一步的，步骤S2中，蝙蝠草粉末与甲醇水溶液的质量体积比为1g：15-30ml；所述甲醇水溶液的体积浓度为60-65％。
进一步的，步骤S2中，蝙蝠草粉末与甲醇水溶液的质量体积比为1g：15ml。
进一步的，步骤S2中，沉淀与水的质量体积比为1g：20-60ml。
进一步的，步骤S2中，沉淀与水的质量体积比为1g：20ml。
进一步的，所述低功率超声处理的超声功率为200-300W，超声频率为25-28kHz，超声温度为25-35℃。
进一步的，所述低功率超声处理的超声功率为250W，超声频率为28kHz，超声温度为30℃。
进一步的，所述离心为在6000-8000r/min，离心3-5min。
进一步的，所述高功率超声处理的超声功率为600-650W，超声频率为33-40kHz，超声温度为35-40℃。
进一步的，所述高功率超声处理的超声功率为600W，超声频率为40kHz，超声温度为40℃。
进一步的，所述苯酚-硫酸法为向供试品溶液中，依次加入水、苯酚溶液、浓硫酸，静置，于60-70℃水浴中加热10-15min后，使用冰水迅速冷却至室温，精密吸取供试品溶液，在485-495nm波长处进行测定。
进一步的，所述苯酚-硫酸法为向0.1ml供试品溶液中，依次加入水1.9ml，体积浓度为5％的苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，于60℃水浴中加热15min后，使用冰水迅速冷却至室温，精密吸取供试品溶液2ml，在487nm波长处进行测定。
进一步的，所述浓硫酸为优级纯硫酸。
进一步的，所述冰水为蒸馏水和冰按3-4:1的质量比混合所得。
进一步的，本发明还提供所述蝙蝠草多糖的含量测定方法在测定蝙蝠草药材中蝙蝠草多糖的含量中的应用。
进一步的，本发明所述蝙蝠草多糖的含量测定方法的检出限，按干燥品计算，为含多糖(C6H10O5)n不得少于171.46mg/g。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种蝙蝠草多糖的含量测定方法，先使用甲醇水溶液进行低功率超声处理蝙蝠草粉末，去除还原糖、蛋白质等物质，避免还原糖等物质在测定多糖含量时对测定结果造成干扰，提高测定方法的精确性，再用水作为溶剂高功率超声处理，得到多糖，最后再用苯酚-硫酸测定多糖含量；本发明的供试品溶液制备方法，步骤简单，仅通过甲醇水溶液超声处理，即可获得纯度较高的多糖；本发明的测定方法能够精确地检测蝙蝠草多糖的含量，专属性强，能够保证用蝙蝠草制备的药品质量可控，为建立蝙蝠草质量标准奠定基础，为蝙蝠草质量控制提供参考，而且本发明的蝙蝠草多糖的含量测定方法，操作简单、方便、科学。
附图说明
图1为本发明实施例3的标准曲线；
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种蝙蝠草多糖的含量测定方法，包括以下步骤：
S1.对照品溶液的制备：精密称定D-无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.1016mg D-无水葡萄糖的对照品溶液；
S2.供试品溶液的制备：精密0.5g称定蝙蝠草粉末(202008001，过二号筛)，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度为65％的甲醇水溶液7.5ml，密塞，在超声功率为250W，超声频率为28kHz，超声温度为30℃的超声条件下处理10min，在8000r/min，离心3min，弃上清，取1g沉淀置具塞锥形瓶，加水20ml，密塞，在超声功率为600W，超声频率为40kHz，超声温度为40℃的超声条件下处理30min，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
S3.测定：取0.1ml供试品溶液，依次加入水1.9ml，体积浓度为5％的苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，于60℃水浴中加热15min后，使用冰水迅速冷却至室温，精密吸取供试品溶液2ml，在487nm波长处进行测定；
S4.标准曲线的绘制：取对照品溶液按照步骤S3的方法，采用序列进样法依次进样0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，以进样浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线；
S5.多糖含量的计算：根据步骤S4所得的标准曲线，计算步骤S3中供试品的多糖含量。
实施例2
一种蝙蝠草多糖的含量测定方法，包括以下步骤：
S1.对照品溶液的制备：精密称定D-无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.1016mg D-无水葡萄糖的对照品溶液；
S2.供试品溶液的制备：精密0.5g称定蝙蝠草粉末(202008001，过二号筛)，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度为60％的甲醇水溶液15ml，密塞，在超声功率为300W，超声频率为25kHz，超声温度为25℃的超声条件下处理15min，在8000r/min，离心3min，弃上清，取1g沉淀置具塞锥形瓶中，加水20ml，密塞，在超声功率为650W，超声频率为33kHz，超声温度为35℃的超声条件下处理30min，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
S3.测定：取0.1ml供试品溶液，依次加入水1.9ml，体积浓度为5％的苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，于70℃水浴中加热15min后，使用冰水迅速冷却至室温，精密吸取供试品溶液2ml，在487nm波长处进行测定；
S4.标准曲线的绘制：取对照品溶液按照步骤S3的方法，采用序列进样法依次进样0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，以进样浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线；
S5.多糖含量的计算：根据步骤S4所得的标准曲线，计算步骤S3中供试品的多糖含量。
对比例1
一种蝙蝠草多糖的含量测定方法，包括以下步骤：
S1.对照品溶液的制备：精密称定D-无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.1016mg D-无水葡萄糖的对照品溶液；
S2.供试品溶液的制备：精密0.5g称定蝙蝠草粉末(202008001，过二号筛)，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度为65％的甲醇水溶液25ml，密塞，在超声功率为180W，超声频率为28kHz，超声温度为60℃的超声条件下处理40min，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
S3.测定：取0.1ml供试品溶液，依次加入水1.9ml，体积浓度为5％的苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，于60℃水浴中加热15min后，使用冰水迅速冷却至室温，精密吸取供试品溶液2ml，在487nm波长处进行测定；
S4.标准曲线的绘制：取对照品溶液按照步骤S3的方法，采用序列进样法依次进样0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，以进样浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线；
S5.多糖含量的计算：根据步骤S4所得的标准曲线，计算步骤S3中供试品的多糖含量。
对比例2
一种蝙蝠草多糖的含量测定方法，包括以下步骤：
S1.对照品溶液的制备：精密称定D-无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.1016mg D-无水葡萄糖的对照品溶液；
S2.供试品溶液的制备：精密0.5g称定蝙蝠草粉末(202008001，过二号筛)，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度为65％的甲醇水溶液7.5ml，密塞，在超声功率为600W，超声频率为48kHz，超声温度为40℃的超声条件下处理10min，在8000r/min，离心3min，弃上清，取1g沉淀置具塞锥形瓶中，加水20ml，密塞，在超声功率为250W，超声频率为28kHz，超声温度为30℃的超声条件下处理30min，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
S3.测定：取0.1ml供试品溶液，依次加入水1.9ml，体积浓度为5％的苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，于60℃水浴中加热15min后，使用冰水迅速冷却至室温，精密吸取供试品溶液2ml，在487nm波长处进行测定；
S4.标准曲线的绘制：取对照品溶液按照步骤S3的方法，采用序列进样法依次进样0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，以进样浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线；
S5.多糖含量的计算：根据步骤S4所得的标准曲线，计算步骤S3中供试品的多糖含量。
取实施例1-2和对比例1-2制备所得的供试品溶液，记录多糖含量的测定结果，并用斐林试剂和双缩脲试剂鉴别还原糖和蛋白质，记录加入样品后滴定至斐林试剂中的蓝色消失所消耗的葡萄糖标准溶液体积和双缩脲试剂反应后的溶液颜色，结果见表1；
表1
| 多糖含量(mg/g) | 样品体积(mL) | 颜色 | |
| 实施例1 | 202.54 | 25.27 | 淡紫色 |
| 实施例2 | 201.72 | 24.83 | 淡紫色 |
| 对比例1 | 223.56 | 15.58 | 紫色 |
| 对比例2 | 148.41 | 16.39 | 深紫色 |
由实验数据可知，本发明制备所得的蝙蝠草供试品溶液的多糖含量高，再结合斐林试剂和双缩脲试剂的检测结果可以看出，与实施例相比，对比例1中未去除还原糖的干扰，导致实际测定的多糖含量偏高，而且还含有一定量的蛋白质；对比例2中未能有效提取多糖，且还原糖和蛋白质含量较高；表示本发明供试品溶液制备方法，可以有效去除还原糖和蛋白质，本发明方法可以有效测定蝙蝠草的多糖含量。
实施例3线性范围考察
取对照品溶液(0.1016mg/ml)，采用序列进样法依次进样0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，以进样浓度(mg/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
表2
结果表明蝙蝠草多糖在0.0125～0.01250mg/ml范围内线性关系良好。
实施例4提取条件考察
对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加纯水制成每1ml含0.1016mg的溶液，即得。
精密称取蝙蝠草粉末(202008001，过二号筛)0.5002g，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度为65％的甲醇水溶液7.5ml，密塞，超声处理(功率250W，频率28kHz，30℃)处理10min，在8000r/min，离心3min，弃上清，取沉淀1g置具塞锥形瓶中，分别加入纯水20ml、40ml、60ml，超声处理(功率600W，频率40kHz，40℃)10min、20min、30min，以溶剂补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液0.1ml于10ml试管中，依次加入纯水1.9ml，5％苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，分别于60℃水浴中加热显色15min，冰水迅速冷却至室温，以487nm作为检测波长，重复测定3次，计算RSD值；
当检测项目为提取时间时，纯水用量为20ml；当检测项目为纯水用量时，提取时间为30min；
表3
结果显示，本发明蝙蝠草多糖提取方法采用的提取时间和纯水用量，均能提取出较高含量的多糖含量，其中，提取时间30min和纯水用量20ml的多糖的提取率最高。
实施例5方法学考察
5.1试剂准备
对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加纯水制成每1ml含0.1016mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：精密称取蝙蝠草粉末(202008001，过二号筛)0.5002g，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度为65％的甲醇水溶液7.5ml，密塞，超声处理(功率250W，频率28kHz，30℃)处理10min，在8000r/min，离心3min，弃上清，取沉淀1g置具塞锥形瓶中，加入纯水20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz，40℃)30min，以溶剂补足减失的重量，滤过，取续滤液。
5.2耐用性考察
精密量取续滤液0.1ml于10ml试管中，依次加入纯水1.9ml，5％苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，分别于60℃水浴中加热显色15min，冰水迅速冷却至室温，分别以485nm、487nm、495nm作为检测波长，重复测定3次，计算RSD值；
表4
| 波长 | 1 | 2 | 3 | 平均吸光值 | RSD |
| 485nm | 0.5034 | 0.5033 | 0.5037 | 0.5034 | 0.0413％ |
| 487nm | 0.5126 | 0.5124 | 0.5127 | 0.5125 | 0.0298％ |
| 495nm | 0.4753 | 0.4751 | 0.4756 | 0.4753 | 0.0529％ |
结果显示，波长在485-495nm的范围内波动对测定结果的影响不大，其中在487nm处测定的RSD最小，故确定487nm为最佳测定波长。
5.3精密度考察
精密量取续滤液0.1ml于10ml试管中，依次加入纯水1.9ml，5％苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，分别于60℃水浴中加热显色15min，冰水迅速冷却至室温，以487nm作为检测波长，重复测定6次，计算RSD值。
表5
结果显示，本发明蝙蝠草多糖含量测定方法的RSD值为0.0410％，表明本发明方法的仪器精密度良好。
5.4稳定性考察
精密量取续滤液0.1ml于10ml试管中，依次加入纯水1.9ml，5％苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，分别于60℃水浴中加热显色15min，冰水迅速冷却至室温，以487nm作为检测波长，分别在不同时间重复测定6次，计算RSD值。
表6
结果显示，本发明蝙蝠草多糖含量测定方法在不同时间进行测定的RSD值为0.0331％，表明本发明方法的稳定性良好。
5.5重复性考察
分别精密称取同批次蝙蝠草粉末6份，按供试品制备方法项下方法分别制备供试品溶液，分别精密量取续滤液0.1ml于10ml试管中，依次加入纯水1.9ml，5％苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，分别于60℃水浴中加热显色15min，冰水迅速冷却至室温，以487nm作为检测波长测定6次，计算RSD值。
表7
结果显示，本发明蝙蝠草多糖含量测定方法的RSD值为0.8372％，表明本方法重复性良好。
5.6加样回收率考察
分别精密称取同批次蝙蝠草粉末6份，按供试品制备方法项下方法分别制备供试品溶液，精密量取续滤液0.1ml于10ml试管中，依次加入，对照品溶液(0.1016mg/ml)0.31ml，纯水1.6ml，5％苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，分别于60℃水浴中加热显色15min，冰水迅速冷却至室温，以487nm作为检测波长测定6次，计算回收率。
表8
结果显示，本发明蝙蝠草多糖含量测定方法的加样回收率为97.91-103.14％，表示本发明方法的回收率高。
5.7含量测定
精密称取不同批次的蝙蝠草药材粉末各2份(202008001-202008010，过二号筛)，每份约0.5g，按供试品制备方法项下方法制备供试品溶液，测定供试品中多糖吸光值，计算样品中多糖的含量，结果见下表。
表9
根据上述测定结果，蝙蝠草中多糖含量差异较大，范围在186.06～223.75mg/g之间，平均含量为204.07mg/g，按照80％批次药材合格的原则，故暂规定：本品按干燥品计算，含多糖(C6H10O5)n总量，不得少于171.46mg/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.对照品溶液的制备：精密称定D-无水葡萄糖对照品，加水制成对照品溶液；
S2.供试品溶液的制备：精密称定蝙蝠草粉末，加入甲醇水溶液，密塞，低功率超声处理10-15min，离心，弃上清，向沉淀中加水，密塞，高功率超声处理10-30min，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
S3.测定：取供试品溶液，采用苯酚-硫酸法在485-495nm波长处测定吸光度；
S4.标准曲线的绘制：取对照品溶液按照步骤S3的方法，采用序列进样法依次进样，以进样浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
S5.多糖含量的计算：根据步骤S4所得的标准曲线，计算步骤S3中供试品的多糖含量。
2.如权利要求1所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，所述蝙蝠草粉末为采收新鲜蝙蝠草，去除杂质，干燥粉碎所得或将蝙蝠草干燥全草粉碎所得。
3.如权利要求1所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，步骤S2中，所述蝙蝠草粉末与甲醇水溶液的质量体积比为1g：15-30ml；所述甲醇水溶液的体积浓度为60-65％。
4.如权利要求1所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，步骤S2中，所述沉淀与水的质量体积比为1g：20-60ml。
5.如权利要求1所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，所述低功率超声处理的超声功率为200-300W，超声频率为25-28kHz，超声温度为25-35℃。
6.如权利要求1所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，所述离心为在6000-8000r/min，离心3-5min。
7.如权利要求1所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，所述高功率超声处理的超声功率为600-650W，超声频率为33-40kHz，超声温度为35-40℃。
8.如权利要求1所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，所述苯酚-硫酸法为向供试品溶液中，依次加入水、苯酚溶液、浓硫酸，静置，于60-70℃水浴中加热10-15min后，使用冰水迅速冷却至室温，精密吸取供试品溶液，在485-495nm波长处进行测定。
9.如权利要求1或8所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法，其特征在于，所述苯酚-硫酸法为向0.1ml供试品溶液中，依次加入水1.9ml，体积浓度为5％的苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，静置5min，于60℃水浴中加热15min后，使用冰水迅速冷却至室温，精密吸取供试品溶液2ml，在487nm波长处进行测定。
10.如权利要求1-8任一项所述的蝙蝠草多糖的含量测定方法的应用，其特征在于，所述蝙蝠草多糖的含量测定方法应用于测定蝙蝠草药材中蝙蝠草多糖的含量。
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