CN113552353A - 一种用于PCa及CRPC疾病诊断的磁微粒化学发光试剂盒 - Google Patents

一种用于PCa及CRPC疾病诊断的磁微粒化学发光试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于PCa及CRPC疾病诊断的磁微粒化学发光试剂盒，属于生物诊断技术领域。本发明首次提出了代谢类蛋白(GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10)可作为生物标志物，通过磁微粒化学发光法制备一次性检测5个指标，单项或多项综合评判用于诊断PCa、CRPC疾病的试剂盒。本发明试剂盒以血液中的代谢类蛋白作为检测指标，有效诊断PCa、CRPC，并弥补血液PSA检测并不能准确诊断PCa的弊端，可大大减轻病人重复穿刺等带来的极大身心负担和经济压力。此试剂盒的检测指标可以用来改善前列腺癌及去势抵抗性前列腺癌的诊断和预后。

Description

一种用于PCa及CRPC疾病诊断的磁微粒化学发光试剂盒
技术领域
本发明属于生物诊断技术领域，具体涉及一种用于PCa及CRPC疾病诊断的磁微粒化学发光试剂盒。
背景技术
前列腺癌是一种常见的多灶性疾病，但现有的诊断方法并不令人满意。大多数肿瘤的恶性潜能较低，但是也有一部分侵袭性很强，最终发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。前列腺癌早期缺乏症状，不易诊断。传统的检验方法是直肠指诊(DRE)，但有时不能发现局限于前列腺内的小肿瘤。Cooner等1990年发表了有关临床应用前列腺超声检验和检测血清中的PSA(前列腺特异性抗原的简称)诊断早期前列腺癌的研究结果，发现DRE和PSA均异常可显著提高对前列腺的预测性。因此，联合检验DRE和PSA可以提高早期前列腺癌的诊断率。目前，PSA在大多数有临床意义的前列腺癌(PCa)中都会升高，也是最重要的早期检测PCa的指标。血清PSA正常值一般<4ng/mL，当PCa发生时PSA>10ng/mL，具有辅助临床诊断的显著意义。但因良性前列腺增生和前列腺炎也会出现PSA阳性的结果，因此解决此问题的一个方法是检测游离前列腺特异性抗原(fPSA)。研究表明，在PCa患者中，绝大部分PSA为结合状态，其fPSA/tPSA(总PSA)的比值低于正常人或良性前列腺增生患者。因此通过计算fPSA/tPSA的比值可以提高筛查和诊断PCa的特异性，参考值为0.16，即其比值<0.16，则提示患PCa的可能性较高。但有研究表明，fPSA水平在血清中不稳定，fPSA/tPSA比值分布较离散，两者相关性不显著，难以根据fPSA/tPSA比值来筛查和诊断前列腺癌。而结合PSA(cPSA)和tPSA相关性好。前列腺操作对cPSA的影响弱于对tPSA的影响。前列腺体积对cPSA的影响也弱于对tPSA的影响。故cPSA是诊断前列腺癌的较理想指标。在tPSA<10ng/ml，cPSA/tPSA≥0.78为前列腺癌敏感性97.8％，特异性95.8％。除此之外，还有关于PSA的检测方法，即观察PSA密度法和PSA速度法。PSA密度指血清PSA的浓度与前列腺体积的比值，前列腺的体积可用B超法测定。若发现一个前列腺体积不大而血清PSA水平却是中等程度的病人，往往有前列癌的可能。而同样数值的PSA对于一个前列腺体积较大的病人，这可能仅仅是良性前列腺增生。PSA密度小于或等于0.15时一般不会有恶性病变存在，但大于0.15时，患前列腺癌的危险性增高。PSA速度：人随着年龄的增加PSA每年增长小于0.75ng/ml，一般不会患有前列腺癌。大于0.75ng/ml则患前列腺癌的危险性增加。据研究对前列腺癌患者术前PSA增长速度在1年内大于2ng/ml，以及前列腺癌切除或放疗后提示复发的患者中，其PSA倍增时间≤3个月与死亡风险增高相关。
除已知的前列腺相关标志物PSA外，还有前列腺酸性磷酸酶(PAP)，为前列腺分泌的酶，正常时PAP很少进入血液，前列腺癌时，恶性细胞产生PAP而且进入血液。正常值血清PAP小于3.5ng/ml。虽然PAP作用有限，但被认为是前列腺癌根治术后治疗失败的另一独立预测因素，尽管其不能预测分期以及周围其他器官的情况。另外，前列腺特异性肽(Prostate specific photase，PSP)和前列腺特异性膜抗原(Prostate specificmembrane antigen，PSMA)，由于前列腺癌上皮细胞中PSMA的表达不受肿瘤细胞分化程度的影响，而且对去势后仍有较高表达，检测PSP、PSMA比PSA或PAP更有意义，该项指标对于前列腺癌的早期诊断、复发和进展情况的评价，具有一定的临床价值。
在PCa的诊断过程中，最常用的筛查指标PSA，确诊的金标准为前列腺穿刺活检术。然而，血PSA诊断准确率较低，而前列腺活检过程为有创方式，患者痛苦较大,最重要的是过度诊断带来的过度治疗风险。核医学影像学诊断的准确率相对较低，通常18F-FDG-PET/CT也只在进展期前列腺癌中显像明显，在早期前列腺癌中诊断准确率低，这也极其不利于肿瘤的早发现、早诊断。
随着我国人口老龄化的加剧，PCa发病率逐年上升，前列腺癌诊疗过程中形成了“PSA检测-穿刺活检-治疗”的经典模式，随之而来的是由于PSA特异性不足带来的重复穿刺问题和惰性PCa的过度治疗问题。为此，急需提供一种针对病情预后合治疗效果能够作出预测、成本低、操作简便的诊断试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为前列腺癌及去势抵抗性前列腺癌的诊断，提供一种有效的血液生物标志物检测试剂盒，即血液中代谢类蛋白(GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10)检测试剂盒，可实现一次检测得出5个代谢类蛋白指标，专门针对PCa、CRPC病人的简单高效综合诊断。
本发明的第一个目的是提供一种用于PCa及CRPC疾病诊断的磁微粒化学发光试剂盒，包括：抗体试剂、链霉亲和素标记的纳米磁微粒和发光物质；
其中，抗体试剂包括生物素标记的抗体溶液；辣根过氧化物酶标记的抗体溶液；抗体选自如下任意一种或多种：GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10；
发光物质包括溶液A和溶液B，溶液A为鲁米诺的水溶液，溶液B为Na2B4O7溶液。
进一步的，试剂盒由抗体试剂与链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液预先混合，然后加入发光物质溶液和测试样品，用于检测诊断测试样品的GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10指标。
进一步的，抗体试剂中，生物素标记的抗体溶液的浓度为0.5μg/mL；辣根过氧化物酶标记的抗体溶液的浓度为2μg/mL。
进一步的，抗体试剂中生物素标记的抗体，与辣根过氧化物酶标记的抗体的质量比为1：4。
进一步的，链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL。
进一步的，溶液A为含有0.4％鲁米诺，pH＝9.0的水溶液，溶液B为含有0.06％Na2B4O7，pH＝5.0的水溶液。溶液A与溶液B的体积比为1：1。
进一步的，抗体与链霉亲和素标记的纳米磁微粒的质量比为1：120。
进一步的，链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液与发光物质的体积比为3：1。
进一步的，试剂盒的使用包括：预先使用校准品、质控品构建GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10的检测模型；其中，校准品：GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10这5个指标校准品浓度为：0.05，0.5，2，8，40，100ng/mL；质控品：GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10这5个指标质控品浓度为：0.5，40ng/mL。
将上述各已知浓度的校准品与抗体溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液混合，然后加入发光物质溶液与校准品，获得相应的发光强度；利用校准品的浓度与发光强度构建标准曲线，即得相应的检测模型。进一步的，所述校准品、所述质控品均由GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗原与0.2M、pH值为7的Tris-HCl缓冲液配制得到；GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗原经纯化所得。
进一步的，所述生物素标记的抗体的配制方法为：将抗体配制成每种抗体的浓度均为2mg/mL的溶液，然后按1:20体积比加入到浓度为10mg/mL的生物素溶液中，然后将其加入到0.01M pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃透析18小时以上，期间换液3-4次，第一次换液间隔2小时以上，其后间隔4小时，透析完成之后再用0.01M、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液透析后调整浓度至0.5μg/mL，GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体由小鼠免疫得到。
进一步的，所述辣根过氧化物酶标记的抗体的配制方法为：将抗体配制成每种抗体的浓度均为1mg/mL的溶液，然后按1:20体积比加入到5.0mg/mL的辣根过氧化物酶溶液中，混合后进行纯化，所述纯化是用pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液平衡并洗脱，紫外检测和记录纯化图谱，再用0.05M、pH＝6.0的MES缓冲液对辣根过氧化物酶标记的抗体稀释至2μg/mL。
进一步的，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过程为：先通过磁场将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀；然后在去除磁场的情况下，沉淀用0.01M、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液重悬，混匀磁分离；其次，加上磁场，使得链霉亲和素标记的纳米磁微粒沉出；再次，清洗沉淀；最后，清洗后的链霉亲和素标记的纳米磁微粒分散于0.01M、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液，浓度为0.5mg/mL；所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒购自GE公司，货号21152104010350。
进一步的，所述试剂盒还包括洗液，所述洗液为含有1％吐温、0.1％Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.8。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将试剂盒中设置有代谢类蛋白抗体作为指示物，来检测血液中的生物标志物代谢类蛋白(GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10)。
本发明的第二个目的是提供上述试剂盒的检测方法：将所测血液加入本试剂盒的生物素标记的GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体溶液及辣根过氧化物酶标记的GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体溶液中在链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液中反应检测信号强度得出所测5个指标值，包括：测得血液样本中GPX4含量>10ng/mL具有辅助临床诊断为PCa的显著意义，GPX4含量>30ng/mL具有辅助临床诊断为CRPC的显著意义；TXNRD2含量>3ng/mL具有辅助临床诊断为PCa的显著意义，TXNRD2含量>5ng/mL具有辅助临床诊断为CRPC的显著意义；PRDX5含量>0.2ng/mL具有辅助临床诊断为PCa的显著意义，PRDX5含量>0.4ng/mL具有辅助临床诊断为CRPC的显著意义；NDUFS4含量>0.6ng/mL具有辅助临床诊断为PCa的显著意义，NDUFS4含量>1ng/mL具有辅助临床诊断为CRPC的显著意义。综合指标：5个指标综合评价>6ng/mL可评判为PCa，>10ng/mL可评判为CRPC。
本发明的第三个目的是提供上述试剂盒在制备PCa及CRPC诊断或预后设备中的应用。
本发明还提供了一种诊断PCa、CRPC的方法，利用代谢类蛋白作为生物标志物的，对PCa、CRPC患者进行检测诊断；所述代谢类蛋白选自如下一种或多种：GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次提出了一种利用代谢类蛋白(GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10)作为生物标记物，制备用于诊断PCa、CRPC疾病的试剂盒，并提供了试剂盒的制备方法、检测方法与应用，运用此代谢类蛋白检测试剂盒对人体血液样本进行检测，可以一次性检测获得GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10 5个指标的准确浓度，从而综合诊断PCa、CRPC疾病进程，为病人得到精准的诊断及后续的治疗。本发明试剂盒可以用于血液检测，方便快捷，使得病人免于重复穿刺，极大减少病人的身心负担和经济压力。本发明试剂盒的检测指标可以用来改善前列腺癌及去势抵抗性前列腺癌的诊断和预后，为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。
附图说明
图1是用ENZ建立耐药的CRPC小鼠模型；其中，图1A为耐药CRPC小鼠模型成功建立过程中前列腺重的变化图；图1B为耐药CRPC小鼠模型成功建立过程中前列腺的变化图像；图1C为耐药CRPC小鼠模型成功建立过程中小鼠前列腺组织切片的HE染色图；图1D为耐药CRPC小鼠模型成功建立过程中小鼠血清PSA的ELISA测定值曲线图。
图2是耐药CRPC小鼠前列腺组织的代谢类蛋白的表达量变化；其中，图2A为NC组及ENZ组在不同时间点灌胃后影响代谢类蛋白表达量变化图；图2B为剥取各组小鼠前列腺组织后切片，免疫组化观察代谢类蛋白表达量的变化。
图3是取20例前列腺增生(Benign)、20例原发性前列腺癌、8例转移性去势抵抗性前列腺癌病人的血液，测定其代谢类蛋白的ELISA表达量；其中，图3A为GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4蛋白的人血清ELISA指标测定结果图；图3B为病人前列腺癌(tumor)、癌旁(normal)的组织切片IHC染色图。
图4是运用本发明的磁微粒化学发光试剂盒测定人血液中GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10指标实施例，判断疾病状态。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1用ENZ建立耐药CRPC小鼠模型后观察代谢类蛋白表达量变化。
用ENZ建立耐药的CRPC小鼠模型，7个月后建立成功，小鼠前列腺肿瘤再次增大，PSA水平的变高，记忆蛋白表达量上升。
1、实验方法
构建C-MYC(Hi-Myc)过表达的自发前列腺癌小鼠模型，在4个月时，小鼠发展为mPIN/Cancer transition，此时随机分组为NC对照组(灌胃溶剂)、Enza用药组，后每三天一次灌胃，Enza为10mg/Kg，共给药3个月，每个月相应的小鼠断颈并取其前列腺癌进行拍照、称重，取其血清进行小鼠PSA ELISA值测定，取其前列腺组织进行切片，HE染色及相应代谢类蛋白marker的IHC染色，另外，前列腺组织按WB步骤进行代谢类蛋白marker的WB测定。
2、结果如图1、图2所示，图1中，图1A为耐药CRPC小鼠模型成功建立过程中前列腺重的变化图；图1B为耐药CRPC小鼠模型成功建立过程中前列腺的变化图像；图1C为耐药CRPC小鼠模型成功建立过程中小鼠前列腺组织切片的HE染色图；图1D为耐药CRPC小鼠模型成功建立过程中小鼠血清PSA的ELISA测定值曲线图；图2中，图2A为NC组及ENZ组在不同时间点灌胃后影响代谢类蛋白的蛋白表达量变化图；图2B为剥取各组小鼠前列腺组织后切片，免疫组化观察代谢类蛋白的表达量变化。
结果显示，灌胃到6个月龄(及灌胃2个月)发现Enza可明显减轻病症，在6个月(6M)时前列腺重相比于NC对照组降低一半，后按上述方法继续用药剩余的小鼠一个月，发现Enza组有复发现象，表现为前列腺重相比于6M增加，前列腺组织切片HE染色着色变深、空泡浓染现象增加，PSA表达量也上升。将这些时间点的小鼠前列腺组织提取蛋白，经过WB测定发现在灌胃ENZ 3个月时GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10均有显著的蛋白表达量上调效果，且前列腺组织切片IHC染色结果观察发现GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4这4个marker阳性率在7M时升高。
实施例2代谢类蛋白可作为诊断CRPC疾病的指标
取20例前列腺增生(Benign)、20例原发性前列腺癌、8例转移性去势抵抗性前列腺癌病人的血液，测定其代谢类蛋白的ELISA表达量。
1、实验方法
取20例前列腺增生(Benign)、20例原发性前列腺癌、8例转移性去势抵抗性前列腺癌病人的血液，根据GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4的ELISA试剂盒说明书测定其蛋白的表达量；取前列腺癌病人的前列腺癌、癌旁组织进行代谢类蛋白免疫组化(IHC)染色观察。
2、结果如图3所示，图3中，图3A为GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4蛋白的人血清ELISA指标测定结果图；图3B为病人前列腺癌(tumor)、癌旁(normal)的组织切片IHC染色图。
结果显示，GPX4的表达在PCa病人和Benign病人中有显著差异，同样在CRPC病人和PCa病人中也有显著差异，说明GPX4或可作为诊断PCa病人及CRPC病人的biomarker；同样地，TXNRD2的表达在PCa病人和Benign病人中有显著差异，而在CRPC病人和PCa病人中没有显著差异，说明TXNRD2或可作为诊断PCa病人的biomarker；PRDX5的表达在PCa病人和Benign病人中有显著差异，同样在CRPC病人和PCa病人中也有显著差异，说明PRDX5或可作为诊断PCa病人及CRPC病人的biomarker；NDUFS4的表达在PCa病人和Benign病人中有显著差异，同样在CRPC病人和PCa病人中也有显著差异，说明NDUFS4或可作为诊断PCa病人及CRPC病人的biomarker。以上数据显示这4个指标可作为CRPC诊断的生物标志物，作为包含相应检测靶点的试剂盒单测或混合测定的指标。为后续磁微粒化学发光试剂盒的发明做理论依据。在前列腺癌病人的前列腺组织中染IHC发现这些代谢类蛋白同样出现癌比癌旁阳性率显著增加，表达量显著升高的现象，说明这4个指标可作为PCa诊断的生物标志物，作为包含相应检测靶点的试剂盒单测或混合测定的指标。为后续磁微粒化学发光试剂盒的发明做理论依据。
实施例3磁微粒化学发光试剂盒测定血液中GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10指标判断疾病状态
取20例前列腺增生(Benign)、20例原发性前列腺癌、8例转移性去势抵抗性前列腺癌病人的血液，测定其代谢类蛋白的表达量。
1、实验方法
取20例前列腺增生(Benign)、20例原发性前列腺癌、8例转移性去势抵抗性前列腺癌病人的血液运用本试剂盒测定。
涉及的校准品、所述质控品均由GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗原与0.2M、pH值为7的Tris-HCl缓冲液配制得到；GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗原经纯化所得。
涉及的生物素标记的GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体的配制方法为：将抗体配制成GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体的浓度均为2mg/mL的溶液，然后按1:20体积比加入到浓度为10mg/mL的生物素溶液中，然后将其加入到0.01MpH＝7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃透析18小时以上，期间换液3-4次，第一次换液间隔2小时以上，其后间隔4小时，透析完成之后再用0.01M、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液透析后调整浓度至0.5μg/mL，获得抗体溶液。GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体由小鼠免疫得到。
涉及的辣根过氧化物酶标记的GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体的配制方法为：将抗体配制成GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体的浓度均为1mg/mL的溶液，然后按1:20体积比加入到5.0mg/mL的辣根过氧化物酶溶液中，混合后进行纯化，所述纯化是用pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液平衡并洗脱，紫外检测和记录纯化图谱，再用0.05M、pH＝6.0的MES缓冲液对辣根过氧化物酶标记的GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体稀释至2μg/mL溶液。
涉及的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过程为：先通过磁场将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀；然后在去除磁场的情况下，沉淀用0.01M、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液重悬，混匀磁分离；其次，加上磁场，使得链霉亲和素标记的纳米磁微粒沉出；再次，清洗沉淀；最后，清洗后的链霉亲和素标记的纳米磁微粒分散于0.01M、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液获得悬浮液，浓度为0.5mg/mL；所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒购自GE公司，货号21152104010350。
涉及的发光物质由溶液A和溶液B组成；其中，溶液A为含有0.4％鲁米诺，pH＝9.0的水溶液，溶液B为含有0.06％Na2B4O7，pH＝5.0的水溶液；溶液A和溶液B的体积比为1：1。
具体使用过程包括：
(1)将50μL生物素标记的GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体溶液、50μL辣根过氧化物酶记的GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10抗体溶液、30μL链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液和50μL待检血清样本混匀并反应，反应后置于磁场中静置并去上清，得到第一溶液；
(2)向所述第一溶液中加入10μL发光底物并反应，测发光强度；
(3)利用已知浓度的校准品替代待检血清样本，获得相应发光强度，利用发光强度与相应校准品浓度绘制发光强度标准曲线；
(4)按照标准曲线，根据待测血清样本的发光强度，计算得出待测血清样本中GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10的含量。
进一步的，步骤(1)中所述反应的条件为37℃下反应15分钟，所述静置的时间为2分钟；步骤(1)中还包括对所述第一溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置并去上清，清洗重复3次；
步骤(2)中所述反应的条件为37℃下反应5分钟，所述静置的时间为2分钟；步骤(2)中还包括对所述第二溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置并去上清，清洗重复3次；
步骤(3)中所述反应的条件为37℃下反应5分钟，在化学发光分析/测定仪中测定发光强度。
进一步的，步骤(1)、步骤(2)中的磁场强度为10000高斯(G)。
2、结果如图4及表1所示，其中，图4为GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10混合蛋白的磁微粒化学发光测定标准曲线图；表1为以上人血清测定结果。
结果显示，标准曲线线性相关性好，R2＝0.9987，表明此标准品及检测方法良好。如表1所示为血液测定结果：指标1(GPX4)测定Benign病人均值为11.31ng/mL，而PCa病人均值则为23.62ng/mL，CRPC病人均值为40.80ng/mL；对于指标2(TNXRD2)测定Benign病人均值为2.04ng/mL，而PCa病人均值则为5.82ng/mL，CRPC病人均值为7.69ng/mL；对于指标3(PRDX5)测定Benign病人均值为0.12ng/mL，而PCa病人均值则为0.41ng/mL，CRPC病人均值为0.59ng/mL；对于指标4(NDUFS4)测定Benign病人均值为0.43ng/mL，而PCa病人均值则为0.99ng/mL，CRPC病人均值为2.23ng/mL；对于指标5(TIMM10)测定Benign病人均值为0.17ng/mL，而PCa病人均值则为0.32ng/mL，CRPC病人均值为0.48ng/mL。计算此5个指标的综合指标来看，Benign病人均值低于6ng/mL，可以此值作为疾病诊断标准，当综合指标>6ng/mL时可评判为PCa疾病，当综合指标>10ng/mL时可评判为CRPC疾病。
表1 GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10 5个混合指标测定结果
Figure BDA0003159141460000091

Claims (10)

1.一种用于PCa及CRPC疾病诊断的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，包括：抗体试剂、链霉亲和素标记的纳米磁微粒和发光物质；
其中，抗体试剂包括生物素标记的抗体溶液；和/或，辣根过氧化物酶标记的抗体溶液；抗体选自如下任意一种或多种：GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10。
2.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，生物素标记的抗体溶液的浓度为0.5μg/mL；辣根过氧化物酶标记的抗体溶液的浓度为2μg/mL。
3.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，抗体试剂中生物素标记的抗体，与辣根过氧化物酶标记的抗体的质量比为1：4。
4.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，链霉亲和素标记的纳米磁微粒配制为浓度为0.5mg/mL的悬浮液。
5.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，发光物质包括溶液A和溶液B，溶液A为鲁米诺的水溶液，溶液B为Na2B4O7的水溶液。
6.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，抗体与链霉亲和素标记的纳米磁微粒的质量比为1：120。
7.根据权利要求5所述的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，溶液A为含有0.4％鲁米诺，pH＝9.0的水溶液。
8.根据权利要求5所述的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，溶液B为含有0.06％Na2B4O7，pH＝5.0的水溶液。
9.权利要求1-8任一项所述的磁微粒化学发光试剂盒在制备用于PCa及CRPC诊断或预后的设备中的应用。
10.一种诊断PCa、CRPC的方法，其特征在于，利用代谢类蛋白作为生物标志物对PCa、CRPC患者进行检测诊断；所述代谢类蛋白选自如下一种或多种：GPX4、TXNRD2、PRDX5、NDUFS4、TIMM10。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100216654A1 (en) * 2007-03-12 2010-08-26 Miraculins, Inc. Biomarkers of prostate cancer and uses thereof
WO2011126482A1 (en) * 2010-04-07 2011-10-13 Egenix, Inc. Immunoassay for the diagnosis of prostate cancer
CN103782174A (zh) * 2011-06-07 2014-05-07 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 用于癌症的循环生物标志物
CN111228269A (zh) * 2020-04-02 2020-06-05 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 千金藤碱及其盐作为铁死亡诱导剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111596060A (zh) * 2020-05-19 2020-08-28 迪瑞医疗科技股份有限公司 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN111707825A (zh) * 2020-07-29 2020-09-25 四川携光生物技术有限公司 联合检测肿瘤标志物mct1和mct4的试剂盒及其制备方法、应用
CN112022871A (zh) * 2020-09-24 2020-12-04 江南大学 金诺芬在制备用于治疗去势抵抗性前列腺癌药物中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100216654A1 (en) * 2007-03-12 2010-08-26 Miraculins, Inc. Biomarkers of prostate cancer and uses thereof
WO2011126482A1 (en) * 2010-04-07 2011-10-13 Egenix, Inc. Immunoassay for the diagnosis of prostate cancer
CN103782174A (zh) * 2011-06-07 2014-05-07 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 用于癌症的循环生物标志物
CN111228269A (zh) * 2020-04-02 2020-06-05 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 千金藤碱及其盐作为铁死亡诱导剂在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111596060A (zh) * 2020-05-19 2020-08-28 迪瑞医疗科技股份有限公司 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN111707825A (zh) * 2020-07-29 2020-09-25 四川携光生物技术有限公司 联合检测肿瘤标志物mct1和mct4的试剂盒及其制备方法、应用
CN112022871A (zh) * 2020-09-24 2020-12-04 江南大学 金诺芬在制备用于治疗去势抵抗性前列腺癌药物中的应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASAKI SHIOTA 等: "Oxidative stress and androgen receptor signaling in the development and progression of castration-resistant prostate cancer", 《FREE RADICAL BIOLOGY & MEDICINE》 *
RENÉ G. FEICHTINGER 等: "Reduced levels of ATP synthase subunit ATP5F1A correlate with earlier-onset prostate cancer", 《OXIDATIVE MEDICINE AND CELLULAR LONGEVITY》 *
VARLAMOVA ELENA GENNADYEVNA 等: "Contribution of mammalian selenocysteine-containing proteins to carcinogenesis", 《JOURNAL OF TRACE ELEMENTS IN MEDICINE AND BIOLOGY》 *
XUMIN ZHOU 等: "Flubendazole, FDA-approved anthelmintic, elicits valid antitumor effects by targeting P53 and promoting ferroptosis in castration-resistant prostate cancer", 《PHARMACOLOGICAL RESEARCH》 *
吴逸飞 等: "硫氧还蛋白还原酶2在恶性肿瘤中的研究进展", 《实用肿瘤学杂志》 *
邵梦楠 等: "基于microRNA-mRNA相互作用的直肠癌预后标志物的研究", 《广西医科大学学报》 *
陈云霞 等: "铁死亡在肿瘤中的研究进展", 《基础医学与临床》 *

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