CN113624752B

CN113624752B - 一种基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113624752B
Application number: CN202110901462.0A
Authority: CN
Inventors: 张新爱; 皇雪月; 石吉勇; 邹小波; 黄晓玮; 李志华; 张迪; 申婷婷
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2041-08-06
Also published as: CN113624752A

Abstract

本发明提供了一种基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器及其制备方法和应用，属于传感器制备和果蔬质量检测技术领域；本发明中，利用具有类过氧化物酶活性的金属有机框架材料（MOFs）催化氧化3,3’,5,5’‑Tetramethylbenzidine（TMB）构建了比色传感器，所述比色传感器基于适配体对MOFs催化活性的增强作用、适配体与农药之间的特异识别，实现果蔬中农残的可视化快速监测。

Description

一种基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于传感器制备和果蔬质量检测技术领域，具体涉及一种基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器及其制备方法和应用。

背景技术

农药的广泛应用对推动农业生产起着积极作用，然而农药存在难降解、毒性强等缺点，极易在水体、土壤、果蔬中富集，因此需要对农药的残留进行检测。农药残留的传统检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱法-串联质谱（LC-MS/MS）等，该类方法由于设备昂贵、操作费用高，难以实现现场快速检测。

目前，为了实现农药残留的快速检测，基于核酸适配体与农药的特异识别构建了荧光、表面增强拉曼散射和电化学等快速检测方法，但是上述方法依赖于特定的仪器设备，以输出相应的光、电信号，在很大程度上限制了其便携式应用。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器及其制备方法和应用。本发明中，利用具有类过氧化物酶活性的金属有机框架材料（MOFs）催化氧化3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine（TMB）构建了比色传感器，所述比色传感器基于适配体对MOFs催化活性的增强作用、适配体与农药之间的特异识别，实现果蔬中农残的可视化快速监测。

本发明中首先提供了一种基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器，所述比色传感器基于MOFs静电吸附氟虫腈和适配体构建而成。

本发明中还提供了上述基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）MOFs的制备及其功能化：

将Zn(NO₃)₂·6H₂O和二甲基咪唑分别分散在甲醇中，然后将两者混合，室温孵育后进行离心、洗涤、干燥，得到ZIF-8；将适配体溶液和ZIF-8溶液混合孵育，得到功能化后的ZIF-8溶液；所述适配体为ACGCGAATCGGAGTTGGGGGT。

（2）基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的构建：

配制一系列浓度的氟虫腈标准品溶液，将氟虫腈标准溶液与功能化的ZIF-8溶液混合反应，得到基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器。

进一步的，步骤（1）中，所述将Zn(NO₃)₂·6H₂O和二甲基咪唑分别分散在甲醇中具体是将4~6 mmol Zn(NO₃)₂·6H₂O和9~11 mmol二甲基咪唑分别分散在45~55mL甲醇中。

进一步的，步骤（1）中，室温孵育的时间为24h。

进一步的，步骤（1）中，所述干燥为在40~60 ℃下真空干燥，干燥时间为12~36 h。

进一步的，步骤（1）中，所述适配体溶液中，适配体溶于蒸馏水中，适配体浓度为100~200 nM。

进一步的，步骤（1）中，所述ZIF-8溶液中，ZIF-8溶于 pH 7.6 Tris-HCl 溶液，ZIF-8的浓度为0.83~1.67 mg/mL。

进一步的，步骤（1）中，适配体溶液和ZIF-8溶液的用量比为10~20 μL：50~70 μL。

进一步的，步骤（1）中，所述混合孵育为10~30 min。

进一步的，步骤（2）中，所述氟虫腈标准溶液的浓度为0.1~8 μM。

进一步的，步骤（2）中，氟虫腈和功能化的ZIF-8溶液的用量比为5~15 μL：75~90μL，混合反应的时间为5~15 min。

本发明中还提供了所述基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器在快速检测氟虫腈中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

与传统检测技术及荧光、电化学等快速检测方法相比，本发明的检测方法无需专用仪器输出光、电信号，能够实现农药残留的可视化监测。与现有的比色分析方法相比，本发明采用具有类酶活性的ZIF-8催化氧化TMB，促使溶液体系颜色发生变化，具有稳定性好、准确度高等优势。

本发明中选用具有比表面积大、稳定性好，且具有辣根过氧化物酶性质的ZIF-8，其能通过静电吸附作用吸附DNA，并且本发明中通过实验考察了对适配体吸附效果最好的浓度。

本发明的首先使用适配体可以增强ZIF-8的辣根过氧化物酶活性，且使得ZIF-8的电位又正电位转为负电位，使得TMB带有正电荷。在有氟虫腈存在时，因为氟虫腈适配体和ZIF-8之间的结合比较弱，而氟虫腈可以和适配体发生特异性结合，因而会导致氟虫腈适配体和ZIF-8的吸附减少，从而功能化后的ZIF-8吸附的TMB减少。ZIF-8具有辣根类过氧化物酶性质，能够在过氧化氢存在时，催化TMB溶液反应产生显色反应。本发明中将氟虫腈浓度和TMB显色反应即吸光度值之间建立线性关系，使用ZIF-8能够耐酸碱、克服传统酶的稳定性差的不足。

本发明中对氟虫腈的检测限为3.3×10^-8M，相较现有技术中的7.5×10^-8M灵敏度更高，检测限更低。本方法灵敏度高、特异性好的原因在于：（1）本发明中以氟虫腈的适配体作为特异性识别元件，从而确保其特异性；（2）本发明中使用的MOF是一种金属有机框架材料，具有比表面积大、催化活性好等优点，能够有效催化氧化底物显色；（3）本发明中利用适配体增强MOFs的类酶活性，具有稳定性好、灵敏度高的优势，从而实现苹果中氟虫腈的快速可视化检测。

附图说明

图1是 ZIF-8 的SEM图。

图2 是 ZIF-8 的TEM图。

图3 是 ZIF-8 的XRD图。

图4是 ZIF-8 的FT-IR图。

图5是 ZIF-8在不同浓度适配体存在时催化氧化H₂O₂的反应速率图。

图6 是ZIF-8在不同浓度适配体存在时催化氧化TMB反应速率图。

图7是 ZIF-8在不同浓度适配体存在时催化氧化H₂O₂反应速率图。

图8是 ZIF-8在不同浓度适配体存在时催化氧化TMB反应速率图。

图9是四种不同碱基对ZIF-8类酶活性的增强效果比较图。

图10是不同底物对ZIF-8类酶活性的影响。

图11是加入适配体前后ZIF-8的ζ电位变化。

图12是基于比色适配体传感器建立氟虫腈检测标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

（1） MOFs的制备及其功能化：

称取5 mM的Zn(NO₃)₂·6H₂O分散在50 mL甲醇溶液中，称取10 mM的二甲基咪唑分散于50 mL甲醇溶液中；在磁力搅拌条件下，将以上两种溶液混合，在室温下孵育24 h，然后在10000 r/min转速下离心；并用甲醇清洗3次，在60℃下真空干燥12 h，即可得到ZIF-8。将10 μL浓度为100 nM的适配体溶液和60 μL 0.83 mg/mL ZIF-8孵育10 min，从而制得功能化的ZIF-8，所述适配体溶液为ACGCGAATCGGAGTTGGGGGT。

图1是ZIF-8的SEM图，从图中看出，ZIF-8纳米晶体背景无杂质，表明制备的ZIF-8结构比较稳定、大小均一。

图2是ZIF-8的TEM图。从图中看出，ZIF-8呈规则的正十二面体，且相邻两个颗粒间的连接轮廓较为清晰。

图3是为了进一步验证ZIF-8的成功合成，使用XRD对其进一步进行研究。从图中看出，ZIF-8的典型峰在2θ 10.29º、12.64º、14.61º、16.40º和18.00º处，分别符合平面（200）、（211）、（220）、（310）和（222），说明了ZIF-8的成功合成。

图4是用FT-IR进一步验证了ZIF-8的晶体结构，其C-H和C-C拉伸峰分别出现在1146~1367 cm^-1之间；甲基咪唑环的脂肪族和芳香族（C-H）伸缩在2925~3130 cm^-1之间出现吸收带；另外，1585 cm^-1处的吸收峰是由于C=N拉伸引起的；在1350~1500 cm^-1处的吸收峰是由于整个N环拉伸引起的；在450和421 cm^-1处的吸收峰分别与Zn-O、Zn-N拉伸有关，表明锌离子已成功与氮结合。

（2）基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的构建：

配制一系列浓度的氟虫氰标准溶液，浓度分别为0.1 μM，0.2 μM，0.4 μM，0.5 μM，0.8 μM，1 μM，2 μM，3 μM，4 μM，5 μM。将10 μL的不同浓度氟虫腈标准溶液分别与75μL功能化的ZIF-8混合10 min，制得所述基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器。

实施例2

（1）MOFs的制备及其功能化:

称取4 mM的Zn(NO₃)₂·6H₂O分散在45 mL甲醇溶液中，称取9 mM的二甲基咪唑分散于45 mL甲醇溶液中；在磁力搅拌条件下，将上述两种溶液混合，在室温下孵育24 h，然后在9000 r/min转速下离心，并用甲醇清洗3次，在40℃下真空干燥24 h，即可得到ZIF-8。将15μL浓度为150 nM的适配体溶液和50 μL 的1.33 mg·mL^-1 ZIF-8孵育15 min，从而制得功能化的ZIF-8，所述适配体溶液为ACGCGAATCGGAGTTGGGGGT。

（2）基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的构建：

配制一系列浓度的氟虫氰标准溶液，浓度分别为0.1 μM，0.2 μM，0.4 μM，0.5 μM，0.8 μM，1 μM，2 μM，3 μM，4 μM，5 μM。将15 μL的不同浓度氟虫腈标准溶液分别与90μL功能化的ZIF-8混合10 min，制得所述基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器。

由于辣根过氧化物酶通常在H₂O₂存在时对TMB具有催化效果，因此本实施例中还根据米氏方程：

，其中，V-反应速率、 K_m-值米氏常数、 V_max-最大反应速率、S-底物浓度，考察了ZIF-8在不同浓度适配体时催化H₂O₂的反应速率，具体考察步骤为：

将10 μL浓度为0、100 nM、300 nM的适配体溶液分别和60 μL 0.83 mg/mL ZIF-8孵育10 min，从而制得功能化的ZIF-8，然后加入NAAc-HAC 缓冲液（350 μL ，pH 4.0）和50μL 2 mM TMB 溶液和15μL 以及H₂O₂ 浓度0.3 mM、0.8 mM、1.2 mM、1.6 mM、2 mM。然后在40℃反应每隔5分钟使用紫外分光度计测吸光度值。根据TMB的消光系数39000 M^-1cm^-1, 从而计算出反应速率，再将反应速率值代入米氏方程作图后计算出V_max、K_m的值。

图5为ZIF-8在不同浓度适配体存在时催化氧化H₂O₂的反应速率图，从图中可以看出，加入适配体后，ZIF-8对底物H₂O₂的米氏常数（K _m）值没有影响，而反应速率（V _max）随适配体的加入而增加。

本实施例中还考察了ZIF-8在不同浓度适配体存在时催化氧化TMB反应速率，具体步骤为：

将10 μL浓度为0、100 nM、300 nM的适配体溶液分别和60 μL 0.83 mg/mL MOFs孵育10 min，从而制得功能化的MOFs。然后加入350 μL pH 4.0 NAAc-HAC 缓冲液和50 μL 1mM 、2 mM、3 mM 、4mM、5mM TMB 溶液和15μL浓度为0.3 mM H₂O₂，然后在40 ℃ 反应每隔5分钟使用紫外分光度计测吸光度值。根据TMB的消光系数39000 M^-1 cm^-1, 从而计算出反应速率，再将反应速率值代入米氏方程作图后计算出V_max、K_m的值。

图6为ZIF-8在不同浓度适配体存在时催化氧化TMB反应速率图，与不含适配体的溶液相比，加入300 nM的适配体后，ZIF-8催化TMB的K _m值降低了约3.5倍，导致ZIF-8能吸附更多的TMB分子。此外，随着适配体浓度的增加，其V _max值显著增加，说明适配体可以加快ZIF-8的催化速率，这些结果都证明了，适配体可以提高MOFs催化活性，进而增强MOFs催化反应TMB。

实施例3：

（1） MOFs的制备及其功能化:

称取6 mM的 Zn(NO₃)₂·6H₂O分散在55 mL甲醇溶液中，称取11 mM的二甲基咪唑分散于55 mL甲醇溶液中；在磁力搅拌条件下，将上述两种溶液混合，在室温下孵育24 h，然后在8000 r/min转速下离心，并用甲醇清洗3次，在50℃下真空干燥36 h即可得到ZIF-8。将20μL浓度为200 nM的适配体溶液和70 μL 的1.67 mg·mL^-1 MOFs孵育30 min，从而制得功能化的MOFs，所述适配体溶液为ACGCGAATCGGAGTTGGGGGT。

（2）基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的构建：

配制一系列浓度的氟虫氰标准溶液，浓度分别为0.1 μM，0.2 μM，0.4 μM，0.5 μM，0.8 μM，1 μM，2 μM，3 μM，4 μM，5 μM。将15 μL的不同浓度氟虫腈标准溶液分别与90μL功能化的ZIF-8混合15 min，制得所述基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器。

本实施例中还考察了ZIF-8在不同浓度氟虫腈存在时催化氧化H₂O₂的反应速率，具体步骤为：

将10 μL浓度为300 nM的适配体溶液分别和60 μL 0.83 mg/mL MOFs孵育10 min，从而制得功能化的MOFs。将1 μM、2μM氟虫腈标准溶液与功能化的ZIF-8混合反应，然后加入NAAc-HAC 缓冲液（350 μL，pH 4.0）、TMB 溶液（50 μL，2 mM）、H₂O₂ （15μL）以及浓度0.3 mM、0.8 mM、 1.2 mM、1.6 mM、2 mM的H₂O₂溶液。然后在40 ℃ 反应每隔5分钟使用紫外分光度计测吸光度值。根据TMB的消光系数39000 M^-1cm^-1，从而计算出反应速率，再将反应速率值代入米氏方程作图后计算出V_max、K_m的值。

图7是ZIF-8在不同浓度氟虫腈存在时催化氧化H₂O₂的反应速率图，从图中根据米氏方程计算可以得出Vmax 和Km值，从图中可以看出，在适配体浓度一定情况下，随着氟虫腈浓度的增加，Vmax值逐渐下降，而Km值变化不大。这说明，当有氟虫腈存在时，功能化后的ZIF-8对H₂O₂的催化速率下降，但其对功能化后的ZIF-8和H₂O₂之间亲和力影响不大。

本实施例中还考察了ZIF-8在不同浓度氟虫腈存在时催化氧化TMB的反应速率，具体考察步骤为：

将10 μL浓度为300 nM的适配体溶液分别和60 μL 0.83 mg/mL MOFs孵育10 min，从而制得功能化的MOFs。将1 μM、2μM氟虫腈标准溶液与功能化的MOFs混合反应，然后加入NAAc-HAC 缓冲液（350 μL，pH 4.0）和50 μL 浓度为1 mM 、2 mM、3 mM 、4mM、5mM TMB 溶液和15μL浓度为0.3 mM H₂O₂。然后在40 ℃ 反应每隔5分钟使用紫外分光度计测吸光度值。根据TMB的消光系数39000 M^-1 cm^-1，从而计算出反应速率，再将反应速率值代入米氏方程作图后计算出V_max、K_m的值。

图8是ZIF-8在不同浓度氟虫腈存在时催化氧化TMB的反应速率图，从图中可以看出，在适配体浓度一定情况下，随着氟虫腈浓度的增加，V _max值逐渐下降，而K _m值逐渐增大，表明ZIF-8与TMB的亲和力不断减小。这说明说明在适配体浓度一定情况下，功能化后的ZIF-8对TMB的催化速率随着氟虫腈浓度的增加在下降，并且氟虫腈浓度会导致ZIF-8与TMB的亲和力不断减小。

本实施例中还考察了四种不同碱基对ZIF-8类酶活性的增强效果的影响，为了考察这四种碱基对ZIF-8的吸附效果的影响选用了四条全是由这四种碱基组成的DNA单链对其增强ZIF-8的酶活性的效果，其中四条DNA单链分别是:AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGGGG CCCCCCCCCCCCCC，具体步骤为：

将10 μL浓度为100 nM的四条完全由相同碱基组成的DNA单链溶液分别和60 μL0.83 mg/mL MOFs孵育10 min，从而制得功能化的MOFs。后边加上加入350 μL pH 4.0NAAc-HAC 缓冲液和TMB 溶液（50 μL，2 mM）和H₂O₂溶液（15μL，0.3 mM）。然后在40℃反应15分钟后测其吸光光度值。

图9是四种不同碱基对ZIF-8类酶活性的增强效果比较图，从图中可以看出，胸腺嘧啶（T）碱基能够显著增强ZIF-8的类酶活性；而其它碱基对ZIF-8的类酶活性影响不明显。这说明，胸腺嘧啶（T）碱基能够显著增强ZIF-8的类酶活性；而其它碱基对ZIF-8的类酶活性影响不明显。

本实施例中还考察了不同底物对ZIF-8类酶活性的影响，具体过程为：首先将适配体溶液（10 μL浓度为300 nM）和ZIF-8（60 μL，0.83 mg/mL）孵育10 min，从而制得功能化的MOFs，然后加入350 μL pH 4.0 NAAc-HAC 缓冲液和50 μL 2 mM TMB溶液和15μL浓度为0.3mM H₂O₂，用紫外分光度计测其吸光度值。

将适配体溶液（10 μL浓度为300 nM）和ZIF-8（60 μL，0.83 mg/mL）孵育10 min，从而制得功能化的MOFs，然后加入350 μL pH 4.0 NAAc-HAC 缓冲液和50 μL 2 mM ABTS溶液和15μL浓度为0.3 mM H₂O₂，然后用紫外分光度计测其吸光度值，比较不同底物对ZIF-8类酶活性的影响。

图10是不同底物对ZIF-8类酶活性的影响，选用四甲基联苯胺TMB和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸ABTS作为底物进行比较。从图中可以看出，当底物为TMB时，适配体可以提高ZIF-8的类酶活性；而底物为ABTS时，适配体不能提高ZIF-8的类酶活性。分析原因可能是：TMB在pH 4带正电荷，ABTS带负电荷；适配体能够促进ZIF-8吸收TMB，因此选用TMB作为催化底物。

本实施例中还考察了适配体对ZIF-8的ζ电位变化的影响，具体过程为：将10 μL浓度为300 nM的适配体溶液和60 μL 0.83 mg/mL MOFs孵育10 min，从而制得功能化的MOFs。然后用pH 4.0 NAAc-HAC 缓冲液稀释至1 mL，然后使用粒度仪测其电位。

图11是加入适配体前后ZIF-8的ζ电位变化，如图所示，在pH 4时，加入适配体后，溶液的ζ电位由3.05 ev变为−3.54 ev，而TMB带有正电荷因此加入适配体后的ZIF-8即功能化后的ZIF-8可以吸附更多TMB从而增强其类过氧化物酶活性。

实施例4

（1）标准曲线的建立：

配制0.1~5 μM的氟虫腈标准溶液，并于比色传感器中加入350 μL（0.30 M，pH 4）的NaAc-HAC缓冲溶液，以及50 μL TMB溶液和15 μL H₂O₂溶液。在40℃反应15 min后，利用紫外分光光度计对其进行测量（652 nm处有吸收峰值）；记录不同浓度氟虫腈标准溶液的吸光度值；根据氟虫腈标准品浓度和吸光度值之间相关关系，建立检测氟虫腈的标准曲线。

图12为吸光度值的差值和氟虫腈浓度间的相关关系构建的标准曲线。从图中可以看出，曲线方程为：y=0.167x+0.015 (R²=0.993)，检测限为3.3×10^-8M。

（2）苹果中氟虫氰的检测：

首先对苹果进行预处理，高速下匀浆，并通过乙腈提取和旋转蒸发后，将其残留溶解于水中。将10 μL苹果样品加入到便携式传感器中，根据步骤（1）中方法检测苹果中氟虫腈的紫外分光光度计读数，得到其与单独加入适配体的吸光度值间的差值，将其代入获得的标准曲线中，从而计算出苹果中氟虫腈含量为0.12 μM，由此实现苹果中氟虫腈的定量检测。

为了验证该传感器对于检测氟虫腈的灵敏度，使用高效液相色谱法（HPLC）与其进行对比，对比结果如表1所示。

表1. 本检测法与HPLC方法对比

样品	本检测法（μg/g）	RSD（%）	HPLC（μg/g）	RSD（%）
					样品1	0.065	5.9	0.072	6.8

从表1 中可以看出，本发明的检测方法的（RSD）小于HPLC，因此本检测方法灵敏度更高。

实施例5：

（1）标准曲线的建立:

配制0.1~6 μM的氟虫腈标准溶液，并于比色分析体系中加入350 μL（0.30 M，pH4）的NaAc-HAC缓冲溶液，以及50 μL TMB溶液和15 μL H₂O₂溶液。在40℃反应15 min后，使用紫外分光光度计对其进行测量（652 nm处有吸收峰值）记录不同浓度氟虫腈标准品的吸光度值；并根据氟虫腈标准品浓度和吸光度值间的相关关系建立测定氟虫氰的标准曲线，标准曲线方程为y=0.152x+0.175 (R²=0.998)。

（2）苹果中氟虫腈的检测：

首先对苹果进行预处理，高速下匀浆；通过乙腈提取和旋转蒸发后，将其溶解于水中。将10 μL苹果样品加到比色分析体系中，根据步骤（1）中方法检测苹果中氟虫腈的紫外分光光度计读数，得到其与单独加入适配体的吸光度值间的差值，将其代入获得的标准曲线中，从而计算出苹果中氟虫腈含量为0.4 μM，由此实现了苹果中氟虫腈的定量检测。

为了验证该传感器对于检测氟虫腈的灵敏度，使用高效液相色谱法（HPLC）与其进行对比，对比结果如表2所示。

表2. 本检测法与HPLC方法对比

样品	本检测法（μg/g）	RSD（%）	HPLC（μg/g）	RSD（%）
					样品2	0.174	7.1	0.189	8.2

从表2 中可以看出，本发明的检测方法的（RSD）小于HPLC，因此本检测方法灵敏度更高。

实施例6：

（1）标准曲线的建立:

配制0.1~8 μM的氟虫腈标准溶液，并于比色分析体系中加入350 μL（0.30 M，pH4）的NaAc-HAC缓冲溶液，以及50 μL TMB溶液和15 μL H₂O₂溶液。在40℃反应15 min后，使用紫外分光光度计对其进行测量（652 nm处有吸收峰值）记录不同浓度氟虫腈标准品的吸光度值，并根据氟虫腈标准品浓度和吸光度值间的相关关系，从而建立检测氟虫腈的标准曲线；标准曲线方程为y=0.142x+0.165 (R²=0.996)。

（2）卷心菜中氟虫腈的检测：

首先对卷心菜进行预处理，高速下匀浆，并通过乙腈提取和旋转蒸发后，将其残留溶解于水中。将10 μL卷心菜样品加到比色分析体系中，根据步骤（1）中方法检测卷心菜中氟虫腈的吸光度值，得到其与单独加入适配体的吸光度值间的差值，将其代入获得的标准曲线中，从而计算出卷心菜中氟虫腈含量为2.4 μM，由此实现了卷心菜中氟虫腈的定量检测。

为了验证该传感器对于检测氟虫腈的灵敏度，使用高效液相色谱法（HPLC）与其进行对比，对比结果如表3所示。

表3本检测法与HPLC方法对比

样品	本检测法（μg/g）	RSD（%）	GB比值法（μg/g）	RSD（%）
					样品3	1.235	4.3	1.357	5.6

从表3 中可以看出，本发明的检测方法的（RSD）小于HPLC，因此本检测方法灵敏度更高。

综上所述，本发明中利用适配体增强MOF的类酶活性，以催化氧化TMB，从而使得溶液体系变为蓝色；通过肉眼可实现农药残留的直观测定。该比色适配体传感器灵敏度高、选择性好、稳定性强等特点，为果蔬中农药残留的可视化监测提供了新的平台。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的制备方法，其特征在于，所述基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器使用适配体增强ZIF-8的辣根过氧化物酶活性，使得ZIF-8的电位由正电位转为负电位，使得TMB带有正电荷；在有氟虫腈存在时，因为氟虫腈适配体和ZIF-8之间的结合比较弱，而氟虫腈和适配体发生特异性结合，导致氟虫腈适配体和ZIF-8的吸附减少，从而功能化后的ZIF-8吸附的TMB减少；ZIF-8具有辣根类过氧化物酶性质，能够在过氧化氢存在时，催化TMB溶液反应产生显色反应；

具体制备方法包括如下步骤：

（1）MOFs的制备及其功能化：

将Zn(NO₃)₂·6H₂O和二甲基咪唑分别分散在甲醇中，然后将两者混合，室温孵育后进行离心、洗涤、干燥，得到ZIF-8；将适配体溶液和ZIF-8溶液混合孵育，得到功能化后的ZIF-8溶液；所述适配体为ACGCGAATCGGAGTTGGGGGT；

所述适配体溶液中，适配体溶于蒸馏水中，适配体浓度为100~200 nM；

所述ZIF-8溶液中，ZIF-8溶于 pH 7.6 Tris-HCl 溶液，ZIF-8的浓度为0.83~1.67 mg/mL；

所述适配体溶液和ZIF-8溶液的用量比为10~20 μL：50~70 μL；

（2）基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的构建：

配制一系列浓度的氟虫腈标准品溶液，将氟虫腈标准溶液与功能化的ZIF-8溶液混合反应，得到基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器；

氟虫腈和功能化的ZIF-8溶液的用量比为5~15 μL：75~90μL；所述氟虫腈标准溶液的浓度为0.1~8 μM。

2.根据权利要求1所述的基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，将4~6 mmol Zn(NO₃)₂·6H₂O和9~11 mmol二甲基咪唑分别分散在45~55mL甲醇中。

3.根据权利要求1所述的基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，室温孵育的时间为24h。

4.根据权利要求1所述的基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述干燥为在40~60 ℃下真空干燥，干燥时间为12~36 h。

5.根据权利要求1所述的基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述混合孵育为10~30 min。

6.根据权利要求1所述的基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，混合反应的时间为5~15 min。

7.权利要求1~6任一项所述方法制备的基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器，其特征在于，所述比色传感器基于MOFs静电吸附氟虫腈和适配体构建而成。

8.权利要求7所述基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器在快速检测氟虫腈中的应用，其特征在于，所述应用为：

基于适配体增强MOFs类酶活性的比色传感器使用适配体增强ZIF-8的辣根过氧化物酶活性，使得ZIF-8的电位又正电位转为负电位，使得TMB带有正电荷；在有氟虫腈存在时，因为氟虫腈适配体和ZIF-8之间的结合比较弱，而氟虫腈和适配体发生特异性结合，导致氟虫腈适配体和ZIF-8的吸附减少，从而功能化后的ZIF-8吸附的TMB减少；ZIF-8具有辣根类过氧化物酶性质，能够在过氧化氢存在时，催化TMB溶液反应产生显色反应。