CN113567676A - 基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒 - Google Patents

基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，利用该试剂盒结合液相芯片法可同时检测四种胃癌肿瘤标志物：PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199，该试剂盒包括：A组分，其包括四种表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球；B组分，其包括生物素标记的四种检测抗体；以及C组分，其为亲和素化的藻红蛋白。本发明提供的试剂盒能利用液相芯片法在同一反应体系内同时综合检测四种胃癌肿瘤标志物指标：PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199，针对胃癌的早期诊断可以在一次检测中得到更多可靠的临床信息，能够减少样本需求量、提高检测效率和准确性，为临床疾病病程判断及治疗方案的选择提供更好的依据。

Description

基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物和医学检测技术领域，特别涉及一种基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒。
背景技术
胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,据资料统计,全球每年新发胃癌100万余例,占所有新发癌症病例的9％,仅次于肺癌,乳腺癌和肠癌之后,位居第4位。每年约有60余万人因胃癌死亡,位居癌症死因的第2位。近些年来在我国随着生活环境及饮食习惯的变化，根据对胃癌发病、患病及死亡状况变化趋势的分析统计结果显示，胃癌标化死亡率、患病率和发病率均呈现男性高于女性，且发病率和患病率均有不同程度的上升，特别是近些年来中青年胃癌发病率也成上升趋。我国每年大约有40万新增胃癌病例,死亡约30万人,居全球首位！胃癌治疗与病期早晚和诊治方法及手段密切相关，早期胃癌京足够的治疗后90％以上患者能生存5年以上或治愈，而晚期胃癌患者，治疗后5年生存率不足5％，因此早期确诊依然是治疗胃癌的关键。
用于诊断胃癌的肿瘤标志物检测样本包括血清、腹水、胃液、组织等，其中血清标志物临床应用较为普遍，诊断胃癌的常用指标有CEA、CA72-4、CA50、CA19-9、CA242、MG—Ag、VEGF及PGⅠ/PGⅡ等。目前免疫诊断主要包括放射免疫、酶联免疫、化学发光、以及现在新兴的侧向流免疫层析等。化学发光由于其准确度高、重复性好、自动化程度高等特点，在免疫检测中占有绝对优势。但是化学发光由于本身技术限制，通量很难进一步提升；同时化学发光的价格相对较高，很多医院仍然大量使用酶联免疫。在实际诊断胃癌时一般是用多个指标综合确诊胃癌，因为多指标综合分析不仅简化了检测步骤，且在特异性和敏感度上明显高于单一指标。因此，有必要开发一种能够在相对统一检测条件下实现多个胃癌指标同时检测的试剂盒，以减少样本需求量、提高检测效率和准确性，为胃癌早期诊断治疗提供更充分的判断依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，该试剂盒可同时检测四种胃癌肿瘤标志物：PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199，该试剂盒包括：
A组分，其包括四种表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球，其中，所述捕获抗体包括PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体，每种量子点磁性编码微球具有不同的荧光强度且表面只标记一种捕获抗体，所述捕获抗体可与对应的胃癌肿瘤标志物结合；
B组分，其包括生物素标记的四种检测抗体，其中，所述检测抗体包括PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体，每种检测抗体上均标记有相同的生物素，所述检测抗体可与对应的胃癌肿瘤标志物结合；
以及C组分，其为亲和素化的藻红蛋白，其可与生物素标记的检测抗体结合。
优选的是，该试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)将待测样本与A组分混合，孵育，通过四种量子点磁性编码微球分别捕获四种胃癌肿瘤标志物；
2)将步骤1)反应后的产物与B组分混合，孵育，使四种检测抗体分别与四种胃癌肿瘤标志物结合；
3)将步骤2)反应后的产物与C组分混合，避光条件下孵育，使亲和素化的藻红蛋白与检测抗体结合；
4)使用流式细胞仪对将步骤3)反应后的产物进行检测，通过四种量子点磁性编码微球对四种胃癌肿瘤标志物进行通道分类，通过亲和素化的藻红蛋白作为报告分子，根据每个通道的荧光信号强度计算出每种胃癌肿瘤标志物的浓度。
优选的是，该试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)将待测样本与A组分涡旋混匀10～30s，在37℃下振荡孵育30min，通过四种量子点磁性编码微球分别捕获四种胃癌肿瘤标志物；
2)将步骤1)反应后的产物弃上清液，加入洗涤液清洗2遍后与B组分混合，涡旋混匀10～30s，在37℃下振荡孵育30min，使四种检测抗体分别与四种胃癌肿瘤标志物结合；
3)将步骤2)反应后的产物弃上清液，加入洗涤液清洗2遍后与C组分混合，涡旋混匀10～30s，避光条件下孵育30min，使亲和素化的藻红蛋白与检测抗体结合；
4)使用流式细胞仪对将步骤3)反应后的产物进行检测，通过四种量子点磁性编码微球对四种胃癌肿瘤标志物进行通道分类，通过亲和素化的藻红蛋白作为报告分子，根据每个通道的荧光信号强度计算出每种胃癌肿瘤标志物的浓度。
优选的是，所述A组分的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ-1)制备量子点磁性编码微球：将磁性聚苯乙烯多孔微球分散于异丙醇溶液中，超声分散均匀得到磁性微球溶液；将量子点溶于氯仿中，得到的量子点氯仿溶液再加入所述磁性微球溶液中，搅拌均匀后，置于真空干燥箱中干燥，得到量子点磁性编码微球；得到的量子点磁性编码微球用环己烷清洗，再用乙醇清洗，最后用去离子水清洗后分散于水中备用；其中，通过加入不同量的量子点氯仿溶液来获得具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球；
Ⅰ-2)通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，然后在量子点磁性编码微球表面标记不同的捕获抗体：
通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，分别记为1～4#，均进行如下处理：用洗涤液清洗，然后用活化液在室温避光条件下摇床振动活化，活化后再用洗涤液清洗，再分散到PBS溶液中；
在得到的四种量子点磁性编码微球溶液中分别加入PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体，然后再均进行如下处理：在室温条件下摇床振动包被，之后用洗涤液清洗，再加入封闭液，在室温条件下摇床振动封闭，封闭结束后洗涤液清洗，加入保存液在避光条件下保存备用，得到A组分。
优选的是，所述A组分的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ-1)制备量子点磁性编码微球：将磁性聚苯乙烯多孔微球分散于异丙醇溶液中，超声分散均匀得到磁性微球溶液；将量子点溶于氯仿中，将得到的量子点氯仿溶液再加入所述磁性微球溶液中，搅拌两小时后，置于真空干燥箱中干燥，得到量子点磁性编码微球；得到的量子点磁性编码微球用环己烷清洗一次，再用乙醇清洗两次，最后用去离子水清洗两次后分散于水中备用；其中，通过加入不同量的量子点氯仿溶液来获得具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球；
Ⅰ-2)通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，然后在量子点磁性编码微球表面标记不同的捕获抗体：
通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，分别记为1～4#，均进行如下处理：用洗涤液清洗两次，然后用活化液在室温避光条件下摇床振动活化20min，活化后再用洗涤液清洗两次，再分散到PBS溶液中；
得到的四种量子点磁性编码微球溶液中分别加入PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体，然后再均进行如下处理：在室温条件下摇床振动包被2～4h，之后用洗涤液清洗两次，再加入封闭液，在室温条件下摇床振动封闭0.5～1h，封闭结束后洗涤液清洗两次，加入保存液在避光、4℃条件下保存备用，得到A组分。
优选的是，所述B组分的制备方法包括以下步骤：
取PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体分别与生物素混合，然后分别进行如下处理：室温避光条件下在摇床上孵育，反应结束后超滤离心，纯化生物素标记的检测抗体，除去未参与反应的生物素；得到生物素标记的四种检测抗体。
优选的是，所述B组分的制备方法包括以下步骤：
取PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体分别与生物素混合，且检测抗体与生物素的摩尔比为1：30，然后分别进行如下处理：室温避光条件下在摇床上孵育30min，反应结束后在6000r/min下超滤离心30min，再加入PBS缓冲液重复超滤过程2次，纯化生物素标记的检测抗体，除去未参与反应的生物素；得到生物素标记的四种检测抗体。
优选的是，所述洗涤液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为0.02％的Tween-20后得到的混合液。
优选的是，所述封闭液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为5％的BSA后得到的混合液。
优选的是，所述保存液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为0.02％的Tween-20和质量分数为0.01％的NaN3后得到的混合液。
本发明的有益效果是：本发明提供的试剂盒能利用液相芯片法在同一反应体系内同时综合检测四种胃癌肿瘤标志物指标：PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199，针对胃癌的早期诊断可以在一次检测中得到更多可靠的临床信息，能够减少样本需求量、提高检测效率和准确性，为临床疾病病程判断及治疗方案的选择提供更好的依据。
附图说明
图1为本发明的试剂盒的组成示意图；
图2-5为发明的实施例4中得到的四种胃癌肿瘤标志物的浓度与荧光信号强度之间关系的标准曲线；
图6为本发明的实施例5中的四指标联检交叉验证的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本实施例提供一种基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，利用该试剂盒结合液相芯片法可同时检测四种胃癌肿瘤标志物：PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199，参照图1，该试剂盒包括：
A组分，其包括四种表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球，其中，所述捕获抗体包括PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体，每种量子点磁性编码微球(图1A中以圆圈表示)具有不同的荧光强度且表面只标记一种捕获抗体，所述捕获抗体可与对应的胃癌肿瘤标志物结合；
B组分，其包括生物素(Bio)标记的四种检测抗体，其中，所述检测抗体包括PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体，每种检测抗体上均标记有相同的生物素，所述检测抗体可与对应的胃癌肿瘤标志物结合；
以及C组分，其为亲和素化的藻红蛋白(SA-PE)，其可与生物素标记的检测抗体结合。
所述A组分的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ-1)制备量子点磁性编码微球：将磁性聚苯乙烯多孔微球分散于异丙醇溶液中，超声分散均匀得到磁性微球溶液；将量子点溶于氯仿中，将得到的量子点氯仿溶液再加入所述磁性微球溶液中，搅拌两小时后，置于真空干燥箱中干燥，得到量子点磁性编码微球；得到的量子点磁性编码微球用环己烷清洗一次，再用乙醇清洗两次，最后用去离子水清洗两次后分散于水中备用；其中，通过加入不同量的量子点氯仿溶液来获得具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球；
Ⅰ-2)通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，然后在量子点磁性编码微球表面标记不同的捕获抗体：
通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，各取100μL(约1×106个)，分别记为1～4#，均进行如下处理：用洗涤液清洗两次，然后用活化液在室温避光条件下摇床振动活化20min，活化后再用洗涤液清洗两次，再分散到PBS溶液中；
得到的四种量子点磁性编码微球溶液中分别加入1～100μg(优选10～50μg)PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体，终体积均补足至250μL，然后再均进行如下处理：在室温条件下摇床振动包被2～4h，之后用洗涤液清洗两次，再加入125μL封闭液，在室温条件下摇床振动封闭0.5～1h，封闭结束后洗涤液清洗两次，加入500μL保存液在避光、4℃条件下保存备用，得到A组分。
其中，所述洗涤液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为0.02％的Tween-20后得到的混合液。所述封闭液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为5％的BSA后得到的混合液。所述保存液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为0.02％的Tween-20和质量分数为0.01％的NaN3后得到的混合液。
所述B组分的制备方法包括以下步骤：
取PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体分别与生物素混合，且检测抗体与生物素的摩尔比为1：30，然后分别进行如下处理：室温避光条件下在摇床上孵育30min，反应结束后在6000r/min下超滤离心30min，再加入PBS缓冲液重复超滤过程2次，纯化生物素标记的检测抗体，除去未参与反应的生物素；得到生物素标记的四种检测抗体。
本实施例中，PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体依次为：K50F4、K28c9、5909SP-5和4701SPTN-5，PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体依次为：K56t1、K30t2、5910SPTN-5和4701SPTN-5，其中，K50F4、K56t1、K28c9、K30t2购自南京欧凯生物科技有限公司，5909SP-5、5910SPTN-5、4701SPTN-5均购自芬兰Medix Biochemica公司。
本实施例中，该试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)将20μL待测样本与80ulA组分涡旋混匀10～30s，放入提前预热到37℃的金属浴中振荡孵育30min，通过四种量子点磁性编码微球(即PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体、CA199捕获抗体四种捕获抗体分别结合在四种不同的量子点磁性编码微球上)分别捕获四种胃癌肿瘤标志物；
2)将步骤1)反应后的产物在磁力架上静置10～30s后弃上清液，加入洗涤液清洗2遍后与100ul B组分混合，涡旋混匀10～30s，在37℃下振荡孵育30min，使四种检测抗体(生物素标记的PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199检测抗体)分别与四种胃癌肿瘤标志物结合；
3)将步骤2)反应后的产物在磁力架上静置10～30s后弃上清液，加入洗涤液清洗2遍后与100ul C组分混合，涡旋混匀10～30s，避光条件下孵育30min，使亲和素化的藻红蛋白与检测抗体结合；
4)使用流式细胞仪对将步骤3)反应后的产物进行检测，通过四种量子点磁性编码微球对四种胃癌肿瘤标志物进行通道分类，通过亲和素化的藻红蛋白作为报告分子，根据每个通道的荧光信号强度计算出每种胃癌肿瘤标志物的浓度。可预先制定每种胃癌肿瘤标志物的浓度与反应产物的荧光信号强度之间的关系的标准曲线，利用该标准曲线即可根据每个通道的荧光信号强度计算出每种胃癌肿瘤标志物的浓度。
以下再提供进一步的实施例
实施例2量子点磁性编码微球表面捕获抗体标记
(1)取四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，各取100μL(约1×106个)，分别记为1～4#，洗涤液洗2遍；
(2)称取10.2mg S-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和10.4mg EDC分别溶解于204ul和208ul的MES缓冲液中；
(3)向步骤(1)洗涤好的4种量子点磁性编码微球中均加入80ul MES缓冲液，涡旋混匀，然后再加入步骤(2)中配置好的50mg/mL S-NHS和EDC溶液各10ul，在室温避光条件下摇床振动活化20～30min，然后各自分散到PBS缓冲液中，记为1～4#；
(4)分别取10～20ul经超滤离心纯化后浓度为1.2mg/mL的PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199捕获抗体，分别加入240ul步骤(3)制得的4种PBS缓冲液，得到4种微球-捕获抗体复合体(表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球)，即PGⅠ捕获抗体与1#PBS缓冲液混合、PGⅡ捕获抗体与2#PBS缓冲液混合、CEA捕获抗体与3#PBS缓冲液混合、CA199捕获抗体与4#PBS缓冲液混合，涡旋混匀，在室温避光条件下摇床振动包被2h；
(5)洗涤液洗2遍步骤(4)反应后的微球-捕获抗体复合体，加125ul封闭液，涡旋混匀，在室温避光条件下摇床振动封闭30min。
(6)洗涤液洗2遍封闭结束后的微球-捕获抗体复合体，加入保存液4℃、避光条件下保存备用，标记完成，得到4种表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球。
实施例3量子点磁性编码微球表面捕获抗体标记结果验证
(1)取实施例2制得的4种表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球各5uL(约5000个)，分别加入95uL生物素高效标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，浓度为50ug/mL，涡旋混匀后在37℃的金属浴中振荡孵育30min。
(2)反应结束洗涤液洗2遍后，加入报告分子SA-PE,涡旋混匀后在避光条件下孵育30min。
(3)上机检测(本实施例中采用BD LSRFortessa流式细胞仪)，检测结果如下表1所示
表1
检测指标 PGⅠ PGⅡ CEA CA199
MFI 149001 151546 145222 143892
阴性值MFI一般在100-200左右，从以上的检测结果可以看出，4种量子点磁性编码微球表面均已成功标记捕获抗体。
实施例4标准曲线的建立
(1)将4种胃癌肿瘤标志物蛋白用含有5％FBS的PBS缓冲液梯度稀释，其中PGⅠ、PGⅡ的浓度为0、15.625、31.25、62.5、125、250ng/mL，CEA的浓度为0、31.25、62.5、125、250、500ng/mL，CA199的浓度为0、31.25、62.5、125、250、500KU/L；
(2)每管取80ul量子点磁性编码微球，加入20ul步骤(1)制得的稀释好的各浓度胃癌肿瘤标志物，每个浓度设置3个平行样本，涡旋混匀10s后放入提前预热到37℃的金属浴中振荡孵育30min。
(3)反应结束后清洗两遍，再分别加入100ul浓度为2.5μg/mL的生物素标记的PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199检测抗体，涡旋混匀10～30s后在37℃的金属浴中振荡孵育30min。
(4)检测抗体反应结束后清洗两遍，加入报告分子SA-PE溶液100ul，涡旋混匀10～30s后在避光条件下孵育30min。
(5)上机检测，数据分析，各指标各浓度的3个平行样本信号值求平均值，分别绘制标准曲线。四种胃癌肿瘤标志物的浓度与荧光信号强度之间关系的标准曲线分别如图2-5所示。
实施例5四指标联检交叉验证
(1)单指标检测：四种表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球分别与各自抗原(胃癌肿瘤标志物)进行单重免疫反应,抗原浓度分别为250和500ng/mL；即标记PGⅠ捕获抗体的量子点磁性编码微球与PGⅠ蛋白反应，标记PGⅡ捕获抗体的量子点磁性编码微球与PGⅡ蛋白反应...；
(2)四指标联检：四种表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球的混合微球与抗原浓度分别为250和500ng/mL的四指标抗原混合液(即4种胃癌肿瘤标志物的混合液)反应；
(3)反应过程操作步骤同实施例4；
(4)上机检测，数据分析。图6为检测结果，图6为在相同浓度下的信号值对比，左边为单指标检测，右边为四指标联检，其中，每个指标的两个柱状图对应两个浓度，从左至右为250和500ng/mL；可以看出四指标联检的各指标信号略低于单指标检测，但是仍能实现检测，能提供可靠的检测结果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒可同时检测四种胃癌肿瘤标志物：PGⅠ、PGⅡ、CEA和CA199，该试剂盒包括：
A组分，其包括四种表面标记有捕获抗体的量子点磁性编码微球，其中，所述捕获抗体包括PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体，每种量子点磁性编码微球具有不同的荧光强度且表面只标记一种捕获抗体，所述捕获抗体可与对应的胃癌肿瘤标志物结合；
B组分，其包括生物素标记的四种检测抗体，其中，所述检测抗体包括PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体，每种检测抗体上均标记有相同的生物素，所述检测抗体可与对应的胃癌肿瘤标志物结合；
以及C组分，其为亲和素化的藻红蛋白，其可与生物素标记的检测抗体结合。
2.根据权利要求1所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)将待测样本与A组分混合，孵育，通过四种量子点磁性编码微球分别捕获四种胃癌肿瘤标志物；
2)将步骤1)反应后的产物与B组分混合，孵育，使四种检测抗体分别与四种胃癌肿瘤标志物结合；
3)将步骤2)反应后的产物与C组分混合，避光条件下孵育，使亲和素化的藻红蛋白与检测抗体结合；
4)使用流式细胞仪对将步骤3)反应后的产物进行检测，通过四种量子点磁性编码微球对四种胃癌肿瘤标志物进行通道分类，通过亲和素化的藻红蛋白作为报告分子，根据每个通道的荧光信号强度计算出每种胃癌肿瘤标志物的浓度。
3.根据权利要求2所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)将待测样本与A组分涡旋混匀10～30s，在37℃下振荡孵育30min，通过四种量子点磁性编码微球分别捕获四种胃癌肿瘤标志物；
2)将步骤1)反应后的产物弃上清液，加入洗涤液清洗2遍后与B组分混合，涡旋混匀10～30s，在37℃下振荡孵育30min，使四种检测抗体分别与四种胃癌肿瘤标志物结合；
3)将步骤2)反应后的产物弃上清液，加入洗涤液清洗2遍后与C组分混合，涡旋混匀10～30s，避光条件下孵育30min，使亲和素化的藻红蛋白与检测抗体结合；
4)使用流式细胞仪对将步骤3)反应后的产物进行检测，通过四种量子点磁性编码微球对四种胃癌肿瘤标志物进行通道分类，通过亲和素化的藻红蛋白作为报告分子，根据每个通道的荧光信号强度计算出每种胃癌肿瘤标志物的浓度。
4.根据权利要求1所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，所述A组分的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ-1)制备量子点磁性编码微球：将磁性聚苯乙烯多孔微球分散于异丙醇溶液中，超声分散均匀得到磁性微球溶液；将量子点溶于氯仿中，得到的量子点氯仿溶液再加入所述磁性微球溶液中，搅拌均匀后，置于真空干燥箱中干燥，得到量子点磁性编码微球；得到的量子点磁性编码微球用环己烷清洗，再用乙醇清洗，最后用去离子水清洗后分散于水中备用；其中，通过加入不同量的量子点氯仿溶液来获得具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球；
Ⅰ-2)通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，然后在量子点磁性编码微球表面标记不同的捕获抗体：
通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，分别记为1～4#，均进行如下处理：用洗涤液清洗，然后用活化液在室温避光条件下摇床振动活化，活化后再用洗涤液清洗，再分散到PBS溶液中；
在得到的四种量子点磁性编码微球溶液中分别加入PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体，然后再均进行如下处理：在室温条件下摇床振动包被，之后用洗涤液清洗，再加入封闭液，在室温条件下摇床振动封闭，封闭结束后洗涤液清洗，加入保存液在避光条件下保存备用，得到A组分。
5.根据权利要求4所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，所述A组分的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ-1)制备量子点磁性编码微球：将磁性聚苯乙烯多孔微球分散于异丙醇溶液中，超声分散均匀得到磁性微球溶液；将量子点溶于氯仿中，将得到的量子点氯仿溶液再加入所述磁性微球溶液中，搅拌两小时后，置于真空干燥箱中干燥，得到量子点磁性编码微球；得到的量子点磁性编码微球用环己烷清洗一次，再用乙醇清洗两次，最后用去离子水清洗两次后分散于水中备用；其中，通过加入不同量的量子点氯仿溶液来获得具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球；
Ⅰ-2)通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，然后在量子点磁性编码微球表面标记不同的捕获抗体：
通过所述步骤Ⅰ-1)制备四种具有不同荧光强度的量子点磁性编码微球，分别记为1～4#，均进行如下处理：用洗涤液清洗两次，然后用活化液在室温避光条件下摇床振动活化20min，活化后再用洗涤液清洗两次，再分散到PBS溶液中；
得到的四种量子点磁性编码微球溶液中分别加入PGⅠ捕获抗体、PGⅡ捕获抗体、CEA捕获抗体和CA199捕获抗体，然后再均进行如下处理：在室温条件下摇床振动包被2～4h，之后用洗涤液清洗两次，再加入封闭液，在室温条件下摇床振动封闭0.5～1h，封闭结束后洗涤液清洗两次，加入保存液在避光、4℃条件下保存备用，得到A组分。
6.根据权利要求1所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，所述B组分的制备方法包括以下步骤：
取PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体分别与生物素混合，然后分别进行如下处理：室温避光条件下在摇床上孵育，反应结束后超滤离心，纯化生物素标记的检测抗体，除去未参与反应的生物素；得到生物素标记的四种检测抗体。
7.根据权利要求6所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，所述B组分的制备方法包括以下步骤：
取PGⅠ检测抗体、PGⅡ检测抗体、CEA检测抗体和CA199检测抗体分别与生物素混合，且检测抗体与生物素的摩尔比为1：30，然后分别进行如下处理：室温避光条件下在摇床上孵育30min，反应结束后在6000r/min下超滤离心30min，再加入PBS缓冲液重复超滤过程2次，纯化生物素标记的检测抗体，除去未参与反应的生物素；得到生物素标记的四种检测抗体。
8.根据权利要求4或5所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为0.02％的Tween-20后得到的混合液。
9.根据权利要求4或5所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为5％的BSA后得到的混合液。
10.根据权利要求4或5所述的基于量子点磁性编码微球多重检测胃癌肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，所述保存液为：pH值为7.4的PBS缓冲液中加入质量分数为0.02％的Tween-20和质量分数为0.01％的NaN3后得到的混合液。
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