CN113621612B - 一种响应非生物胁迫的顺式作用元件及其鉴定方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域,公开了一种响应非生物胁迫的顺式作用元件及其鉴定方法和应用,顺式作用元件的核苷酸序列为“AGCCT”,并提供了含有权利要求1所述的顺式作用元件的植物报告载体。本发明所述顺式作用元件的启动子片段能够被富集,且在盐和渗透胁迫条件下的富集程度加强。可见所述新顺式作用元件参与白桦非生物胁迫应答,可用于白桦抗逆性改良。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域,具体涉及一种响应非生物胁迫的顺式作用元件的鉴定及其在植物抗逆性改良中的应用。
背景技术
高盐、干旱和低温等非生物胁迫是植物在生长发育过程中遭受的主要逆境因子,植物对逆境的抵御涉及复杂的生理生化反应和一系列相关功能基因的表达,这就要求转录因子作为调控网络的主开关发挥作用。转录因子通过与顺式作用元件结合来调控下游基因的表达,在逆境胁迫反应中发挥重要作用。因此,鉴定转录因子识别的顺式作用元件,可以揭示参与环境适应的转录调控机制和基因表达模式,进一步加深对转录因子功能的认识及植物逆境胁迫应答的分子机制解析。
科研人员基于酵母单杂交技术建立了一套以转录因子为中心鉴定其识别的顺式作用元件的技术体系,该技术可以快速、准确地鉴定转录因子所识别的各种顺式作用元件,主要用于鉴定特定转录因子结合的新顺式作用元件。
白桦(Betula platyphylla)具有生长迅速、适应性和抗逆性强等特点,是研究耐盐抗旱机理的理想材料。目前,已经在白桦中克隆得到一些抗逆相关转录因子基因,其中,白桦BpRAV1转录因子基因被发现参与了白桦非生物胁迫应答过程,但 BpRAV1转录因子调控白桦非生物胁迫应答的分子机制尚未阐明。鉴定BpRAV1转录因子识别的非生物胁迫响应顺式作用元件,将有助于揭示BpRAV1转录因子参与胁迫应答的转录调控机制。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明的目的是提供一种响应非生物胁迫的顺式作用元件。本发明的另一目的是提供所述新顺式作用元件在白桦抗逆性改良中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明采用下述技术方案:
一种响应非生物胁迫的顺式作用元件,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,核苷酸序列为“AGCCT”。
一种响应非生物胁迫的顺式作用元件的鉴定方法。
(1)、随机DNA文库的筛选:利用转录因子为中心的酵母单杂交技术体系,以效应载体pGADT7-Rec2-BpRAV1为诱饵,筛选随机DNA插入序列文库。从TDO+50mM 3- AT培养基上挑取阳性酵母克隆,提取pHIS2质粒并测序,从而鉴定出一个BpRAV1识别的不包含任何已知元件的插入序列“CCAAGCCTCCGGG”;
(2)、插入序列中核心元件的鉴定:为确定BpRAV1结合的这一新序列的核心序列,将插入序列“CCAAGCCTCCGGG”分别从左、右边界依次删除,将每个缺失序列以3 次串联拷贝克隆到pHIS2中,通过酵母单杂交实验研究其与BpRAV1的相互作用;酵母单杂交实验结果显示,BpRAV1能与序列“AGCCTCCGG”结合,但未能与“GCCTCCGG”结合;另外,BpRAV1可以与序列“CCAAGCCT”结合,但不能与“CCAAGCC”结合;表明 BpRAV1结合的顺式作用元件是“AGCCT”。
一种植物报告载体,其含有所述顺式作用元件。
将“AGCCT”及其突变序列的3次串联拷贝分别与35S CaMV小启动子序列融合,经酶切、连接反应使融合序列定向替换掉pCAMBIA1301载体中的CaMV 35S启动子,即获得瞬时表达的报告载体;将BpRAV1构建到pROK2植物表达载体CaMV 35S启动子的下游,用作共转化的效应表达载体。
所述的顺式作用元件在提高白桦抗逆性中的应用,用于白桦抗逆性改良。
有益效果:与现有技术相比,本发明提供了白桦BpRAV1转录因子结合的一种顺式作用元件,对顺式作用元件与BpRAV1转录因子的互作研究发现,BpRAV1转录因子能够与其靶基因启动子上的顺式作用元件结合,且这种结合能力受盐和渗透胁迫诱导加强,从而调控非生物胁迫应答基因的表达,提高白桦植株的抗逆性。可见本发明提供的顺式作用元件能够响应非生物胁迫,在白桦抗逆性改良中将具有广泛的应用。
附图说明
图1是顺式作用元件核心序列的鉴定。
图2是烟草共转化体系报告载体和效应载体的示意图。
图3是顺式作用元件与BpRAV1转录因子的互作结果。
图4是盐和渗透胁迫下新顺式作用元件与BpRAV1转录因子的结合。
图5是胁迫应答基因启动子上包含新顺式作用元件的示意图。
图6是正常生长条件下胁迫应答基因启动子的富集程度。
图7是盐和渗透胁迫下胁迫应答基因启动子的富集程度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。
实施例1白桦BpRAV1转录因子结合的顺式作用元件的鉴定
1、随机DNA文库的筛选
利用转录因子为中心的酵母单杂交技术体系,以效应载体pGADT7-Rec2-BpRAV1为诱饵,筛选随机DNA插入序列文库。从TDO+50mM 3-AT培养基上挑取阳性酵母克隆,提取pHIS2质粒并测序,从而鉴定出一个BpRAV1识别的不包含任何已知元件的插入序列(CCAAGCCTCCGGG)。
2、插入序列中核心元件的鉴定
为确定BpRAV1结合的这一新序列的核心序列,将插入序列“CCAAGCCTCCGGG”分别从左、右边界依次删除,将每个缺失序列以3次串联拷贝克隆到pHIS2中,各缺失序列如图1左侧所示,通过酵母单杂交(Y1H)实验研究其与BpRAV1的相互作用。Y1H 结果显示,BpRAV1能与序列“AGCCTCCGG”结合,但未能与“GCCTCCGG”结合(图1, L3和L4)。另外,BpRAV1可以与序列“CCAAGCCT”结合,但不能与“CCAAGCC”结合 (图1,R5和R6)。以上结果表明BpRAV1结合的顺式作用元件是“AGCCT”(SEQ ID NO.1),将该元件命名为RBS1(RAV-Binding Site 1)。
实施例2顺式作用元件与BpRAV1转录因子的互作验证
1、报告载体和效应载体的构建
将“AGCCT”及其突变序列的3次串联拷贝分别与35S CaMV小启动子序列(长46 bp)融合,经酶切、连接反应使融合序列定向替换掉pCAMBIA1301载体中的CaMV 35S 启动子,即获得瞬时表达的报告载体(图2)。将BpRAV1构建到pROK2植物表达载体 CaMV 35S启动子的下游,用作共转化的效应表达载体(图2)。将构建的报告载体和效应载体质粒分别通过电击法转化EHA105农杆菌,检测无误后保存菌种用于后续的烟草瞬时侵染。
2、瞬时共转化烟草
将报告载体和效应载体的农杆菌分别活化至菌液OD600达到0.4-0.5,离心收集菌体,将两种菌体混合重悬于1/2MS液体培养基(含乙酰丁香酮终浓度为150μM),用作共转化菌液。选取3周大的烟草苗,浸入共转化菌液中,25℃,120rpm共培养2 d,期间更换一次新的1/2MS液体培养基。共培养结束后,取出烟草苗用蒸馏水冲洗3 遍,叶片用于GUS酶活的测定和GUS染色。结果如图3所示,RBS1报告载体与BpRAV1 效应载体共转化时,GUS基因被强烈激活,具有很强的GUS活性;而RBS1突变体与 BpRAV1效应载体共转化时,GUS基因未能被激活,不具有GUS活性。这些结果表明, BpRAV1能够特异性地结合RBS1元件。
实施例3盐和渗透胁迫下顺式作用元件与BpRAV1转录因子的结合能力
将RBS1报告载体与BpRAV1效应载体共转化烟草,共转化结束后一部分烟草移至含有200mM NaCl或300mM甘露醇的1/2MS液体培养基中培养6小时,另一部分置于正常的1/2MS液体培养基中。不含BpRAV1效应载体的烟草转化用作阴性对照。取未胁迫处理和胁迫处理的烟草叶片进行GUS酶活测定和GUS染色,结果如图4所示,相比于正常生长条件,盐和渗透胁迫条件下BpRAV1与RBS1元件的结合活性显著升高。以上结果表明BpRAV1能够特异性的识别RBS1元件并与之发生互作,且BpRAV1与 RBS1的结合活性受盐和渗透胁迫的诱导。
实施例4顺式作用元件在白桦非生物胁迫应答过程中的功能
通过PLACE在线序列分析工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在SOD和POD基因(BpRAV1调控的非生物胁迫应答基因)启动子上发现多个RBS1元件,在这些基因的启动子上选择只包含RBS1元件的约200bp长的片段,设计扩增启动子片段的引物,如图5所示,含有RBS1元件(用灰色阴影标记)的启动子区域用黑色线条表示,不含顺式作用元件的启动子区域用黑色三角形表示并用作阴性对照。
分别用200mM NaCl或300mM甘露醇溶液处理pROK2-BpRAV1-GFP转基因白桦, 12h后收集正常生长条件下及胁迫处理后的白桦苗,用于染色质免疫共沉(ChIP)实验,取一部分超声破碎后的染色质样品用作Input(阳性对照),剩余的染色质样品经 GFP抗体免疫沉淀后共获得3个染色质样品(记作Normal、NaCl和Mannitol),未经过GFP抗体免疫沉淀的染色质样品记作ChIP-对照组。通过PCR反应测定上述包含 RBS1元件的启动子片段的富集程度。结果如图6所示,ChIP-对照组中没有检测到任何启动子片段的富集,而经GFP抗体免疫沉淀的染色质样品(Normal)中存在启动子片段的富集,说明BpRAV1能够与SOD、POD等非生物胁迫应答基因启动子上的RBS1元件结合,从而调控它们的表达。
进一步利用实时荧光定量PCR研究BpRAV1在盐和渗透胁迫条件下与这些基因启动子的结合能力,结果如图7所示,与正常生长条件相比,这些启动子片段在盐 (NaCl)和渗透(Mannitol)胁迫条件下的富集程度加强,表明BpRAV1与包含RBS1 元件的启动子的结合受到盐和渗透胁迫的诱导。
本发明利用转录因子为中心的酵母单杂交技术体系,鉴定得到一个白桦BpRAV1转录因子识别的顺式作用元件。烟草共转化实验显示该顺式作用元件能够特异性地与BpRAV1转录因子结合,从而激活报告基因的表达,且这种结合能力受盐和渗透胁迫诱导加强。在胁迫应答基因的启动子上发现多个顺式作用元件,进一步的染色质免疫共沉(ChIP)实验发现,包含该顺式作用元件的启动子片段能够被富集,且在盐和渗透胁迫条件下的富集程度加强。可见所述顺式作用元件参与白桦非生物胁迫应答,可用于白桦抗逆性改良。
序列表
<110> 江西省科学院生物资源研究所
<120> 一种响应非生物胁迫的顺式作用元件及其鉴定方法和应用
<141> 2021-07-23
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> DNA
<213> Betula platyphylla
<400> 1
agcct 5
Claims (1)
1.一种受非生物胁迫诱导的顺式作用元件在提高白桦抗逆性中的应用,其特征在于,所述顺式作用元件与白桦BpRAV1转录因子结合,其核苷酸序列为“AGCCT”,用于在盐和渗透胁迫下白桦抗逆性改良。
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