CN113577085B - 杠柳苷组合物、其制备方法及其在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种杠柳苷组合物，其制备方法及其用途。所述杠柳苷组合物包括以下组分：Periploside A 0.1‑49％重量份、Periploside C 0.1‑49％重量份、Periploside D 0.1‑49％重量份、Periploside E 0.1‑20％重量份、Periploside K 0.1‑20％重量份、Periploside O 0.1‑20％重量份、Periploside Q 0.1‑20％重量份、Periploside R 0.1‑20％重量份。由根据本公开的杠柳多苷为药物活性成分的药物制剂可以保护肠道组织结构，减少肠道组织中炎症细胞浸润；并且可以缓解关节组织炎症浸润情况，缓解关节炎骨侵蚀情况。
Description
技术领域
本公开涉及一种自身免疫性疾病药物，具体而言，本公开涉及一种杠柳苷组合物、其制备方法及其在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一组特定的慢性、反复发作的肠道疾病的统称，主要包括克罗恩病(Crohn's disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)两种。溃疡性结肠炎是一种会引起结肠与直肠发炎与溃疡的慢性疾病，病因尚未完全阐明，可能与遗传因素、自身免疫病、肠道菌群的改变等因素相关。其发作时的主要症状包括腹痛与伴有血便的腹泻，体重减轻、发热以及贫血的症状也有可能在溃疡性结肠炎发作时出现。通常其症状发生的进程缓慢，且轻重不一，其症状表现常间歇出现，两次发作中间常伴随有一段无症状期。溃疡性结肠炎的并发症可能包括巨结肠症或眼部、关节或肝脏的炎症，以及结肠癌。目前IBD已成为一种全球性疾病，临床干预主要局限于抗炎和免疫调节药物。然而，现有治疗药物无法完全控制IBD的进展和复发，存在多种缺陷，临床治疗迫切需要开发新的防治手段。
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的自身免疫性疾病，伴有进行性残疾，可引起全身并发症，甚至早期死亡，耗费庞大的社会和经济成本。类风湿性关节炎发病机制复杂，可能与遗传、环境等因素有关，目前仍无法治愈，治疗手段主要以控制疾病发展为主。目前临床常用的RA治疗药物有非甾体类抗炎药(NonsteroidalAntiinflammatory Drugs，NSAIDs)、改善病情的抗风湿药(Disease ModifyingAntirheumatic Drugs,DMARDs)、激素类药物、生物制剂等。非甾体类抗炎药是一类不含有甾体结构的解热镇痛抗炎药，为目前治疗RA的一线药物，它主要是通过抑制前列腺素的合成，从而达到抗炎、镇痛和缓解肿胀的作用。但NSAIDs仅能缓解RA患者的临床症状，消除或减轻关节局部的炎症反应，对疾病的活动及进展无法控制，必须加用DMARDs才能有效控制病情；另外服用NSAIDs存在潜在的心血管和消化道出血风险。临床上将具有控制病情发展的药物统称为DMARDs。DMARDs包括两大类：1.人工合成改善病情抗风湿药(sDMARDs)，如羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine，SSZ)、金制剂(goldcompounds)、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、来氟米特(leflunomide)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、环孢素(Cyclosporin A)等，长期用药会有胃肠道、肝肾功能损伤、骨髓抑制等毒副作用。2.生物类DMARDs(bDMARDs)，包括阿那白滞素(Anakinra，IL-1受体拮抗剂)、英夫利昔单抗(Inflectra，TNF-α单抗)、阿巴西普(Abatacept，TNF-α单抗)、利妥昔单抗(Rituximab，抗CD20单抗)、托珠单抗(tocilizumab，IL-6单抗)。bDMARDs价格昂贵，限制了其临床的广泛应用。糖皮质激素类如泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼松龙等治疗RA疗效显著，起效快、改善关节功能，控制疾病发展，但长期用药会引起许多不良反应，且不能根治RA，停药后疾病容易复发。类风湿性关节炎在传统中医学理论中属“痹证”范畴，中医对痹证的治疗有几千年的丰富经验。在中医药理论的指导下，对RA辩证施治，起到了标本兼治的效果，且以治本为主，副作用小。
中药作为中国的传统药物，其悠久的临床使用经验和治疗效果为发现慢性复杂性疾病的治疗新策略提供了新颖的资源。萝藦科杠柳属植物杠柳(Periploca sepium Bunge)的根皮，中药称为香加皮或北五加皮，是一种临床常用中药，具有悠久的药用历史，从1977年起的各版《中国药典》均有收载，具有祛风除湿的功效，被用于治疗风湿和类风湿性关节炎。中药香加皮中存在一系列杠柳苷类化合物，其结构特征是含有原酸酯基团的孕甾烷糖苷类化合物，8种主要的杠柳苷类化合物(Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R)和微量杠柳苷类化合物Periploside F的化学结构式如下所示。其中化合物Periploside A和C分别对类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎和实验性多发性硬化症动物模型具有良好的治疗效果。{参考文献：[1]Zhu Y N,Zhao W M,Yang Y F,et al.Periplocoside E,an effective compoundfrom Periploca sepium Bge,inhibited T cell activation in vitro and in vivo[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2006,316(2):662-669.[2]Zhu Y N,Zhong X G,Feng J Q,et al.Periplocoside E inhibits experimentalallergic encephalomyelitis by suppressing interleukin 12-dependent CCR5expression and interferon-γ-dependent CXCR3 expression in T lymphocytes[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2006,318(3):1153-1162.[3]Wan J,Zhu Y N,Feng J Q,et al.Periplocoside A,a pregnane glycoside fromPeriploca sepium Bge,prevents concanavalin A-induced mice hepatitis throughinhibiting NKT-derived inflammatory cytokine productions[J].InternationalImmunopharmacology,2008,8(9):1248-1256.[4]Zhang J,Ni J,Chen Z,etal.Periplocoside A prevents experimental autoimmune encephalomyelitis bysuppressing IL-17production and inhibits differentiation of Th17 cells[J].Acta Pharmacologica Sinica,2009,30(8):1144.[5]Yang Y,Hu X,Cheng L,etal.Periplocoside A ameliorated type II collagen-induced arthritis in mice viaregulation of the balance of Th17/Treg cells[J].InternationalImmunopharmacology,2017,44:43-52.}
杠柳苷类化合物Periploside F在香加皮中含量较低，但可从其他高含量的杠柳苷类化合物(例如Periplcoside C)通过化学转化得到，Periploside F对T淋巴细胞的增殖也具有显著的抑制作用。{参考文献：Wang LY,Chen ZH,Zhou Y,et al.Structuralrevision of periplocosides and periperoxides,natural immunosuppressive agentsfrom the genus Periploca.Phytochemistry,2011,72,2230-2236.}杠柳苷类化合物在香加皮药材中的含量约为0.1％，且药材中存在强心苷类有毒成分及大量与杠柳苷类化合物性质近似的脂肪酸、低级性寡糖和4-甲氧基水杨醛等成分，富含杠柳苷类化合物的有效成分(即杠柳多苷)难以制备，其制备方法尚未见文献报道。
发明内容
发明目的
发明人通过摸索各种提取工艺的组合，发现了一种杠柳苷组合物的制备方法，分析了通过该方法提取的杠柳苷类化合物的组成，并发现了杠柳苷类化合物在治疗炎症性肠病中的作用效果。在此基础上完成了本公开。
本公开的一个目的是提供一种杠柳苷组合物。
本公开的另一个目的是提供一种杠柳苷组合物的制备方法。
本公开的再一个目的是提供所述杠柳苷组合物的制药用途。
根据本公开的一个方面，其提供了一种杠柳苷组合物，其包括以下组分：
Periploside A 0.1-49％重量份、
Periploside C 0.1-49％重量份、
Periploside D 0.1-49％重量份、
Periploside E 0.1-20％重量份、
Periploside K 0.1-20％重量份、
Periploside O 0.1-20％重量份、
Periploside Q 0.1-20％重量份、
Periploside R 0.1-20％重量份。
所述组分Periploside A、C、D、E、K、O、Q和R的质量之和大于所述组合物总质量的50％，优选大于60％。
根据本公开的另一个方面，其提供了一种杠柳苷组合物的制备方法，包括：
(1)提取、浓缩步骤
取萝藦科杠柳属(Periploca)植物杠柳(Periploca sepium Bunge)的根皮加水提取，弃去提取液，将药渣加40％-95％乙醇提取1-10次，将醇提液合并浓缩，得到悬浊液；
(2)柱前预处理步骤
在搅拌条件下向悬浊液加入乙醇-水混合物使乙醇含量为10％-50％，进行固液分离；将固形物溶于乙醇-水混合物使乙醇含量为60％以上，从而得到清液，将清液用烃类溶剂萃取，将萃余液作为大孔树脂柱上样液；
其中，所述烃类溶剂是选自C5-C8烃溶剂(如环戊烷、正己烷、环己烷、环己烯、正庚烷、正辛烷、异辛烷)和石油醚的一种或多种；
(3)柱层析纯化步骤
用大孔树脂填充色谱柱，将上样液上样后，依次采用60％-75％乙醇除杂质，80％-90％乙醇洗脱，再用90％-95％乙醇洗脱，收集90％-95％乙醇洗脱液，浓缩，干燥得到粉末混合物；
(4)柱后处理步骤
将粉末混合物用乙醇-水精制处理，得到杠柳苷组合物。
根据本公开的另一方面，其提供了杠柳苷组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
有益效果
为了降低杠柳苷类药物的成本，本公开的发明人通过对杠柳根皮有效成分的提取方法进行反复实验，在实验中发现了特别有效的提取工艺。
通过对所述提取工艺进行进一步分析，发明人发现通过该提取工艺提取得到的特定组成的杠柳苷组合物中的periploside C和F对自身免疫性疾病，如克罗恩病和溃疡性结肠炎等炎症性肠病有活性。
附图说明
图1为葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠炎症性肠病实验期间各组小鼠体重及炎症性肠病疾病活动指数评分曲线。
图2A为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点各组小鼠结直肠组织的代表性照片。
图2B为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，各组小鼠结肠长度统计结果。与DSS造模组比较，*，p<0.05；***，p<0.001,(n＝8)。
图2C为DSS诱导肠炎模型小鼠实验终点结肠组织，通过H&E染色法制成病理切片代表性示意图。
图3A为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，通过流式细胞术分析小鼠肠系膜淋巴结中巨噬细胞(抗F4/80抗体+抗CD11b抗体的染色双阳性)比例代表性示意图和统计结果(n＝5)；
图3B为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，通过流式细胞术分析小鼠肠系膜淋巴结内中性粒细胞(抗Gr-1抗体+抗CD11b抗体的染色双阳性)比例代表性示意图以及统计结果(n＝5)；
图3C为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，小鼠结直肠组织中髓过氧化物酶(MPO)中表达水平的免疫组化分析代表性示意图。
图4为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，小鼠血清中异硫氰酸荧光素(FITC)标记标记的葡聚糖含量统计结果(n＝6)。
图5A为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，通过流式细胞术分析小鼠肠系膜淋巴结中Th17细胞比例(CD3+CD4+IL-17+)。
图5B为Th17细胞比例统计结果(n＝5)。
图5C为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，小鼠血清中白细胞介素-17(IL-17)含量水平(n＝5)。
图6A为三硝基苯磺酸(TNBS)诱导小鼠炎症性肠病实验期间，各组小鼠体重变化曲线；
图6B为TNBS诱导小鼠炎症性肠病实验期间，各组小鼠生存率变化曲线；
图6C为TNBS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，各组小鼠结肠长度统计结果(n＝3-10)。
图6D为结肠长度照片结果。
图7(A)为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验期间各组小鼠体重。
图7(B)为各组小鼠的炎症性肠病疾病活动指数评分曲线。
图7C为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点，各组小鼠结肠长度统计结果。与DSS造模组比较，*，p<0.05；***，p<0.001,(n＝10)。
图7D为DSS诱导小鼠炎症性肠病实验终点各组小鼠结直肠组织的代表性照片。
图8A为胶原诱导小鼠关节炎实验期间各组小鼠的关节临床评分。
图8B为胶原诱导小鼠关节炎实验期间各组小鼠的体重。
图9为胶原诱导小鼠关节炎实验终点，通过H&E染色法制成病理切代表性示意图。
图10A为胶原诱导小鼠关节炎实验终点，小鼠血清中抗胶原特异性抗体血清总IgG的水平。
图10B为胶原诱导小鼠关节炎实验终点，小鼠血清中抗胶原特异性抗体血清IgG2a的水平。
图11A为佐剂诱导大鼠关节炎实验期间各组大鼠关节临床评分。
图11B为佐剂诱导大鼠关节炎实验期间各组大鼠继发足肿胀程度。
图11C为佐剂诱导大鼠关节炎实验期间各组大鼠体重结果。
图12A为佐剂诱导大鼠关节炎实验终点，各组大鼠继发足代表性照片。
图12B为佐剂诱导大鼠关节炎实验终点，各组大鼠通过微计算机断层扫描骨侵蚀情况代表性示意图。
图13为佐剂诱导大鼠关节炎实验终点，通过H&E染色法制成病理切代表性示意图。
具体实施方式
为使本领域具有普通知识的人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open-ended transitional phrase)，其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言，含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已，而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。除此之外，除非有相反的明确说明，否则用语“或”是指涵盖性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件“A或B”：A为真(或存在)且B为伪(或不存在)、A为伪(或不存在)且B为真(或存在)、A和B均为真(或存在)。此外，在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的解读应视为已具体公开并同时涵盖“由…所组成”及“实质上由…所组成”等封闭式或半封闭式连接词。
在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值，特别是整数数值。举例而言，“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有次级范围，特别是由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。
若数量或其他数值或参数是以范围、较佳范围或一系列上限与下限表示，则其应理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或较佳值与该范围的下限或较佳值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。
在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。
在本文中，对于使用马库什群组(Markush group)或选项式用语以描述本发明特征或实例的情形，本领域技术人员应了解马库什群组或选项列表内所有要素的次级群组或任何个别要素亦可用于描述本发明。举例而言，若X描述成“选自于由X1、X2及X3所组成的群组”，亦表示已经完全描述出X为X1的主张与X为X1及/或X2的主张。再者，对于使用马库什群组或选项式用语以描述本发明的特征或实例的情况，本领域技术人员应了解马库什群组或选项列表内所有要素的次级群组或个别要素的任何组合亦可用于描述本发明。据此，举例而言，若X描述成“选自于由X1、X2及X3所组成的群组”，且Y描述成“选自于由Y1、Y2及Y3所组成的群组”，则表示已经完全描述出X为X1或X2或X3而Y为Y1或Y2或Y3的主张。
以下具体实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明及其用途。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。
根据本公开的一个实施方式，其提供了一种杠柳苷组合物，其包括以下组分：
Periploside A 0.1-49％重量份、
Periploside C 0.1-49％重量份、
Periploside D 0.1-49％重量份、
Periploside E 0.1-20％重量份、
Periploside K 0.1-20％重量份、
Periploside O 0.1-20％重量份、
Periploside Q 0.1-20％重量份、
Periploside R 0.1-20％重量份。
包含上述组分的杠柳苷组合物在治疗自身免疫性疾病过程中体现出更好的治疗效果。
根据本公开的另一个实施方式，其中，所述Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R，且其质量之和大于所述组合物总质量的50％，优选大于60％。
根据本公开的另一个实施方式，其提供了一种杠柳苷组合物的制备方法，包括：
(1)提取、浓缩步骤
取萝藦科杠柳属(Periploca)植物杠柳(Periploca sepium Bunge)的根皮加水提取，弃去提取液，将药渣加40％-95％乙醇提取1-10次，将醇提液合并浓缩，得到悬浊液；
(2)柱前预处理步骤
在搅拌条件下向悬浊液加入乙醇-水混合物使乙醇含量为10％-50％，进行固液分离；将固形物溶于乙醇-水混合物使乙醇含量为60％以上，从而得到清液，将清液用烃类溶剂萃取，将萃余液作为大孔树脂柱上样液；
其中，所述烃类溶剂是选自C5-C8烃溶剂(如环戊烷、正己烷、环己烷、环己烯、正庚烷、正辛烷、异辛烷)和石油醚的一种或多种；
(3)柱层析纯化步骤
用大孔树脂填充色谱柱，将上样液上样后，依次采用60％-75％乙醇除杂质，80％-90％乙醇洗脱，再用90％-95％乙醇洗脱，收集90％-95％乙醇洗脱液，浓缩，干燥得到粉末混合物，
(4)柱后处理步骤
将粉末混合物用乙醇-水精制处理，得到杠柳苷组合物。
其中，在步骤(1)中，在将醇提液合并浓缩后，由于浓缩过程乙醇被除去，浓缩液变为悬浊液。在步骤(2)中，悬浊液中加入低浓度乙醇不能溶解所需的固形物，而在加入高浓度乙醇后方可溶解期望的化合物。
根据上述方法，可以以低成本有效获得包含活性成分的药物组合物，而避免使用成本较高的色谱填料、有毒溶剂和化学合成工艺。
其中，所述烃类溶剂优选是环己烷。
根据本公开的另一个实施方式，所述制备方法包括
(1)提取、浓缩步骤
取萝藦科杠柳属(Periploca)植物杠柳(Periploca sepium Bunge)的根皮加2-10倍质量的水在5-100℃下提取2-10h，提取液弃去，将药渣加2-10倍质量的40％-95％乙醇提取1-10次，将醇提液合并浓缩至原料根皮的40％至80％质量，得到悬浊液；
(2)柱前预处理步骤
在搅拌条件下向悬浊液中加入40％-95％乙醇使乙醇含量为10％-50％，搅拌后固液分离取沉淀，之后，将沉淀再次悬浮于10％-50％乙醇搅拌后固液分离取沉淀，再将沉淀溶于60％以上的乙醇，过滤得到上清液，将上清液用烃类溶剂萃取3次，弃去所述烃类溶剂层，乙醇液经减压蒸除残留的烃类溶剂，得大孔树脂柱上样液；
其中，所述烃类溶剂是选自C5-C8烃溶剂(如环戊烷、正己烷、环己烷、环己烯、正庚烷、正辛烷、异辛烷)和石油醚的一种或多种；
(3)柱层析纯化步骤
用大孔树脂填充色谱柱，上样液经吸附后，依次采用60％-75％乙醇除杂质，80％-90％乙醇洗脱，再用90％-95％乙醇作为洗脱液进行第一轮洗脱，然后收集用80％-90％乙醇洗脱的洗脱液，浓缩至60％-75％乙醇后作为上样液再次上样，再依次用60％-75％乙醇、80％-90％乙醇、90％-95％乙醇作为洗脱液进行第二轮洗脱，收集第一轮和第二轮洗脱中用95％乙醇洗脱的洗脱液，浓缩，干燥得到粉末混合物；
(4)柱后处理步骤
将上述粉末混合物用70％-95％乙醇溶解，加水调至乙醇浓度为60％以下得到悬浊液，过滤该悬浊液，得第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物加醇洗涤后过滤得第二上清液和第二沉淀物，将第一上清液和第二上清液合并后静置沉降，过滤得第三沉淀，合并第二沉淀和第三沉淀，干燥、粉碎即得杠柳苷组合物。
在该制备方法中，由于先使用水提工艺，可以低成本除去高极性成分；此外，通过采用不同浓度乙醇沉淀和烃类溶剂萃取工艺，可以除去杠柳苷以外的大量杂质，减少大孔树脂柱的上样量。
其中，所述烃类溶剂优选是环己烷。
根据本公开的另一个实施方式，其提供了一种根据上述方法制备的杠柳苷组合物。
根据本公开的另一个实施方式，其提供了上述杠柳苷组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
根据本公开的另一个实施方式，其中，所述自身免疫性疾病包括炎症性肠病和类风湿性关节炎。
根据本公开的另一个实施方式，其中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
根据本公开的另一个实施方式，其中，所述治疗炎症性肠病的药物是通过抑制体重减轻，改善便溏、便血，保护肠道粘膜损伤，减轻结肠组织的病理学损伤，抑制结肠组织中炎症细胞的浸润，下调相关促炎性细胞因子的水平来起作用的。
根据本公开的另一个实施方式，其中，所述治疗类风湿性关节炎的药物是通过缓解关节部位肿胀程度，降低关节组织中炎症浸润情况，缓解关节炎病灶骨侵蚀程度，降低血清中特异性自身抗体的产生来起作用的。
根据本公开的另一个实施方式，其提供了杠柳苷化合物Periploside C和Periploside F在制备治疗炎症性肠病的药物中的用途。
制备实施例一：杠柳多苷的制备(一)
药材：500g香加皮药材。
提取：水提三次之后弃掉水提液，然后醇提两次，每次加入4L 70％乙醇，得到8L醇提液。
浓缩：醇提液进行浓缩得到300g悬浊液。
20％乙醇沉淀：悬浊液中兑乙醇至20％，固液分离得20％乙醇沉淀56.175g。
35％乙醇沉淀：对20％乙醇沉淀进行35％乙醇沉淀，固液分离得35％乙醇沉淀45.85g。
70％乙醇沉淀：加入2倍体积量95％乙醇，及4倍体积量70％乙醇进行65℃复溶，抽取上清液，获得70％乙醇上清液305mL。
环己烷萃取：305mL 70％乙醇上清液加入305mL环己烷萃取三次，乙醇液经减压蒸除残留的环己烷得到脱油的乙醇相。
柱层析：萃取后醇层进行大孔树脂柱层析(填料名称A4)，装好填料用95％乙醇清洗干净后用70％乙醇平衡柱子，加入物料后，依次采用70％、85％、95％乙醇梯度洗脱，洗脱体积分别为3BV、3BV、6BV。
85％乙醇部位回收：将85％乙醇洗脱部位(共200mL)兑稀乙醇至70％，泵入柱子后，分别用70％乙醇，80％乙醇，95％乙醇进行洗脱，洗脱体积分别为3BV、3BV、6BV。收集70％乙醇洗脱部位，80％乙醇洗脱部位，95％乙醇洗脱部位。将这一步与上一步所有70％与80％乙醇洗脱部位合并浓缩，95％乙醇洗脱部位也合并浓缩，最终50mL 95％乙醇洗脱部位浓缩液。
95％乙醇复溶除杂：50mL 95％乙醇部位浓缩液浓缩至干，在65℃水浴下加入12倍固体量95％乙醇进行复溶，过滤除杂，得到上清液。
60％乙醇沉淀过滤：加水调乙醇至60％，抽滤，滤饼用50％乙醇润洗后，55℃真空干燥，得到1.119g杠柳多苷原料药(1)。
60％乙醇上清液过柱层析：将60％乙醇上清液过B17型大孔树脂柱，依次用3BV75％乙醇和80％乙醇、6BV95％乙醇洗脱，收集80％乙醇第2、3个BV洗脱部位和95％第1、2个BV洗脱部位，合并浓缩，干燥，进行60％乙醇沉淀，将60％沉淀真空干燥，得到57mg杠柳多苷原料药(2)。
两步中间体混合：将上述杠柳多苷原料药(1)和(2)混合，共得1.176g中间体，测定其中8个杠柳苷类化合物Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为59.09％，其中8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 2.52％重量份、Periploside C 31.12％重量份、Periploside D 8.54％重量份、Periploside E 5.35％重量份、Periploside K 2.62％重量份、Periploside O 3.52％重量份、Periploside Q 3.67％重量份、Periploside R1.75％重量份。
制备实施例二：杠柳多苷的制备(二)
药材：500g香加皮药材。
提取：水提三次之后弃掉水提液，然后醇提两次，每次加入4L 70％乙醇，得到8L醇提液。
浓缩：醇提液进行浓缩得到255g悬浊液。
20％乙醇沉淀：向悬浊液中加入50g 95％乙醇配成20％乙醇混悬液，固液分离得20％乙醇沉淀为164g。
35％乙醇沉淀：向20％乙醇沉淀中加入164g(与沉淀同质量)35％乙醇，混合均匀后固液分离得35％乙醇沉淀157g。
70％乙醇沉淀：157g 35％乙醇沉淀中共加入95％乙醇157mL，与70％乙醇278.5mL配置成70％乙醇混悬液，固液分离得70％乙醇上清液400mL。
环己烷萃取：400mL 70％乙醇上清液加入400mL环己烷萃取三次，乙醇液经减压蒸除残留的环己烷得到脱油的乙醇相。
柱层析：乙醇相过大孔树脂柱层析(填料名称A19)，装好填料用95％乙醇清洗干净后用70％乙醇平衡，加入物料后，采用70％、85％、95％乙醇梯度洗脱，洗脱体积分别为3BV、3BV、6BV。
85％乙醇部位回收：将85％乙醇洗脱部位作为85％乙醇上样液，兑低浓度乙醇至70％，泵入柱子后，分别用70％乙醇，80％乙醇，95％乙醇进行洗脱，收集70％乙醇部位，80％乙醇部位，95％乙醇部位。将95％部位合并浓缩，获得40mL 95％乙醇浓缩液。
95％乙醇复溶除杂：40mL 95％乙醇部位浓缩液浓缩至干，得到2.2g固形物，在65℃水浴下加入12倍固体量95％乙醇进行复溶，过滤除杂，得到上清液。
60％乙醇沉淀：向95％乙醇复溶上清液中加入17.6g水配制成60％乙醇溶液，加热到30-40℃趁热过滤得到沉淀，将其置于60℃鼓风烘箱烘干，得到1.014g杠柳多苷原料药，测定其中8个杠柳苷类化合物Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为60.33％，其中8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 2.74％重量份、Periploside C 30.33％重量份、Periploside D 9.62％重量份、Periploside E 5.27％重量份、Periploside K 3.04％重量份、Periploside O3.89％重量份、Periploside Q 3.55％重量份、Periploside R1.89％重量份。
制备实施例三：杠柳多苷的制备(三)
除了使用中试设备，以100倍规模提取香加皮药材以外，已与制备实施例一相同的方式对1.0吨香加皮药材进行了提取和分离纯化，制备出2.1kg杠柳多苷原料药。其中，8个杠柳苷Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为64.96％，8个杠柳苷的含量分别为Periploside A4.54％重量份、Periploside C 31.46％重量份、Periploside D 10.31％重量份、Periploside E 6.34％重量份、Periploside K 3.12％重量份、Periploside O3.45％重量份、Periploside Q 3.76％重量份、Periploside R 1.98％重量份。
制备实施例四：杠柳苷类化合物Periploside C和Periploside F的制备
取制备实施例一所得杠柳多苷原料500mg进行反相C18中压色谱分离，色谱柱尺寸20(内径)×460(长度)mm，70-100％甲醇-水梯度洗脱，洗脱馏分采用Merck C18 HPTLC检测，合并含有periploside C的组分，减压浓缩至干，得到白色粉末状Periploside C150mg，纯度99％。
另取制备实施例一所得杠柳多苷原料500mg，溶于10mL 1％氢氧化钠的甲醇溶液，室温放置24小时，反应液减压浓缩，并用氯仿-水分配，氯仿层水洗后浓缩，并进行反相C18中压色谱分离，色谱柱尺寸20(内径)×460(长度)mm，70-100％甲醇-水梯度洗脱，洗脱馏分采用Merck C18 HPTLC检测，合并含有periploside F的组分，减压浓缩，析出PeriplosideF无色结晶180mg，纯度99％。
实验实施例1：杠柳多苷对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎的药效学研究
实验材料：
Balb/c雌性小鼠，8-10周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
试剂：硫酸葡聚糖钠(DSS，购自美国MP Biomedicals生物医学公司)，CD3、CD4、IL-17、IFN-γ、CD11b、GR1、F4/80等流式细胞抗体购自BD Pharmingen公司。细胞因子检测试剂盒ProcartaPlex Mouse Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg Cytokine 17因子检测试剂盒购自美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)。羟丙基甲基纤维素(HPMC)购自美国Sigma-Aldrich公司。隐血测试盒，购自南京建成生物工程研究所。
使用制备实施例三中制备的杠柳多苷(即杠柳苷组合物)，性状：浅棕色粉末；其中8个杠柳苷Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为64.96％，8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 4.54％重量份、Periploside C 31.46％重量份、Periploside D 10.31％重量份、Periploside E 6.34％重量份、Periploside K 3.12％重量份、Periploside O3.45％重量份、Periploside Q 3.76％重量份、Periploside R 1.98％重量份。杠柳多苷使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
柳氮磺吡啶结肠溶胶囊，购自广东强基药业有限公司，250mg/胶囊，使用时用0.2％(w/v)HPMC稀释至所需浓度后使用。
实验方法：
动物分组及处理:Balb/c小鼠随机分成4组，正常对照组，DSS造模组，柳氮磺吡啶治疗组，杠柳多苷治疗组。其中柳氮磺吡啶治疗组为阳性药对照组。除正常对照组的小鼠以外，其他各组包括DSS造模组、柳氮磺吡啶治疗组、杠柳多苷治疗组的饮用水中均加入了5％DSS，连续7天进行肠道炎症模型的诱导造模。自造模当日起，柳氮磺吡啶治疗组经口给与柳氮磺吡啶250mg/kg，一日一次；杠柳多苷治疗组口服给予杠柳多苷12.5mg/kg，一日一次；正常对照组和DSS造模组分别经口给予等体积的0.2％(w/v)HPMC，一日一次。
监测指标：
[一]疾病活动指数(Disease activity index,DAI)：实验期间每天对各组小鼠体重进行监测并记录；小鼠粪便采用隐血试剂盒监测并进行量化评分。依据疾病活动指数评分表评价杠柳多苷对DSS诱导炎症性肠病的治疗效果。
疾病活动指数＝(粪便形态评分+粪便隐血评分+体重减轻百分比评分)/3。
疾病活动指数(DAI)评分表：
[二]小鼠结肠组织整体病理学评价
实验终点迅速取小鼠结肠组织，自盲肠底部至直肠底部量取长度，记录并拍照。
[三]小鼠结肠组织微观病理学检测
实验终点将小鼠结肠组织结肠固定于福尔马林中，石蜡包埋切片、H&E染色制作病理学切片。
[四]小鼠结肠组织髓过氧化物酶(MPO)检测
实验终点将小鼠结肠组织结肠固定于福尔马林中，石蜡包埋切片，通过免疫组化检测小鼠结肠组织中MPO表达水平。
[五]小鼠肠系膜淋巴结中性粒细胞、巨噬细胞和Th17细胞检测
实验终点取小鼠肠系膜淋巴结制备单细胞悬液，用相应流式细胞术抗体对细胞标记，并进行统计分析。
[六]DSS结肠炎小鼠肠黏膜通透性的检测
实验终点前，在各组小鼠安乐死4小时前口服给予各组小鼠FITC标记的葡聚糖，剂量为400mg/kg。实验终点，收集小鼠血液。常温避光静置2h后，以6000g转速离心10分钟，血清用PBS稀释后，荧光酶标仪在488nm的激发波长和520nm的发射波长下测定FITC-葡聚糖浓度，用于反映小鼠黏膜通透性。
[七]小鼠结肠组织中细胞因子检测。
取各组小鼠相同节段结肠组织进行匀浆，离心后，以BCA试剂盒对匀浆上清进行蛋白定量。匀浆中细胞因子按照ProcartaPlex Mouse Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/TregCytokine 17因子检测试剂盒说明书进行检测。
[八]统计学方法
采用GraphPad Prism 7软件分析，数据以均值±标准差表示，采用方差分析比较组间差异。当P<0.05认为存在显著性差异。
实验结果：
体重减轻是DSS诱导炎症性肠病的重要疾病指征，可以反映小鼠的健康状态。结果如图1A所示，杠柳多苷在治疗后第六天，第七天均能够显著改善DSS引起的体重降低。
疾病活动指数(DAI)是结合炎症性肠病小鼠的体重下降百分率、大便黏稠度和大便出血等三种情况进行评分，并将3项结果的总分除以3即得到DAI值，评价小鼠疾病临床症状的重要指标。研究发现，杠柳多苷治疗组小鼠疾病活动指数在治疗第五天起即显著性缓解炎症性肠病小鼠的疾病活动指数，结果见图1B。
DSS诱导炎症性肠病引起结肠变短，从图2A，图2B可以看出，DSS造模组小鼠结肠长度较正常组小鼠降低明显，杠柳多苷干预治疗组及阳性药柳氮磺吡啶治疗组小鼠结肠长度显著高于DSS造模组小鼠。另外，结肠病理染色(图2C)可以看出，DSS造模组小鼠肠组织中性粒细胞及单核细胞和多核细胞等炎性细胞浸润程度显著升高，部分隐窝破坏，而杠柳多苷治疗组、阳性药柳氮磺吡啶治疗组上述情况明显得到缓解。巨噬细胞、中性粒细胞等是重要的炎症性细胞，通过流式细胞术检测DSS诱导的炎症性肠病小鼠实验终点肠系膜淋巴结中巨噬细胞(F4/80+和CD11b+双阳性细胞)和中性粒细胞(Gr-1+和CD11b+双阳性细胞)的比例。结果(图3A，图3B)显示，杠柳多苷治疗组和阳性药治疗组小鼠肠系膜淋巴结中巨噬细胞、中性粒细胞比例较DSS造模组均能显著降低。髓过氧化物酶(MPO)又称过氧化物酶，是一类含有亚铁血红素的的酶类物质，广泛存在于中性粒细胞以及组织巨噬细胞中。通过免疫组化检测炎症性肠病小鼠结肠组织中MPO表达情况，从图3C中可以看出，DSS造模组小鼠肠组织中MPO较正常对照组显著升高，杠柳多苷治疗组和阳性药对照组中MPO含量较模型组显著降低。表明杠柳多苷可以减轻DSS诱导炎症性肠病小鼠肠组织局部的炎症程度。
肠粘膜通透性增加，肠粘膜屏障功能受损，肠内细菌及毒素进一步通过受损的肠上皮屏障引起肠粘膜炎症和损伤，是诱发炎症性肠病的重要机制之一。通过异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖检测肠通透性实验结果显示(图4)，杠柳多苷治疗组和阳性药治疗组血清中FITC-葡聚糖含量较模型组显著降低，表明在杠柳多苷或者柳氮磺吡啶治疗能够更好的保护肠粘膜。
Th17细胞在以慢性炎症为损伤机制的自身免疫病发病中起重要作用，可以分泌IL-17等炎症性细胞因子。通过流式细胞术检测肠系膜淋巴结中Th17细胞比例(CD3+CD4+IL-17+)发现，杠柳多苷治疗组Th17比例较DSS造模组显著降低(见图5A，图5B)，组织匀浆中IL-17含量也较模型组显著降低(图5C)。
实验结论：
葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium，DSS)诱导的炎症性肠病发病机制复杂，可能与肠道菌群失调，巨噬细胞功能失调，肠道粘膜上皮细胞异常增生，肠粘膜屏障破坏等相关，是人类炎症性肠病理想的动物模型。实验结果显示，杠柳多苷治疗5天即可显著缓解炎症性肠病小鼠疾病活动指数；杠柳多苷治疗6天即可显著改善炎症性肠病小鼠体重减轻情况，杠柳多苷治疗能够改善炎症性肠病小鼠结肠病理学改变，减少结肠组织中炎性细胞浸润情况并降低肠系膜淋巴结中巨噬细胞、中性粒细胞比例，改善炎症性肠病小鼠肠粘膜的通透性，提示杠柳多苷对肠道粘膜免疫具有调节作用。由以上结果我们可以明确杠柳多苷对小鼠炎症性肠病具有明显的改善作用。
实验实施例2：杠柳多苷对三硝基苯磺酸(TNBS)用于诱导炎症性肠病的药效学研究
实验材料：
C57BL/6雌性小鼠，8-10周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
试剂：2,4,6-三硝基苯磺酸溶液5％水溶液(TNBS)购自美国Sigma-Aldrich公司。
细胞因子检测试剂盒ProcartaPlex Mouse Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/TregCytokine 17因子检测试剂盒购自美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)。羟丙基甲基纤维素(HPMC)购自美国Sigma-Aldrich公司。无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。
使用制备实施例三种制备的杠柳多苷，性状：浅棕色粉末；其中8个杠柳苷Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为64.96％，8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 4.54％重量份、Periploside C 31.46％重量份、Periploside D 10.31％重量份、Periploside E 6.34％重量份、Periploside K 3.12％重量份、Periploside O3.45％重量份、Periploside Q 3.76％重量份、Periploside R 1.98％重量份。杠柳多苷使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
杠柳苷C(periploside C)，性状：白色无定形粉末，纯度：99％。Periploside C使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
杠柳苷F(periploside F)，性状：无色结晶，纯度：99％。Periploside F使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
杠柳苷C和F的制备方法参见制备实施例四。
醋酸泼尼松片，购自上海上药信谊药厂有限公司，5mg/片，使用时用0.2％(w/v)HPMC稀释至所需浓度后使用。
配制2.5％TNBS：无水乙醇与5％的TNBS溶液按照1:1(v/v)比例混合，现配现用。
50％酒精配制：无水乙醇与双蒸水按照1:1(v/v)比例混合，现配现用。
实验方法：
动物分组及处理:Balb/c小鼠随机分成6组，正常对照组，模型对照组，醋酸泼尼松对照组，杠柳多苷12.5mg/kg治疗组，杠柳多苷6.25mg/kg治疗组，杠柳多苷3.13mg/kg治疗组。其中醋酸泼尼松对照组为阳性药对照组。
小鼠禁食24h后，使用异氟烷进行麻醉。用透明胶管将导入小鼠距肛门约4cm直肠中，模型对照组、醋酸泼尼松2mg/kg组、杠柳多苷12.5mg/kg治疗组、Periploside C12.5mg/kg治疗组治疗组和Periploside F 12.5mg/kg治疗组小鼠缓慢注入100μL 2.5％(v/v)TNBS。正常对照组的小鼠以同样的方法注入50％(v/v)酒精。
自造模当日起，醋酸泼尼松组经口给与醋酸泼尼松2mg/kg(醋酸泼尼松片溶于0.2％(v/v)HPMC中)，一日一次；杠柳多苷治疗组口服给予杠柳多苷12.5mg/kg，一日一次；Periploside C治疗组口服给予Periploside C12.5mg/kg，一日一次；Periploside F治疗组口服给予Periploside F 12.5mg/kg，一日一次；正常对照组和模型组分别经口给予等体积的0.2％(w/v)HPMC，一日一次。
监测指标：
[一]小鼠体重检测。
体重实验期间每天对各组小鼠体重进行监测并记录。
[二]小鼠生存率统计。
记录实验期间小鼠死亡情况，绘制生存率曲线。
[三]小鼠结肠组织整体病理学评价。
实验终点迅速取小鼠结肠组织，自盲肠底部至直肠底部量取长度，记录并拍照。
实验结果：
体重减轻可以反映小鼠的健康状态,是TNBS诱导炎症性肠病的重要疾病指征。结果如图6A所示，在TNBS诱导炎症性肠病后，模型对照组小鼠体重造模次日即显著降低，杠柳多苷给药四天后该组小鼠体重较模型组小鼠体重显著高于正常组。杠柳多苷12.5mg/kg治疗组在给药7天后，体重已恢复到正常水平。Periploside C和F治疗7天后，小鼠体重较模型组小鼠有显著的改善。如图6B所示，杠柳多苷、Periploside C和F治疗均能显著提高TNBS诱导的结肠炎小鼠的存活率。图6C，图6D所示，TNBS模型对照组小鼠结肠长度较正常对照组明显缩短，阳性药醋酸泼尼松组，杠柳多苷12.5mg/kg治疗组、Periploside C 12.5mg/kg治疗组和Periploside F 12.5mg/kg治疗组小鼠结肠长度较模型对照组均显著升高。
实验结论：
三硝基苯磺酸(TNBS)诱导小鼠的炎症性肠病模型与临床上的溃疡性结肠炎病理改变相似。该模型中小鼠出行粪便形态改变、便血、肠道形态学改变和肠道组织学改变等于溃疡性结肠炎患者临床症状相似。本实施例采用TNBS诱导炎症性肠病模型，对杠柳多苷的治疗作用进行药效学评价。结果显示，杠柳多苷能够显著提高TNBS诱导结肠炎小鼠生存率，缓解小鼠体重减轻情况，并维持小鼠结肠长度。以上结果显示，可以明确杠柳多苷对小鼠炎症性肠病具有明显的改善作用。
实验实施例3：杠柳多苷、Periploside C和F对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎的药效学研究
实验材料：
Balb/c雌性小鼠，8-10周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
试剂：硫酸葡聚糖钠(DSS，购自美国MP Biomedicals生物医学公司)
使用制备实施例三中制备的杠柳多苷，性状：浅棕色粉末；其中8个杠柳苷Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为64.96％，8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 4.54％重量份、Periploside C 31.46％重量份、Periploside D 10.31％重量份、Periploside E 6.34％重量份、Periploside K 3.12％重量份、Periploside O3.45％重量份、Periploside Q 3.76％重量份、Periploside R 1.98％重量份。杠柳多苷使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
杠柳苷C(periploside C)，性状：白色无定形粉末，纯度：99％。Periploside C使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
杠柳苷F(periploside F)，性状：无色结晶，纯度：99％。Periploside F使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
杠柳苷C和F的制备方法参见制备实施例四。
柳氮磺吡啶结肠溶胶囊，购自广东强基药业有限公司，250mg/胶囊，使用时用0.2％(w/v)HPMC稀释至所需浓度后使用。
实验方法：
动物分组及处理:Balb/c小鼠随机分成4组，正常对照组，DSS造模组，柳氮磺吡啶治疗组，杠柳多苷治疗组。其中柳氮磺吡啶治疗组为阳性药对照组。除正常对照组的小鼠以外，其他各组包括DSS造模组、柳氮磺吡啶治疗组、杠柳多苷治疗组的饮用水中均加入了5％DSS，连续7天进行肠道炎症模型的诱导造模。自造模当日起，柳氮磺吡啶治疗组经口给与柳氮磺吡啶250mg/kg，一日一次；杠柳多苷治疗组口服给予杠柳多苷12.5mg/kg，一日一次；Periploside C治疗组口服给予Periploside C 12.5mg/kg，一日一次；Periploside F治疗组口服给予Periploside F12.5mg/kg，一日一次；正常对照组和DSS造模组分别经口给予等体积的0.2％(w/v)HPMC，一日一次。
监测指标：
实验期间每天对各组小鼠体重进行监测并记录；小鼠粪便采用隐血试剂盒监测并进行量化评分。依据疾病活动指数评分表评价杠柳多苷对DSS诱导炎症性肠病的治疗效果。
实验结果：
体重减轻是DSS诱导炎症性肠病的重要疾病指征，可以反映小鼠的健康状态。结果如图7A所示，杠柳多苷治疗组、柳氮磺吡啶阳性药组在治疗后第六天和第七天均能够显著改善DSS引起的体重降低。Periploside C和F治疗组小鼠在治疗后第七天后体重降低情况显著改善。
疾病活动指数(DAI)是结合炎症性肠病小鼠的体重下降百分率、大便黏稠度和大便出血等三种情况进行评分，并将3项结果的总分除以3即得到DAI值，评价小鼠疾病临床症状的重要指标。研究发现，杠柳多苷治疗组、柳氮磺吡啶阳性药组治疗组小鼠在治疗后第六天和第七天疾病活动指数较模型组小鼠显著降低；Periploside C治疗组和Periploside F治疗组小鼠疾病活动指数在治疗后第七天后较模型组小鼠显著改善，结果见图7B。DSS诱导炎症性肠病引起结肠变短，从图7C，图7D可以看出杠柳多苷治疗组、柳氮磺吡啶阳性药组、Periploside C治疗组和Periploside SF治疗组小鼠结肠长度较模型组小鼠均显著改善。提示杠柳多苷、Periploside C和F对DSS诱导的炎症性肠病具有良好的治疗效果。
实验实施例4：杠柳多苷对胶原诱导小鼠关节炎的药效学研究
实验材料：
DBA/1小鼠，6-8周龄，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司。
试剂：乙酸(冰醋酸)(10000218)购自国药集团化学试剂有限公司；牛Ⅱ型胶原(Immunization Grade Bovine Type II Collagen)购自Chondrex公司；Freund’sAdjuvant Complete(CFA,弗氏完全佐剂)(F5881-10X10mL)购自SIGMA；Freund’sAdjuvant,Incomplete(IFA,弗氏不完全佐剂)购自SIGMA；HRP-rabbit anti-mouse IgG(H+L)(616520)、HRP-rabbit anti-mouse IgG2a(610220)购自Invitrogen。
使用制备实施例三种制备的杠柳多苷，性状：浅棕色粉末；其中8个杠柳苷Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为64.96％，8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 4.54％重量份、Periploside C 31.46％重量份、Periploside D 10.31％重量份、Periploside E 6.34％重量份、Periploside K 3.12％重量份、Periploside O3.45％重量份、Periploside Q 3.76％重量份、Periploside R 1.98％重量份。杠柳多苷使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
甲氨蝶呤片，上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂，2.5mg/片，使用时用0.2％(w/v)HPMC稀释至所需浓度后使用。
实验方法：
[一]胶原诱导小鼠关节炎模型建立
牛II型胶原溶解入0.1M的无菌醋酸，4℃溶解过夜，制成胶原浓度为10mg/mL的溶液。
将牛II型胶原溶液与等体积的CFA充分乳化，DBA/1小鼠麻醉后，于小鼠的尾根部注射25μl的牛II型胶原佐剂混合乳化液进行第1次免疫诱导；3周后以相同剂量的牛II型胶原与IFA混合乳化后，于小鼠的尾根部进行免疫强化，诱导小鼠发生多关节性关节炎。
[二]动物分组及给药
动物分组及处理:在小鼠发病后，根据其体重、足肿胀评分分成5组，共有实验组6组，每组10只：正常对照组、关模型对照组、阳性药甲氨蝶呤组(1mg/kg，1次/天)、杠柳多苷(12.5mg/kg/天，6.25mg/kg/天；2次/天)。各组均采用口服灌胃给药。连续给药8周，考察口服杠柳多苷对CIA小鼠关节炎疾病指征的影响。
[三]柳多苷治疗胶原诱导小鼠关节炎药效学评价指标
每天观察比较各实验组关节炎症状的发展情况，按0-4分五级标准评分(表3-1)来评价关节炎病变及炎症严重程度，每周评分两次。
[四]胶原诱导关节炎鼠血清中抗CII特异性抗体检测
杠柳多苷治疗8周后，实验终点分离DBA/1小鼠血清，血清于-30℃冰箱保存，ELISA法检测血清中抗牛II型胶原(CII)特异性抗体IgG的水平。
[五]小鼠关节组织病理学检测
实验终点将小鼠后肢固定于福尔马林中，石蜡包埋切片、H&E染色制作病理学切片。
实验结果：
[一]杠柳多苷降低胶原诱导关节炎小鼠临床评分
牛II型胶原诱导的DBA/1小鼠关节炎表现为严重的多发性关节损伤，其临床、病理表现，体液免疫、细胞免疫应答与人类类风关相似，广泛应用于抗关节炎药物疗效评价和作用机理的研究。
关节炎临床发病指数(Clinic Score)是反映关节炎病变发生与发展的重要指标。实验结果显示，杠柳多苷治疗给药的3个剂量组(12.5mg/kg，6.25mg/kg)能够降低胶原诱导关节炎鼠的发病指数，表现为胶原诱导关节炎鼠小鼠的四肢足爪肿胀发生数以及严重程度明显减轻(图8A)
胶原诱导关节炎鼠模型小鼠随着疾病发展，可出现体重下降。在杠柳多苷治疗周期内，对小鼠进行每周2次体重记录，结果显示杠柳多苷治疗组小鼠体重较模型组有升高趋势(图8B)。
[二]病理组织学观察结果
各组后肢踝关节病理组织学结果代表图见图9，其改变及程度如下：
正常对照组：除1例动物可见轻微炎症、出血外，其它动物未见明显异常。
模型组：3/8例动物重度炎症，1/8例动物中度炎症，3/8例动物轻微炎症，1/8例动物未见异常。与对照组相比，模型组踝关节可见重度炎症，病理组织学形态表现为滑膜及滑膜周边大量炎细胞浸润，延伸到周边组织，侵蚀软骨和伴有纤维化。
阳性药甲氨蝶呤组：2/8例动物重度炎症，3/8例动物中度炎症，3/8例动物未见异常。
杠柳多苷组：12.5mg/kg组2/8例动物中度炎症，1/8例动物轻度炎症，2/8例动物轻微炎症，3/8例动物未见异常；6.25mg/kg组1/8例动物中度炎症，1/8例动物轻度炎症，4/8例动物轻微炎症，2/8例动物未见异常。
[三]杠柳多苷降低胶原诱导关节炎鼠小鼠血清中抗CII特异性抗体含量
抗牛II型胶原(CII)抗体的产生是CIA小鼠的重要病理特征，与疾病的严重程度密切相关，可以作为药效学评价的重要指标。
我们在实验终点，分离各组小鼠血清检测抗CII特异性抗体含量，结果显示，杠柳多苷治疗能够显著降低抗CII特异性抗体总IgG(图10A)及IgG2a水平(图10B)，且表现出剂量依赖性。
实验结论：
牛II型胶原(Type II bovine collagen，CII)诱导的DBA/1小鼠关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)表现为严重的多发性关节损伤，其临床、病理表现，体液免疫、细胞免疫应答与人类类风关相似，广泛应用于抗关节炎药物疗效评价和作用机理的研究。本实验应用胶原诱导小鼠关节炎，观察杠柳多苷口服给药胶原诱导小鼠关节炎的治疗作用。杠柳多苷表现出良好的治疗效果，能够显著改善模型小鼠胶原诱导关节炎的临床症状，降低关节炎临床评分，改善病理损伤及胶原特异性抗体的产生，表明杠柳多苷对佐剂诱导小鼠关节炎具有显著的治疗效果。
实验实施例5：杠柳多苷对佐剂诱导大鼠关节炎的药效学研究
实验材料：
SD大鼠，雄性，约150-180g，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司。
使用制备实施例三种制备的杠柳多苷，性状：浅棕色粉末；其中8个杠柳苷Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为64.96％，8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 4.54％重量份、Periploside C 31.46％重量份、Periploside D 10.31％重量份、Periploside E 6.34％重量份、Periploside K 3.12％重量份、Periploside O3.45％重量份、Periploside Q 3.76％重量份、Periploside R 1.98％重量份。杠柳多苷使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
甲氨蝶呤片，上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂，2.5mg/片，使用时用0.2％(w/v)HPMC稀释至所需浓度后使用。
灭活结核杆菌冻干粉(M.TUBRCULOSIS H37 Ra)购自DIFCO公司。
实验方法：
[一]杠柳多苷治疗佐剂诱导大鼠关节炎动物分组及给药
雄性SD大鼠，除正常对照组，其余大鼠在造模后第13天，根据体重、足肿胀评分及肿胀度分成5组，共有实验组6组，每组8只：正常对照组、关节炎模型组(溶剂对照)、阳性药MTX组(1mg/kg，1次/天)、杠柳多苷(10mg/kg/天，5mg/kg/天，2.5mg/kg/天；2次/天)。
以上6组实验动物除正常对照组外，各组大鼠于实验开始的第一天自左后足垫皮内注射含10mg/mL结合杆菌灭活菌株的佐剂0.1mL，并于造模后第13天开始灌胃给药。
[三]柳多苷治疗佐剂诱导大鼠关节炎药效学评价指标
按时间点监测各组大鼠体重；
按时间点观察比较各实验组关节炎症状的发展情况，按0-4分五级标准评分(临床发病指数)来评价关节炎病变及炎症严重程度【0分：无红肿；1分：小趾关节红肿；2分：趾关节和足趾肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀】；
大鼠原发足(左后足)肿胀反映关节炎性病变，致敏对侧(右后足)则为继发性自身免疫性肿胀。运用足趾容积测量仪检测大鼠关节炎的肿胀程度，计算公式如下：
大鼠关节肿胀度(μL)＝模型组/实验治疗组大鼠后足排水体积－未造模正常对照组大鼠的后足平均排水体积
[四]Micro-CT扫描
在实验终点，将各组小鼠安乐死后，剪取后肢，并在福尔马林中固定。采用西门子公司Inveon micro PET/CT(Inveon MM system,Siemens Preclinical Solutions)进行扫描。按照下面参数进行高分辨率扫描：扫描厚度8.5μm，电压为80千伏，电流为500微安，以360°旋转曝光，每步曝光时长1000毫秒。大鼠后肢选用中分辨率参数进行微计算机断层扫描，扫描厚度32μm，曝光时间设定为600毫秒。
[五]大鼠关节组织病理学检测
实验终点将大鼠后肢固定于福尔马林中，石蜡包埋切片、H&E染色制作病理学切片。
实验结果：
[一]杠柳多苷降低佐剂诱导大鼠关节炎临床评分
实验结果显示，杠柳多苷对大鼠佐剂关节炎有显著的治疗作用，且呈一定浓度依赖性。杠柳多苷口服治疗对继发足的临床评分(图11A)及肿胀体积(图11)均有很好的抑制作用，且表现出浓度依赖性。同时，杠柳多苷杠柳多苷口服治疗对大鼠体重无显著影响(图11C)。
杠柳多苷在治疗佐剂诱导大鼠关节炎模型中表现出良好的治疗效果，能够显著改善模型大鼠关节炎的临床症状，降低关节炎临床评分。
[二]杠柳多苷减轻佐剂诱导关节炎大鼠骨损伤程度
我们通过实验终点各组代表性继发足照片(图12A)可以看出，杠柳多苷对佐剂诱导大鼠关节炎具有足肿胀有显著的抑制作用。通过微计算机断层扫描(Micro computedtomography，micro-CT)分析了佐剂诱导关节炎大鼠关节炎继发足、胶原诱导关节炎(CIA)小鼠左后肢的骨质侵蚀情况，从图12B可以看出，杠柳多苷对于两种关节炎模型动物中骨损伤具有明显的保护作用。
[三]病理组织学观察结果
各组后肢踝关节病理组织学结果代表图见图13，其改变及程度如下：
正常对照组：2/8例动物可见轻微或轻度炎症，其余动物未见明显异常。
模型对照组：与对照组相比，全部动物可见轻微至重度炎症。模型组踝关节炎症病理组织学形态表现为滑膜及滑膜周边大量炎细胞浸润，延伸到周边组织，侵蚀软骨和骨，伴有纤维化。
阳性药甲氨蝶呤组：1/8例动物可见轻度炎症，其余动物未见明显异常。
杠柳多苷组：10mg/kg治疗组均未见异常；5mg/kg治疗组组4/8例动物可见轻微或中度炎症，其余动物未见明显异常；2.5mg/kg治疗组组2/8例动物可见中度炎症，其余动物未见明显异常。
实验结论：
佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)模型是细菌学家Freund于20世纪50年代创立的，又称弗氏佐剂关节炎，是一种经典的免疫性炎症模型，广泛应用于治疗类风关候选药物的临床前评价。本实验应用CFA诱发SD大鼠产生实验性佐剂性关节炎，观察杠柳多苷口服给药对佐剂诱导的SD大鼠关节炎的治疗作用。杠柳多苷在治疗佐剂诱导大鼠关节炎模型中表现出良好的治疗效果，能够显著改善模型大鼠关节炎的临床症状，降低关节炎临床评分，减轻关节炎大鼠骨侵蚀及炎症浸润情况。
实验实施例6：杠柳多苷、杠柳苷C对胶原诱导小鼠关节炎的药效学研究
实验材料：
DBA/1小鼠，雄性，6-8周龄，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司。
试剂：乙酸(冰醋酸)(10000218)购自国药集团化学试剂有限公司；牛Ⅱ型胶原(Immunization Grade Bovine Type II Collagen)购自Chondrex公司；Freund’sAdjuvant Complete(CFA,弗氏完全佐剂)(F5881-10X10mL)购自SIGMA；Freund’sAdjuvant,Incomplete(IFA,弗氏不完全佐剂)购自SIGMA；HRP-rabbit anti-mouse IgG(H+L)(616520)、HRP-rabbit anti-mouse IgG2a(610220)购自Invitrogen。
使用制备实施例三种制备的杠柳多苷，性状：浅棕色粉末；其中8个杠柳苷Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为64.96％，8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 4.54％重量份、Periploside C 31.46％重量份、Periploside D 10.31％重量份、Periploside E 6.34％重量份、Periploside K 3.12％重量份、Periploside O3.45％重量份、Periploside Q 3.76％重量份、Periploside R 1.98％重量份。杠柳多苷使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
杠柳苷C(periploside C)，性状：白色无定形粉末，纯度：99％。Periploside C使用时混悬于溶剂中并稀释至所需浓度后使用。溶剂为0.2％(w/v)HPMC。
杠柳苷C的制备方法参见制备实施例四。
甲氨蝶呤片，上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂，2.5mg/片，使用时用0.2％(w/v)HPMC稀释至所需浓度后使用。
实验方法：
[一]胶原诱导小鼠关节炎模型建立
牛II型胶原溶解入0.1M的无菌醋酸，4℃溶解过夜，制成胶原浓度为10mg/mL的溶液。
将牛II型胶原溶液与等体积的CFA充分乳化，DBA/1小鼠麻醉后，于小鼠的尾根部注射25μL的牛II型胶原佐剂混合乳化液进行第1次免疫诱导；3周后以相同剂量的牛II型胶原与IFA混合乳化后，于小鼠的尾根部进行免疫强化，诱导小鼠发生多关节性关节炎。
[二]动物分组及给药
动物分组及处理:在小鼠发病后，根据其体重、足肿胀评分分成5组，共有实验组6组，每组10只：正常对照组、关模型对照组、阳性药甲氨蝶呤组(1mg/kg，1次/天)、杠柳多苷(12.5mg/kg/天；2次/天)、杠柳苷C(12.5mg/kg/天；2次/天)。各组均采用口服灌胃给药。连续给药10周，比较口服杠柳多苷或杠柳苷C对CIA小鼠关节炎疾病指征的影响，并于给药后第10周对各组小鼠后肢拍照记录。
[三]药品治疗胶原诱导小鼠关节炎药效学评价指标
每天观察比较各实验组关节炎症状的发展情况，按0-4分五级标准评分来评价关节炎病变及炎症严重程度，每周评分两次。
实验结果：
[一]杠柳多苷降低胶原诱导关节炎小鼠临床评分
实验结果显示，杠柳多苷治疗组小鼠在给药4周后能够降低胶原诱导关节炎鼠的发病指数，杠柳苷C治疗组在治疗6周后显著降低胶原诱导关节炎鼠的发病指数，相比杠柳多苷治疗组具有统计学上显著性的药效发挥时间晚2周(图13A)。
胶原诱导关节炎鼠模型小鼠随着疾病发展，可出现体重下降。在杠柳多苷治疗周期内，对小鼠进行每周1次体重记录，结果显示杠柳多苷治疗组小鼠体重较模型组小鼠和杠柳苷C治理组小鼠体重均有升高趋势(图13B)。
实验结论：
牛II型胶原(Type II bovine collagen，CII)诱导的DBA/1小鼠关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)表现为严重的多发性关节损伤，其临床、病理表现，体液免疫、细胞免疫应答与人类类风关相似，广泛应用于抗关节炎药物疗效评价和作用机理的研究。本实验应用胶原诱导小鼠关节炎，观察杠柳多苷和杠柳苷C分别口服给药胶原诱导小鼠关节炎的治疗作用。杠柳多苷和杠柳苷C表现出良好的治疗效果，能够显著降低关节炎临床评分。杠柳多苷相比杠柳苷C对于维持胶原诱导关节炎鼠体重具有更好的效果且发挥出显著性治疗效果的时间更早，表明杠柳多苷在治疗关节炎上具有更优异的效果。
实验实施例7：杠柳多苷及8个主要活性成分体外免疫抑制活性研究
实验材料：
BALB/c小鼠，雌性，18-20克，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司。
刀豆蛋白A(ConA)购自Sigma公司；细菌脂多糖(LPS)购自Sigma公司；MTT购自Sigma公司；3H-胸腺嘧啶核苷酸(1μCi/mL)购自珀金埃尔默公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司。
使用制备实施例三种制备的杠柳多苷，性状：浅棕色粉末；其中8个杠柳苷Periploside A、C、D、E、K、O、Q、R的累积含量为64.96％，8个杠柳苷的含量分别为Periploside A 4.54％重量份、Periploside C 31.46％重量份、Periploside D 10.31％重量份、Periploside E 6.34％重量份、Periploside K 3.12％重量份、Periploside O3.45％重量份、Periploside Q 3.76％重量份、Periploside R 1.98％重量份。
实验方法：
[一]MTT法检测化合物对小鼠脾脏淋巴细胞免疫抑制活性的影响：
小鼠脾脏淋巴细胞悬液5*105/孔接种于96孔板，同时加入不同浓度化合物，另设相应的溶媒对照(细胞对照)及培养液本底对照(空白对照)，总体积为200μL。37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。结束培养前4小时加入浓度为5mg/mL的MTT溶液。至培养结束，吸弃上清，每孔加入200μL DMSO溶解紫色结晶，于酶标仪570nM处测定OD值。计算细胞存活率，公式如下：
[二]3H-TdR掺入法检测化合物对小鼠脾脏T|、B淋巴细胞增殖功能的影响
小鼠脾脏淋巴细胞悬液5*105/孔接种于96孔板，加入ConA(终浓度5μg/mL)或LPS(终浓度10μg/mL)及不同浓度化合物，使培养体系终体积为200μL；每实验组设3个复孔，另设无刺激的本底对照、相应溶剂对照组。于37℃，含5％CO2的培养箱中培养48小时。
培养结束前8小时每孔加入25μL 3H-胸腺嘧啶核苷酸(1μCi/mL)。培养结束后先将培养板冻存至-30℃冰箱，待测。测定时将冻融的细胞收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta计数仪上读取掺入细胞DNA的3H-胸腺嘧啶核苷酸量，以cpm(Counts per minute，每分钟计数)值代表细胞增殖的情况。计算细胞增殖抑制率，公式如下：
实验结果：
杠柳多苷半数细胞致死浓度(CC50)为0.94±0.56μg/mL,能够抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖,其半数有效抑制浓度(IC50)为0.10±0.01μg/mL，与其他8个有效组分相比具有最优的抑制活性；能够抑制LPS诱导的B淋巴细胞增殖，其半数有效抑制浓度(IC50)为0.40±0.12μg/mL，与其他8个有效组分相比具有最优的抑制活性。选择指数(SI)为判断药物效果的安全范围，选择指数为CC50/IC50，指数越大表明安全范围越大。杠柳多苷具有良好的免疫抑制活性，SI值表明其安全性高，免疫抑制活性强，具有潜在的药用价值(见下表)。
实验结论：
通过体外免疫抑制活性筛选模型研究发现，杠柳多苷与其所含8个主要活性成分相比，具有更高的细胞毒性，且具有最强的免疫抑制活性。表明杠柳多苷的免疫抑制活性优于8个单体杠柳苷类化合物。
Claims (7)
1.一种杠柳苷组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途，所述杠柳苷组合物包括以下组分：
Periploside A0.1-49％重量份、
Periploside C 0.1-49％重量份、
Periploside D 0.1-49％重量份、
Periploside E 0.1-20％重量份、
Periploside K 0.1-20％重量份、
Periploside O 0.1-20％重量份、
Periploside Q 0.1-20％重量份、
Periploside R 0.1-20％重量份，
其中，所述杠柳苷组合物通过以下方法制备：
(1)提取、浓缩步骤
取萝藦科杠柳属Periploca植物杠柳Periploca sepium Bunge的根皮加水提取，弃去提取液，将药渣加40％-95％乙醇提取1-10次，将醇提液合并浓缩，得到悬浊液；
(2)柱前预处理步骤
在搅拌条件下向悬浊液加入乙醇-水混合物使乙醇含量为10％-50％，进行固液分离；将固形物溶于乙醇-水混合物使乙醇含量为60％以上，从而得到清液，将清液用烃类溶剂萃取，将萃余液作为大孔树脂柱上样液；
其中，所述烃类溶剂是选自C5-C8烃溶剂和石油醚的一种或多种；
(3)柱层析纯化步骤
用大孔树脂填充色谱柱，将上样液上样后，依次采用60％-75％乙醇除杂质，80％-90％乙醇洗脱，再用90％-95％乙醇洗脱，收集90％-95％乙醇洗脱液，浓缩，干燥得到粉末混合物；
(4)柱后处理步骤
将粉末混合物用乙醇-水精制处理，得到杠柳苷组合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述组分Periploside A、C、D、E、K、O、Q和R的质量之和大于所述组合物总质量的50％。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述组分Periploside A、C、D、E、K、O、Q和R的质量之和大于所述组合物总质量的60％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述自身免疫性疾病包括炎症性肠病和类风湿性关节炎。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
6.根据权利要求4所述的用途，其中，所述治疗炎症性肠病的药物是通过抑制体重减轻，改善便溏、便血，保护肠道粘膜损伤，减轻结肠组织的病理学损伤，抑制结肠组织中炎症细胞的浸润，下调相关促炎性细胞因子的水平来起作用的。
7.根据权利要求4所述的用途，其中，所述治疗类风湿性关节炎的药物是通过缓解关节部位肿胀程度，降低关节组织中炎症浸润情况，缓解关节炎病灶骨侵蚀程度，降低血清中特异性自身抗体的产生来起作用的。
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