CN113603629A

CN113603629A - 一种具有免疫抑制活性的细胞松弛素类化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN113603629A
Application number: CN202110740049.0A
Authority: CN
Inventors: 徐静; 张雪侠; 冯昭; 韦成文
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113603629B

Abstract

本发明首先通过对Phomopsis asparagi DHS‑48发酵物的进一步分离纯化，得到了具有新颖结构的化合物，其结构式为

Description

一种具有免疫抑制活性的细胞松弛素类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有免疫抑制活性的细胞松弛素类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

细胞松弛素，又称植物抗毒素，是一大类真菌代谢产物，其典型特征是以高度可替的氢化异吲哚环连接到一大环。由于结构的差异性，这类化合物表现出不同的生物活性，其中包括免疫调节、细胞毒性、抑制肿瘤和杀线虫活性。目前该家族已分离得到至少300个化合物，包括常见的细胞松弛素A～H，其中细胞松弛素B和细胞松弛素C是被广泛研究的两种。

目前，鲜见关于细胞松弛素类化合物在免疫抑制方面的研究。徐国波等在《球毛壳菌 CIB-160次生代谢产物的分离鉴定及其免疫活性》中报道，对球毛壳菌CIB-160的次生代谢产物进行纯化，得到10个化合物。体外免疫活性检测显示化合物1～6细胞松弛素类化合物显示较强的抑制活性，但同时在低浓度下对静息脾细胞具有杀伤作用。

发明内容

鉴于现有技术的不足，为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种具有免疫抑制活性的细胞松弛素类化合物及其制备方法和应用。

本发明方案包括以下内容：

本发明首先提供一种细胞松弛素类化合物，结构式如下所示：

另一方面，本发明还提供了所述的细胞松弛素类化合物的制备方法，包括以下步骤：

将天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi发酵物用乙酸乙酯浸提，得提取物，将提取物浓缩后加水混悬，得混悬物，混悬物用有机溶剂萃取，得到二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物；合并二氯甲烷提取物和乙酸乙酯提取物，然后在硅胶柱上使用CH₂Cl₂-MeOH进行梯度洗脱，极性依次递增，得到组分Fr.1～Fr.8；组分Fr.2使用CH₂Cl₂-EtOAc进行硅胶梯度洗脱，极性依次递增，得到组分Fr.2.1～2.6；组分Fr.2.5在硅胶柱上用MeOH-H₂O梯度洗脱得到权利要求1所述化合物。

优选的，所述发酵物为将天门冬拟茎点霉接种至大米培养基中，避光静置发酵培养所得的发酵物。

优选的，MeOH-H₂O的体积比为1:1。

优选的，组分Fr.2.5在RP-18硅胶柱上用MeOH-H₂O梯度洗脱得到目标化合物。

本发明还进一步提供了所述化合物在制备免疫抑制剂方面的应用，所述化合物的结构式为：

本发明还涉及一种产生所述细胞松弛素类化合物的真菌Phomopsis asparagiDHS-48，该真菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2021318，保藏日2021年3月 31，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。

本发明所取得的有益效果：

本发明首先通过对Phomopsis asparagi DHS-48发酵物的进一步分离纯化，得到了具有新颖结构的细胞松弛素类化合物。经过对该化合物的细胞毒性和免疫抑制活性进行的评估，证明化合物对小鼠脾细胞有较低的细胞毒性且具有明显的免疫抑制活性。作用机制研究显示该化合物是一种潜在的能抑制细胞内磷酸化的NFAT蛋白去磷酸化的免疫抑制剂，可用于制备针对器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制药物。

附图说明

图1：化合物1、化合物2的COZY和HMBC相关性

图2：化合物1、化合物2的NOESY相关性

图3：实验和计算的化合物1～2电子圆二色性(ECD)光谱

图4：实施例3实验结果

图5：实施例5实验结果

图6：实施例6实验结果

图7：实施例7实验结果

图8：实施例8实验结果

图9：实施例8实验结果

图10：实施例9实验结果

图11：化合物1的¹H-NMR图谱

图12：化合物1的¹³C-NMR图谱

图13：化合物1的DEPT图谱

图14：化合物1的¹H-¹H COSY图谱

图15：化合物1的HMQC图谱

图16：化合物1的HMBC图谱

图17：化合物1的NOESY图谱

图18：化合物1的HR-ESI-MS图谱

图19：化合物2的¹H-NMR图谱

图20：化合物2的¹³C-NMR图谱

图21：化合物2的DEPT图谱

图22：化合物2的¹H-¹H COSY图谱

图23：化合物2的HMQC图谱

图24：化合物2的HMBC图谱

图25：化合物2的NOESY图谱

图26：化合物2的HR-ESI-MS图谱

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1-化合物的制备

将Phomopsis asparagi DHS-48接种至大米培养基(大米100g、粗海盐3g、蛋白胨0.6g、水100mL，置于500mL三角瓶)中，共100瓶，25℃下避光静置发酵培养28d，得发酵物；

将发酵物倒入适量的乙酸乙酯，首次超声提取三十分钟，然后浸泡提取24h，提取完成后将残渣过滤掉，获得乙酸乙酯提取物，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯提取物进行减压浓缩，总共重复提取3次，最终得到目标菌株的总发酵产物，将总的发酵产物用适量的水进行溶解、混悬，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取之后获得石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；合并二氯甲烷提取物和乙酸乙酯提取物 (30g)，然后在硅胶柱上使用CH₂Cl₂-MeOH进行梯度洗脱，极性依次递增(100：0～0：100， v/v)，得到组分Fr.1～Fr.8；将组分Fr.2使用CH₂Cl₂-EtOAc(4∶1～1∶1，v/v)进行硅胶梯度洗脱，极性依次递增，得到组分Fr.2.1～2.6；组分Fr.2.5在RP-18硅胶柱上用MeOH-H₂O (50：50～90：10，v/v)梯度洗脱得到化合物2(8.0mg)；组分Fr.2.6使用CHCl₃-MeOH (1：1，v/v)在Sephadex LH-20凝胶柱上进行分离，得到化合物1(105mg)。

实施例2化合物结构鉴定

通过解析其NMR、MS和电子圆二色谱图(ECD)计算数据确定新化合物的平面结构和立体结构。

化合物1，无色无定形粉末，比旋光度[α]²⁵ _D＝(c 0.001,MeOH)，紫外吸收UV(MeOH)λmax nm，阳离子HR-ESI-MS在m/z 434.2644处给出[M+H]⁺峰，因此该化合物分子式为C₂₈H₃₅NO₃，不饱和度为12。化合物1的氢谱数据以及连接的质子的耦合常数表明在δ_H (1.74,3H,s,H₃-23)处存在叔甲基，在δ_H(0.73,3H,d,J＝6.1Hz,H₃-11；0.95,3H,d,J ＝6.7Hz,H₃-22)处存在两个仲甲基，在δ_H(5.13and 4.96,2H,both s,H₂-12)处存在一个环外亚甲基，在δ_H(4.13,1H,d,J＝9.8Hz,H-7；4.19,1H,t,J＝9.7Hz,H-14；2.99,1H, d,J＝2.4Hz,H-21)处存在三个氧化次甲基，在δ_H(5.28,1H,br s,H-19)处存在一个烯基次甲基，在δ_H(7.22-7.30,5H)处具有典型的单个取代苯基。它的碳谱显示28个碳共振，结合DEPT和HSQC光谱，观察到其中包括三个sp³甲基，三个sp³亚甲基，10个sp³次甲基，一个sp³季碳，一个sp²环亚甲基，六个sp²烯烃次甲基和四个sp²季碳(三个烯烃碳和一种酰胺羰基)。并通过对其2DNMR光谱的分析来确定化合物1的完整结构。¹H-¹H COSY(图 1)和HSQC光谱表明存在片段-CH₂(10)-CH(3)-CH(4)-CH(5)-CH₃(11)-,-CH(7)-CH(8)-CH(13)- CH(14)-CH₂(15)-CH(16)-CH₂(17)-,-CH(7)-CH(8)-CH(20)-CH(21)-,和CH(2′)至CH(6′)。在H MBC光谱中(图1)，观察到C-1/H-3,C-1/H-4,C-9/H-4,C-9/H-5,C-5/H-7,C-6/H-7, C-12/H-7,C-8/H-7之间碳氢远程相关确定了苯丙氨酸部分(环A和B)。在HMBC光谱中观察到H-8(δ_H 2.19,t,10.0Hz)与C-1、C-4(δ_C 47.9)、C-9的相关性，以及H-4(δ_H 2.49,m)与C-21(δ_C 75.6)的相关性，表明五元环C通过C-8和C-9与环B稠合。通过H-19 (δ_H 5.28,br s)与C-17(δ_C 43.4),C-21,C-22(δ_C138.9)，C-23(δ_C 27.7)以及H-22(δ_H 0.95, d,6.7)与C-15(δ_C 44.4)，C-17(δ_C 43.4)的HMBC相关性表明存在八元环D。另外，H-1 0(δ_H 2.76,2.69)与C-3(δ_C 54.5)，C-4(δ_C 47.6),C-1′(δ_C 138.7)，C-2′/C-6′(δ_C 131.1)的相关性揭示了苯基通过C-10与C-3相连接。化合物1的¹H和¹³C NMR光谱与以前从内生真菌P homopsis sp.shj2分离的PhophochachalasinA的光谱比较，与Isodon eriocalyx var.Laxif L ora(疏花毛萼香茶菜)存在联系，表明这两种化合物具有相同的5/6/5/8稠合的四环细胞松弛素环系统(环A-D)。这两种化合物之间明显的区别是通过7-OH和14-OH之间的脱水反应形成了一个新的五元环氧单元(环E)。结合HR-ESI-MS数据，证明与C-8(δ_C 51.3)和C-1 3(δ_C 51.7)相比，C-8(δ_C 41.9)和C-13(δ_C42.5)在化合物1中的化学位移具有一定的偏移。因此，上述证据也推导了C-7通过氧原子与C-14的连接。

再通过对NOESY光谱的分析来确定化合物1的相对构型。H-8/H-14，H-14/H-20和H-20/H-16之间的NOE相关性(图2)表明这些质子的β取向。观察到H-7/H-13和H-13/ H-21，表明它们在同一平面并被分配为α方向。

化合物1的绝对构型是通过使用时间依赖性密度泛函理论(TDDFT)比较实验和计算的 ECD光谱来确定的。两种可行的配置3S，4R，5S，7S，8R，9R，13R，14R，16R，20S， 21R和3R，4S，5R，7R，8S，9S，13S，14S，16S，20R，21S(1和ent-1)分别在B3LYP/6-31+G (d，p)浓度下使用MeOH的PCM溶剂模型进行计算。计算出的ECD光谱图与实验光谱图非常吻合(图3)，表明其绝对构型为3S，4R，5S，7S，8R，9R，13R，14R，16R，20S， 21R。综合前述结果确定了化合物1的结构。

化合物2，无色针状，比旋光度[α]²⁵ _D＝(c 0.001,MeOH)，紫外吸收UV(MeOH)λmaxnm，阳离子HR-ESI-MS在m/z 516.2733处给出[M+Na]⁺峰，因此该化合物分子式为C₃₀H₃₉NO₅，不饱和度为12。化合物2的氢碳谱图与苯甲酰胆碱A相似，只是后者的C-21处的羟基被化合物2的乙酰氧基取代。观察到两种化合物之间的42amu的分子量差异，以及来自甲基酯基团(δ1.99，3H，s)和H-21(δ3.71，1H，d，5.0)与C-24(δ173.1)的质子的强HMBC相关性(图1)表明化合物2中C-21存在乙酰氧基。通过解析NOESY数据确定化合物2的相对构型(图2)。如预期的那样，化合物2的实验ECD光谱(图3)与计算的光谱完全匹配。因此，将化合物2的绝对构型确定为3S，4R，5S，7S，8R，9R，13R，14R，16R，20S，21R。综合前述结果确定了化合物2的结构。

经过对所分离的化合物1、化合物2的细胞毒性和免疫抑制活性进行的评估，实验结果表明化合物1对小鼠脾细胞不具有免疫抑制活性，化合物2对小鼠脾细胞有较低的细胞毒性且具有明显的免疫抑制活性。且对化合物2进行了CN/NFAT信号通路上的机制机理的研究，为开发新型的高效低毒的免疫抑制剂提供了可能。

实施例3化合物2的钙调蛋白磷酸酶抑制活性

实验方案：

将CNA稀释成合适的酶溶液备用，取5ml试管若干置于冰上，分别依次加入10μL药和 10μL酶液于冰上孵育5min，加180μL测活液于30℃水浴反应20min，加入1800μL终止液终止反应，720型分光光度计上测定OD₄₁₀值。

空白对照：10μL酶稀释液+10μL Buffer

酶：10μL酶+10μL Buffer

对照组：10μL酶稀释液+10μL药

酶+药：10μL酶+10μL药

注：Buffer为溶解药所用的溶液

按以下公式计算药物对CNA的相对抑制率：

相对抑制率(％)＝[1-(OD_药+酶-OD_药对照)/OD_酶]×100％

实验结果见图4

实验结果分析：

以pNPP为底物，检测单体化合物化合物2对CN活力的影响，由图4可知：化合物2 的浓度越高，对CN的抑制率越高，呈现浓度依赖性，化合物2半抑制浓度为IC₅₀＝17.89±0.40μMμM。

实施例4化合物2对小鼠脾细胞的毒性作用

动物材料：SPF条件下饲养的BLAB/c小鼠(雌雄不拘)，规格：18～20g/只。

实验试剂：RPMI1640培养基(HyClone)、胎牛血清(四季青)、CCK-8试剂(Biosharp)、细胞专用DMSO(Boster)、红细胞裂解液(Biosharp)、台盼蓝(Sigma)、化合物2等。

实验步骤：

4.1小鼠脾细胞悬浮液的制备：

1)取小鼠，摘眼球放血后颈椎脱位处死，75％乙醇浸泡3min，取出小鼠置于无菌培养皿上，左腹侧朝上。

2)在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开腹部皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。

3)在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，放入盛有5mL培养基的离心管中。

4)钢网研磨法：将脾脏剪成几段，放置在200目的不锈钢网上，用注射器针芯轻轻研压脾脏(多压少研，放置细胞破碎)，并用移液枪吸取培养基轻轻冲洗钢网(大约3～5mL培养基)，使细胞过钢网进入溶液中，获取细胞悬浮液。

5)1000rpm离心5min后弃上清液，然后用红细胞裂解液裂解红细胞(4～5mL)，4℃裂解5 min，1000rpm离心5min，裂解两次，加入5ml含10％的胎牛血清的RPMI1640培养基制成细胞悬浮液。台盼蓝染色，细胞计数板计数活细胞达到95％以上，然后计数，用RPMI1640培养基制成细胞悬浮液(密度为5×10⁶个/ml)。

4.2毒性实验：

1)取96孔细胞培养板，每孔接种淋巴细胞悬浮液100μL、浓度为1.5×10⁷个/mL，于37℃， 5％CO₂培养箱中培养4h，待细胞稳定。

2)4h后取出细胞培养板，每孔加入用完全培养基稀释成不同浓度的化合物2或阳性对照 (CsA)，使得终浓度分别为50、25、12.5、6.25和3.125μg/mL。空白对照组加入含有0.2％DMSO 的完全培养基，每组设置3个复孔。

3)将培养板置于培养箱中培育72h。

4)培养72h后，取出细胞培养板，先在倒置显微镜下观察，后在每孔中加入20μLCCK-8 试剂。

5)继续于37℃下孵育4h后，酶标仪读取OD450，计算细胞存活率，脾细胞存活率＝OD实验组/OD空白对照组×100％。

实验结果：

表1

实验分析：从表1可知，本发明化合物2对正常小鼠的脾淋巴细胞有较弱的细胞毒性 (IC₅₀＝108.70±1.05μM)，而CsA则严重影响淋巴细胞的存活率，具有很强的细胞毒性(IC50＝10.89±0.78μM)，可见化合物2一定浓度范围内对淋巴细胞的毒性很低。

实施例5化合物2对Con A诱导的小鼠脾细胞的免疫抑制活性的影响

实验试剂：(Con A)刀豆蛋白A(Sigma)、RPMI1640培养基(HyClone)、胎牛血清(四季青)、CCK-8试剂(Biosharp)、细胞专用DMSO(Boster)、红细胞裂解液(Biosharp)、台盼蓝(Sigma)、化合物2等。

实验步骤：

5.1小鼠脾淋巴细胞悬液的制备

小鼠脾细胞悬浮液的制备同4.1

5.2ConA诱导脾细胞增殖及药物抑制

1)取96孔细胞培养板，接种所需脾细胞悬浮液为每孔100μl、浓度为5×10⁶个/ml，于 37℃，5％CO₂培养箱中培养。

2)分组加药：

空白对照组只加200μl的RPMI-1640完全培养液；阴性对照组加100μL完全RPMI-1640 培养液；Con A阳性对照组将每孔加入100μl的含Con A(终浓度为5μg/mL)的 RPMI-1640完全培养液；药对照组不加脾淋巴细胞只加200μl同时含有Con A(终浓度为5 μg/m L)和不同浓度的化合物2；药物组分别加100μl含Con A(终浓度为5μg/m L)和化合物2(终浓度为3μM、6μM、12μM、25μM、50μM)的RPMI-1640完全培养液，终体积为200μl，每孔设置三个复孔，将96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中连续培养48h。

3)铺完板后，将96孔板放置于CO₂培养箱中培养48h，培养时间到后取出96孔板每孔加入20ul CCK-8试剂，再置于培养箱中避光继续孵育4h。用酶标仪于450nm处测定吸光值。

实验结果：见图5

实验分析：

在ConA诱导脾细胞增殖实验中，ConA诱导的是脾细胞中的T细胞增殖，控制组也就是阴性对照不加药组设为细胞存活率为100％，其余组都用终浓度为5μg/ml的ConA作诱导增殖处理，由图可知，化合物2对Con A诱导的脾淋巴细胞具有一定的抑制作用，化合物2浓度越高，细胞存活率越小，呈现浓度依赖性。化合物2对Con A诱导的脾淋巴细胞半抑制浓度为IC50＝21.56±1.69μM。

实施例6化合物2对LPS诱导的小鼠脾细胞的免疫抑制活性测定

实验试剂：LPS(Sigma)、RPMI1640培养基(HyClone)、胎牛血清(四季青)、CCK-8 试剂(Biosharp)、细胞专用DMSO(Boster)、红细胞裂解液(Biosharp)、台盼蓝(Sigma)、化合物2等。

实验步骤：

6.1小鼠脾淋巴细胞悬液的制备

小鼠脾细胞悬浮液的制备同4.1

6.2LPS诱导脾细胞增殖及药物抑制

2)分组加药：

空白对照组只加200μl的RPMI-1640完全培养液；阴性对照组加100μL完全RPMI-1640 培养液；LPS阳性对照组将每孔加入100μl的含Con A(终浓度为10μg/m L)的RPMI-1640 完全培养液；药对照组不加脾淋巴细胞只加200μl同时含有LPS(终浓度为10μg/m L)和不同浓度的化合物2；药物组分别加100μl含LPS(终浓度为5μg/m L)和化合物2(终浓度为 3μM、6μM、12μM、25μM、50μM)的RPMI-1640完全培养液，终体积为200μl，每孔设置三个复孔，将96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中连续培养48h。

实验结果：见图6

实验分析：

在LPS诱导脾细胞增殖实验中，LPS诱导的是脾细胞中的B细胞增殖，控制组也就是阴性对照不加药组设为细胞存活率为100％，其余组都用终浓度为10μg/ml的LPS作诱导增殖处理，由图可知，化合物2对LPS诱导的脾淋巴细胞具有一定的抑制作用，化合物2浓度越高，细胞存活率越小，呈现浓度依赖性。化合物2对LPS诱导的脾淋巴细胞半抑制浓度为IC50＝78.50±1.31μM。由图5和图6可知化合物2对T细胞的抑制效果比对B细胞的效果相对较显著些。

实施例7免疫荧光检测

7.1实验仪器与试剂

7.1.1实验仪器

盖玻片、六孔板、载玻片、激光共聚焦显微镜、免疫湿盒

7.1.2实验试剂

兔抗鼠NFAT1抗体(NFAT1(D43B1)XP Rabbit mAb)、荧光标记的羊抗兔IgG(H+L)(Anti-rabbit IgG(H+L),F(ab')2Fragment(Alex)、PBS、4％多聚甲醛、Triton X-100、DAPI、 BSA。

7.2实验材料与方法

7.2.1实验材料

小鼠原代脾细胞

7.2.2实验方法

1.细胞培养及处理

将制备好的小鼠脾淋巴细胞悬液加入到6孔细胞培养板中，每孔1m L。Con A阳性对照组将每孔加入1m L的含Con A(终浓度为5μg/m L)的RPMI-1640完全培养液；药物组分别加1m L含Con A(终浓度为5μg/m L)和化合物2药物(终浓度为10μM、30μM、 50μM)的RPMI-1640完全培养液，终体积为4m L，将6孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中连续培养48h，48h后，500×g离心5min收集细胞。

2.免疫荧光分析(整个步骤在EP管中进行最后转移到载玻片上)

(1)将处理过的T细胞用PBS洗涤2次，弃上清后轻弹管底，使细胞适当。

(2)加入4％多聚甲醛固定细胞1m L，室温下固定15min。固定细胞时间视细胞情况适当延长或者缩短。(10-30min)

(3)500×g离心5min，弃上清，PBS洗涤2次，每次10min。

(4)再用0.1％Triton X-100(先配成20％的母液，然后稀释200倍)室温通透细胞膜15min，以便在后续步骤中DAPI(复染核)渗入细胞而起到染核的作用。

(5)500×g离心5min，弃上清，PBS洗涤3次，每次10min。

(6)加入5％BSA封闭1小时。

(7)500×g离心5min，弃上清，加入已经稀释好的NFAT1一抗(用PBS按照1:100稀释)300μL,4℃过夜或室温孵育2h。

(8)500×g离心5min，弃上清，PBS洗涤3次每次10min。

(9)500×g离心5min，弃上清，加入荧光标记的羊抗兔IgG(H+L)(用PBS按照1:500稀释)作为二抗，室温孵育1h。

(10)500×g离心5min，弃上清，PBS洗涤3次，每次10min。

(11)向细胞中加入300μL的DAPI(核染液)，室温染色5min。

(12)激光共聚焦显微镜下观察荧光强度。

7.3.实验结果：见图7

7.4.实验结果分析

采用免疫荧光法检测化合物2对CN/NFAT途径的影响。结果，我们发现阴性对照T细胞中有少量NFAT1蛋白存在于细胞质中。Con A刺激后，细胞迅速增殖，并且大量的NFAT 蛋白在细胞核中表达。然而，在使用化合物2作用于T细胞后，NFAT蛋白逐渐减少，表明化合物2可以以剂量依赖的方式抑制细胞质中NFAT向核的转移。

实施例8WB实验检测化合物2对小鼠脾细胞内NFAT蛋白的表达量的影响

实验试剂：Con A(Sigma)、RPMI1640培养基(HyClone)、胎牛血清(四季青)、CCK-8试剂(Biosharp)、细胞专用DMSO、红细胞裂解液(Biosharp)、台盼蓝(Sigma)、化合物2、PMSF、RIPA、5×Protein Loading Buffer、PBS(Boster)、anti-NFAT antibody(BM5047，Boster), anti-β-actin antibody(BM0627，Boster),goat anti-mouse IgG(BA1050，Boster)and goat anti-rabbit IgG(BA1054，Boster)。红细胞裂解液(Biosharp)、台盼蓝(Sigma)、化合物2等。

实验步骤：

总蛋白的制备：如上4.1所示方法制备得到小鼠脾细胞悬浮液，将制备好的细胞悬浮液铺于6孔板中,每孔1mL，孵育12小时过夜，次日分别加10、30、50μM的化合物2和20μM的CsA，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育48小时。将处理后的细胞转移至2ml EP管中，2000rpm离心5min收集细胞，并用PBS溶液清洗一遍。2000rpm离心5min收集细胞，吸弃上清液，加入400μL含PMSF(10:990)的裂解液，然后吹匀，涡旋30s，置于冰上静置15min(每隔 5min，涡旋样品30s)。4℃下12000rpm离心5min，小心将细胞裂解后的上清液转到新的1.5mL EP管中，取160μL的上清液向样品中加入40μL 5×Protein Loading Buffer，在沸水中煮10min，既得制备好的蛋白样品，将蛋白样品分装(20μL/管)，置于-20℃保存备用。

(1)电泳：用得到的细胞总蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。

(2)转膜：在电泳缓冲液中，250mA冰浴转膜1.5h，将蛋白转移到PVDF膜上。

(3)封闭：将PVDF膜转入含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液配制的封闭液中，室温封闭4h或4℃过夜。

(4)洗涤：用PBS加0.1％Tween-20洗涤3次×10min。

(5)一抗结合：用含5％脱脂奶粉的TBST稀释一抗(称1.0g脱脂奶粉，加入20mLTBST 混匀)，稀释比例为1:1000，即1μL一抗加入到1000μL 5％脱脂奶粉中，将封口膜用水固定在桌面上，揭开封口膜，用移液枪将配制好的一抗转移至封口膜上，注意不要产生气泡，PVDF 膜覆盖在稀释的抗体上。

(6)二抗结合：在室温条件下，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min；用含5％脱脂奶粉的TBST稀释二抗(1:5000)，即0.1μL二抗加入到1000μL 5％脱脂奶粉的TBST中，将封口膜用水固定在桌面上，揭开封口膜，用移液枪将配置好的二抗吸在封口膜中央，不要产生气泡，PVDF膜正面朝下盖在稀释的抗体上，用盒子盖住，并用水封住盆口边缘，室温下孵育1h，之后回收二抗。

(7)显色：在相应大小的塑料盒或培养皿中放入滤膜(沥掉多余的液体)，加入化学发光液于PVDF膜上，轻轻摇动，反应3-5min。用保鲜膜将PVDF膜包裹起来，在滤纸上挤掉多余的发光液。

(8)显影定影：在暗室中将印有蛋白的PVDF膜表面朝向X光片进行曝光。曝光完成后，取出X光片，将曝光好的胶片放入显影液中显影，待胶片出现条带后，转移至定影液中，定影完全后，取出胶片，用自来水冲洗并晾干，拍照留存(扫描)，用Image J对结果进行定量分析。

实验结果：见图8、图9

实验分析：

由条带图8可以看出，脾细胞经Con A诱导后，去磷酸化程度明显上升。加入不同浓度的化合物2和阳性对照(CsA)处理后，去磷酸化程度降低，且随着药物浓度增大，脾细胞细胞去磷酸化程度越低。由图9可知，NFAT活化的过程可以被化合物2所抑制。因此，化合物2是一种潜在的能抑制细胞内磷酸化的NFAT蛋白去磷酸化的免疫抑制剂。

实施例9ELISA实验检测化合物2对小鼠脾细胞内细胞白介素-2含量的影响

实验试剂：Con A(Sigma)、RPMI1640培养基(HyClone)、胎牛血清(四季青)、CCK-8试剂(Biosharp)、细胞专用DMSO(Boster)、ELISA试剂盒(A105604-96T，上海抚生)、红细胞裂解液(Biosharp)、台盼蓝(Sigma)、化合物2等。

实验步骤：

7.1待测样品的制备

如上4.1所示方法制备小鼠脾淋巴细胞悬液，将制备好的细胞悬浮液铺于6孔板中,每孔 1mL,孵育12小时过夜，次日分别加10、30、50μM的化合物2和20μM的CsA，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育48小时。培养结束后，收集细胞培养上清检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(pH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清。

7.2ELISA法测IL-2含量

1)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3)加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

9)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

实验结果：见图10

实验分析：

脾细胞经Con A诱导后，细胞迅速活化，IL-2含量急剧升高，加入不同浓度的化合物2 和阳性对照(CsA)处理细胞，结果显示，化合物2可以明显降低IL-2含量，浓度越大，抑制作用较大，呈现出浓度依赖型。化合物2可以抑制脾细胞中IL-2的产生，从而具有较好的免疫抑制活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.细胞松弛素类化合物，其特征在于，结构式如下所示：

2.权利要求1所述的细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，MeOH-H₂O的体积比为1:1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，组分Fr.2.5在RP-18硅胶柱上用MeOH-H₂O梯度洗脱得到权利要求1所述化合物。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵物为将天门冬拟茎点霉接种至大米培养基中，避光静置发酵培养所得的发酵物。

6.权利要求1所述的化合物在制备免疫抑制剂方面的应用，所述化合物的结构式为：

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述天门冬拟茎点霉为Phomopsisasparagi DHS-48，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2021318，保藏日2021年3月31。

8.一株产生权利要求1所述细胞松弛素类化合物的真菌Phomopsis asparagi DHS-48，其特征在于，该真菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2021318，保藏日2021年3月31。