CN113631232A - Ltbp-1表达促进用组合物以及具有ltbp-1表达促进作用的物质的筛选方法 - Google Patents

Ltbp-1表达促进用组合物以及具有ltbp-1表达促进作用的物质的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于，提供一种促进LTBP‑1表达的LTBP‑1表达促进用组合物以及具有LTBP‑1表达促进作用的物质的筛选方法等。本发明涉及LTBP‑1表达促进用组合物等，其含有选自蔷薇、绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草以及杨桃中的1种以上的植物的萃取物，且所述蔷薇为含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。

Description

LTBP-1表达促进用组合物以及具有LTBP-1表达促进作用的物 质的筛选方法
技术领域
本发明涉及LTBP(Latent TGFβbinding protein；潜在型TGF-β结合蛋白质)-1表达促进用组合物、具有LTBP-1表达促进作用的物质的筛选方法以及促进LTBP-1的表达的方法等。
背景技术
皮肤、血管、肺、韧带等组织，其机能须具有经拉伸亦能恢复原状的性质，即弹性。此种组织中的弹性，是通过细胞及细胞外基质经组合而成的组织来维持的。细胞外基质中有胶原纤维、氨基聚糖(玻尿酸、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等)、弹性纤维等。胶原纤维及氨基聚糖虽然强度大，但应对外部强度时却无法伸缩。另一方面，弹性纤维具有弹性。从而，在必须具有伸缩机能的上述皮肤等组织中，弹性纤维是赋予弹性的重要因子。
据称，弹性纤维可将弹性蛋白沉积、交联于称为微原纤维的纤维周围。弹性纤维的更新极为缓慢，若因年龄增长或暴露于紫外线等而导致弹性纤维分解或变性，则会发生动脉硬化、肺气肿、皮肤松弛等。
近年来，促进弹性纤维形成的纤维蛋白与LTBP(潜在型TGF-β结合蛋白质)的分子间相互作用备受瞩目。LTBP是属于与原纤维蛋白相同的超家族的蛋白质。众所周知，LTBP有LTBP-1～4四种家族成员，以具有TGF-βbinding 8-Cys domain为特征。LTBP-2以不与潜在型TGF-β结合的方式存在，但LTBP-1和LTBP-3则是通过与惰性的潜在型TGF结合而具有使TGF-β以惰性状态储存、并在必要时可动员TGF-β的作用。关于LTBP-4有报道称，其与纤维蛋白-5相互作用因而与弹性纤维的形成有关(专利文献1及非专利文献1)。
专利文献
专利文献1：日本专利第6050573号公报
非专利文献
非专利文献1：Noda k et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,110,2852-7,2013
发明内容
虽然有人指出LTBP家族与弹性纤维的形成有关，但LTBP-1对弹性纤维形成的作用并不很明了。因此本发明人聚焦于LTBP-1，研究了其对弹性纤维形成的影响。其结果如后述实施例所示，LTBP-1有别于LTBP-4，其单独仍具有弹性纤维形成促进作用。从而认为促进LTBP-1表达的物质对弹性纤维形成促进是有用的。然而，尚未有关于促进LTBP-1表达的物质的报道。
本发明的目的在于，提供一种促进LTBP-1表达的LTBP-1表达促进用组合物。此外，本发明的目的在于，提供一种具有LTBP-1表达促进作用的物质的筛选方法等。
本发明人为解决上述课题进行了深入研究，结果发现：绞股蓝、汉荭鱼腥草、含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇等特定植物的萃取物，具有LTBP-1表达促进作用，至此完成了本发明。
即本发明包括以下LTBP-1表达促进用组合物等。
(1)一种LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，含有选自蔷薇、绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草以及杨桃中的1种以上的植物的萃取物，且所述蔷薇为含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。
(2)根据(1)所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，所述植物的萃取物为选自绞股蓝、汉荭鱼腥草以及含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇中的1种以上的植物的萃取物。
(3)根据(1)或(2)所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，用于促进皮肤中的LTBP-1的表达。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，在皮肤中用于促进因暴露于紫外线而降低的LTBP-1的表达。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，用于通过促进皮肤中的LTBP-1的表达，来预防或改善暴露于紫外线所引起的弹性纤维的减少。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，为皮肤外用剂。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，为化妆品。
(8)根据(1)～(5)中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，为饮食品。
(9)一种具有LTBP-1表达促进作用的物质的筛选方法，其特征在于，包括：
在体外对皮肤细胞进行紫外线照射的工序；
将照射了紫外线的上述皮肤细胞以含受试物质的受试培养基或不含上述受试物质的对照培养基进行培养的工序；以及，
比较以上述受试培养基培养的受试皮肤细胞及以对照培养基培养的对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量的工序；
当上述受试皮肤细胞中的LTBP-1表达量多于上述对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量时，选择上述受试物质作为具有LTBP-1表达促进作用的物质。
(10)一种促进LTBP-1的表达的方法，其特征在于，包括：将选自蔷薇、绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草以及杨桃中的1种以上的植物的萃取物适用于对象，且所述蔷薇为含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。
(11)一种用于促进LTBP-1的表达的植物萃取物的应用，其特征在于，所述植物萃取物为选自蔷薇、绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草以及杨桃中的1种以上的植物的萃取物，且所述蔷薇为含有玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。
根据本发明，可提供一种促进LTBP-1表达的LTBP-1表达促进用组合物。根据本发明，可促进LTBP-1表达。此外，根据本发明，可提供一种具有LTBP-1表达促进作用的物质的筛选方法等。
附图说明
图1为表示通过免疫荧光染色来评价LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞中的弹性纤维形成的结果的显微镜照片(倍率：200倍)。
图2为表示半定量LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞中的弹性纤维量的结果的图。
具体实施方式
＜LTBP-1表达促进用组合物＞
本发明的LTBP-1表达促进用组合物，含有选自绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草、杨桃以及含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇中的1种以上的植物的萃取物。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物，含有上述植物萃取物作为有效成分。本发明的LTBP-1表达促进用组合物的有效成分可使用上述任意1种植物的萃取物，也可使用2种以上的植物的萃取物。
在本发明中，绞股蓝是指葫芦科绞股蓝属的Gynostemma pentaphyllum(学名)。汉荭鱼腥草是指牻牛儿苗科牻牛儿苗属的Geranium robertianum L.(学名)。菖蒲是指菖蒲科菖蒲属的Acorus calamus(学名)。紫苏是指唇形科紫苏属的Perilla frutescensvar.crispa(学名)。鼠尾草是指唇形科鼠尾草属的Salvia officinalis(学名)。杨桃是指酢浆草科杨桃属的Averrhoa carambola(学名)。蔷薇是指蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)的植物，优选以Rosa hybrida(学名)为代表的蔷薇科蔷薇属的蔷薇。
本发明中的蔷薇为含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。蔷薇只要是含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物中的1种以上的蔷薇即可，优选含玫瑰花青苷化合物及玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。
玫瑰花青苷化合物为选自玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2及玫瑰花青苷B中的1种以上的化合物。含玫瑰花青苷化合物的蔷薇，只要是含1种以上上述化合物的蔷薇即可，但优选为含玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2及玫瑰花青苷B的蔷薇。玫瑰花青苷A1为下述通式(I)中R1为氢原子的化合物；玫瑰花青苷A2为下述通式(II)中R2为氢原子的化合物；玫瑰花青苷B为下述通式(III)中R3为氢原子的化合物。
[化1]
Figure BDA0003268162810000051
(上述式中，葡萄糖的1位羟基的配位(波浪线)表示α体与β体的互变异构性。R1表示氢原子或羟基。)
[化2]
Figure BDA0003268162810000052
(上述式中，R2表示氢原子或羟基。)
[化3]
Figure BDA0003268162810000053
(上述式中，R3表示氢原子或羟基。)
作为含玫瑰花青苷化合物的蔷薇，可列举呈蓝色系或淡紫色系色调的蔷薇，例如紫夫人、紫雨、薰衣草、曼哈顿蓝、Chantilly Lace、蓝月、黄昏、戴高乐、Violet Dolly、BlueRibbon、青空、Lady X、Blue Bajou、纹银等品种的蔷薇。
玫瑰飞燕草素苷化合物为选自玫瑰飞燕草素苷A1、玫瑰飞燕草素苷A2及玫瑰飞燕草素苷B中的1种以上的化合物。含玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇，只要是含1种以上上述化合物的蔷薇即可，但优选含玫瑰飞燕草素苷A1、玫瑰飞燕草素苷A2及玫瑰飞燕草素苷B的蔷薇。玫瑰飞燕草素苷A1，为上述通式(I)中R1为羟基的化合物；玫瑰飞燕草素苷A2，为上述通式(II)中R2为羟基的化合物；玫瑰飞燕草素苷B，为上述通式(III)中R3为羟基的化合物。
上述玫瑰飞燕草素苷化合物并不存在于野生种的蔷薇中，而是在以基因重组等方法导入编码类黄酮3',5'-羟化酶的基因(以下也称类黄酮3',5'-羟化酶基因)的蔷薇或以基因重组蔷薇为亲本而得的具有类黄酮3',5'-羟化酶基因的蔷薇中，合成属于蓝色色素的花翠素，并将其与没食子酸酯或特里马素类相结合而生成的化合物。
作为含上述玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇，可使用以基因重组等方法导入类黄酮3',5'-羟化酶基因的蔷薇、以及以此种基因重组蔷薇为亲本而得的具有类黄酮3',5'-羟化酶基因的蔷薇。作为此种蔷薇，例如可使用APPLAUSE(注册商标)等品种的蔷薇。已知APPLAUSE(注册商标)的花瓣中含玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2、玫瑰花青苷B以及玫瑰飞燕草素苷A1、玫瑰飞燕草素苷A2及玫瑰飞燕草素苷B(例如WO2010/110382)。APPLAUSE(注册商标)是指与SUNTORY blue rose APPLAUSE(注册商标)相同的品种，可由三得利花卉株式会社(日本国东京都)取得。具有类黄酮3',5'-羟化酶基因的蔷薇，也能以WO2010/110382等所记载的方法来制备。作为类黄酮3',5'-羟化酶基因，可列举WO2004/020637所记载的源自植物的基因，例如优选源自堇菜属三色堇(堇菜属黑三色堇(Viola spp.cv Black Pansy)等)的类黄酮3',5'-羟化酶基因等。另外，本说明书中所记载的学术文献及专利文献的全部都将作为参照并入本说明书中。
作为本发明中的含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇，优选花瓣中含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇，优选花瓣中含玫瑰花青苷化合物及玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。蔷薇中含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物，能以例如WO2010/110382、WO2015/178385等中所记载的方法通过HPLC-TOF-MS来确认。
本发明的植物萃取物的调制可使用上述植物的任意部位，例如根、根茎、茎、叶、枝、树皮、花、种子(包括种皮、胚芽、胚乳、胚轴、子叶等)、果实(包括果肉、果皮)或它们中的多种组合。通过将该植物的任意部位以溶剂进行萃取，可制造植物萃取物。
作为制备植物萃取物的优选部位，例如可列举以下部位。作为本发明中的植物萃取物，优选植物的下述部位的萃取物。
绞股蓝、紫苏、鼠尾草以及杨桃优选使用叶。汉荭鱼腥草优选使用全株。含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇优选使用花瓣。菖蒲优选使用根茎及/或根，更优选根茎。
上述植物的部位，可直接供于萃取工序，也可经粉碎、切断或干燥后再供于萃取工序。在本发明中，植物萃取物可为将上述植物直接进行萃取而得的萃取物，但也可为将该植物粉碎、切断或干燥后再经萃取而得的萃取物。优选由上述植物经粉碎、切断或干燥而得的物质制得的萃取物。
本发明的一种方式中，作为植物萃取物，优选为选自绞股蓝、汉荭鱼腥草以及含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇中的1种以上的植物的萃取物，更优选为选自绞股蓝的叶萃取物、汉荭鱼腥草的全株萃取物、以及含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇的花瓣萃取物中的1种以上。
植物的萃取方法没有特别限定，可通过植物成分萃取中所使用的一般萃取方法从植物中获得植物萃取物。萃取方法可适当设定，萃取条件也没有特别限定。例如，优选通过将上述植物的各部位在常温或加热条件下，以溶剂进行萃取来获得植物萃取物。萃取时也可适当进行搅拌等操作。
用于植物萃取的溶剂(萃取溶剂)可适当选择，可使用一般用于植物成分萃取的溶剂。作为萃取溶剂，例如，可列举水；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇等碳原子数为1～5的低级一元醇；乙二醇、丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇等多元醇；丙酮、甲乙酮等酮；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯；四氢呋喃、二乙醚等链状及环状醚；聚乙二醇等聚醚；角鲨烷等。这些可单独使用，也可使用2种以上组合而成的混合溶剂。低级一元醇优选碳原子数为1～4的一元醇，更优选碳原子数为2～4的一元醇，进一步优选乙醇等。多元醇例如优选二元或三元醇，更优选二元醇。此外，多元醇例如优选碳原子数为2～4的多元醇，更优选1,3-丁二醇等。其中，作为萃取溶剂，优选水、低级一元醇、多元醇、角鲨烷、它们的2种以上的混合溶剂，更优选水、低级一元醇、多元醇、它们的2种以上的混合溶剂。在一种实施形态中，作为萃取溶剂，例如更优选水、低级一元醇或其水溶液、多元醇或其水溶液、角鲨烷等，进一步优选水、乙醇、乙醇水溶液、1,3-丁二醇、1,3-丁二醇水溶液、角鲨烷等。作为本发明中的植物萃取物，优选上述溶剂萃取物。萃取时也可添加酸或碱来调节萃取溶剂的pH。
在萃取后，优选将植物残渣(萃取后的植物体或其部分)从萃取液中去除。将植物残渣从萃取液中去除的方法没有特别限定，可列举过滤、离心分离等公知的分离方法。
在一种方式中，绞股蓝萃取物，优选为绞股蓝的水萃取物。汉荭鱼腥草萃取物、紫苏萃取物及杨桃萃取物，优选为这些植物的1,3-丁二醇萃取物或1,3-丁二醇水溶液萃取物。菖蒲萃取物、鼠尾草萃取物及蔷薇萃取物，优选这些植物的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。
作为植物的萃取方法的一例，例如可使用以下方法。将植物原体或干燥物弄碎，添加以质量计为5～20倍量的萃取溶剂，于常压、室温下，优选以10分钟～15天、更优选为30分钟～10天、进一步优选为1小时～7天进行萃取，或在萃取溶剂的沸点附近，优选以10分钟～1天(更优选为10分钟～2小时)左右进行萃取后过滤得到滤液。萃取时，可静置，也可适当进行搅拌。此外，可将所得滤液(植物萃取液)直接作为植物的萃取物，也可视需要进行浓缩或干燥。
在本发明中，可将通过萃取而得的植物萃取液直接作为植物萃取物使用。此外，也可将植物萃取液用适当的溶剂进行稀释后作为植物萃取物使用，也可进行浓缩或干燥工序制成浓缩物或干燥粉末、或制成糊状而使用。浓缩方法、干燥方法也没有特别限定，可使用冷冻干燥、喷雾干燥等公知方法。此外，可将干燥粉末溶解或悬浮于溶剂中而使用。
进而，关于上述植物萃取液、其浓缩物或干燥粉末，在不损害本发明效果的范围内，也可视需要进一步进行除臭、脱色等纯化。此种纯化方法，任意选择一般方法进行即可，例如可列举：过滤；采用使用离子交换树脂、合成吸附树脂、活性碳等载体的管柱色谱等各种色谱法等方法。本发明中的植物萃取物，包含用如上述萃取方法所得的各种溶剂萃取液、其稀释液、其浓缩物或其干燥粉末、它们的纯化物。此外，作为上述植物萃取物，也可使用市售品。
本发明中所使用的上述植物萃取物，具有LTBP-1表达促进作用。在本发明中，LTBP-1表达促进包括LTBP-1的mRNA的表达促进以及蛋白质的表达促进。表达促进可为在生物体内的表达促进，也可为培养体系等生物体外的表达促进。LTBP-1优选为表达于皮肤细胞、更优选为表达于人类皮肤细胞的LTBP-1。本发明的LTBP-1表达促进用组合物，优选作为在皮肤中的LTBP-1表达促进用组合物而使用。LTBP-1表达也可称为产生LTBP-1。
如后述实施例所示，因暴露于紫外线而导致皮肤细胞中的LTBP-1的表达降低时，如果使用上述植物萃取物，则与未使用时相比增加了LTBP-1的表达。从而上述植物萃取物，具有在皮肤中促进因暴露于紫外线而降低的LTBP-1的表达的作用。在一种方式中，本发明的LTBP-1表达促进用组合物，可用于在皮肤中促进因暴露于紫外线而降低的LTBP-1的表达。促进降低的LTBP-1的表达，也可视为恢复LTBP-1的表达。此外，通过促进LTBP-1的表达，也可抑制主要因暴露于紫外线等导致的LTBP-1的表达降低。
如实施例所示，LTBP-1单独具有弹性纤维形成促进作用。从而，具有促进LTBP-1的表达作用的物质，具有弹性纤维形成促进作用。
在本发明中，弹性纤维形成促进作用，是指促进弹性蛋白在微原纤维周围沉积及交联的工序的作用，该沉积及交联的程度不限。在本发明中，使用某种物质时，与未使用时相比只要可在某种程度上促进弹性蛋白对微原纤维的沉积，则该物质即可称为具有弹性纤维形成促进作用。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物所使用的上述植物萃取物，具有LTBP-1表达促进作用。从而，本发明的LTBP-1表达促进用组合物，例如可用于促进弹性纤维的形成。通过例如促进皮肤中的LTBP-1的表达，可促进皮肤中的弹性纤维的形成。本发明的LTBP-1表达促进用组合物，对期望促进与LTBP-1相关的弹性纤维的形成的状态或症状(例如因年龄增长或暴露于紫外线所致的弹性纤维的变性或减少)的预防或改善是有用的。在一种方式中，本发明的LTBP-1表达促进用组合物，可用于通过促进皮肤中的LTBP-1的表达来预防或改善因暴露于紫外线所致的弹性纤维的减少。本发明的LTBP-1表达促进用组合物，通过LTBP-1表达促进作用，对皮肤松弛的预防或改善、皱纹的预防或改善等美容目的也是有用的。预防，包括防止、延缓发病或降低发病率等。改善，包括缓解症状、抑制症状恶化、治愈症状等。
此外，本发明的LTBP-1表达促进用组合物，也可作为具有弹性纤维再生能力的细胞的培养用试剂等使用。本发明的组合物，可用于人工弹性纤维形成促进。此外，也可用于人工皮肤、皮肤模型、人工血管等人工组织的制备。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物的形态没有特别限定，可为粉末状、颗粒状、糊状、固状等，也可为液状，可适当选择。本发明的组合物中，只要不损害本发明效果，则除上述植物萃取物外可调配其他成分。作为其他成分，例如可列举能用于后述化妆料(化妆品)、饮食品、医药品、医药部外品等的成分。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物，作为一例，能以制剂形态提供，但并不限定于本形态。也可将该制剂直接制成组合物或制成含有该制剂的组合物而提供。在一种方式中，本发明的LTBP-1表达促进用组合物也可称为LTBP-1表达促进剂。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物，在治疗用途(医疗用途)或非治疗用途(非医疗用途)中均适用。非治疗，指不包括医疗行为即手术、治疗或诊断的概念。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物，可用于化妆品、饮食品、医药品、医药部外品等各种用途。本发明的LTBP-1表达促进用组合物，其本身可为LTBP-1表达促进用化妆品、饮食品、医药品或医药部外品，或者可为调配于该化妆品、饮食品、医药品或医药部外品等中而使用的素材或制剂等。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物，例如适用于作为皮肤外用剂。皮肤外用剂，包括化妆品、医药品、医药部外品，优选为化妆品。在一个实施方式中，用于皮肤中的LTBP-1表达促进时，优选将LTBP-1表达促进用组合物制成皮肤外用剂，更优选制成化妆品。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物，也可作为皮肤外用剂以外的医药品或医药部外品而使用。
在其他实施方式中，优选将LTBP-1表达促进用组合物制成饮食品。以下针对将本发明的LTBP-1表达促进用组合物制成化妆品、医药品、医药部外品等皮肤外用剂、饮食品等的情况进行说明。
将本发明的LTBP-1表达促进用组合物制成皮肤外用剂(LTBP-1表达促进用皮肤外用剂)时，其剂型等没有特别限定，例如，可制成溶液、乳液、乳霜、凝胶、粉末、气溶胶、喷雾、胶囊及片剂等任意形态。皮肤外用剂，优选为化妆品。化妆品的制品形态也没有特别限定，例如，可列举洗面奶、卸妆品、化妆水、美容液、面膜、乳液、乳霜、防晒乳等护肤化妆品；粉底、隔离霜、口红、眼影、眼线笔、睫毛膏、眉粉、腮红、指甲油等上妆用化妆品；洗发精、护发素、发胶、染发剂、生发剂等毛发化妆品；肥皂、沐浴露等清洁剂；沐浴剂等。
上述化妆品也可单独使用上述植物萃取物。此外，此种化妆品，在不损害本发明效果的范围内，可适当含有化妆品可允许的载体、添加剂等成分，例如水、醇类、油剂、表面活性剂、增粘剂、金属皂、胶化剂、粉体、螯合剂、水溶性高分子、成膜剂、树脂、包合物、抗菌剂、除臭剂、盐类、pH调节剂、紫外线吸收剂、上述以外的源自动植物/微生物的萃取物、角质溶解剂、酶、激素类、其他维生素类、保湿剂、杀菌剂、抗炎剂、香料等中的1种或2种以上。化妆品，可通过一般的制造法进行制造。例如，可通过将上述植物萃取物与可用于上述化妆品的成分中的1种或2种以上混合后，加工成期望的形态而得。
将皮肤外用剂制成医药品或医药部外品时，可单独使用上述植物萃取物，也可将该植物萃取物与医药品或医药部外品可允许的载体、添加剂等成分组合而使用。作为此种成分，例如，可列举赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、着色剂等中的1种或2种以上，这些可视需要使用。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物，也可制成上述皮肤外用剂以外的医药品、医药部外品。此种医药品或医药部外品，可口服给予，也可非口服给予。医药品或医药部外品可制成口服给予制剂(内服剂)或非口服给予制剂的形态。作为口服给予制剂的剂型，可列举液剂、片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、糖衣片、胶囊剂、悬浮液、乳剂、咀嚼剂等。作为非口服给予制剂的剂型，可列举注射剂、输液剂等。此种医药品或医药部外品，可单独使用上述植物萃取物，也可将该植物萃取物与医药品或医药部外品可允许的载体、添加剂等成分组合而使用。作为此种成分，例如，可列举赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、着色剂、矫味剂等中的1种或2种以上，这些可视需要使用。医药品、医药部外品，可通过一般的制造方法来制造。例如，可通过将上述植物萃取物与医药品或医药部外品中可使用的成分中的1种或2种以上混合后，加工成期望的形态而得。
将本发明的LTBP-1表达促进用组合物制成饮食品时，饮食品没有特别限定，例如，可列举一般的饮食品、健康食品、机能性标示食品、特定保健用食品等。饮食品的形态也没有特别限定。上述健康食品、机能性标示食品、特定保健用食品，例如可制成液剂、片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、糖衣片、胶囊剂、悬浮液、乳剂、咀嚼剂、流质食物等各种制剂形态。
上述饮食品可单独使用上述植物萃取物，也可调配饮食品中可允许的成分，例如其他饮食品材料、调配于饮食品中的添加剂等，制成LTBP-1表达促进用的饮食品(LTBP-1表达促进用饮食品组合物)。此种饮食品，可通过一般的制造法进行制造。例如，在饮食品制造中，只要在饮食品材料等中调配上述植物萃取物即可。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物为皮肤外用剂、皮肤外用剂以外的医药品或医药部外品、饮食品等任一种形态时，上述植物萃取物的含量，在该组合物中，例如以该萃取物的干燥物换算的质量计，均优选为0.0000001～100质量％，更优选为0.000001～100质量％，进一步优选为0.000001～99.9质量％，更进一步优选为0.00001～99.9质量％，特别优选为0.00001～10质量％。包含2种以上的植物萃取物时，上述含量为其总含量。
本发明的LTBP-1表达促进用组合物的使用量，没有特别限定，可根据对象的状态、体重、性別、年龄或其他因素适当设定。如果为化妆品等皮肤外用剂，例如成人(60kg)每人每日以上述植物萃取物(干燥物换算)计，例如优选设为0.01～500mg。口服给予医药品或医药部外品时的给予量，例如成人(60kg)每人每日以植物萃取物(干燥物换算)计，例如优选设为0.01～500mg。如果为饮食品，其摄取量，例如成人(60kg)每人每日以上述植物萃取物(干燥物换算)计，例如优选设为0.01～500mg。可将上述量的植物萃取物单次或分多次来摄取或给予。将含有上述植物萃取物的皮肤外用剂适用于皮肤的时间点、摄取或给予饮食品、医药品或医药部外品的时间点没有特别限定。本发明的LTBP-1表达促进用组合物，可根据其形态、剂型等以自身周知的各种方法来使用。
作为本发明的LTBP-1表达促进用组合物的适用对象没有特别限定，可适用于人类或非人类哺乳动物等，优选人类(人)。作为适用对象，例如优选LTBP-1的表达降低的对象、期望或需要促进LTBP-1的表达的对象。
＜具有LTBP-1表达促进作用的物质的筛选方法＞
本发明包括一种具有LTBP-1表达促进作用的物质的筛选方法，其包括：在体外，对皮肤细胞进行紫外线照射的工序；将照射了紫外线的上述皮肤细胞，以含受试物质的受试培养基或不含上述受试物质的对照培养基进行培养的工序；以及比较以上述受试培养基培养的受试皮肤细胞以及以对照培养基培养的对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量的工序；当上述受试皮肤细胞中的LTBP-1表达量多于上述对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量时，选择上述受试物质作为具有LTBP-1表达促进作用的物质。
本发明的筛选方法为在体外(in vitro)进行的方法(在体外的筛选方法)。
作为本发明的筛选方法中所使用的皮肤细胞，可使用表达LTBP-1的人类或非人类哺乳动物的皮肤细胞。作为本发明的方法中所使用的皮肤细胞，例如，可列举人真皮纤维母细胞等的培养皮肤细胞。使细胞增殖时的培养条件没有特别限定，只要根据细胞来采用公知的条件即可。
本发明的筛选方法是对皮肤细胞进行紫外线照射。紫外线照射例如可照射紫外线B波(UVB)。在一种方式中，累计光量例如可设为1～20mJ/cm2，优选设为3～10mJ/cm2。
本发明的筛选方法，进行了如下工序：将照射了紫外线的皮肤细胞以含受试物质的培养基(受试培养基)或不含上述受试物质的培养基(对照培养基)进行培养的工序。
受试物质没有特别限定，例如，可列举植物萃取液、细胞萃取液、发酵产品、蛋白质、肽、维生素类、合成化合物等。这些可为已知物质，也可为新物质。可在培养基中添加受试物质来调制受试培养基。对照培养基，除了不含受试物质以外，只要使用与受试培养基相同的培养基即可。
培养基、培养条件等，可根据细胞的种类等适当设定。培养时间没有特别限定，只要根据培养条件等适当设定即可。例如，只要在紫外线照射后，在添加了受试物质的培养基或对照培养基中，将皮肤细胞优选培养5～72小时，更优选培养12～48小时即可。
作为培养基的一例，可列举α-MEM培养基。培养基中也可添加市售的血清。培养基也可使用市售品。
本发明中，在紫外线照射后，将皮肤细胞以含受试物质的受试培养基或不含上述受试物质的对照培养基进行培养。在该培养后，比较以上述受试培养基培养的受试皮肤细胞以及以对照培养基培养的对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量。当受试皮肤细胞中的LTBP-1表达量多于对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量时，选择上述受试物质作为具有LTBP-1表达促进作用的物质。
经由紫外线照射，皮肤细胞中的LTBP-1的表达量会减少。通过将照射了紫外线的皮肤细胞进行培养，即对于受试皮肤细胞以含受试物质的受试培养基培养，对于对照皮肤细胞以不含该物质的对照培养基进行培养，并比较这些细胞中的LTBP-1的表达量，可在例如主要因暴露于紫外线等而导致LTBP-1的表达降低的皮肤中，筛选出能够发挥LTBP-1表达促进作用的物质。
皮肤细胞中的LTBP-1表达量的测定，可通过测定编码LTBP-1的mRNA的量或LTBP-1的蛋白质的量来进行。mRNA或蛋白质的量的测定，可用公知方法进行。
例如，LTBP-1的蛋白质的量可通过免疫化学分析、质谱分析等进行测定。作为免疫化学分析，可列举Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)、蛋白质印迹法等。蛋白质的量的测定，可使用市售的ELISA试剂盒(MyBioSource公司制)等。
编码LTBP-1的mRNA的量，可通过PCR、Northern印迹法、微阵列、使用荧光探针的实时成像等来测定。
人类的LTBP-1的碱基序列或氨基酸序列(ORF)已为公知，碱基序列(mRNA)以Accession No.Q14766登记于公共数据库Genbank。只要是本领域技术人员，则可容易地进行供测定编码LTBP-1的mRNA的量的引物的设计或合成、DNA的扩增等。
本发明的筛选方法中，在照射紫外线的工序前，也可进行培养皮肤细胞的工序。在紫外线照射前的培养中，也可使用含上述受试物质的受试培养基。在一种方式中，照射紫外线的工序之前，也可进行将皮肤细胞以含上述受试物质的受试培养基或不含该受试物质的对照培养基进行培养的工序。此时，在紫外线照射工序后的培养中，优选将紫外线照射前的培养中以含受试物质的受试培养基培养的皮肤细胞以该受试培养基培养，将以对照培养基培养的皮肤细胞以该对照培养基培养。当紫外线照射前的培养使用受试培养基时，如果与以对照培养基培养的皮肤细胞相比LTBP-1表达量较多，即受试物质具有LTBP-1表达促进作用，则可通过该受试物质来抑制紫外线照射所致的LTBP-1表达降低。在一种方式中，从选择抑制暴露于紫外线所致的皮肤细胞中的LTBP-1表达降低的受试物质的观点出发，优选在紫外线照射前的培养中，进行以含上述受试物质的受试培养基进行培养的工序。紫外线照射前的培养中所使用的培养基、培养条件等，可根据细胞的种类等适当设定，也可使用上述培养条件等。
在本发明的筛选方法的其他方式中，包括：将皮肤细胞以含受试物质的受试培养基或不含上述受试物质的对照培养基进行培养的工序；对以上述受试培养基培养的受试皮肤细胞及以上述对照培养基培养的对照皮肤细胞照射紫外线的紫外线照射工序；以及比较上述受试皮肤细胞及对照皮肤细胞的LTBP-1的表达量的工序；当上述受试皮肤细胞中的LTBP-1表达量多于上述对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量时，选择上述受试物质作为具有LTBP-1表达促进作用的物质。培养基、培养条件、紫外线照射的条件等没有特别限定，可使用上述培养基以及培养、照射条件。
＜LTBP-1的表达促进方法等＞
本发明还包括一种促进LTBP-1的表达的方法，其包括：将选自绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草、杨桃以及含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇中的1种以上的植物的萃取物适用于对象。
本发明的方法的优选方式的一例，为促进皮肤中的LTBP-1的表达的方法。对象与上述LTBP-1表达促进用组合物的适用对象相同，优选人类或非人类哺乳动物，更优选人类。
作为将上述植物萃取物适用(使用)于对象的方法，可列举口服给予上述植物萃取物的方法、非口服给予的方法，优选非口服给予，更优选适用于皮肤的方法。当促进皮肤中的LTBP-1的表达时，优选将植物萃取物适用于皮肤。上述方法可为治疗方法，也可为非治疗方法。在一种方式中，本发明的方法，可为通过将上述植物萃取物适用于暴露于紫外线后的对象，而在皮肤中促进因暴露于紫外线而降低的LTBP-1的表达的方法。
本发明还包括一种用于促进LTBP-1的表达的植物萃取物的应用，所述植物萃取物为选自绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草、杨桃以及含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇中的1种以上的植物的萃取物。
上述应用，优选用于促进皮肤中的LTBP-1的表达。此外，优选在人类或非人类哺乳动物中的应用。在一种方式中，上述应用优选为在皮肤中用于促进因暴露于紫外线而降低的LTBP-1的表达的上述植物萃取物的应用。应用可为治疗应用，也可为非治疗应用。
上述方法及应用中的植物萃取物及其优选方式、优选使用量等，与上述LTBP-1表达促进用组合物相同。植物萃取物可使用1种植物的萃取物，也可使用2种以上的植物萃取物。植物萃取物，可直接使用，也可与其他成分组合使用。植物萃取物能以上述皮肤外用剂、饮食品等形态使用。
本发明还包括一种上述植物萃取物的应用，其用于制造LTBP-1表达促进用组合物。LTBP-1表达促进用组合物及植物萃取物的优选方式，如上所述。
实施例
以下示出更具体地说明本发明的实施例。另外，本发明并不仅限于这些实施例。
＜试验例1＞
(LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞的制备)
使用RNAzol(注册商标)RT(COSMO BIO(株式会社))，由经培养的人类皮肤纤维母细胞(NHDF-Neo：由Lonza公司购入)萃取出mRNA。使用M-MLV逆转录酶，以萃取的mRNA为模板进行逆转录反应。使用PrimeSTAR(注册商标)GXL DNA Polymerase(Takara Bio(株式会社))，以制备的cDNA为模板进行PCR反应。
用于扩增编码LTBP-1的DNA片段(LTBP-1的cDNA)的引物如下。
(LTBP-1用引物对)
LTBP-1-Forward：
5’-TGAGCAGTGTGTGAATTCTCCTGGATCTTACCAGTGCG-3’(序列号1)
LTBP-1-Reverse：
5’-GACTGCGCTCGAGCTCCAGGTCACTGTCTTTCTC-3’(序列号2)
(质粒的制备)
将扩增的基因用含有溴乙锭的2％琼脂糖凝胶进行电泳，在UV照射下观察单条带(single band)，切出条带部分，用Wizard(注册商标)SV Gel and PCR Clean-UP System(Promega公司)将编码LTBP-1的DNA片段纯化，其后用DNA Ligation kit<Mighty Mix>(Takara Bio(株式会社))将其导入pMXs-Puro Retroviral Vector。将LTBP-1的cDNA与100ng纯化的pMXs-Puro Retroviral Vector以1：3摩尔比混合，并添加DNA Ligation kit<Mighty Mix>(Takara Bio(株式会社))，使其反应一夜。反应结束后，向E.coli DH5α感受态细胞(Takara Bio(株式会社))中添加所得的混合溶液并进行孵育，其后添加SOC培养基并进行搅拌。将反应液涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于37℃下培养一夜。培养后，用管尖的前端刮取形成于培养板上的菌落，并添加于LB培养基中，于37℃下振荡培养一夜。培养后，用Fast Gene(注册商标)Plasmid Mini Kit(日本Genetics公司)进行纯化，得到质粒。进而将该质粒与用序列号1及2的引物对扩增的编码LTBP-1的DNA片段用EcoR I和Xho I切断，并进行连接、转化、纯化，从而得到目标质粒。纯化的质粒用EcoRI及Xho I切断后，用2％琼脂糖凝胶进行电泳来确认基因已载入。
(质粒的导入)
在含质粒的培养基中将Plat-A细胞培养一夜，所述含质粒的培养基为：在Opti-MEM I培养基中添加有pMXs-Puro Retroviral Vector及制备的LTBP-1的质粒、FuGENE HDTransfection Reagent(Promega公司)、10％血清的培养基。培养后以含10％血清的培养基培养，制备含逆转录病毒的培养基。以制备的含逆转录病毒的培养基处理源自新生儿的人类皮肤纤维母细胞，制备LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞。此外，作为对照，向上述源自新生儿的人类皮肤纤维母细胞中导入未载入LTBP-1的cDNA的pMXs-Puro Retroviral Vector(空载体)，从而制备对照细胞。
以下亦将所得的LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞称为L1L-NHDF，将导入有空载体的皮肤纤维母细胞称为对照细胞。
＜试验例2＞
使用试验例1中所制备的LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞(L1L-NHDF)及对照细胞，来评价LTBP-1的弹性纤维形成促进效果。
(1)免疫荧光染色
将L1L-NHDF与对照细胞分别以4×104cell/well播种于8well chamber，以含10％血清的培养基培养5天。以多聚甲醛固定后，使用特异性一抗或特异性二抗进行免疫荧光染色，并以激光扫描共聚焦显微镜进行观察。此外，一抗使用可辨识人类弹性蛋白的抗体，二抗使用经荧光标记的IgG抗体。
(2)由ELISA进行的纤维量的半定量
将L1L-NHDF与对照细胞分别以1.8×104cell/well的形式播种于96well培养板，以含10％血清的培养基培养5天。以多聚甲醛固定后，添加一抗及二抗，并添加TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)-substrate reagent)，以微培养板分析仪测定各孔的吸光度(测定波长450nm、对照波长600nm)。此外，一抗使用可辨识人类弹性蛋白的抗体，二抗使用HRP标记的IgG抗体。
(结果)
(1)LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞(L1L-NHDF)中的弹性纤维形成
在上述方法中，通过免疫荧光染色确认L1L-NHDF中的弹性纤维形成。图1为表示通过免疫荧光染色来评价L1L-NHDF中的弹性纤维形成结果的显微镜照片。上排为属于弹性纤维的弹性蛋白经免疫荧光染色的照片，下排为细胞核经免疫荧光染色的照片。图1中，EmptyVector(左列)表示对照细胞，LTBP-1(右列)表示LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞。根据免疫荧光染色的结果，可见L1L-NHDF中的弹性纤维形成与对照细胞相比有增加的倾向(图1)。
(2)L1L-NHDF中的弹性纤维量的半定量
通过ELISA对L1L-NHDF中的弹性纤维形成进行半定量。将结果示于图2。图2的纵轴为450nm的吸光度。显著差异检验根据Unpaired two-tailed Student's t-test来进行(＊＊P＜0.01(n＝4))。图2中，Empty Vector表示对照细胞，LTBP-1表示LTBP-1过表达皮肤纤维母细胞。根据图2，L1L-NHDF中的弹性纤维形成与对照细胞相比有显著增加。
根据上述结果，由LTBP-1的过表达可促进弹性纤维的形成。由此可知，LTBP-1单独具有促进弹性纤维形成的作用。
＜试验例3＞
探讨是否因暴露于紫外线而导致细胞中的LTBP-1的表达量发生变化。
将源自新生儿的人类皮肤纤维母细胞(NHDF-NB：由Kurabo株式会社购入)播种于100mm的培养皿中，以α-MEM培养基(Sigma-Aldrich公司制)于37℃下、二氧化碳浓度为5vol％中培养至铺满。其后去除培养上清，更换为对照培养基(含0.1质量％二甲基亚砜(DMSO)的α-MEM培养基)培养24小时。其次，对细胞照射紫外线B波(UVB)(累计光量约5.7mJ/cm2)，进一步培养24小时。在该培养后，回收细胞(经照射UVB的细胞：UVB(+))作为检验体。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)，由该细胞(检验体)萃取出mRNA，并通过RT-PCR进行LTBP-1基因表达量的定量。
为了比较，除未进行上述UVB照射以外，以与上述相同的方法进行源自新生儿的人类皮肤纤维母细胞(NHDF-NB)的培养，并以相同的方法由细胞(未照射UV的细胞：UVB(-))萃取出mRNA，合成cDNA后通过RT-PCR进行LTBP-1基因表达量的定量。
RT-PCR，通过Applied Biosystems公司的TaqMan Assay，用市售的LTBP-1用引物(Applied Biosystems公司)来进行。PCR反应以95℃、20秒，60℃、20秒，40个循环的条件进行。
上述试验进行3次(试验No.1～3)。各试验中，分别以n＝6调制检验体。LTBP-1基因表达量的测定是对各检验体各进行2次，并将其平均值作为测定值。将该测定值(n＝6)的平均值作为LTBP-1表达量的定量结果。
将结果示于表1。LTBP-1表达量(％)以相对值表示，该相对值是指：将各试验中未进行UV照射的细胞(UVB(-))的LTBP-1表达量(mRNA量)设为100％时，照射了UV的细胞(UVB(+))的LTBP-1表达量(mRNA量)的相对值。
[表1]
UV(+) LTBP-1表达量(％)
试验No.1 76.34
试验No.2 74.08
试验No.3 71.16
平均 73.86
根据表1，照射了UVB的细胞中的LTBP-1基因的表达量，比未照射UVB的细胞中的表达量平均低26.1％。显示如果对人类皮肤纤维母细胞照射UVB，则LTBP-1的表达会降低。
<调制例1>
源自植物的萃取物的调制
以各种植物为对象进行筛选，通过该筛选选择下述7种植物，并将其以溶剂进行萃取，从而得到萃取物。萃取所使用的植物及其部位如下。
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)：叶
汉荭鱼腥草(Geranium robertianum)：全株
蔷薇(Rosa hybrida，品种“APPLAUSE”(注册商标)，三得利花卉(株式会社))：花瓣
紫苏(Perilla frutescens var.crispa)：叶
菖蒲(Acorus calamus)：根茎
鼠尾草(Salvia officinalis)：叶
杨桃(Averrhoa carambola)：叶
上述蔷薇(品种“APPLAUSE”)为花瓣中含玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2及玫瑰花青苷B以及玫瑰飞燕草素苷A1、玫瑰飞燕草素苷A2及玫瑰飞燕草素苷B的蓝色系蔷薇。
将上述植物的粉碎物浸渍于溶剂中进行萃取。更详细而言，对于绞股蓝将其叶以水进行萃取，过滤萃取液得到滤液。将该滤液浓缩制成粉末后，溶解于1，3-丁二醇及水，进行过滤得到绞股蓝萃取液。对于汉荭鱼腥草，将其全株以1，3-丁二醇进行萃取得到萃取液。对于蔷薇，将其花瓣以乙醇进行萃取得到萃取液。对于紫苏，将其叶以1,3-丁二醇进行萃取得到萃取液。对于菖蒲，将其根茎以乙醇进行萃取得到萃取液。对于鼠尾草，将其叶以乙醇进行萃取得到萃取液。对于杨桃，将其叶以1,3-丁二醇进行萃取得到萃取液。从所得的萃取液中通过过滤去除植物残渣，从而将得到的滤液作为植物萃取液。
将所得的植物萃取液用蒸发仪浓缩后，通过冷冻干燥以粉末的形式得到各植物的萃取物。将该粉末状的植物萃取物(绞股蓝萃取物、汉荭鱼腥草萃取物、蔷薇萃取物、紫苏萃取物、菖蒲萃取物、鼠尾草萃取物及杨桃萃取物)用于以下评价。
在以下实施例1～3中，针对各样本以n＝6调制检验体。LTBP-1基因的表达量的测定是对各检验体各进行2次，并将其平均值作为测定值。将该检验体的测定值(n＝6)的平均值作为LTBP-1表达量的定量结果。针对对照也以同样的方式进行。显著差异检验根据student's t test来进行。
＜实施例1＞
针对源自植物的萃取物的LTBP-1表达促进作用，使用源自新生儿的人类皮肤纤维母细胞，以LTBP-1的表达量为指标进行评价。
将源自新生儿的人类皮肤纤维母细胞(NHDF-NB：由Kurabo株式会社购入)播种于100mm的培养皿中，以α-MEM培养基(Sigma-Aldrich公司制)在37℃下、二氧化碳浓度5vol％中培养至铺满。其后去除培养上清，更换为含样本的培养基培养24小时。其次，对细胞照射紫外线B波(UVB)(累计光量约5.7mJ/cm2)，进一步培养24小时。于此培养后，回收细胞作为检验体。以与试验例3相同的方法从细胞中萃取mRNA，并通过RT-PCR进行LTBP-1基因表达量的定量。
上述含样本的培养基，是在α-MEM培养基中添加各植物萃取物后调制而成的。表2中示出了所使用的植物萃取物及其在培养基中的浓度。植物萃取物(粉末)溶解于DMSO，并以培养基中的DMSO的终浓度为0.1质量％的形式进行添加。
除用试验例3中所使用的对照培养基(含0.1质量％DMSO的α-MEM培养基)来代替含样本的培养基以外，以与上述相同的方法进行UVB照射及培养，将所得的细胞作为对照。针对对照，也以与上述相同的方法进行LTBP-1基因表达量的定量。
将结果示于表2。LTBP-1表达量以相对值表示，该相对值是指：将对照的LTBP-1表达量(mRNA量)设为100％时，使用各植物萃取物时的LTBP-1表达量(mRNA量)的相对值。显著差异为相对于对照的检验结果。
[表2]
样本 LTBP-1表达量(％) 显著差异
绞股蓝萃取物10μg/mL 132.53 ＜0.05
汉荭角腥草萃取物20μg/mL 118.52 ＜0.05
蔷薇萃取物10μg/mL 114.38 ＜0.05
蔷薇萃取物20μg/mL 120.03 ＜0.01
以含绞股蓝萃取物、汉荭鱼腥草萃取物及蔷薇萃取物的培养基进行培养时，与以不含该萃取物的培养基进行培养时(对照)相比，LTBP-1表达量显著提高。显示这些植物的萃取物具有LTBP-1表达促进作用。
<实施例2>
将源自新生儿的人类皮肤纤维母细胞(NHDF-NB：由Kurabo株式会社购入)播种于100mm的培养皿中，以α-MEM培养基(Sigma-Aldrich公司制)，在37℃下、二氧化碳浓度5vol％中培养至铺满。其后去除培养上清，更换为新鲜的α-MEM培养基培养24小时。其次，去除培养基并更换为平衡盐溶液(HBSS)，其后对细胞照射UVB(累计光量约5.7mJ/cm2)。UV照射后，将HBSS更换为含样本的培养基，进一步培养24小时。于此培养后，回收细胞作为检验体。以与试验例3相同的方法从细胞中萃取mRNA，并通过RT-PCR进行LTBP-1基因表达量的定量。
含样本的培养基，是在α-MEM培养基中添加各植物萃取物调制而成的。表3示出了所使用的植物萃取物及其在培养基中的浓度。植物萃取物溶解于DMSO，并以培养基中的DMSO的终浓度为0.1质量％的形式进行添加。除使用试验例3中所使用的对照培养基(含0.1质量％DMSO的α-MEM培养基)来代替含样本的培养基以外，以与上述相同的方法进行UVB照射及培养，将所得的细胞作为对照(+UV)。此外，除使用试验例3中所使用的对照培养基来代替含样本的培养基且未进行UVB照射以外，以与上述相同的方法进行培养，将所得细胞作为对照(-UV)。针对对照，也以与上述相同的方法进行LTBP-1基因表达量的定量。
将结果示于表3。表3中，“对照(-UV)”为未照射UVB的对照，“对照(+UV)”为照射了UVB的对照。在表3中，UV照射的“-”是指未照射UVB，“+”是指照射了UV。显著差异为相对于“对照(+UV)”各样本的LTBP-1表达量(％)的显著差异。
各样本的LTBP-1表达量(％)以相对值表示，该相对值是指：将照射了UVB的对照(对照(+UV))的LTBP-1表达量(mRNA量)设为100％时的相对值(％)。此外，将针对照射UVB所致的LTBP-1表达量的降低，植物萃取物显示何种程度的复苏作用以“复苏率(％)”表示。复苏率(％)由未照射UV的对照(-UV)的LTBP-1表达量(C0)、照射了UV的对照的LTBP-1表达量(C1)及添加有各植物萃取物的细胞的LTBP-1表达量(S)，根据以下计算求得。
复苏率＝100×((S)-(C1))/((C0)-(C1))
[表3]
样本 照射UV LTBP-1表达量(％) 复苏率(％) 显著差异
对照(-UV) - 242.96 - -
对照(+UV) + 100.00 0.00 -
绞股蓝萃取物10μg/mL + 118.39 12.86 ＜0.01
绞股蓝萃取物20μg/mL + 121.01 14.70 ＜0.01
汉荭鱼腥草萃取物5μg/mL + 120.72 14.49 ＜0.05
汉荭鱼腥草萃取物20μg/mL + 112.80 8.96 ＜0.05
绞股蓝萃取物及汉荭鱼腥草萃取物可使因暴露于UV而降低的LTBP-1的表达复苏。
<实施例3>
作为植物萃取物，除使用表4所示的各植物萃取物以外，以与实施例1相同的方法来评价LTBP-1表达促进作用。表4中示出了含样本的培养基中的植物萃取物的浓度及评价结果。LTBP-1表达量以相对值表示，该相对值是指：将对照的LTBP-1表达量(mRNA量)设为100％时，使用各植物萃取物时的LTBP-1表达量(mRNA量)的相对值。显著差异为相对于对照的检验结果。由表4显示，紫苏萃取物、菖蒲萃取物、鼠尾草萃取物及杨桃萃取物具有LTBP-1表达促进作用。
[表4]
样本 LTBP-1表达量(％) 显著差异
紫苏萃取物10μg/mL 117.17 ＜0.05
菖蒲萃取物5μg/mL 123.96 ＜0.05
菖蒲萃取物10μg/mL 123.06 ＜0.05
菖蒲萃取物20μg/mL 138.59 ＜0.01
鼠尾草萃取物5μg/mL 114.12 ＜0.05
鼠尾草萃取物10μg/mL 113.88 ＜0.01
鼠尾草萃取物20μg/mL 115.41 ＜0.01
杨桃萃取物10μg/mL 120.83 ＜0.01
杨桃萃取物20μg/mL 115.96 ＜0.01
序列表
<110> 三得利控股株式会社
<120> LTBP-1表达促进用组合物以及具有LTBP-1表达促进作用的物质的筛选方法
<130> SP2019-0270
<150> JP2019-067473
<151> 2019-03-29
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 (LTBP-1-Forward)
<400> 1
tgagcagtgt gtgaattctc ctggatctta ccagtgcg 38
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 (LTBP-1-Reverse)
<400> 2
gactgcgctc gagctccagg tcactgtctt tctc 34

Claims (11)

1.一种LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，含有选自蔷薇、绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草以及杨桃中的1种以上的植物的萃取物，且所述蔷薇为含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。
2.根据权利要求1所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，所述植物的萃取物为选自绞股蓝、汉荭鱼腥草以及含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇中的1种以上的植物的萃取物。
3.根据权利要求1或2所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，用于促进皮肤中的LTBP-1的表达。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，在皮肤中用于促进因暴露于紫外线而降低的LTBP-1的表达。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，用于通过促进皮肤中的LTBP-1的表达，来预防或改善暴露于紫外线所引起的弹性纤维的减少。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，为皮肤外用剂。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，为化妆品。
8.根据权利要求1～5中任一项所述的LTBP-1表达促进用组合物，其特征在于，为饮食品。
9.一种具有LTBP-1表达促进作用的物质的筛选方法，其特征在于，包括：
在体外对皮肤细胞进行紫外线照射的工序；
将照射了紫外线的上述皮肤细胞以含受试物质的受试培养基或不含上述受试物质的对照培养基进行培养的工序；以及，
比较以上述受试培养基培养的受试皮肤细胞及以对照培养基培养的对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量的工序；
当上述受试皮肤细胞中的LTBP-1表达量多于上述对照皮肤细胞中的LTBP-1的表达量时，选择上述受试物质作为具有LTBP-1表达促进作用的物质。
10.一种促进LTBP-1的表达的方法，其特征在于，包括：将选自蔷薇、绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草以及杨桃中的1种以上的植物的萃取物适用于对象，且所述蔷薇为含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。
11.一种用于促进LTBP-1的表达的植物萃取物的应用，其特征在于，所述植物萃取物为选自蔷薇、绞股蓝、汉荭鱼腥草、菖蒲、紫苏、鼠尾草以及杨桃中的1种以上的植物的萃取物，且所述蔷薇为含有玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飞燕草素苷化合物的蔷薇。
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