CN113621632A

CN113621632A - 一种敲低cbs基因的方法及其在制备治疗人脑胶质瘤的药物中的应用

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Publication number: CN113621632A
Application number: CN202110903988.2A
Authority: CN
Inventors: 吴东栋; 王怡禛; 郑蒙; 吴海刚; 刘媛媛; 司伟荣; 敬米蓉; 张艳霞; 蔡春波; 王迪; 祁慧雯; 张婧; 李涛; 李彦章; 姬新颖
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2041-08-06
Also published as: CN113621632B

Abstract

本发明公开了一种敲低CBS基因的方法及其在制备治疗人脑胶质瘤的药物中的应用，包含以下步骤：S1:合成siRNA:依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列如下：正义链序列为：5’‑CAGACCAAGUUGGCAAAGUTT‑3’；反义链序列为：5’‑ACUUUGCCAACUUGGUCUGTT‑3’；S2:配置高分子聚合物:将PEG‑b‑P(Gu/Hb)粉末溶于10mM(mmol/L)HEPES(pH 7.2‑7.4)缓冲溶液中，配制成10mg/mL的溶液浓度备用。S3:配置siRNA溶液：siRNA粉末溶于HEPES溶液中，配制成200μg/mL的浓度备用，本发明涉及医疗技术领域。将该方法敲低人脑胶质瘤中的CBS基因后，可显著抑制人脑胶质瘤生长、迁移和侵袭。本发明可有针对性地抑制人脑胶质瘤CBS基因表达量；体外实验表明抑制人脑胶质瘤CBS基因表达量能够显著抑制人脑胶质瘤生长、迁移和侵袭，促进人脑胶质瘤凋亡。

Description

一种敲低CBS基因的方法及其在制备治疗人脑胶质瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体为一种敲低CBS基因的方法及其在制备治疗人脑胶质瘤的药物中的应用。

背景技术

神经胶质瘤是人类最严重的恶性肿瘤之一，是中枢神经系统肿瘤。在这方面，胶质母细胞瘤(GBM)是最恶性的胶质瘤类型。胶质母细胞瘤(GBM)是起源于脑部和脊髓的胶质细胞肿瘤。胶质母细胞瘤是来源于神经胶质瘤的最具侵袭性的原发性脑肿瘤，其发病率高、预后差。胶质瘤占所有颅内肿瘤的12-15％，占星形细胞肿瘤的50-60％。原发性胶质瘤也有两种类型，一种是从头发生，另一种是从低级别星形细胞瘤发展而来的次级胶质瘤。每一个亚型都有不同的基因属性。男性被诊断为胶质瘤的风险通常高于女性，男性和女性的最高发病年龄都在60-75岁。尽管最近治疗有所进展，但GBM的前景仍然很差，诊断后患者生存期的中位数少于15个月。因此，寻找治疗脑胶质瘤的新靶点，开发脑胶质瘤诊疗的新方法显得尤为重要。

硫化氢是一种新近发现的气体递质，对健康和疾病有广泛的调节作用。在哺乳动物体内由三种酶合成H₂S:胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸(3-MST)。与邻近的非癌组织或非肿瘤细胞相比，细胞内H₂S浓度以及一种或多种H₂S合成酶在多种恶性肿瘤细胞中的表达增加。细胞内CBS蛋白表达的增加可刺激肿瘤的生长、血管生成和瘤周血管张力，H₂S浓度、CBS、CSE和3-MST蛋白表达也常常在较高的肿瘤分级和分期中呈现增加。为了解CBS在脑胶质瘤发生发展中的潜在功能，研究探讨了CBS在人脑胶质瘤细胞增殖和转移的影响及潜在的分子机制，旨在为改善脑胶质瘤预后，开发脑胶质瘤诊疗策略提供新思路。

发明内容

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：包含以下步骤：

S1:合成siRNA:依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列如下：

正义链序列为：

5’-CAGACCAAGUUGGCAAAGUTT-3’；

反义链序列为：

5’-ACUUUGCCAACUUGGUCUGTT-3’；

S2:配置高分子聚合物:将PEG-b-P(Gu/Hb)粉末溶于10m M(mmol/L)HEPES(pH7.2-7.4)缓冲溶液中，配制成10mg/mL的溶液浓度备用。

S3:配置siRNA溶液：siRNA粉末溶于HEPES溶液中，配制成200μg/mL的浓度备用；

S4:制备siRNA纳米药物:以聚合物中NH₃ ⁺、Gu⁺与siRNA中PO₃ ^4-的摩尔比值进行计算，将步骤S2中聚合物与siRNA按1:5的摩尔比例混合并将混合溶液进行震荡混匀,静置30min后即可形成siRNA纳米药物；

S5:瞬时转染：将步骤S4所构建的纳米药物转染人脑胶质瘤细胞；将上述制备的纳米药物转染人脑胶质瘤细胞后，即可使肿瘤细胞中的CBS基因被敲低。

优选的，所述肿瘤细胞为人脑胶质瘤系的U87。

优选的，敲低人脑胶质瘤中CBS基因抑制人脑胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭，促进人脑胶质瘤细胞凋亡。

有益效果

本发明提供了一种敲低CBS基因的方法及其在制备治疗人脑胶质瘤的药物中的应用。具备以下有益效果，将该方法敲低人脑胶质瘤中的CBS基因后，可显著抑制人脑胶质瘤生长、迁移和侵袭。本发明可有针对性地抑制人脑胶质瘤CBS基因表达量；体外实验表明抑制人脑胶质瘤CBS基因表达量能够显著抑制人脑胶质瘤生长、迁移和侵袭，促进人脑胶质瘤凋亡。

附图说明

图1为本发明实施例的用纳米药物复合体敲低人脑胶质瘤细胞CBS基因后，Western blot检测肿瘤细胞中CBS的蛋白表达水平结果图；

图2为本发明实施例的MTT法检测CBS敲低对人脑胶质瘤细胞增殖的影响图；

图3为本发明实施例的EDU法检测CBS敲低对人脑胶质瘤细胞增殖的影响图；

图4为本发明实施例的TUNEL法检测敲低CBS基因对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响图；

图5为本发明实施例的Transwell法检测CBS敲低对人脑胶质瘤细胞迁移的影响图；

图6为本发明实施例的Invasion法检测CBS敲低对人脑胶质瘤细胞侵袭的影响图。

具体实施方式

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅附图1-6，其中control为野生型细胞，HB@siCBS为阴性对照组细胞，Ang-HB@siNC为阴性对照组细胞，Ang-HB@siCBS为基因敲低组细胞。

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，对本发明所用到的主要仪器设备及实验试剂简要介绍如下。

主要试剂、药品及样品：

人脑胶质瘤细胞U87-MG赠自河南大学－麦考瑞大学生物医学联合创新中心。

转染试剂纳米粒子复合物赠自河南大学－麦考瑞大学生物医学联合创新中心；

MTT购自美国Sigma公司；

细胞增殖检测试剂盒购自锐博生物科技有限公司；

细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；

Transwell小室购自Corning公司；

质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供；

其余未说明试剂、药品等均为实验室常用分析纯类制品，不再赘述。

主要仪器设备：

实时定量PCR仪(型号：QuantStudio 5)，为美国Thermo Fisher公司产品；

荧光倒置显微镜(型号：ECLIPSE Ti)，购自Nikon公司。

实施例1

(1)合成siRNA:依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列如下：

正义链序列为：

5’-CAGACCAAGUUGGCAAAGUTT-3’；

反义链序列为：

5’-ACUUUGCCAACUUGGUCUGTT-3’；

(2)配置高分子聚合物:将PEG-b-P(Gu/Hb)粉末溶于10m M(mmol/L)HEPES(pH7.2-7.4)缓冲溶液中，配制成10mg/mL的溶液浓度备用。

(3)配置siRNA溶液：siRNA粉末溶于HEPES溶液中，配制成200μg/mL的浓度备用。

(4)制备siRNA纳米药物:以聚合物中NH₃ ⁺、Gu⁺与siRNA中PO₃ ^4-的摩尔比值进行计算，将步骤(2)中聚合物与siRNA按1:5的摩尔比例混合并将混合溶液进行震荡混匀,静置30min后即可形成siRNA纳米药物。

为对肿瘤细胞中CBS基因的过表达效果进行客观评价，可对肿瘤细胞中CBS蛋白表达进行蛋白表达水平检验，具体过程简要介绍如下。

CBS蛋白表达水平检测：

分别提取肿瘤细胞的野生型(即空白对照)、两个阴性对照和敲低CBS基因后肿瘤细胞中的总蛋白，对其浓度进行测定后，进行免疫印迹(Western blot)检测，以确定细胞中CBS蛋白的表达水平。

CBS蛋白表达水平检测如图1所示，从图中可以看出，细胞中的CBS的蛋白表达水平也较对照组有大幅度明显降低，表明本发明所制备的siCBS纳米药物较好地敲低了肿瘤细胞中的CBS基因。

实施例2

为检测上述实施例1中敲低肿瘤细胞中CBS基因肿瘤细胞增殖的影响，发明人做了进一步的检测实验，相关过程介绍如下。

(1)首先采用MTT法确定敲低CBS后对肿瘤细胞增殖的影响，具体过程如下：

分别消化计数实施例1中空白对照、两个阴性对照及敲低CBS基因的肿瘤细胞，铺至96孔培养板中，接种量为6×10³个/孔，每组设6个副孔，每孔加入100μL培养基，培养箱中37℃孵育；

24h后，每孔分别加入20L、5mg/mL的MTT溶液，培养箱中继续培养2h；

然后取出细胞，使用酶标仪490nm处测定各孔的吸光值，根据吸光值计算敲低CBS基因对细胞生长的抑制率。

细胞生长抑制率计算公式为：

细胞生长抑制率(％)＝(对照孔OD值－实验孔OD值)/对照孔OD值×100％。

实验结果如图2所示，从图2可以看出，敲低CBS基因后的肿瘤细胞，细胞增殖生长情况显著低于阴性对照组的肿瘤细胞，可以认为敲低CBS抑制肿瘤细胞的生长。

(2)采用EDU法确定敲低CBS后对肿瘤细胞增殖的影响，具体过程如下：

EdU标记(12孔板操作)：用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；每孔加入300L 50μM EdU培养基孵育2h，弃培养基；PBS清洗细胞2次，每次5min。

细胞固定化：每孔加入150L细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min，弃固定液；每孔加入150L 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液；每孔加入300LPBS，清洗1次，5min，弃PBS；(加强)每孔加入100L渗透剂(0.5％Triton-X 100的PBS)脱色摇床孵育10min，PBS清洗1次，5min。

Apollo染色：每孔加入300L的1×Apollo染色反应液(一定要按顺序配，现用现配，30min用完)，避光，室温，脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；

Apollo染色反应液配制：1.5mL

加入300L渗透剂(0.5％Triton-X 100的PBS)脱色摇床清洗2次，每次10min，弃渗透剂；(加强)每孔每次加入300L甲醇清洗1-2次，每次5min，PBS洗1次，每次5min。

DNA染色：用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入300L1×Hoechst33342反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；每孔每次加入300LPBS洗3次，每次5min；每孔加300LPBS保存，拍照，计数细胞增值率。

结果如图3所示，从图中可以看出，敲低CBS基因的肿瘤细胞其细胞增殖率显著低于对照组和空白组肿瘤细胞，这表明在肿瘤细胞中敲低CBS基因，可以抑制肿瘤细胞的生长。

实施例3

为检测上述实施例1中敲低CBS基因对肿瘤细胞凋亡的影响，发明人做了TUNEL检测实验，相关过程介绍如下。

采用TUNEL法确定敲低CBS基因后对肿瘤细胞凋亡的影响，具体过程如下：

将细胞消化计数，铺至96孔培养板中，接种量为2×10⁴个/孔，于5％CO₂、37℃培养箱内孵育；

待细胞贴壁12小时后，用PBS将细胞清洗1次；用4％多聚甲醛固定30min；PBS清洗1次；

加入含0.1％Triton-X 100的PBS，冰浴孵育2min；PBS洗2次，配250L Tunel检测液：10L TdT酶+240L荧光标记液；在样品上加50L Tunel检测液，37℃避光孵育60min；PBS洗3次；

DAPI染色：5％BSA 1:1000稀释，3min；每孔加200LPBS保存，荧光显微镜下观察，拍照，计数细胞凋亡率。

结果如图4所示。从图中可以看出，敲低CBS基因的肿瘤细胞其细胞凋亡率显著高于对照组肿瘤细胞，这表明在肿瘤细胞中敲低CBS基因，可以促进肿瘤细胞的凋亡。

实施例4

为检测上述实施例2中敲低CBS基因对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响，发明人做了Transwell和Invasion检测实验，相关过程介绍如下。

(1)采用Transwell法确定敲低CBS基因后对肿瘤细胞迁移的影响，具体过程如下：

将小室置于24孔板中，小室下层加入600L含20％血清的培养基，上层加入200L不含血清的培养基，每孔1×10⁴个细胞，37℃培养箱内孵育24h；

取出培养板，弃去培养基，每孔加75％酒精固定15min，PBS洗2次；

结晶紫染色10min，自来水冲洗，将结晶紫洗去，用棉签将小室上层擦干净，用刀片轻轻刮下薄膜放于载玻片上，用中性树胶固定，100×镜下拍照。

(2)采用Invasion法确定敲低CBS基因后对肿瘤细胞侵袭的影响，具体过程如下：

具体操作同(1)，不同的是小室上有基质胶，每孔1×10⁴个细胞。

迁移结果如图5所示，敲低CBS基因的肿瘤细胞与对照组相比，迁移能力明显降低；侵袭结果如图6所示，敲低CBS基因后细胞侵袭能力明显降低。因此表明在胶质母细胞瘤细胞中敲低CBS基因，可以抑制细胞迁移和侵袭。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 河南大学

<120> 一种敲低CBS基因的方法及其在制备治疗人脑胶质瘤的药物中的应用

<141> 2021-08-06

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2495

<212> DNA

<213> CBS

<400> 1

gtcgccgtct ccgcctcgcc gcagtcgggg cagccgctcg cccctctttt ccatgtatcc 60

gtccaggatc ccatgacaga ttctgttgtc acgtctcctt acagagtttg agcggtgctg 120

aactgtcagc accatctgtc cggtcccagc atgccttctg agacccccca ggcagaagtg 180

gggcccacag gctgccccca ccgctcaggg ccacactcgg cgaaggggag cctggagaag 240

gggtccccag aggataagga agccaaggag cccctgtgga tccggcccga tgctccgagc 300

aggtgcacct ggcagctggg ccggcctgcc tccgagtccc cacatcacca cactgccccg 360

gcaaaatctc caaaaatctt gccagatatt ctgaagaaaa tcggggacac ccctatggtc 420

agaatcaaca agattgggaa gaagttcggc ctgaagtgtg agctcttggc caagtgtgag 480

ttcttcaacg cgggcgggag cgtgaaggac cgcatcagcc tgcggatgat tgaggatgct 540

gagcgcgacg ggacgctgaa gcccggggac acgattatcg agccgacatc cgggaacacc 600

gggatcgggc tggccctggc tgcggcagtg aggggctatc gctgcatcat cgtgatgcca 660

gagaagatga gctccgagaa ggtggacgtg ctgcgggcac tgggggctga gattgtgagg 720

acgcccacca atgccaggtt cgactccccg gagtcacacg tgggggtggc ctggcggctg 780

aagaacgaaa tccccaattc tcacatccta gaccagtacc gcaacgccag caaccccctg 840

gctcactacg acaccaccgc tgatgagatc ctgcagcagt gtgatgggaa gctggacatg 900

ctggtggctt cagtgggcac gggcggcacc atcacgggca ttgccaggaa gctgaaggag 960

aagtgtcctg gatgcaggat cattggggtg gatcccgaag ggtccatcct cgcagagccg 1020

gaggagctga accagacgga gcagacaacc tacgaggtgg aagggatcgg ctacgacttc 1080

atccccacgg tgctggacag gacggtggtg gacaagtggt tcaagagcaa cgatgaggag 1140

gcgttcacct ttgcccgcat gctgatcgcg caagaggggc tgctgtgcgg tggcagtgct 1200

ggcagcacgg tggcggtggc cgtgaaggcc gcgcaggagc tgcaggaggg ccagcgctgc 1260

gtggtcattc tgcccgactc agtgcggaac tacatgacca agttcctgag cgacaggtgg 1320

atgctgcaga agggctttct gaaggaggag gacctcacgg agaagaagcc ctggtggtgg 1380

cacctccgtg ttcaggagct gggcctgtca gccccgctga ccgtgctccc gaccatcacc 1440

tgtgggcaca ccatcgagat cctccgggag aagggcttcg accaggcgcc cgtggtggat 1500

gaggcggggg taatcctggg aatggtgacg cttgggaaca tgctctcgtc cctgcttgcc 1560

gggaaggtgc agccgtcaga ccaagttggc aaagtcatct acaagcagtt caaacagatc 1620

cgcctcacgg acacgctggg caggctctcg cacatcctgg agatggacca cttcgccctg 1680

gtggtgcacg agcagatcca gtaccacagc accgggaagt ccagtcagcg gcagatggtg 1740

ttcggggtgg tcaccgccat tgacttgctg aacttcgtgg ccgcccagga gcgggaccag 1800

aagtgaagtc cggagcgctg ggcggtgcgg agcgggcccg ccacccttgc ccacttctcc 1860

ttcgctttcc tgagccctaa acacacgcgt gattggtaac tgcctggcct ggcaccgtta 1920

tccctgcaca cggcacagag catccgtctc ccctcgttaa cacatggctt cctaaatggc 1980

cctgtttacg gcctatgaga tgaaatatgt gattttctct aatgtaactt cctcttagga 2040

tgtttcacca aggaaatatt gagagagaag tcggccaggt aggatgaaca caggcaatga 2100

ctgcgcagag tggattaaag gcaaaagaga gaagagtcca ggaaggggcg gggagaagcc 2160

tgggtggctc agcatcctcc acgggctgcg ccgtctgctc ggggctgagc tggcgggagc 2220

agtttgcgtg tttgggtttt ttaattgaga tgaaattcaa ataacctaaa aatcaatcac 2280

ttgaaagtga acaatcagcg gcatttagta catccagaaa gttgtgtagg caccacctct 2340

gtcacgttct ggaacattct gtcatcaccc cgtgaagcaa tcatttcccc tcccgtcttc 2400

ctcctcccct ggcaactgct gatcgacttt gtgtctctgt tgtctaaaat aggttttccc 2460

tgttctggac atttcatata aatggaatca cacaa 2495

Claims

1.一种敲低CBS基因的方法，其特征在于，包含以下步骤：

正义链序列为：

5’-CAGACCAAGUUGGCAAAGUTT-3’；

反义链序列为：

5’-ACUUUGCCAACUUGGUCUGTT-3’；

S2:配置高分子聚合物:将PEG-b-P(Gu/Hb)粉末溶于10mM(mmol/L)HEPES(pH 7.2-7.4)缓冲溶液中，配制成10mg/mL的溶液浓度备用；

S4:制备siRNA纳米药物:以聚合物中NH₃ ⁺、Gu⁺与siRNA中PO₃ ^4-的摩尔比值进行计算。将步骤S2中聚合物与siRNA按1:5的摩尔比例混合并将混合溶液进行震荡混匀,静置30min后即可形成siRNA纳米药物；

2.根据权利要求1所述的一种敲低CBS基因的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为人脑胶质瘤系的U87。

3.一种敲低CBS基因的方法及其在制备治疗人脑胶质瘤的药物中的应用，其特征在于，敲低人脑胶质瘤中CBS基因抑制人脑胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭，促进人脑胶质瘤细胞凋亡。