CN113509550A - 一种分子刷纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种分子刷纳米粒子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种分子刷纳米粒子及其制备方法和应用，涉及生物医药材料领域。本发明提供的分子刷纳米粒子是将抗肿瘤药物和光敏剂负载于聚合物Ⅰ中制备得到，所述聚合物Ⅰ是以聚‑L‑谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物，所述聚合物Ⅰ具有刷子状结构。本发明技术方案聚合物I在水溶液中自组装形成纳米粒子，并同时负载疏水性抗肿瘤药物及光敏剂形成分子刷纳米粒子，使得制备的分子刷纳米粒子具有能对骨肉瘤同时进行化疗及光动力治疗的特性。

Description

一种分子刷纳米粒子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药材料领域，特别涉及一种分子刷纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨肿瘤，临床传统治疗方案主要为术前化疗、手术保肢和术后辅助化疗，采用上述治疗方案患者5年生存率为60％-70％，肺转移导致的病死率为30％-40％。化疗是骨肉瘤临床治疗的主要手段之一，然而，骨肉瘤是高度恶性肿瘤，很容易对多种化疗药物如顺铂、阿霉素、环磷酰胺等产生耐药性，骨肉瘤患者的预后自化疗以来，骨原性肉瘤的存活率在过去30年中无改变。因此，开发新的改善骨肉瘤患者预后的治疗方法对提高骨肉瘤患者生存率具有重要意义。
光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)是一种非侵袭性治疗肿瘤及一些非肿瘤的方法，它是利用一定波长的可见光激发聚集于肿瘤组织中的光敏剂，诱导光敏剂发生的一系列的光化学、光生物学反应，产生氧自由基或者活性氧(ROS)物质。ROS能高效地氧化细胞器，对肿瘤细胞有强烈的杀死杀伤作用。同时，由于光动力治疗的作用机理与传统化疗药物的作用机理不一样，因此，将化疗与光动力治疗相结合，是当前肿瘤治疗的新发展方向，这种联合治疗往往能取得1+1>2的效果。PDT在浅表层肿瘤，如黑色素瘤，乳腺癌的治疗上具有明显的效果，由于骨肉瘤也属于浅层肿瘤，因此PDT在骨肉瘤的治疗上具有较大的潜力。然而，常规的有机光敏剂存在水溶性差、细胞摄取量低、缺乏靶向性等缺陷。因此，如何提高光敏剂在肿瘤部位的富集程度，将直接影响光动力治疗的最终效果。
以高分子为载体的纳米药物能够延长其在体内的循环时间，通过“增强通透性和保留效应(EPR效应)”可以被动靶向肿瘤组织，进而提高生物利用度。当前大多数的高分子药物载体都是两亲性聚合物，该类聚合物主要通过自组装过程实现对药物的负载。高分子药物载体的稳定性受制于聚合物浓度，即高分子药物载体只有在聚合物浓度高于其临界纳米粒子浓度的条件下才能通过物理作用形成聚集体，而当聚合物浓度低于其临界纳米粒子浓度时，特别是载药纳米粒子通过静脉注射进入人体后，由于被血液稀释，以及受到血液流动的剪切作用，有可能导致药物提前释放，不但降低了药物利用度，同时也会造成严重的毒副作用。因此如何提高高分子药物载体在血液循环过程中的稳定性是当前一个研究热点。
提高药物载体稳定性的方法主要有化学键交联、设计单分子纳米粒子或使用刷子状的聚合物等。聚乙二醇/聚己内酯是常用的两亲性药物载体，聚谷氨酸酯由天然氨基酸制备，具有良好的生物安全性及生物相容性，因此，制备以聚-L-谷氨酸酯为主链聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的分子刷纳米粒子，并探讨其作为药物载体的应用前景，有可能为设计新型药物载体提供帮助。联合治疗在肿瘤治疗中已经体现出其独特优势，因此以聚-L-谷氨酸酯为主链聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的分子刷纳米粒子作用药物及光敏剂载体，制备新型的可用于骨肉瘤化疗及光动力治疗的纳米体系，有望为骨肉瘤的临床治疗提出新的方案。
发明内容
本发明提供了一种分子刷纳米粒子及其制备方法和应用，为骨肉瘤的临床治疗构建出新型的纳米体系。
为实现上述目的，第一方面，本发明提出了一种分子刷纳米粒子，所述分子刷纳米粒子呈球形，直径为50-110nm，所述分子刷纳米粒子是将抗肿瘤药物和光敏剂负载于聚合物I中制备得到，所述聚合物I是以聚-L-谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物，所述聚合物I具有刷子状结构，所述聚合物I的分子结构式如下：
Figure BDA0003109505190000021
其中，m,n为≥1的自然数。
由于聚合物I具有刷子状结构，可以形成稳定的纳米粒子，本发明技术方案中，利用以聚-L-谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物(即聚合物I)在水溶液中自组装形成纳米粒子，并同时负载疏水性抗肿瘤药物及光敏剂形成分子刷纳米粒子，使得制备的分子刷纳米粒子具有能对骨肉瘤同时进行化疗及光动力治疗的特性。
作为本发明所述分子刷纳米粒子的优选实施方式，所述抗肿瘤药物为阿霉素，所述光敏剂为二氢卟吩。
第二方面，本发明还提出一种分子刷纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将聚合物Ⅰ、抗肿瘤药物和光敏剂溶于有机溶剂中形成混合体系，在磁力搅拌状态下，向所述混合体系中滴加去离子水得到混合溶液，将所述混合溶液装入透析袋中，置于去离子水中透析以除去所述有机溶剂，得到负载了抗肿瘤药物和光敏剂的聚合物Ⅰ，即所述分子刷纳米粒子。
作为本发明所述分子刷纳米粒子的制备方法的优选实施方式，按重量份计，所述聚合物Ⅰ为10-20重量份，所述抗肿瘤药物为1-3重量份，所述光敏剂为1-2重量份。
作为本发明所述分子刷纳米粒子的制备方法的优选实施方式，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
作为本发明所述分子刷纳米粒子的制备方法的优选实施方式，所述聚合物Ⅰ的制备方法包括以下步骤：将端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物、聚炔丙基-L-谷氨酸酯、硫酸铜和抗坏血酸钠加入到反应容器中，在所述反应容器中继续加入二甲基亚砜充分溶解聚合物，同时通入干燥的氮气鼓泡，室温搅拌下反应24h后将反应产物用透析法提纯，收集透析液，冷冻干燥得到产物即为所述聚合物Ⅰ。
作为本发明所述分子刷纳米粒子的制备方法的优选实施方式，所述端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物的制备方法包括以下步骤：
(1)制备聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在反应容器中加入烯丙基聚乙二醇、己内酯单体、辛酸亚锡，抽真空后，在氩气保护下，将反应容器置于110℃的油浴中反应24h，反应结束后，冷却至室温，采用四氢呋喃溶解，甲醇沉淀，过滤后真空干燥得到白色产物，即为所述聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物；
(2)制备端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在反应容器中加入步骤(1)制备得到的聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物，然后加入无水二氯甲烷，将反应容器置于冰水浴中搅拌溶解，再依次加入对甲基苯磺酰氯、三乙胺，冰水浴条件下继续搅拌2小时后，在室温下继续搅拌24小时，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤、分离后的有机相再经加压蒸馏以除去二氯甲烷，得到所述端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物；
(3)制备端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：将步骤(2)制备得到的端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物溶解于二甲基亚砜中，加入叠氮钠，在70-90℃下反应24小时后冷却至室温，转入透析袋中，用去离子水为透析介质，透析48小时以除去有机溶剂及多余的叠氮化钠，收集透析液体，冷冻干燥得到所述端氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物。
本发明技术方案中，端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物的合成路径如下：
Figure BDA0003109505190000041
作为本发明所述分子刷纳米粒子的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中烯丙基聚乙二醇的分子量为1000g/mol或2000g/mol；和/或
所述步骤(3)中透析所用纤维素透析袋的截留分子量为3500-8000Da。
作为本发明所述分子刷纳米粒子的制备方法的优选实施方式，所述聚炔丙基-L-谷氨酸酯的制备方法包括以下步骤：
(a)制备炔丙基-L-谷氨酸酯：将L-谷氨酸加入反应容器中，再加入炔丙醇，冰浴冷却并充分搅拌，在搅拌下缓慢滴加浓硫酸，再置于室温下反应得到粘稠液体，采用三乙胺中和反应体系中的硫酸，冷冻、过滤得到沉淀，沉淀用甲醇洗涤后，60℃下真空干燥，得到所述炔丙基-L-谷氨酸酯；
(b)制备炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体：将步骤(a)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯加入到反应容器中，再添加四氢呋喃并升温至50℃，加入三光气，控制反应过程在冷凝、干燥和氮气保护下进行，反应直至溶液变澄清为止，冷却至室温，减压蒸馏除去四氢呋喃，用乙酸乙酯溶解粗产物，并用冷的5％碳酸氢钠水溶液洗涤三次，分离出乙酸乙酯溶液，再用无水硫酸镁干燥，过滤除去硫酸镁后得到的乙酸乙酯通过减压蒸馏除去，最后得到的无色粘稠油状物即为所述炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体；
(c)制备聚炔丙基-L-谷氨酸酯：将N,N-二甲基甲酰胺和步骤(b)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体添加到Schlenk反应瓶中，通入干燥的氮气鼓泡15min，此时用注射器注入正己胺，密闭Schlenk反应瓶，室温反应3天，之后将反应溶液慢慢滴加到乙醚中沉淀出聚合物，即为所述聚炔丙基-L-谷氨酸酯。
本发明技术方案中，聚炔丙基-L-谷氨酸酯的合成路径如下：
Figure BDA0003109505190000051
第三方面，本发明还提出一种分子刷纳米粒子在制备骨肉瘤抗癌药物中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明技术方案通过利用以聚-L-谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物(即聚合物I)具有刷子状结构，可以形成稳定的纳米粒子的特点，以聚合物I在水溶液中自组装形成纳米粒子，并同时负载疏水性抗肿瘤药物及光敏剂形成分子刷纳米粒子，使得制备的分子刷纳米粒子具有能对骨肉瘤同时进行化疗及光动力治疗的特性。
附图说明
图1为实施例1制备的聚炔丙基-L-谷氨酸酯(PPLG)的1H NMR谱图；
图2为实施例1制备的聚合物I1H NMR谱图；
图3为实施例1制备的分子刷纳米粒子的透射电镜图；
图4为实施例2制备的分子刷纳米粒子的透射电镜图；
图5为实施例3制备的分子刷纳米粒子的透射电镜图；
图6为实施例4中阿霉素的累计释放曲线图；
图7为实施例5中对聚合物I的生物相容性评价结果图；
图8为实施例6中对聚合物I的细胞毒性评价结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例的分子刷纳米粒子包括如下重量份的组分：以聚-L-谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物I10份、阿霉素1份、二氢卟吩1份，其中，聚合物I的分子结构式如下：
Figure BDA0003109505190000061
其中，m,n为大于1的自然数。
本实施例的分子刷纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
(1)制备聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在圆底烧瓶中加入分子量为1000g/mol的烯丙基聚乙二醇1g、己内酯单体2g、辛酸亚锡2μL，抽真空后，在氩气保护下，将反应体系置于110℃的油浴中反应24h，反应结束后，冷却至室温，采用20ml四氢呋喃溶解反应产物，再于100mL的冷甲醇中沉淀，过滤后真空干燥得到白色产物2.8g，即为聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物；
(2)制备端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在圆底烧瓶中加入步骤(1)制备得到的聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物2.8g，然后加入50ml无水二氯甲烷，将圆底烧瓶置于冰水浴中，搅拌溶解，后依次加入对甲基苯磺酰氯1.0g、3ml三乙胺，冰水浴条件下继续搅拌2小时后，在室温下继续搅拌24小时，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次、分离后的有机相再经加压蒸馏以除去二氯甲烷，得到端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物2.5g；
(3)制备端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：将步骤(2)制备得到的端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物2.0g溶解于20ml二甲基亚砜中，加入叠氮钠1.0g，在70℃油浴条件下反应24小时后，冷却至室温，转入截留分子量为3500Da的纤维素透析袋中，用去离子水为透析介质，透析48小时以除去有机溶剂及多余的叠氮化钠，收集透析液体，冷冻干燥得到所述端氮基聚乙二醇聚己内酯1.9g；
(4)制备炔丙基-L-谷氨酸酯(PLG)：将L-谷氨酸15g加入圆底烧瓶中，再加入15ml炔丙醇，冰浴冷却并充分搅拌，在搅拌下缓慢滴加5ml浓硫酸，浓硫酸滴加完毕后将反应体系置于室温下反应过夜，得到粘稠液体，采用40ml三乙胺中和反应体系中的硫酸，4℃下冷冻、过滤得到沉淀，沉淀用足量甲醇洗涤后，60℃下真空干燥，得到炔丙基-L-谷氨酸酯；
(5)制备炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐(PLG-NCA)单体：将步骤(4)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯2g加入到配有冷凝、干燥和通氮气装置的三口瓶中，再添加40ml四氢呋喃并升温至50℃，加入三光气1g，反应直至溶液变澄清为止，冷却至室温，减压蒸馏除去四氢呋喃，用100ml乙酸乙酯溶解粗产物，并用冷的5％碳酸氢钠水溶液洗涤三次，分离出乙酸乙酯溶液，再用无水硫酸镁干燥，过滤除去硫酸镁后得到的乙酸乙酯通过减压蒸馏除去，最后得到的无色粘稠油状物即为炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体；
(6)制备聚炔丙基-L-谷氨酸酯(PPLG)：将10ml无水N,N-二甲基甲酰胺和步骤(5)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体1.0g添加到Schlenk反应瓶中，通入干燥的氮气鼓泡15min，此时用注射器注入正己胺10μg，密闭Schlenk反应瓶，室温反应3天，之后将反应溶液慢慢滴加到乙醚中沉淀出聚合物，即为聚炔丙基-L-谷氨酸酯；
(7)制备聚合物I：将步骤(3)制备得到的端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物2g、步骤(6)制备得到的聚炔丙基-L-谷氨酸酯0.15mg、硫酸铜25mg和抗坏血酸钠40mg加入到反应瓶中，在反应瓶中继续加入10ml二甲基亚砜充分溶解聚合物，同时通入干燥的氮气鼓泡，室温搅拌下反应24h后将反应产物用透析法提纯，先以DMSO为透析介质除去未反应的PEG-PCL-N3和溶剂DMSO，后以去离子水为透析介质，以除去有机溶剂，收集透析液，冷冻干燥得到产物即为所述聚合物I；
(8)制备分子刷纳米粒子：将步骤(7)制备得到的聚合物Ⅰ10mg、阿霉素1mg和二氢卟吩1mg溶于1ml二甲基亚砜中形成混合体系，在磁力搅拌状态下，向混合体系中滴加5ml去离子水得到混合溶液，将混合溶液装入透析袋中，置于去离子水中透析以除去所述有机溶剂，得到负载了抗肿瘤药物和光敏剂的聚合物Ⅰ，即分子刷纳米粒子。
效果例1
将实施例1步骤(6)制备的聚炔丙基-L-谷氨酸酯(PPLG)溶于氘代-氯仿，样品浓度为10mg/mL，以四甲基硅烷(TMS)为内标，利用400兆超导核磁共振谱仪Bruker AVANCE 400(Bruker Co.Switzerland)对样品结构进行1H NMR表征，结果如图1所示。
从图1的核磁谱图中可以看出，PPLG上的特征吸收峰分别出现在：2.10ppm(t,2H,CH2CH2-CO)，2.49ppm(t 2H,CH2CH2-CO)，2.80ppm(t,1H,C≡CH)，3.65ppm(t,1H,-CH-CH2CH2CO)，4.63ppm(d,2H,COO CH2-C≡CH)，8.11ppm(s,1H,-NHCHCO-)，说明成功合成了PPLG。
效果例2
将实施例1步骤(7)制备的聚合物I溶于DMSO-d6，样品浓度为10mg/mL，以四甲基硅烷(TMS)为内标，利用400兆超导核磁共振谱仪Bruker AVANCE 400(BrukerCo.Switzerland)对样品结构进行1H NMR表征，结果如图2所示。
从图2的核磁谱图中可以看出，以聚-L-谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物I的核磁谱图在3.65ppm处出现了PEG质子的核磁共振峰，而聚己内酯的特征峰分别分现在：4.1-3.8ppm(-COOCH2CH2-)，3.6ppm(-CH2CH2OH)，2.4-2.2ppm(-CH2CH2COO-)以及1.17-1.12ppm(-COOCH2CH2CH2CH2CH2-)之间，此外在8.2ppm附近出现了属于点击反应生成的三唑环的特征峰，说明成功合成了聚合物I。
效果例3
以实施例1步骤(8)制备的分子刷纳米粒子为研究对象，由紫外-可见光吸收光谱测定阿霉素在485nm波长处的吸光度，根据工作曲线计算出阿霉素的浓度，阿霉素负载率(DOX Loading capacity，DLC)根据以下公式计算：DLC＝(M1/M0)×100％，其中M0为以聚-L-谷氨酸酯为主链聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物的质量，M1为载入的DOX的质量。经计算，阿霉素的负载率(DLC)为6.8％。
由紫外-可见光吸收光谱测定二氢卟吩在645nm波长处的吸光度，根据工作曲线计算出Ce6的浓度，二氢卟吩负载率(Ce6 Loading capacity，DLC)根据以下公式计算：DLC＝(M2/M0)×100％，其中M0为以聚-L-谷氨酸酯为主链聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物的质量；M2为载入的Ce6的质量。经计算，二氢卟吩的负载率(DLC)为7.5％。
效果例4
将实施例1制备的分子刷纳米粒子稀释至10mL，经孔径为0.45μm和0.22μm的针式过滤器过滤，然后取10μL纳米粒子溶液，滴于200目表面镀有碳膜的铜网上，自然干燥60s，然后将铜网浸泡在2％(w/v)磷钨酸溶液中，染色60s，利用120kV透射电镜FEI Tecnai G2Spirit(FEI Co.Netherlands)对纳米粒子的形貌进行观察，结果如图3所示。
从图3的透射电镜图中可以看出，实施例1制备的分子刷纳米粒子呈球形，直径约为50nm。
实施例2
本实施例的分子刷纳米粒子包括如下重量份的组分：以聚-L-谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物I 20份、阿霉素3份、二氢卟吩2份。
本实施例的分子刷纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
(1)制备聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在圆底烧瓶中加入分子量为2000g/mol的烯丙基聚乙二醇8g、己内酯单体10g、辛酸亚锡6μL，抽真空后，在氩气保护下，将反应体系置于110℃的油浴中反应24h，反应结束后，冷却至室温，采用30ml四氢呋喃溶解反应产物，再于500mL的冷甲醇中沉淀，过滤后真空干燥得到白色产物17.1g，即为聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物；
(2)制备端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在圆底烧瓶中加入步骤(1)制备得到的聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物15g，然后加入500ml无水二氯甲烷，将圆底烧瓶置于冰水浴中，搅拌溶解，后依次加入对甲基苯磺酰氯6.0g、7ml三乙胺，冰水浴条件下继续搅拌2小时后，在室温下继续搅拌24小时，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次、分离后的有机相再经加压蒸馏以除去二氯甲烷，得到端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物12.5g；
(3)制备端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：将步骤(2)制备得到的端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物10.0g溶解于40ml二甲基亚砜中，加入叠氮钠4.0g，在90℃油浴条件下反应24小时后，冷却至室温，转入截留分子量为8000Da的纤维素透析袋中，用去离子水为透析介质，透析48小时以除去有机溶剂及多余的叠氮化钠，收集透析液体，冷冻干燥得到所述端氮基聚乙二醇聚己内酯9.3g；
(4)制备炔丙基-L-谷氨酸酯(PLG)：将L-谷氨酸45g加入圆底烧瓶中，再加入45ml炔丙醇，冰浴冷却并充分搅拌，在搅拌下缓慢滴加15ml浓硫酸，浓硫酸滴加完毕后将反应体系置于室温下反应过夜，得到粘稠液体，采用120ml三乙胺中和反应体系中的硫酸，4℃下冷冻、过滤得到沉淀，沉淀用足量甲醇洗涤后，60℃下真空干燥，得到炔丙基-L-谷氨酸酯；
(5)制备炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐(PLG-NCA)单体：将步骤(4)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯8g加入到配有冷凝、干燥和通氮气装置的三口瓶中，再添加200ml四氢呋喃并升温至50℃，加入三光气4g，反应直至溶液变澄清为止，冷却至室温，减压蒸馏除去四氢呋喃，用200ml乙酸乙酯溶解粗产物，并用冷的5％碳酸氢钠水溶液洗涤三次，分离出乙酸乙酯溶液，再用无水硫酸镁干燥，过滤除去硫酸镁后得到的乙酸乙酯通过减压蒸馏除去，最后得到的无色粘稠油状物即为炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体；
(6)制备聚炔丙基-L-谷氨酸酯(PPLG)：将30ml无水N,N-二甲基甲酰胺和步骤(5)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体6.0g添加到Schlenk反应瓶中，通入干燥的氮气鼓泡15min，此时用注射器注入正己胺30μg，密闭Schlenk反应瓶，室温反应3天，之后将反应溶液慢慢滴加到乙醚中沉淀出聚合物，即为聚炔丙基-L-谷氨酸酯；
(7)制备聚合物I：将步骤(3)制备得到的端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物8g、步骤(6)制备得到的聚炔丙基-L-谷氨酸酯0.45mg、硫酸铜60mg和抗坏血酸钠80mg加入到反应瓶中，在反应瓶中继续加入30ml二甲基亚砜充分溶解聚合物，同时通入干燥的氮气鼓泡，室温搅拌下反应24h后将反应产物用透析法提纯，先以DMSO为透析介质除去未反应的PEG-PCL-N3和溶剂DMSO，后以去离子水为透析介质，以除去有机溶剂，收集透析液，冷冻干燥得到产物即为所述聚合物I；
(8)制备分子刷纳米粒子：将步骤(7)制备得到的聚合物Ⅰ20mg、阿霉素3mg和二氢卟吩2mg溶于2ml二甲基亚砜中形成混合体系，在磁力搅拌状态下，向混合体系中滴加5ml去离子水得到混合溶液，将混合溶液装入透析袋中，置于去离子水中透析以除去所述有机溶剂，得到负载了抗肿瘤药物和光敏剂的聚合物Ⅰ，即分子刷纳米粒子。
效果例5
以实施例2步骤(8)制备的分子刷纳米粒子为研究对象，由紫外-可见光吸收光谱测定阿霉素在485nm波长处的吸光度，根据工作曲线计算出阿霉素的浓度，阿霉素负载率(DOX Loading capacity，DLC)根据以下公式计算：DLC＝(M1/M0)×100％，其中M0为以聚-L-谷氨酸酯为主链聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物的质量；M1为载入的DOX的质量。经计算，阿霉素的负载率(DLC)约为6.9％。
由紫外-可见光吸收光谱测定光敏剂二氢卟吩在645nm波长处的吸光度，根据工作曲线计算出Ce6的浓度，二氢卟吩负载率(Ce6 Loading capacity，DLC)根据以下公式计算：DLC＝(M2/M0)×100％，其中M0为以聚-L-谷氨酸酯为主链聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物的质量；M2为载入的Ce6的质量。经计算，二氢卟吩的负载率(DLC)约为7.1％。
效果例6
将实施例2制备的分子刷纳米粒子稀释至10mL，经孔径为0.45μm和0.22μm的针式过滤器过滤，然后取10μL纳米粒子溶液，滴于200目表面镀有碳膜的铜网上，自然干燥60s，然后将铜网浸泡在2％(w/v)磷钨酸溶液中，染色60s，利用120kV透射电镜FEI Tecnai G2Spirit(FEI Co.Netherlands)对纳米粒子的形貌进行观察，结果如图4所示。
从图4的透射电镜图中可以看出，实施例2制备的分子刷纳米粒子呈圆球形，直径约为110nm。
实施例3
本实施例的分子刷纳米粒子包括如下重量份的组分：以聚-L-谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物I 20份、阿霉素1.5份、二氢卟吩1.5份。
本实施例的分子刷纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
(1)制备聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在圆底烧瓶中加入分子量为1000g/mol的烯丙基聚乙二醇4g、己内酯单体5g、辛酸亚锡4μL，抽真空后，在氩气保护下，将反应体系置于110℃的油浴中反应24h，反应结束后，冷却至室温，采用20ml四氢呋喃溶解反应产物，再于100mL的冷甲醇中沉淀，过滤后真空干燥得到白色产物17.1g，即为聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物；
(2)制备端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在圆底烧瓶中加入步骤(1)制备得到的聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物8g，然后加入200ml无水二氯甲烷，将圆底烧瓶置于冰水浴中，搅拌溶解，后依次加入对甲基苯磺酰3.0g、5ml三乙胺，冰水浴条件下继续搅拌2小时后，在室温下继续搅拌24小时，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次、分离后的有机相再经加压蒸馏以除去二氯甲烷，得到端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物7.5g；
(3)制备端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：将步骤(2)制备得到的端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物7.0g溶解于40ml二甲基亚砜中，加入叠氮钠3.0g，在80℃油浴条件下反应24小时后，冷却至室温，转入截留分子量为8000Da的纤维素透析袋中，用去离子水为透析介质，透析48小时以除去有机溶剂及多余的叠氮化钠，收集透析液体，冷冻干燥得到所述端氮基聚乙二醇聚己内酯6.3g；
(4)制备炔丙基-L-谷氨酸酯(PLG)：将L-谷氨酸30g加入圆底烧瓶中，再加入30ml炔丙醇，冰浴冷却并充分搅拌，在搅拌下缓慢滴加10ml浓硫酸，浓硫酸滴加完毕后将反应体系置于室温下反应过夜，得到粘稠液体，采用100ml三乙胺中和反应体系中的硫酸，4℃下冷冻、过滤得到沉淀，沉淀用足量甲醇洗涤后，60℃下真空干燥，得到炔丙基-L-谷氨酸酯；
(5)制备炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐(PLG-NCA)单体：将步骤(4)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯5.0g加入到配有冷凝、干燥和通氮气装置的三口瓶中，再添加100ml四氢呋喃并升温至50℃，加入三光气2.5g，反应直至溶液变澄清为止，冷却至室温，减压蒸馏除去四氢呋喃，用150ml乙酸乙酯溶解粗产物，并用冷的5％碳酸氢钠水溶液洗涤三次，分离出乙酸乙酯溶液，再用无水硫酸镁干燥，过滤除去硫酸镁后得到的乙酸乙酯通过减压蒸馏除去，最后得到的无色粘稠油状物即为炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体；
(6)制备聚炔丙基-L-谷氨酸酯(PPLG)：将20ml无水N,N-二甲基甲酰胺和步骤(5)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体3.0g添加到Schlenk反应瓶中，通入干燥的氮气鼓泡15min，此时用注射器注入正己胺20μg，密闭Schlenk反应瓶，室温反应3天，之后将反应溶液慢慢滴加到乙醚中沉淀出聚合物，即为聚炔丙基-L-谷氨酸酯；
(7)制备聚合物I：将步骤(3)制备得到的端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物5g、步骤(6)制备得到的聚炔丙基-L-谷氨酸酯0.3mg、硫酸铜40mg和抗坏血酸钠60mg加入到反应瓶中，在反应瓶中继续加入20ml二甲基亚砜充分溶解聚合物，同时通入干燥的氮气鼓泡，室温搅拌下反应24h后将反应产物用透析法提纯，先以DMSO为透析介质除去未反应的PEG-PCL-N3和溶剂DMSO，后以去离子水为透析介质，以除去有机溶剂，收集透析液，冷冻干燥得到产物即为所述聚合物I；
(8)制备分子刷纳米粒子：将步骤(7)制备得到的聚合物Ⅰ20mg、阿霉素1.5mg和二氢卟吩1.5mg溶于1ml二甲基亚砜中形成混合体系，在磁力搅拌状态下，向混合体系中滴加5ml去离子水得到混合溶液，将混合溶液装入透析袋中，置于去离子水中透析以除去所述有机溶剂，得到负载了抗肿瘤药物和光敏剂的聚合物Ⅰ，即分子刷纳米粒子。
效果例7
以实施例3步骤(8)制备的分子刷纳米粒子为研究对象，由紫外-可见光吸收光谱测定阿霉素在485纳米波长处的吸光度，根据工作曲线计算出阿霉素的浓度，阿霉素负载率(DOX Loading capacity，DLC)根据以下公式计算：DLC＝(M1/M0)×100％，其中M0为以聚-L-谷氨酸酯为主链聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物的质量；M1为载入的DOX的质量。经计算，阿霉素的负载率(DLC)约为7.2％。
由紫外-可见光吸收光谱测定光敏剂二氢卟吩在645纳米波长处的吸光度，根据工作曲线计算出Ce6的浓度，二氢卟吩负载率(Ce6 Loading capacity，DLC)根据以下公式计算：DLC＝(M2/M0)×100％，其中M0为以聚-L-谷氨酸酯为主链聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物的质量；M2为载入的Ce6的质量。经计算，二氢卟吩的负载率(DLC)约为7.3％。
效果例9
将实施例3制备的分子刷纳米粒子稀释至10mL，经孔径为0.45μm和0.22μm的针式过滤器过滤，然后取10μL纳米粒子溶液，滴于200目表面镀有碳膜的铜网上，自然干燥60s，然后将铜网浸泡在2％(w/v)磷钨酸溶液中，染色60s，利用120kV透射电镜FEI Tecnai G2Spirit(FEI Co.Netherlands)对纳米粒子的形貌进行观察，结果如图5所示。
从图5的透射电镜图中可以看出，本实施例制备的分子刷纳米粒子呈球形，直径约为75nm。
实施例4
在截留分子量为3500Da的透析袋中装入3mL溶解有实施例3所制备的负载阿霉素及光敏剂的分子刷纳米粒子的溶液，透析袋外面为27mL，pH为7.4的PBS透析液，进行透析。在特定的时间间隔里，每次在透析袋外液中取样3mL(Ve)，后补加3mL的PBS，以维持总体积不变。阿霉素的浓度用标准工作曲线进行测定，每个样品的测定均重复三次。
药物的累计释放百分数(Er)用以下公式进行计算：
Figure BDA0003109505190000151
mDOX代表在纳米粒子中的阿霉素的质量，V0为释放介质的总体积(V0＝30mL),，Ci为第i个样品中阿霉素的浓度。阿霉素的累计释放结果如图6所示。
由图6可知，阿霉素可以在载药纳米粒子中缓慢释放出来，并不存在暴释阶段，24小时累积释放量约为63％。
实施例5
使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒评价实施例3所制备的聚合物I的生物相容性。将生长良好的人骨肉瘤细胞MG-63以及正常人骨髓间充质干细胞(BMSC)以每孔5×103个接种到96孔板中，经过24小时的培养后，加入浓度分别为：0、10、50、100、250μg/mL的聚合物I，并且每个浓度设置4个复孔，然后在培养箱分别放置24小时、48小时。达到培养时间后，每孔加入20μL新配置好的CCK-8试剂，然后在培养箱中放置2-4小时，再用酶标仪测试吸光度(OD值)。最后按照公式生长抑制率＝[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100％，横坐标为浓度梯度，纵坐标为生长抑制率，再将不同的药物组别拼合成柱状图对比，实验结果如图7所示。
从图7的细胞毒性实验结果中可以看出本发明所制备的聚合物I具有良好的生物安全性，对人骨肉瘤细胞MG-63以及正常人骨髓间充质干细胞(BMSC)的生长均不存在明显的生长抑制作用。
实施例6
使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒评价实施例3所制备的聚合物I对人骨肉瘤细胞(MG-63)的细胞毒性。
细胞毒性实验将生长良好的人骨肉瘤细胞以每孔4×103个接种到96孔板中，经过24小时的培养后再如上述步骤一样，将同时负载抗肿瘤药物及光敏剂的聚合物I纳米粒子(即实施例3制备的分子刷纳米粒子)以不同的浓度加入每孔，使阿霉素的最终浓度为：0、1.25、1.75、2.0、2.25μg/mL，每个浓度设置4个复孔，开启激光发射器(波长为640nm，功率为100mw/cm2)，每孔光照1min。分别以相同实验浓度游离阿霉素及不进行光动力治疗纳米粒子组为对照组。然后在培养箱分别放置24小时、48小时，每个孔中加入20μl新配置好的CCK-8试剂，然后在培养箱中放置2-4小时，再用酶标仪测试吸光度(OD值)。然后按照公式生长抑制率＝[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100％，横坐标为浓度梯度，纵坐标为生长抑制率，实验结果如图8所示。
从图8的细胞毒性实验结果中可以看出实施例3制备的分子刷纳米粒子对骨肉瘤细胞具有一定的生长抑制作用，但其效果明显弱于游离阿霉素，表明单独的药物治疗能显著抑制骨肉瘤细胞的生长。但是当对人骨肉瘤细胞进行药物与光动力联合治疗后，可以发现载药纳米粒子对骨肉瘤具有显著的生长抑制作用，而且其生长抑制效果远优于相同浓度的游离阿霉素。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种分子刷纳米粒子，其特征在于，所述分子刷纳米粒子呈球形，直径为50-110nm，所述分子刷纳米粒子是将抗肿瘤药物和光敏剂负载于聚合物Ⅰ中制备得到，所述聚合物Ⅰ是以聚-L-谷氨酸酯为主链、聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物为侧链的聚合物，所述聚合物Ⅰ具有刷子状结构，所述聚合物I的分子结构式如下：
Figure FDA0003109505180000011
其中，m,n为≥1的自然数。
2.如权利要求1所述的分子刷纳米粒子，其特征在于，所述抗肿瘤药物为阿霉素，所述光敏剂为二氢卟吩。
3.如权利要求1或2所述的分子刷纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将聚合物Ⅰ、抗肿瘤药物和光敏剂溶于有机溶剂中形成混合体系，在磁力搅拌状态下，向所述混合体系中滴加去离子水得到混合溶液，将所述混合溶液装入透析袋中，置于去离子水中透析以除去所述有机溶剂，得到负载了抗肿瘤药物和光敏剂的聚合物Ⅰ，即所述分子刷纳米粒子。
4.如权利要求3所述的分子刷纳米粒子的制备方法，其特征在于，按重量份计，所述聚合物Ⅰ为10-20重量份，所述抗肿瘤药物为1-3重量份，所述光敏剂为1-2重量份。
5.如权利要求3所述的分子刷纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
6.如权利要求3所述的分子刷纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述聚合物Ⅰ的制备方法包括以下步骤：将端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物、聚炔丙基-L-谷氨酸酯、硫酸铜和抗坏血酸钠加入到反应容器中，在所述反应容器中继续加入二甲基亚砜充分溶解聚合物，同时通入干燥的氮气鼓泡，室温搅拌下反应24h后将反应产物用透析法提纯，收集透析液，冷冻干燥得到产物即为所述聚合物Ⅰ。
7.如权利要求6所述的分子刷纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物的制备方法包括以下步骤：
(1)制备聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在反应容器中加入烯丙基聚乙二醇、己内酯单体、辛酸亚锡，抽真空后，在氩气保护下，将反应容器置于110℃的油浴中反应24h，反应结束后，冷却至室温，采用四氢呋喃溶解，甲醇沉淀，过滤后真空干燥得到白色产物，即为所述聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物；
(2)制备端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：在反应容器中加入步骤(1)制备得到的聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物，然后加入无水二氯甲烷，将反应容器置于冰水浴中搅拌溶解，再依次加入对甲基苯磺酰氯、三乙胺，冰水浴条件下继续搅拌2小时后，在室温下继续搅拌24小时，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤、分离后的有机相再经加压蒸馏以除去二氯甲烷，得到所述端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物；
(3)制备端叠氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物：将步骤(2)制备得到的端对甲基苯磺酸酯聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物溶解于二甲基亚砜中，加入叠氮钠，在70-90℃下反应24小时后冷却至室温，转入透析袋中，用去离子水为透析介质，透析48小时以除去有机溶剂及多余的叠氮化钠，收集透析液体，冷冻干燥得到所述端氮基聚乙二醇聚己内酯嵌段聚合物。
8.如权利要求7所述的分子刷纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中烯丙基聚乙二醇的分子量为1000g/mol或2000g/mol；和/或
所述步骤(3)中透析所用纤维素透析袋的截留分子量为3500-8000Da。
9.如权利要求6所述的分子刷纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述聚炔丙基-L-谷氨酸酯的制备方法包括以下步骤：
(a)制备炔丙基-L-谷氨酸酯：将L-谷氨酸加入反应容器中，再加入炔丙醇，冰浴冷却并充分搅拌，在搅拌下缓慢滴加浓硫酸，再置于室温下反应得到粘稠液体，采用三乙胺中和反应体系中的硫酸，冷冻、过滤得到沉淀，沉淀用甲醇洗涤后，60℃下真空干燥，得到所述炔丙基-L-谷氨酸酯；
(b)制备炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体：将步骤(a)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯加入到反应容器中，再添加四氢呋喃并升温至50℃，加入三光气，控制反应过程在冷凝、干燥和氮气保护下进行，反应直至溶液变澄清为止，冷却至室温，减压蒸馏除去四氢呋喃，用乙酸乙酯溶解粗产物，并用冷的5％碳酸氢钠水溶液洗涤三次，分离出乙酸乙酯溶液，再用无水硫酸镁干燥，过滤除去硫酸镁后得到的乙酸乙酯通过减压蒸馏除去，最后得到的无色粘稠油状物即为所述炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体；
(c)制备聚炔丙基-L-谷氨酸酯：将N,N-二甲基甲酰胺和步骤(b)制备得到的炔丙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐单体添加到Schlenk反应瓶中，通入干燥的氮气鼓泡15min，此时用注射器注入正己胺，密闭Schlenk反应瓶，室温反应3天，之后将反应溶液慢慢滴加到乙醚中沉淀出聚合物，即为所述聚炔丙基-L-谷氨酸酯。
10.如权利要求1或2所述的分子刷纳米粒子在制备骨肉瘤抗癌药物中的应用。
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王三喜: "圆柱状聚合物分子刷和α-环糊精聚轮烷的合成研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

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CN113509550B (zh) 2023-04-14

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