CN110724096A - 一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱Malaysiensin及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱Malaysiensin及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱Malaysiensin及其制备方法和应用，该化合物由链霉菌Streptomyces sp.DSM 4137进行SFM固体培养基发酵并对发酵产物进行分离纯化获得。本发明化合物具有显著抑制ConA诱导T细胞增殖，其免疫抑制作用比临床广泛使用的免疫抑制剂环孢菌素A相当，作用机制研究显示Malaysiensin为靶向NFAT信号通路发挥免疫抑制活性，是一种高效的免疫抑制剂，可用于制备针对器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制药物。

Description

一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱Malaysiensin及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱Malaysiensin及其制备方法和应用。
背景技术
免疫抑制药物是指针对机体免疫应答有抑制作用的药物，是针对于自身免疫性疾病而研发出来的，能够抑制与免疫反应有关细胞的增殖和功能，能降低机体的免疫反应。常用的免疫抑制剂主要有五类：(1)糖皮质激素类，如可的松和强的松；(2)微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；(3)抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；(4)多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；(5)烷化剂类，如环磷酰胺等。临床上用于治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应的免疫抑制药物主要有环孢菌素A(CsA)、他克莫司(FK506)等，虽然此类药物在临床的疗效十分确切，但却具有不同程度的肝肾毒性或神经毒性等，长期服用会引发高脂血症、代谢性骨病甚至诱发肿瘤的发生；同时，这些免疫抑制药物的价格也比较昂贵。因此，获得一种低毒、有效、价格低廉的新的免疫抑制药物具有重大意义。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱Malaysiensin及其制备方法和应用，该化合物具有显著抑制ConA诱导T细胞增殖，其免疫抑制作用比临床广泛使用的免疫抑制剂环孢菌素A相当，作用机制研究显示Malaysiensin为靶向NFAT信号通路发挥免疫抑制活性，是一种高效的免疫抑制剂，可用于制备针对器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制药物。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，该化合物结构式(I)为：
该化合物命名为Malaysiensin。
本发明提供一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱的制备方法，包括以下步骤：
S1、将链霉菌进行发酵培养；
S2、发酵培养结束后，用甲醇充分浸泡，过滤获取甲醇提取物，减压浓缩，回收甲醇，获得菌株发酵产物；
S3、将发酵产物进行梯度洗脱，洗脱剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、甲醇的混合溶液，梯度洗脱后残余物在硅胶柱上进行真空液相色谱洗脱，获得9个组分，即组分1-组分9，再采用反相色谱柱，以甲醇和水为线性梯度，用高效液相色谱法分析获得的每个组分；再以甲醇溶液为溶剂，对组分6用葡聚糖凝胶进行色谱分离，再用C18反相柱纯化，得到亚组分6-4；
S4、取洗脱产物6-4，通过高效液相色谱进行洗脱，以甲醇和水混合溶液为流动相，再用C18反相柱纯化，得到具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱。
进一步的，步骤S1中，所述链霉菌为Streptomyces sp.DSM 4137，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日：2018年08月01日，保藏编号：CCTCC No：M 2018512。
进一步的，步骤S3中，所述梯度洗脱的洗脱剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、甲醇由体积比9：6：6：1至9：6：6：10。
进一步的，步骤S3中，所述硅胶柱的硅胶尺寸为100-200目。
进一步的，步骤S3中，所述葡聚糖凝胶为sephadex LH-20。
进一步的，步骤S3中，所述甲醇溶液的体积浓度为60～80％。
进一步的，步骤S4中，所述流动相由甲醇和水按体积比为8:1混合制得。
本发明任一项所述的具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱应用于制备免疫抑制剂。
本发明任一项所述的具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱应用于制备针对器官移植或自身免疫性疾病的免疫抑制药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱Malaysiensin，该化合物具有显著抑制ConA诱导T细胞增殖，其免疫抑制作用比临床广泛使用的免疫抑制剂环孢菌素A相当，作用机制研究显示Malaysiensin为靶向NFAT信号通路发挥免疫抑制活性，是一种高效的免疫抑制剂，可用于制备针对器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制药物。
附图说明
图1：化合物Malaysiensin的(+)-HRESI-MS谱图；
图2：化合物Malaysiensin的1H-NMR谱图(氘代氯仿)；
图3：化合物Malaysiensin的13C-NMR谱图(氘代氯仿)；
图4：化合物Malaysiensin的DEPT-135谱图(氘代氯仿)；
图5a：化合物Malaysiensin的1H-1H COSY谱图(氘代氯仿)；
图5b：化合物Malaysiensin的1H-1H COSY相关；
图6：化合物Malaysiensin的HSQC谱图(氘代氯仿)；
图7a：化合物Malaysiensin的HMBC谱图(氘代氯仿)；
图7b：化合物Malaysiensin的HMBC相关；
图8a：化合物Malaysiensin的MS2谱图；
图8b：化合物1的ESIMS碎裂方式及主要碎片离子；
图9a：化合物Malaysiensin的ROESY谱图(氘代氯仿)；
图9b：化合物1的ROESY相关；
图10：实施例3Con A诱导T细胞增殖实验结果图；
图11实施例4小鼠脾细胞毒活性实验结果图；
图12：实施例5单向混合淋巴细胞反应实验结果图；
图13：实施例6化合物I对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖中细胞因子IL-2mRNA转录的影响的实验结果图；
图14：实施例7ELISA法测定化合物I对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖中IL-2的含量的实验结果图；
图15-a和15-b：实施例8蛋白免疫印记法(Western blotting，WB)测定化合物I对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖中NFAT的抑制作用的实验结果图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-化合物的制备
一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其制备方法包括以下步骤：
S1、将链霉菌Streptomyces sp.DSM 4137进行发酵培养；链霉菌Streptomycessp.DSM 4137，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日：2018年08月01日，保藏编号：CCTCCNo：M 2018512；链霉菌Streptomyces sp.DSM 4137的发酵培养方法参见本发明人在先申请的专利，公开号CN 109467579A，发明名称：一种具有免疫抑制活性的PKS I型聚酮类化合物及其制备方法和应用。
S2、发酵培养结束后，用甲醇充分浸泡，过滤获取甲醇提取物，减压浓缩，回收甲醇，获得6.2g菌株发酵产物；
S3、将发酵产物进行梯度洗脱，洗脱剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、甲醇由体积比9：6：6：1至9：6：6：10，梯度洗脱后残余物在100-200目硅胶柱上进行真空液相色谱洗脱，获得9个组分，即组分1-组分9，再采用反相色谱柱，以甲醇和水为线性梯度，用高效液相色谱法分析获得的每个组分；再以70v/v％甲醇溶液为溶剂，对组分6用sephadex LH-20进行色谱分离，再用C18反相柱纯化，得到亚组分6-4(12.6mg)；
S4、取洗脱产物6-4，通过高效液相色谱进行洗脱，流动相由甲醇和水按体积比为8:1混合制得，再用C18反相柱纯化，得到目标化合物1(2.0mg)。后经确证得到四氢喹啉类生物碱Malaysiensin。
实施例2-化合物结构确证
运用多种光谱(IR，UV，CD)、波谱(1H NMR，13C NMR，DEPT，H-HCOSY，HMQC，HMBC，NOESY)和MS(ESI-MS，HRMS)等结构鉴定技术，确定所得到的活性成分化学结构，发现新颖结构活性成分。结果见图1-图3。
Malaysiensin(化合物1)，白色固体，比旋光度[α]25 D＝+10(c 0.001,MeOH)，紫外吸收UV(MeOH)λmax 202,332nm，阳离子HRESI-MS在m/z 451.2193处给出[M+Na]+峰(图1)，因此该化合物分子式为C24H32N2O5，不饱和度为10。化合物1的氢碳谱(图2、图3、表1)表明7个不饱和度源于一个酰胺羰基、一个酮羰基和五个碳碳双键。因此，推测分子为三环结构。DEPT谱(图4)表明化合物1有三个烯丙基甲基、一个甲氧基、六个亚甲基、四个次甲基和十个季碳。随后，通过一系列二维核磁分析，包括1H-1H COSY(图5a,5b),HSQC(图6)和HMBC(图7a,7b)，确定了该结构。1H-1H COSY谱提示该分子含有4个自旋系统，-CH(5)-CH(6)-,-CH2(8)-CH(9)-,-CH2(11)-CH2(12)-和-CH2(4′)-CH2(5′)-。芳香质子H-5(δH 6.54,d,J＝8.5Hz)与H-6(δH 7.53,dd,J＝8.5Hz,2.1Hz)的邻位耦合，H-6(δH 7.53,dd,J＝8.5Hz,2.1Hz)与H-2(δH6.66,d,J＝2.1Hz)的间位耦合表明存在1,3,4-三取代苯环部分。在HMBC谱中观察到C-4/H-2,C-6/H-2,C-7/H-2之间碳氢远程相关确定了苯环的归属，并揭示了羰基官能团的取代位于C-1。观察到从H2-8(δH 3.11,dd,J＝16.8Hz,4.3Hz；2.86,dd,J＝16.8Hz,5.8Hz)到C-2,C-3，C-4和NH质子(δH 4.49,brs)到C-3,C-5，C-9(δC67.2)之间的远程耦合表明存在1，2，3，4-四氢喹啉-6-羧酰胺。从亚甲基质子H2-12(δH 2.09,td,J＝12.0Hz,5.2Hz；6.54,td,J＝12.0Hz,4.8Hz)和三个烯丙基甲基质子H-15,H-17,H-16到两个烯烃季碳C-13(δC 126.7)和C-14(δC 124.7)的HMBC相关揭示了2，3-二甲基戊-2-烯部分。甲氧基质子H3-19(δH 3.41,s)与亚甲基碳C-18(δC 74.9)之间的HMBC相关表明甲氧基在C-18处被取代。此外，从氧亚甲基质子H2-18(δH 3.66,d,J＝9.3Hz；3.50,d,J＝9.3Hz)到C-9，C-10，C-11(δC 33.3)，亚甲基质子H2-11到C-9氧次甲基碳和C-10季碳(δC 57.6)的远程耦合证实了这些部分结构的连接。根据二维核磁分析数据，其余5个碳和3个不饱和单元归属于羟基环戊烯酮部分。1H-1H COSY谱显示两个相邻的亚甲基CH2-4′(δH 3.66,d,J＝9.3Hz；δC 32.1)和CH2-5′(δH 2.64,d,J＝8.6Hz；δC 25.6)。观察到一个从H2-4′到C-1′(δC 197.5)和3′-OH(δH 13.69,brs)到C-3′(δC172.7)HMBC交叉峰。C-2′(δC 115.1)和C-3′的化学位移进一步表明在C-3′处存在一个含羟基取代的环戊-2-烯酮。酰胺质子(δH 7.82,brs)与C-3′和C-7羰基的HMBC相关揭示了这5个碳部分通过酰胺键与C-7相连，从而建立了1的完整平面结构。在阳离子ESIMS观察到源于羟环戊烯酮部分丢失产生的m/z 316片段进一步证实了这一判断(图8a,8b)。随后通过NOESY图谱(图9a,9b)确定了1的相对构型。Ha,b-18/9-OH，H3-19/9-OH和Hb-11/H-9之间的NOE相关表明它们是相互顺式关系。当H-9被假定为伪轴α取向质子和R*构型时，基于上述结果，确定了10的S*构型。
表1.1H(500MHz)and 13C NMR(125MHz)spectroscopic data(J in Hz)for 1inCDCl3
Figure BDA0002222081740000061
该化合物确证结构式为式(I)：
Figure BDA0002222081740000062
实施例3-Con A诱导T细胞增殖实验
1.实验材料
1.1实验动物
健康Balb/c小鼠，雌性，体重18-20g/只，年龄6-8周，购自海南医学院，饲养在25℃左右，相对湿度50-80％的环境下。
1.2药品和试剂
刀豆蛋白A(Sigma)、CCK-8(Biosharp)、RPMI-1640培养液(HyClone)、胎牛血清(四季青)、红细胞裂解液(Biosharp)、台盼蓝(Sigma))等。
1.3主要仪器
CO2细胞培养箱(Galaxy R，英国RS Biotech公司)、超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司)、倒置显微镜(BX51-32P01，日本Olympus)、高压灭菌锅(HVE-50，日本株式会社)、离心机(DM0412S，美国SCILOGEX)、酶标仪(ST-360，上海科华实验系统有限公司)、96孔细胞培养板(3599，美国Costar)、恒温水浴锅(DK-S28，上海精宏仪器设备有限公司)、移液枪、10ml枪头、5ml枪头、1ml枪头、15ml离心管、血球计数板、盖玻片、镊子、剪刀、酒精灯、冰箱、注射器等。
2.实验方法
2.1小鼠脾淋巴细胞悬液的制备
a)颈椎脱臼处死小鼠，75％酒精浸泡3min,将小鼠置于已准备好的无菌培养皿中，小鼠背部朝上，用灭菌消毒过的镊子稍提起小鼠左侧背部皮肤，用灭菌消毒过的剪刀，剪开腹部皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。
b)在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，放入事先准备好的5ml培养基的离心管中。
c)先用3ml培养基润洗200目不锈钢网，将离心管中的小鼠脾脏连同培养基倒入200目不锈钢网上，200目不锈钢网放在另一干净的无菌培养皿中，用注射器针心轻轻研压脾脏(多压少研，防止细胞破碎)，并用移液枪吸取少量培养基轻轻冲洗钢网(大约3～5ml培养基)，使细胞过钢网进入溶液中，获取细胞悬浮液。
d)收集细胞悬浮液于离心管中，离心1000rpm*5min后弃上清液，，然后用红细胞裂解液裂解红细胞4～5ml，裂解5min，1000rpm*5min离心，用红细胞裂解液再裂解一次后，加入5ml含10％的胎牛血清的RPMI1640培养基制成细胞悬浮液。台盼蓝染色，细胞计数板计数活细胞达到95％以上，然后计数，用RPMI1640培养基制成细胞悬浮液(密度为5*106个/ml)。
2.2ConA诱导脾细胞增殖及药物抑制
1)取96孔细胞培养板，接种所需脾细胞悬浮液为100μl、浓度为5*106个/ml，于37℃，5％CO2培养箱中培养12h(过夜再加药，使细胞修复好)。
2)培养一定时间后，分组加药：
a.空白对照组(只加200μL完全RPMI-1640培养液)3个复孔。
b.阴性对照组(加100μL完全RPMI-1640培养液+100μL脾细胞悬液)3个复孔。
c.ConA对照组(50μL 20μg/mL的ConA+50μL完全RPMI-1640培养液+100μL脾细胞悬液)(保持ConA的终浓度为5μg/mL，3个复孔)。
d.药对照组(分别加50μL不同浓度的化合物1+50μL 20μg/mL的ConA+100μL完全RPMI-1640培养液)(1个孔)。(化合物1的终浓度为20、40、80μM)
e.实验组(50μL不同浓度的化合物1+50μL 20μg/mL ConA+100μL脾细胞悬液)(5个复孔)。(化合物1的终浓度为10、20、40、60、80μM其阳性对照CsA为20μM)
每孔终体积为200μL。
3)铺完板后，将96孔板放置于CO2培养箱中培养24h、48h、72h，培养时间到后取出96孔板每孔加入20ul CCK-8试剂，再置于培养箱中避光继续孵育4h。用酶标仪于450nm处测定吸光值。
Figure BDA0002222081740000081
3.实验结果
如图10示，IC50(CsA)＝20.41±0.61μM，IC50(化合物1)＝29.28±0.40μM
4.实验分析
在ConA诱导脾细胞增殖实验，各组都用终浓度为5μg/ml的ConA作诱导增殖处理，当用10μM、20μM的化合物1处理后，抑制效果不太明显，抑制率为8.90％、18.75％；当用40μM、60μM、80μM的化合物1处理后，抑制效果逐渐显著，抑制率为46.41％、67.95％、84.15％，其抑制作用呈现剂量依赖性；阳性对照为20μM的CsA，抑制效果较为显著，抑制率达到52.47％。化合物1对ConA诱导脾细胞增殖的半抑制浓度为IC50(化合物1)＝29.28±0.40μM。
实施例4-小鼠脾细胞毒活性实验
1.实验材料
1.1实验动物
SPF条件下饲养的BLAB/c小鼠(雌雄不拘)，规格：18～20g/只，年龄6-8周，购自海南医学院，饲养在25℃左右，相对湿度50-80％的环境下。
1.2药品和试剂
RPMI1640培养基、胎牛血清、CCK-8试剂盒、细胞专用DMSO、待测样品
2.实验方法
2.1小鼠脾淋巴细胞悬液的制备
a)取小鼠，摘眼球放血后颈椎脱位处死，75％乙醇浸泡3min，取出小鼠置于无菌培养皿上，左腹侧朝上。
b)在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开腹部皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。
c)在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，放入盛有5ml培养基的离心管中。
d)钢网研磨法：将脾脏剪成几段，放置在200目的不锈钢网上，用注射器针芯轻轻研压脾脏(多压少研，放置细胞破碎)，并用移液枪吸取培养基轻轻冲洗钢网(大约3～5ml培养基)，使细胞过钢网进入溶液中，获取细胞悬浮液。
e)离心1000rpm*5min后弃上清液，然后用红细胞裂解液裂解红细胞(4～5ml)，4℃裂解5min，1000rpm*5min离心，加入5ml培养基制成细胞悬浮液，计数。
2.2、毒性试验:
a)取96孔细胞培养板，每孔接种淋巴细胞悬浮液100ul、浓度为1.5*107个/ml，于37℃，5％CO2培养箱中培养4h，待细胞稳定。
b)4h后取出细胞培养板。每孔加入用完全培养基稀释成不同浓度化合物或阳性对照(CsA)，使得终浓度分别为1,5,10,15,20,30,40μM。空白孔加入含0.2％的DMSO，每组设置5个复孔。去掉最大值去掉最小值，以减少偶然误差(实际n＝3)。
c)将培养板置于培养箱中培育68h。
d)培养68h后，取出细胞培养板，先在倒置显微镜下观察，后在每孔中加入20ulCCK-8试剂。
e)继续于37℃下孵育4h，用酶标仪于450nm波长处检测吸光度(OD)。
f)计算细胞存活率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图。
细胞存活率＝实验组OD值/空白对照组OD值*100％
3.实验结果
如图11所示，4137-14-5-1对小鼠脾淋巴细胞的毒性(72h)，IC50(CsA)＝10.15±0.42μM，
IC50(4137-14-5-1)＝8.05±0.15μM。
4.实验分析
化合物1对正常小鼠的淋巴细胞有一定的细胞毒性，毒性和CsA相当。在同浓度范围内影响淋巴细胞的存活率，具有较强的细胞毒。
实施例5-单向混合淋巴细胞反应实验
1、实验仪器、试剂和动物
1.1实验仪器
CO2细胞培养箱、超净工作台、倒置显微镜、灭菌锅、离心机、酶标仪、96孔细胞培养板、移液枪、10μl枪头、1ml枪头、恒温水浴锅、15ml离心管、血球计数板、盖玻片、镊子、剪刀、酒精灯、冰箱、注射器。
1.2实验试剂
RPMI-1640培养液、胎牛血清、CCK-8、红细胞裂解液、丝裂霉素C
1.3实验动物
健康Balb/c小鼠和C57小鼠，雌性，体重18-20g/只,年龄6-8周，购自海南医学院，饲养在25℃左右，相对湿度50-80％的环境下。
2、实验材料与方法
2.1实验材料
两种小鼠的原代脾淋巴细胞
2.2.1实验方法
靶细胞的处理
颈椎脱臼处死小鼠，用RPMI1640培养液制成细胞悬液(密度为1×107个/mL)。
其中近交系C57BL小鼠脾细胞经丝裂霉C处理，作为反应细胞(丝裂霉素C终浓度为50μg/mL，37℃孵育40～45min，设为靶细胞①；其余未用丝裂霉素C处理的作为靶细胞②)近交系Balb/c小鼠脾细胞作为刺激细胞。
药物和细胞的共孵育
在96孔板中分别加入两种脾细胞悬液、不同浓度的药物共同孵育。其中，
(1)空白阴性对照组加入200μL含10％FBS的RPMI1640液,
(2)靶细胞对照组加入50μL10％FBS靶细胞悬液、50μL含10％FBS的1640液、100μLRPMI1640液，
(3)效应细胞对照组加入50μL10％FBS效应细胞悬液、50μL含10％FBS的RPMI1640液、100μL RPMI1640液，
(4)靶细胞+效应细胞组阳性对照加入50μL10％FBS靶细胞悬液、50μL10％FBS效应细胞悬液和100μLRPMI1640，
(5)药物对照组加入100μL含10％FBS的RPMI1640液、100μL用RPMI1640培养液稀释好的药物，
(6)药物组每孔加入50μL10％FBS靶细胞悬液、50μL10％FBS效应细胞悬液和100μL用RPMI1640培养液稀释好的药物
分别在CO2培养箱中培养48hour、72hour、96hour。等培养结束时，每孔加入20μlCCK-8，继续放入培养箱中孵育，4小时后，酶标仪读取OD450。
3.实验结果
如图12所示，IC50(CsA)＝22.71±0.13μM，IC50(化合物1)＝30.29±0.528μM
4.实验分析
在单向混合淋巴细胞反应实验中，当用10μM、20μM的化合物1处理后，抑制效果不太显著，抑制率为9.60％、17.60％；当用40μM、60μM、80μM的化合物1处理后，抑制效果逐渐显著，抑制率为43.99％、55.37％、70.52％，其抑制作用呈现剂量依赖性；阳性对照为20μM的CsA，抑制效果较为显著，细胞存活率为50.85％。化合物1对ConA诱导脾细胞增殖的半抑制浓度为IC50(化合物1)＝30.29±0.528μM。
实施例6-化合物I对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖中细胞因子IL-2mRNA转录的影响
1、实验仪器与试剂
1.1实验仪器
制冰机，EP管，离心机，-80℃冰箱，PCR仪(Eppendorf)，电泳仪(Bio-Rad)，凝胶成像仪(Bio-Rad)
1.2实验试剂
Total RNA Extraction Reagent(Vazyme,243元)，氯仿，异丙醇，75％乙醇(自己配)，DEPC水(100ml,35元)，
Figure BDA0002222081740000121
1st Strand cDNA(Vazyme，378元)，引物，2×tapMaster Mix(Vzayme,105元),琼脂糖，TAE，GV,DNA ladder
2、实验材料与方法
2.1实验材料
小鼠原代脾淋巴细胞
2.2实验方法
2.2.1小鼠原代脾淋巴细胞的制备
a)颈椎脱臼处死小鼠，75％酒精浸泡3min,将小鼠置于已准备好的无菌培养皿中，小鼠背部朝上，用灭菌消毒过的镊子稍提起小鼠左侧背部皮肤，用灭菌消毒过的剪刀，剪开腹部皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。
b)在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，放入事先准备好的5ml培养基的离心管中。
c)将离心管中的小鼠脾脏连同培养基倒入200目不锈钢网上，200目不锈钢网放在另一干净的无菌培养皿中，用注射器针心轻轻研压脾脏(多压少研，防止细胞破碎)，并用移液枪吸取少量培养基轻轻冲洗钢网(大约3～5ml培养基)，使细胞过钢网进入溶液中，获取细胞悬浮液。
d)收集细胞悬浮液于离心管中，离心1000rpm*5min后弃上清液，，然后用红细胞裂解液裂解红细胞4～5ml，裂解5min，1000rpm*5min离心，用红细胞裂解液再裂解一次后，加入5ml含10％的胎牛血清的RPMI1640培养基制成细胞悬浮液。台盼蓝染色，细胞计数板计数活细胞达到95％以上，然后计数，用RPMI1640培养基制成细胞悬浮液(密度为5*106个/ml)。
2.2.2小鼠原代脾淋巴细胞的培养及总RNA的提取
a)将制备好的细胞悬浮液铺于6孔板中，每孔1000μL，孵育12小时过夜，次日控制组加1000μL RPMI1640培养基，仅ConA组加500μL ConA、500μL RPMI1640培养基(ConA终浓度为5μg/mL)，药物组加500μL ConA(ConA终浓度为5μg/mL)、500μL用RPMI1640培养基稀释好的Efophylin B和4137(Efophylin B的终浓度为5、15、30μM，4137的终浓度为20、40、80μM)，阳性对照组加500μL ConA(ConA终浓度为5μg/mL)、500μL用RPMI1640培养基稀释好的CsA(Efophylin B对照组的CsA的终浓度为15μM、4137对照组的CsA的终浓度为20μM)在37℃，5％CO2培养箱中孵育48小时。
b)连续培养48小时后，药物孵育后的脾淋巴细胞RPMI-1640培养液1000r/min离心5min，去上清液。加入1mL PBS吹吸沉淀，1000r/min离心5min，去除上清，洗2次,向细胞中加入RNA isolater,RNA isolater加入量为107个细胞加入1m L。室温条件下静止放置5min,使核蛋白复合物充分解离。
c)加入氯仿，使氯仿：RNA isolater＝1:5。使用涡旋振荡器将混合液震荡直至呈现出乳白色，时间约为15～30s。将混合液静止放置2～3min。
d)将混合液放入4℃离心机中，12000×g离心15min，小心取上层水层至一个无RNA酶的1.5m L离心管中。此时溶液分为三层：无色水相层(上层)，白色中间层以及红色的有机层(下层)。小心吸取上层水相至一个新的离心管中。上层体积约占起始RNA isolater的60％，如用1mLRNA isolater提取，上层水相约为600uL,建议吸取400-500uL,不要吸的太完全，以防吸到中间层导致基因组污染。
e)加入与水层同体积的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，室温条件(4℃)下放置10min。
f)10min后，将混合液放入4℃离心机中，12000×g离心10min，此时可见沉淀白色，小心翼翼吸取并弃掉上清液，注意沉淀不要丢失。
g)沿着离心管壁缓慢加入DEPC水配制的75％的乙醇1mL，充分洗涤管盖和管壁，上下轻轻颠倒和用手轻弹管底洗涤，让沉淀悬浮起来，静置3-5min。
8)将样品12000rmp离心5分钟，设置温度为4℃，吸取并弃掉上清(黄白枪头交替吸净)，吸掉剩余乙醇，并使用灭菌滤纸轻轻吸干管壁液体。
h)打开管盖，超净台通风干燥2-5分钟，每管加入20DEPC处理过的水，充分溶解混匀后收集至RNA管，每管取出5μL检测浓度，其他RNA管放置于-80℃中保存。
2.2.3cDNA第一链的合成
应用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA并储存在-20℃待用。体系20μL
a.RNA模板变性＊
在RNase free离心管中配制如下混合液
Figure BDA0002222081740000141
65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
＊RNA模板变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3kb的cDNA片段，请勿省略变性步骤。
b.配制第一链cDNA合成反应液
Figure BDA0002222081740000142
用移液器轻轻吹打混匀。
c.按下列条件进行第一链cDNA合成反应
a仅当使用Random hexamers时需要此步骤；使用Oligo(dT)18或Gene SpecificPrimers时省略此步骤。
b.如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至55℃，有助于提高产量。
产物可直接用于PCR，也可以置于-20℃长期保存；长期存放建议分装后在-80℃保存，cDNA应避免反复冻融。
2.2.4引物设计合成
所用引物如下：
IL-2：上游引物5′-TGTCACAAACAGTGCACCTACTTC-3′，
下游引物5′-TGTGGCCTTCTTGGGCATGT-3′；
内参β-actin：上游引物5′-GTGACAGCAGTCGGTTGGAG-3′，
下游引物5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′；
2.2.5PCR扩增及检测(体系50μL)
反应体系
＊不同模板最佳反应浓度不同，下表为50μl反应体系推荐模板使用量；
Figure BDA0002222081740000152
反应程序
Figure BDA0002222081740000153
a.该预变性条件适合绝大多数扩增反应，可根据模版结构复杂程度修改，如模板结构复杂，可将预变性时间延长至5-10min以提高预变性效果；
b.退火温度需要根据引物的Tm值进行调整，一般设置成低于引物Tm值3-5℃即可；对于复杂模板，需要调节退火温度和延长延伸时间来实现高效扩增。
2.2.6琼脂糖凝胶电泳
将样品取出，配制1％琼脂糖凝胶，(1％琼脂糖凝胶：称量1g琼脂糖，放入广口烧瓶中加入TAE定容至100mL，置于微波炉中加热至煮沸三分钟，凉水冲烧杯外侧使温度稍稍降低后加入2.5μLGV)以DNA ladder作Marker在电泳仪上跑胶。设置电压为恒压120V。将跑出样品的胶放入凝胶成像仪拍照保存。
3.实验结果
如图13所示。
4.实验分析
RT-PCR法检测结果表明，控制组IL-2m RNA平均相对表达水平为1.12，用Con A刺激后，细胞因子IL-2mRNA相对表达水平平均升高到2.40(P<0.01)，ConA诱导增殖率为53.3％；化合物1的20μM剂量组用Con A刺激后对IL-2mRNA相对平均表达水平为1.92，抑制率为20％(P<0.01))；40μM、80μM剂量组能够极显著地降低Con A诱导的IL-2mRNA平均表达水平(P<0.01)，40μM、80μM剂量组用Con A刺激后对IL-2m RNA平均表达水平为1.65、1.40，抑制率为31.25％、41.7％(P<0.01))，其抑制作用呈现剂量依赖性。阳性对照为CsA 20μM,对IL-2m RNA表达水平抑制率为67％，其抑制作用非常明显。
实施例7-ELISA法测定化合物I对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖中IL-2的含量
1.实验材料
健康Balb/c小鼠等
2.实验方法
(1)蛋白样品的制备：Balb/c小鼠摘眼球放血断颈处死无菌取脾，用RPMI1640培养基制成细胞悬液，取六孔板，然后将1000μL细胞悬浮液(5×106个/mL)、500μL的各个浓度药物和500μL的ConA加入六孔板，刺激组加入500μL的ConA和500μL含10％血清和1％DMSO的培养液，对照组加1000μL含10％血清和1％DMSO的培养液，于37℃，5％CO2条件下培养48h。(化合物1的终浓度为20、40、60、80μM，环孢菌素A终浓度为20μM，ConA的终浓度为5μg/mL)。将处理后的细胞转移至2mlEP管中，2000rpm离心5min收集细胞，并用PBS溶液清洗一遍。2000rpm离心5min收集细胞，吸弃上清液，加入150-200μL含PMSF的裂解液，然后吹匀，涡旋30s，置于冰上静置15min(每隔5min，涡旋样品30s)。4℃下12000rpm离心5min，小心将细胞裂解后的上清液转到新的1.5mL EP管中，取一定量上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。其余样品中加入5×Protein Loading Buffer，在沸水中煮5min，既得制备好的蛋白样品，将蛋白样品分装(20μL/管)，其余置于－20℃保存备用。
(2)标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
1200pg/ml 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
600pg/ml 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
300pg/ml 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
150pg/ml 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
75pg/ml 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
(3)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
(5)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(7)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
(8)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
(9)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(10)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
(11)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
(12)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
3.实验结果
如图14所示。
4.实验分析
通过ELISA法对小鼠T淋巴细胞分泌的主要细胞因子IL-2的检测，未使用Con A诱导的细胞处于正常状态，小鼠T淋巴细胞经Con A诱导之后，IL-2含量急剧升高，加入不同浓度的化合物1和阳性对照CsA处理细胞，结果显示，化合物1可以降低IL-2含量，浓度越大，抑制作用越强，呈现出浓度依赖型。
实施例8-蛋白免疫印记法(Western blotting，WB)测定化合物I对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖中NFAT的抑制作用
1.实验材料
健康Balb/c小鼠等
2.实验方法
(1)蛋白样品的制备：Balb/c小鼠摘眼球放血断颈处死无菌取脾，用RPMI1640培养基制成细胞悬液，取六孔板，然后将1000μL细胞悬浮液(5×106个/mL)、500μL的各个浓度药物和500μL的ConA加入六孔板，刺激组加入500μL的ConA和500μL含10％血清和1％DMSO的培养液，对照组加1000μL含10％血清和1％DMSO的培养液，于37℃，5％CO2条件下培养48h。(化合物1的终浓度为20、40、80μM，环孢菌素A终浓度为20μM，ConA的终浓度为5μg/mL)。将处理后的细胞转移至2mlEP管中，2000rpm离心5min收集细胞，并用PBS溶液清洗一遍。2000rpm离心5min收集细胞，吸弃上清液，加入150-200μL含PMSF的裂解液，然后吹匀，涡旋30s，置于冰上静置15min(每隔5min，涡旋样品30s)。4℃下12000rpm离心5min，小心将细胞裂解后的上清液转到新的1.5mL EP管中，取一定量上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。其余样品中加入5×Protein Loading Buffer，在沸水中煮5min，既得制备好的蛋白样品，将蛋白样品分装(20μL/管)，置于－20℃保存备用。
(2)电泳：对所提细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳。控制条件为：浓缩胶80V，大约15min后蛋白向下移动进入到分离胶的上边缘，切换至分离胶电压120V，约50min左右，蛋白溴酚蓝条带，跑至胶板底部，停止电泳
(3)转膜：在电泳缓冲液中，250mA冰浴转膜1.5h，将蛋白转移到PVDF膜上。
(4)封闭：将PVDF膜转入含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液配制的封闭液封闭液中，室温封闭4h或4℃过夜。
(5)洗涤：用PBS加0.1％Tween-20洗涤3次×10min。
(6)一抗结合：用含5％脱脂奶粉的TBST稀释一抗(称1.0g脱脂奶粉，加入20mLTBST混匀)，稀释比例为1:1000，即1μL一抗加入到1000μL 5％脱脂奶粉中，将封口膜用水固定在桌面上，揭开封口膜，用移液枪将配制好的一抗转移至封口膜上，注意不要产生气泡，PVDF膜覆盖在稀释的抗体上。
(7)二抗结合：在室温条件下，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min；用含5％脱脂奶粉的TBST稀释二抗(1:5000)，即0.1μL二抗加入到1000μL 5％脱脂奶粉的TBST中，将封口膜用水固定在桌面上，揭开封口膜，用移液枪将配置好的二抗吸在封口膜中央，不要产生气泡，PVDF膜正面朝下盖在稀释的抗体上，用盒子盖住，并用水封住盆口边缘，室温下孵育1h，之后回收二抗。
(8)显色：在相应大小的塑料盒或培养皿中放入滤膜(沥掉多余的液体)，加入化学发光液于PVDF膜上，轻轻摇动，反应3-5min。用保鲜膜将PVDF膜包裹起来，在滤纸上挤掉多余的发光液。
(9)显影定影：在暗室中将印有蛋白的PVDF膜表面朝向X光片进行曝光。曝光完成后，取出X光片，将曝光好的胶片放入显影液中显影，待胶片出现条带后，转移至定影液中，定影完全后，取出胶片，用自来水冲洗并晾干，拍照留存(扫描)，用Image J对结果进行定量分析。
3.实验结果
如图15-a、15-b所示。
4.实验分析
由条带图可以看出，小鼠脾细胞经Con A诱导后，脱磷酸化程度明显上升。加入不同浓度的化合物1和阳性对照(环孢菌素A)处理后，脱磷酸化程度降低，且随着药物浓度增大，细胞脱磷酸化程度越低。由图可知，NFAT活化的过程可以被化合物1所抑制。因此，化合物1是一种潜在的能抑制细胞内磷酸化的NFAT蛋白去磷酸化的免疫抑制剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其特征在于，该化合物结构式(I)为：
Figure FDA0002222081730000011
2.如权利要求1所述的一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
S1、将链霉菌进行发酵培养；
S2、发酵培养结束后，用甲醇浸泡，过滤获取甲醇提取物，减压浓缩，回收甲醇，获得菌株发酵产物；
S3、将发酵产物进行梯度洗脱，洗脱剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、甲醇的混合溶液，梯度洗脱后残余物在硅胶柱上进行真空液相色谱洗脱，获得9个组分，即组分1-组分9，再采用反相色谱柱，以甲醇和水为线性梯度，用高效液相色谱法分析获得的每个组分；再以甲醇溶液为溶剂，对组分6用葡聚糖凝胶进行色谱分离，再用C18反相柱纯化，得到亚组分6-4；
S4、取洗脱产物6-4，通过高效液相色谱进行洗脱，以甲醇和水混合溶液为流动相，再用C18反相柱纯化，得到具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱。
3.如权利要求2所述的一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其特征在于，步骤S1中，所述链霉菌为Streptomyces sp.DSM 4137，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日：2018年08月01日，保藏编号：CCTCC No：M 2018512。
4.如权利要求2所述的一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其特征在于，步骤S3中，所述梯度洗脱的洗脱剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、甲醇由体积比9：6：6：1至9：6：6：10。
5.如权利要求2所述的一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其特征在于，步骤S3中，所述硅胶柱的硅胶尺寸为100-200目。
6.如权利要求2所述的一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其特征在于，步骤S3中，所述葡聚糖凝胶为sephadex LH-20。
7.如权利要求2所述的一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其特征在于，步骤S3中，所述甲醇溶液的体积浓度为60～80％。
8.如权利要求2所述的一种具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱，其特征在于，步骤S4中，所述流动相由甲醇和水按体积比为8:1混合制得。
9.权利要求1-8任一项所述的具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱应用于制备免疫抑制剂。
10.权利要求1-8任一项所述的具有免疫抑制活性的四氢喹啉类生物碱应用于制备针对器官移植或自身免疫性疾病的免疫抑制药物。
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