CN113604592A - 白色花椰菜花球变紫性状的InDel分子标记及其引物和应用 - Google Patents

白色花椰菜花球变紫性状的InDel分子标记及其引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了白色花椰菜花球变紫性状的InDel分子标记及其引物和应用。本发明首先提供了分子标记的筛选方法，包括：配置F2分离群体；混池测序；分离群体混合分组分析和定位区间内InDel标记开发，最终筛选得到与白色花椰菜花球变紫性状紧密连锁的InDel标记Pur‑28，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其对应的引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和3所示。应用所述的InDel分子标记的引物能够快速、准确的鉴定白色花椰菜花球变紫性状，在花椰菜幼苗期就可以进行花球不变紫的花椰菜种质资源进行鉴定和筛选，操作简单、准确性高、实验成本低廉、易于应用。

Description

白色花椰菜花球变紫性状的InDel分子标记及其引物和应用
技术领域
本发明涉及白色花椰菜性状的分子标记，尤其涉及白色花椰菜花球变紫性状的InDel分子标记及其引物和应用，属于白色花椰菜性状的分子标记及其应用领域。
背景技术
花椰菜(Brassica oleracea var.Botrytis)是世界上最重要的蔬菜品种之一，因其花球营养丰富、风味鲜美而深受中西方消费者的喜爱。中国是世界上花椰菜种植和产量最大的国家。2018年，中国花椰菜产量达到1026万吨，占世界总产量的40.67％(FAO，2019)。作为高品质健康蔬菜的代表，其肉质茎与花序分生组织构成的花球富含维生素C与硫代葡萄糖苷类抗癌物质，符合当下国人对健康蔬菜的需求。
目前，育种家们已成功培育了橙色、紫色、绿色等彩色花椰菜品种，其作为功能性食品越来越受到人们的关注，但白色花椰菜依然是中国传统烹饪中最受欢迎的食材。然而，在花椰菜实际的生产过程中，环境因素(包括温度、光照等)的变化常常导致花椰菜花球球面大量紫色花青素的沉积，这对花椰菜花球的商业价值的实现极为不利。因此，在各种自然条件下生产稳定的白色花球是花椰菜的重要育种目标。
尽管学者们对紫色花椰菜品系的性状遗传和育种，做出了一些积极的探索，并且认为BoMYB2是调控花椰菜花青素合成的关键转录因子，但环境因素调控花椰菜花球表面紫色花青素沉积的代谢与分子机理并不清楚，也少有研究，因此，开发控制花椰菜花球表面变紫性状的新主效位点、分子标记及其引物，是生产稳定的白色花椰菜的关键。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记的筛选方法；
本发明的目的之二是提供由所述筛选方法筛选得到的与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记及其引物；
本发明的目的之三是江所提供的与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记及其引物应用于快速检测花椰菜花球性状是否变紫或应用于花椰菜花球性状辅助选择育种等方面。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了一种与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记的筛选方法，包括：
(1)配置F2分离群体：将花椰菜花球不变紫品系作为母本，花椰菜花球变紫品系为父本，二者进行杂交，获得杂种F1代，然后由杂种F1代自交得到F2分离群体，F2分离群体中存在花球变紫和花球不变紫两种表型；
(2)混池并高通量测序：提取母本、父本、F2代分离群体中存在的花球变紫和花球不变紫两个极端性状的基因组DNA并分别混合形成4个混池，即母本池、父本池、花球变紫池以及花球不变紫池，对各个混池的基因组DNA进行Illumina双末端测序，对测序得到的读段使用BWA软件与花椰菜参考基因组进行比对，使用GATK HaplotypeCaller模块对混池样本中的SNP以及InDel变异进行检测；
(3)分离群体混合分组分析(BSA)：根据测序获得的SNP结果，对各个混池进行等位基因频率分析，对其中一个亲本构建参考基因组，分别计算花球变紫池和花球不变紫池的Δ(SNP-index)得到BSA结果图，采用Δ(SNP-index)值的95％的置信区间确定目标基因所在区域；
(4)定位区间内InDel标记开发：基于候选区间选取的候选InDel标记位点，提取InDel标记位点上下游200bp的核苷酸序列，设计引物在F2群体中进行基因分型，得到与白色花椰菜花球变紫性状紧密连锁的InDel分子标记位点；
(5)Indel标记引物筛选：使用步骤(4)的引物在父、母本以及F2群体中结合表型进行筛选，得到与白色花椰菜花球变紫性状紧密连锁的InDel分子标记位点。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(1)中所述的花椰菜花球不变紫品系为“PS-87”，所述花椰菜花球变紫品系为“PS-88”；步骤(1)中的F2群体大小至少为1500株。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(3)中所述SNP-index是指在特定位点上、携带不同于参考亲本的SNP的读序数占比对到同一位点的总读序数的比值，Δ(SNP-index)指花球变紫池和花球不变紫池的SNP-index值之差。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(3)中目标基因所在区域定位在花椰菜基因组9号染色体上，其中，区域1：1,300,001-4,010,000，大小2.7Mb；区域2：4,240,001-7,990,000，大小3.7M。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(4)中InDel标记位点的大小为20～500bp。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(4)中利用父、母本进行全基因组测序，基于候选区间选取的父、母本差异的InDel标记位点，提取InDel标记位点上下游200bp的核苷酸序列设计引物，得到InDel分子标记位点对应的引物。
本发明采用上述的筛选方法筛选获得了与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记Pur-28，其位于花椰菜的Chr9染色体5,186,990bp位置，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。
本发明进一步提供了与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记Pur-28的引物，其核酸序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明更进一步提供了一种应用所述的InDel分子标记Pur-28的引物应用于筛选与白色花椰菜花球不变紫性状改良育种材料。
具体的，本发明提供了一种应用所述的InDel分子标记Pur-28的引物鉴定白色花椰菜花球变紫性状的方法，包括：(1)提取待检测花椰菜材料的基因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为上下游引物进行PCR扩增；(3)琼脂糖凝胶电泳检测：如果扩增产物为251bp的父本特征性条带，则待测花椰菜为具有白色花球变紫性状的花椰菜材料；如果扩增产物为229bp的母本特征性条带，则待测花椰菜为具有白色花球不变紫性状的花椰菜材料。
其中，将251bp的扩增产物进行测序并将测序的结果进行重新拼接后，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；将229bp的扩增产物进行测序并将测序的结果进行重新拼接后，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
其中，步骤(2)中所述的PCR扩增体系包括，TaKaRa TaqTM Version 2.0 10ul，10umol/L上、下游引物各0.5ul，DNA模板1ul，加ddH2O至20ul；所述的PCR扩增扩增反应程序为：95℃预变性4min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。
由此，本发明提供了一种鉴定白色花椰菜花球变紫性状的的PCR检测试剂盒，包括：Taq酶，dNTP，上、下游引物，缓冲液和ddH2O；其中，所述的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明通过对与白色花椰菜花球变紫性状的基因定位，找到与此性状紧密连锁的InDel分子标记，所述InDel分子标记位于花椰菜基因组的第9号染色体上，将该InDel标记和分子标记扩增引物应用于筛选具有不受环境因素影响稳定生产白色花球的花椰菜，从而更快速、准确地判断花椰菜花球是否变紫的性状，从而建立花椰菜花球变紫性状的辅助选择育种技术体系，用于花椰菜白色花球的高效生产。
本发明涉及缩略语和关键术语定义
InDell(insertion-deletion)分子标记：插入缺失分子标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异。根据基因组中插入缺失位点，设计扩增这些插入缺失位点的PCR引物。
附图说明
图1为实施例1白色花椰菜花球及花球球面变紫表型图。
图2为实施例1中BSA定位结果图。
图3为实施例1中分子标记引物在2个亲本中检测验证的PCR检测结果；由左到右,第1泳道为母本的PCR结果，第2泳道为父本的PCR结果；F2群体中花球变紫性状单个植株呈现父本特征性条带，花球不变紫性状单个植株呈现母本特征性条带。
图4为实施例1中分子标记引物在F2单株中检测验证的PCR检测结果；其中从左到右、从上到下的第1泳道母本“PS-87”，第2泳道为父本“PS-88”，第3～28泳道为F2群体中花球变紫植株的PCR结果，第29泳道母本“PS-87”，第30泳道为父本“PS-88”，第31～40泳道为F2群体中花球不变紫植株的PCR结果。
图5为试验例1中分子标记及检测引物应用于检测筛选育种改良材料的PCR检测结果；其中编号1-28泳道分别为：PN-149，PN-170，PN-226，PN-217，PN-283，PN-337，PN-495，PN-500，PN-538，PN-614，PN-664，PN-704，PN-720，PN-772，PN-784，PN-794，SN-8，YC-69，YC-70，YC-71，YC-73，YC-131，PN-759，PN-4，PN-308，PN-622，PN-798，PN-602。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记及其对应的引物的筛选
1.配置F2分离群体
以天津市农业科学院蔬菜研究所保存的花球不变紫编号为“PS-87”的资源(母本)(图1a)和花球变紫标号为“PS-88”的资源(父本)(图1b)为亲本，二者进行杂交，获得杂种F1代，然后由杂种F1代自交得到F2分离群体，F2分离群体中存在花球变紫和花球不变紫两种表型。
2.混池并高通量测序
表型鉴定后，使用CTAB法提取母本“PS-87”基因组DNA、父本“PS-88”基因组DNA、F2代分离群体中花球变紫单株(30株)基因组DNA、F2代分离群体中花球不变紫单株基(30株)基因组DNA，共形成4个混池，即母本池、父本池、花球变紫池及花球不变紫池。全基因组测序实验流程按照Illumina公司提供的标准protocol执行，包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和文库测序等流程。本发明基于Illumina Hiseq 2500平台开展测序工作。使用FastQC对原始数据进行质量检测,使用Trimmomatic 0.39去除接头以及质量过低的序列和碱基，数据过滤参数为：LEADING:3、TRAILING:3、SLIDINGWINDOW:4:15、MINLEN:50，即：去除序列头部和尾部质量值都低于3的碱基，以4个碱基为窗口滑动，丢掉平均碱基质量小于15的窗口碱基，保留最小长度为50bp的读长，获得Clean Bases和Clean Reads；用BWA软件将Clean reads比对到花椰菜参考基因组，BWA比对参数为bwa mem-t 8-M-R"\@RG\tID:{library}\tLB:{library}\tPL:Illumina\tPU:{sample}\tSM:{sa mple}\"；基于比对结果，使用GATK软件进行SNP calling和InDel calling，参数为：gatk--java-options\"-Xms5G-Xmx5G\"HaplotypeCaller-R$genome_file-ERC GVCF-I$j-O$output。
3.分离群体混合分组分析(BSA)
根据测序获得的SNP结果，对各个混池进行等位基因频率分析，对其中一个亲本构建参考基因组，分别计算花球变紫池和花球不变紫池的SNP-index值，具体方法为覆盖该特定位点的突变基因型的读段占覆盖同一位点的总读序数的比值，如覆盖某一位点的读段数为30，而突变基因型的读段为24，则改为点的SNP-index值为0.8。若SNP-index＝0，则该读段来源于父本“PS-88”，若SNP-index＝1，则该读段来源于母本“PS-87”。然后计算花球变紫池和花球不变紫池的Δ(SNP-index)值，得到BSA结果图(图2)。
本试验采用Δ(SNP-index)值的95％的置信区间，来确定目标基因所在区域，结果表明目标基因所在区域定位在花椰菜基因组9号染色体上(区域1：1,300,001-4,010,000，大小2.7Mb；区域2：4,240,001-7,990,000，大小3.7M)。
4.定位区间内InDel标记开发
利用2亲本进行全基因组测序，基于候选区间选取的2亲本差异的InDel标记位点36个，提取InDel标记位点上下游200bp的核苷酸序列，使用Primer3设计引物，参数为SEQUENCE_ID＝$tag；SEQUENCE_TEMPLATE＝$seq；SEQUENCE_TARGET＝201,$InDel_length；SEQUENCE_EXCLUDED_REGION＝201,$InDel_length；PRIMER_TASK＝generic；PRIMER_PICK_LEFT_PRIMER＝1；PRIMER_PICK_INTERNAL_OLIGO＝0；PRIMER_PICK_RIGHT_PRIMER＝1；PRIMER_OPT_SIZE＝20；PRIMER_MIN_SIZE＝18；PRIMER_MAX_SIZE＝22；PRIMER_EXPLAIN_FLAG＝1；得到36个InDel分子标记位点对应的36对引物(表1)。
表1候选区间内36个InDel分子标记位点及其引物
Figure BDA0003171580390000101
5.Indel标记引物筛选
使用36对引物在父母本以及F2群体中结合表型进行筛选，得到1个与白色花椰菜花球变紫性状紧密连锁的InDel分子标记位点Pur-28(图3，图4)。核苷酸序列为：AAATAATTGAAATTAGCTGA(SEQ ID NO.1)。Pur-28分子标记引物为Pur-28F/Pur-28R:ACATCAACGCATGAGAAACACT(SEQ ID NO.2)/ATGTATGTGGCCCTCCCTCT(SEQ ID NO.3)。
PCR扩增体系使用20ul体系，包括，TaKaRa TaqTM Version 2.0(货号：R004Q)10ul，10umol/L上下游引物各0.5ul，DNA模板1ul，加ddH2O至20ul。PCR扩增扩增反应程序为：95℃预变性4min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。按照上述体系和程序，InDel标记在两个亲本和F2代中进行扩增，使用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，亲本间呈现特征性条带，母本条带大小229bp，父本扩增条带大小251bp。
结果如图3所示，其中，由左到右,第1泳道为母本的PCR结果，第2泳道为父本的PCR结果；F2群体中花球变紫性状单个植株呈现父本特征性条带，花球不变紫性状单个植株呈现母本特征性条带。
结果如图4所示，其中从左到右、从上到下的第1泳道母本“PS-87”，第2泳道为父本“PS-88”，第3～28泳道为F2群体中花球变紫植株的PCR结果，第29泳道母本“PS-87”，第30泳道为父本“PS-88”，第31～40泳道为F2群体中花球不变紫植株的PCR结果。
试验例1 InDel分子标记及检测引物应用于与白色花椰菜花球不变紫性状改良育种材料筛选试验
本试验中所使用的28份白色花椰菜花球不变紫性状的改良材料为天津市农业科学院蔬菜研究所选育保存种质资源，根据田间性状调查，23份改良材料田间表现为白色花球变紫性状，编号分别为：PN-149，PN-170，PN-226，PN-217，PN-283，PN-337，PN-495，PN-500，PN-538，PN-614，PN-664，PN-704，PN-720，PN-772，PN-784，PN-794，SN-8，YC-69，YC-70，YC-71，YC-73，YC-131，PN-759；5份改良材料田间表现为白色花球不变紫性状，编号分别为PN-4，PN-308，PN-622，PN-798，PN-602。
(1)采用CTAB法分别提取28份改良材料的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的28份花椰菜改良材料的基因组DNA为模板，以Pur-28F/Pur-28R为上下游引物进行PCR扩增。其中PCR扩增体系使用20ul体系，包括，TaKaRa TaqTMVersion 2.0(货号：R004Q)10ul，10umol/L上下游引物各0.5ul，DNA模板1ul，加ddH2O至20ul。PCR扩增扩增反应程序为：95℃预变性4min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸7min；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测：如果扩增产物为251bp的父本特征性条带，则待测花椰菜为具有白色花球变紫性状的花椰菜材料；如果扩增产物为229bp的母本特征性条带，则待测花椰菜为具有白色花球不变紫性状的花椰菜材料。
结果发现各改良材料的表型与PCR检测结果一致，PCR检测结果为图5所示。其中编号1-28泳道分别为：PN-149，PN-170，PN-226，PN-217，PN-283，PN-337，PN-495，PN-500，PN-538，PN-614，PN-664，PN-704，PN-720，PN-772，PN-784，PN-794，SN-8，YC-69，YC-70，YC-71，YC-73，YC-131，PN-759，PN-4，PN-308，PN-622，PN-798，PN-602。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业科学院
<120> 白色花椰菜花球变紫性状的 InDel分子标记及其引物和应用
<130> TJ-2002-210612A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Brassica oleracea var. Botrytis
<400> 1
aaataattga aattagctga 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
acatcaacgc atgagaaaca ct 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
atgtatgtgg ccctccctct 20
<210> 4
<211> 237
<212> DNA
<213> Brassica oleracea var. Botrytis
<400> 4
acgcatgaga aacactcaat tgatttcact aataacacaa actggagaaa aacgaaatag 60
aaaaacactc aattgatttc actaataacg agtttgctaa atcttcgaaa agaaaaacat 120
taaatttcca ttactttata gcttttcaca caaaaatcaa ataattgaaa ttagctgatt 180
gattcacctt agaaaatgaa atagagcttg gtgtcgagtg caaagagagg gagggcc 237
<210> 5
<211> 215
<212> DNA
<213> Brassica oleracea var. Botrytis
<400> 5
acgcatgaga aacactcaat tgatttcact aataacacaa actggagaaa aacgaaatag 60
agaaacactc aattgatttc actaataacg agtttgctaa atcttcgaaa gaaaaacatt 120
aaatttccat tactttagct tttcacacac aaatcttgat tcaccttaga aaatgaaata 180
gagcttggtg ccgagtgcaa agagagggag ggcca 215

Claims (10)

1.一种与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记的筛选方法，其特征在于，包括：
(1)配置F2分离群体：将花椰菜花球不变紫品系作为母本，花椰菜花球变紫品系为父本，二者进行杂交，获得杂种F1代，然后由杂种F1代自交得到F2分离群体，F2分离群体中存在花球变紫和花球不变紫两种表型；
(2)混池并高通量测序：提取母本、父本、F2代分离群体中存在的花球变紫和花球不变紫两个极端性状的基因组DNA并分别混合形成4个混池，即母本池、父本池、花球变紫池以及花球不变紫池，对各个混池的基因组DNA进行Illumina双末端测序，对测序得到的读段使用BWA软件与花椰菜参考基因组进行比对，使用GATK HaplotypeCaller模块对混池样本中的SNP以及InDel变异进行检测；
(3)分离群体混合分组分析(BSA)：根据测序获得的SNP结果，对各个混池进行等位基因频率分析，对其中一个亲本构建参考基因组，分别计算花球变紫池和花球不变紫池的Δ(SNP-index)得到BSA结果图，采用Δ(SNP-index)值的95％的置信区间确定目标基因所在区域；
(4)定位区间内InDel标记开发：基于候选区间选取的候选InDel标记位点，提取InDel标记位点上下游200bp的核苷酸序列，设计引物在F2群体中进行基因分型，得到与白色花椰菜花球变紫性状紧密连锁的InDel分子标记位点；
(5)Indel标记引物筛选：使用步骤(4)的引物在父、母本以及F2群体中结合表型进行筛选，得到与白色花椰菜花球变紫性状紧密连锁的InDel分子标记位点。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述的花椰菜花球不变紫品系为“PS-87”，所述花椰菜花球变紫品系为“PS-88”；步骤(1)中的F2群体大小至少为1500株。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述SNP-index是指在特定位点上、携带不同于参考亲本的SNP的读序数占比对到同一位点的总读序数的比值，Δ(SNP-index)指花球变紫池和花球不变紫池的SNP-index值之差；
步骤(3)中目标基因所在区域定位在花椰菜基因组9号染色体上，其中，区域1：1,300,001-4,010,000，大小2.7Mb；区域2：4,240,001-7,990,000，大小3.7M。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中InDel标记位点的大小为20～500bp；
步骤(4)中利用父、母本进行全基因组测序，基于候选区间选取的父、母本差异的InDel标记位点，提取InDel标记位点上下游200bp的核苷酸序列设计引物，得到InDel分子标记位点对应的引物。
5.采用权利要求1-6任何一项筛选方法得到的与白色花椰菜花球变紫性状相关的InDel分子标记。
6.根据权利要求5所述的InDel分子标记，其特征在于，该InDel分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
7.权利要求6所述InDel分子标记的引物，其特征在于，其核酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
8.权利要求5或6所述的InDel分子标记Pur-28、权利要求7所述的引物在筛选与白色花椰菜花球不变紫性状改良育种材料中的应用。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：(1)提取待检测花椰菜材料的基因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为上下游引物进行PCR扩增；(3)琼脂糖凝胶电泳检测：如果扩增产物为251bp的父本特征性条带，则待测花椰菜为具有白色花球变紫性状的花椰菜材料；如果扩增产物为229bp的母本特征性条带，则待测花椰菜为具有白色花球不变紫性状的花椰菜材料；
优选的，步骤(2)中所述的PCR扩增体系包括，TaKaRa TaqTMVersion 2.0 10ul，10umol/L上、下游引物各0.5ul，DNA模板1ul，加ddH2O至20ul；所述的PCR扩增扩增反应程序为：95℃预变性4min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。
10.一种鉴定白色花椰菜花球变紫性状的的PCR检测试剂盒，包括：Taq酶，dNTP，上、下游引物，缓冲液和ddH2O；其特征在于，所述的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。
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