CN113490498A

CN113490498A - 包含16α-溴-3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮及其水合物、衍生物和类似物的水性悬浮液组合物、制剂和水中可分散的干燥的组合物

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Publication number: CN113490498A
Application number: CN201980091115.7A
Authority: CN
Inventors: 葛羽
Original assignee: San Diego Chemistry
Current assignee: San Diego Chemistry
Priority date: 2019-02-05
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-10-08
Also published as: US10836788B2; US20210061846A1; KR20210113294A; EP3920936A1; EP3920936A4; US20210061847A1; AU2022201849A1; US11685762B2; AU2019428193A1; CA3125478C; AU2019428193B2; AU2019428193C1; WO2020163026A1; MX2021009347A; JP2022523341A; WO2020163026A8; US20200247838A1; CA3125478A1; BR112021012932A2; US11667665B2

Abstract

异常和意想不到地稳定的下式(I)化合物的水性悬浮液制剂和水分散性干燥组合物。与非水性制剂相比，它几乎不会或不会引起注射部位刺激，并具有优异的性能。它刺激自噬，增强先天免疫，下调非生产性炎症并产生Th1免疫偏倚。它在体外和体内模型中均显示出更好的功效。

Description

包含16α-溴-3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮及其水合物、衍生物和类似物的水性悬浮液组合物、制剂和水中可分散的干燥的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年2月5日提交的美国专利申请第16/267,815号的优先权。上述美国申请的主题和内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及药物物质16α-溴-3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮及其水合物、溶剂化物、衍生物和类似物的水性悬浮液组合物和制剂。此外，本发明还涉及含有该药物物质的组合物和制剂的制备方法和在药物和非药物应用诸如免疫调节剂中的用途。

背景技术

16α-溴-3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮(BEA)是人工合成的脱氢表雄酮(DHEA)的类似物，结构如下：

已知作为α-溴酮的BEA易受亲核攻击，并且16α-溴被亲核试剂置换。参见Numazawa，M.等人，“16α-17-酮类固醇的立体选择性水解及其对16α-溴-17-酮和2a-溴-3-酮的水解的远距离取代作用(Stereoselective Hydrolysis of 16alpha-17-KetoSteroids and Long-range Substitution Effects on the Hydrolysis of 16alpha-Bromo-17-Ketones and 2a-Bromo-3-Ketones)”，《类固醇(Steroid)》，45(5)，403-10(1985)。因此，BEA通常在化学性质上不稳定。

还已知BEA在水的存在下在16位经历差向异构化并损失手性纯度。参见Numazawa，M.等人，“相应的16-溴-17-酮的受控碱水解立体定向合成16d-羟基-17-氧代类固醇及其反应机理(Stereospecific Synthesis of 16alpha-Hydroxy-17-oxo Steroids byControlled Alkaline Hydrolysis of Corresponding 16-Bromo-17-Ketones and itsReaction Mechanism)”，《有机化学杂志(J.Org.Chem)》，47(21)，4024-4029(1982)。

由于BEA极难溶于水，因此注射用制剂通常被制成非水溶液。由于BEA的化学不稳定性及水存在下的差向异构化，非水溶液必须非常干燥；并且为了使其更稳定，水含量通常不能大于0.1％。然而，即使具有这样低的水含量，溶液制剂仍然不稳定。制剂的灭菌、分装和包装必须在低温下进行。这些制剂也必须在低温下储存。参见Ahlem，C.等人的美国专利申请公开US2003060425A1。

BEA的稳定性差，使其不适合于药物用途。该化合物必须在注射前才进行配制。为了使BEA成为一种可行的药物，需要一种能够稳定BEA的新制剂。

非水性BEA注射用制剂通过将BEA溶解于有机溶剂，诸如聚乙二醇、丙二醇、苯甲酸苄酯和苄醇，中制备。该非水性溶液制剂被发现在动物和人类中均引起严重的注射部位刺激，这严重影响了患者的遵从。注射部位刺激的原因在于BEA的水溶性差。一旦BEA的有机溶液在注射后与水接触，BEA将立即沉淀并在组织中形成大块固体并引起刺激。

有机溶剂被用来制备注射用的BEA溶液。当施用BEA溶液时，大量的有机溶剂被注射到体内。有机溶剂的耐受性差是注射部位刺激的另一根源。因此，为了消除有机溶剂所引起的刺激和毒性，需要以水为基础的制剂。

已知DHEA和其它类固醇具有多种应用，例如调节免疫反应。参见例如美国专利第5,869,090、5,863,910、5,856,340、5,824,668、5,804,576、5,753,237、5,714,481、5,709,878、5,407,684、5,206,008、5,077,284、4,978,532、4,898,694、4,542,129、3,711,606和3,710,795号。BEA已经被用作通过肌肉内或皮下注射和口腔粘膜施用来治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)、结核病(TB)和疟疾的免疫调节类固醇。

Stickney，D.等人，“免疫调节剂HE2000对艾滋病患者中结核病和其它机会性感染的发生的安全性和活性(Safety and Activity of the Immune Modulator HE2000 onthe Incidence of Tuberculosis and Other Opportunistic Infections in AIDSPatients)，”《抗菌剂与化疗(Antimicrob.Agents Chemother)》，51(7)，2639-41(2007)披露通过肌肉内注射含有BEA和赋形剂诸如聚乙二醇300、丙二醇、苯甲酸苄酯、苄醇的制剂降低结核病的发病率和AIDS患者的感染率。然而，结果显示严重的注射部位刺激。

Reading，C.等人，“16α-溴表雄酮(HE2000)治疗的个体中的参数和人类免疫缺陷病毒-1病毒反应的改进(Improvement in Parameters and Human ImmunodeficiencyVirus-1 Viral Response in Individuals Treated with 16alpha-bromoepiandrosterone(HE2000))”，《临床微生物学与传染(Clin.Microbio1.Infect.)》，12(11)，1082-8(2006)披露将另一种BEA制剂用于通过皮下注射对HIV患者进行的试验。该制剂是BEA在PEG200、丙二醇、苯甲酸苄酯和苄醇中的溶液。临床试验研究了对HIV活性、免疫效果、耐受性和安全性的影响，并且结果显示BEA组中IL-1β、TNF-α、IL-6和Cox-2转录物显著减少，而CD8⁺显著增加。安全性试验的结果再次表明BEA引起严重的注射部位刺激并且耐受性差。

Frincke J.M.等人，“HE2000治疗降低无并发症疟疾患者的寄生虫水平(Reduction of Parasite Levels in Patients with Uncomplicated Malaria byTreatment with HE2000)”，《美国热带医学和卫生杂志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)》，76(2)，232-6(2007)披露了将两种BEA制剂用于通过皮下注射和粘膜药物递送系统对疟疾患者进行的试验。皮下注射的制剂是BEA在PEG200、丙二醇、苯甲酸苄酯和苄醇中的溶液。用于粘膜药物递送系统的制剂是BEA和赋形剂诸如乳糖、交聚维酮、甘露醇、硬脂酸镁和二氧化硅的混合物。临床试验研究了BEA制剂的安全性、耐受性和抗疟疾活性。结果证明两种不同制剂显示相似的抗疟反应。安全性试验显示最频繁发生的不良事件是频频发生的注射部位的严重疼痛。

Hernandez-Pando，R.等人，“16a-溴表雄酮在进行性肺结核模型中恢复1型T辅助细胞活性并加速化学疗法诱导的细菌清除(16a-Bromoepiandrosterone Restores THelper Cell Type 1 Activity and Accelerates Chemotherapy-Induced BacterialClearance in a Model of Progressive Pulmonary Tuberculosis)“，《传染病杂志(Journal of Infectious Diseases)》，191，299-306(2005)披露了BEA恢复结核分枝杆菌感染的肺结核BALB/c小鼠的Th1活性，并观察到其对细菌增殖的抑制及增加TNF-α、IFN-和iNOS的表达。当作为常规化疗(利福平、异烟肼和吡嗪酰胺)的辅助用药时，BEA增强清除细菌的效果。

Nicoletti，F.等人，“16α-溴表雄酮(HE2000)限制非生产性炎症并刺激肺部的免疫力(16alpha-Bromoepiandrosterone (HE2000)limits non-productive inflammationand stimulates immunity in lungs)”，《临床与实验免疫学(Clin Exp Immunol.)》，158(3)，308-16(2009)披露BEA降低脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞的一氧化氮产生。用BEA治疗还减少了小鼠中与角叉菜胶诱导的胸膜炎和LPS诱导的肺损伤相关的非生产性炎症。在半抗原-载体报告抗原腘窝淋巴结试验中，BEA增加淋巴细胞、抗原呈递细胞、和半抗原特异性免疫球蛋白M(IgM)抗体形成细胞的绝对数量，并使干扰素-γ(IFN-γ)/白介素-4(IL-4)的平衡倾向干扰素-γ(IFN-γ)的产生。在急性铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)感染的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR(-/-))小鼠模型中，BEA治疗持续降低肺中的细菌负荷。所有BEA效应均依赖剂量。BEA降低动物和患者中与过度炎症和机会性肺感染相关的死亡率。

Carrero，J.等人，“16α-溴表雄酮(EpiBr)对阿米巴病和囊虫病的杀虫作用(Parasiticidal effect of 16alpha-bromoepiandrosterone(EpiBr)in amoebiasis andcysticercosis)“，《微生物与感染(Microbes and Infection)》，12(8-9)，677-82(2010)披露BEA对绦虫-肥头绦虫(Taenia crassiceps)和原生生物痢疾变形虫(Entamoebahistolytica)在体内和体外的作用，并发现在小鼠中，在囊状虫感染前施用BEA与对照相比减少了50％的寄生虫量。BEA治疗还使仓鼠的阿米巴肝脓肿的增长减少20％。用BEA体外治疗肥头绦虫和痢疾变形虫培养物依照剂量和时间不同可以降低其繁殖、活动能力和生存率。这些结果可用来评估激素类似物作为抗寄生虫病，包括囊虫病和变形虫病，的药物的潜力。

细胞通过自噬，即一进化上保守的细胞内过程，来去除不需要的分子、细胞器和微生物。强大的自噬作用对于先天吞噬细胞(巨噬细胞和树突细胞)作为中央抗原加工细胞和作为杀死微生物的终末期效应细胞的功能尤其重要。巨噬细胞通过自噬过程处理结核分枝杆菌和其它微生物感染。自噬酶引导脂质从内质网包围微生物，将微生物包封在自噬泡中。溶酶体与其融合，带来杀微生物的组分以破坏细菌。微生物分子中储存的信息通过模式识别受体触发途径来解释，该途径指导细胞核激活适当的遗传网络以合成适当的信号传导细胞因子和受体转录物。消化的抗原与适当的信号传导分子一起通过MHC装置呈递至免疫网络的适应性臂的T细胞，从而协调有效的整体免疫应答。有效的自噬和Th1/细胞介导的应答是有效控制分枝杆菌感染所必需的。作为综合应答的组分，适当起作用的自噬在通过关闭NAPL3炎性小体和停止促炎IL-1β的释放来下调炎症中是关键的。参见Deretic，V.“结核中的自噬(Autophagy in Tuberculosis)”，《冷泉港的医学展望(Cold Spring HarborPerspectives in Medicine)》(2014)。

自噬受损的最终结果是持续性的微生物感染、不适当的细胞因子产生、有缺陷的抗原呈递至适应性免疫网络的T细胞、免疫信号传导调节异常和无法下调IL-1β，导致慢性损伤性炎性疾病。参见Nakahira，K.等人，“自噬蛋白通过抑制由NALP3炎性小体介导的线粒体DNA的释放来调节先天免疫反应(Autophagy proteins regulate innate immuneresponses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by theNALP3 inflammasome)”《自然免疫学(Nat.Immunol.)》，12(3)，222-30(2011)；Liang，Y.等人，“利福平通过增强自噬抑制鱼藤酮诱导的小胶质细胞炎症(Rifampicin inhibitsrotenone-induced microglial inflammation via enhancement of autophagy)”，《神经毒理学(Neuro.Toxicology)》，63，137-45(2017)。

鼠系统中强烈的Th1(辅助性Tell 1)应答有助于清除感染或减缓感染的进展。当受试者主体的免疫应答偏向Th2型应答时，其倾向于抑制免疫系统发动强烈的Th1应答的能力。Th1应答不足可能与一些感染或其它病况的进展有关。参见Clerici，M.等人，《今日免疫学(Immunol.Today)》，14，107-111(1993)；Clerici，M.，等人，《今日免疫学》，15，575-581(1994)。

后生动物中通过激素控制生物学途径涉及不同细胞类型中的复杂过程，该复杂过程整合到通常涉及冗余和平行信号传导途径的功能性应答中。“先锋”转录因子从覆盖组蛋白打开了大的和相关的遗传网络，所述组蛋白被其它转录因子进一步调节以选出最终转录的基因。BEA与作为先锋转录因子的其它类固醇激素起类似作用来协调复杂的免疫应答。由于BEA能够刺激自噬，它刺激先天免疫，下调非生产性的炎症，产生Th1免疫偏倚，并显示出抗病毒、细菌、原生动物和蠕虫的活性。

能够影响先天免疫和炎症的药剂将在创伤、感染、瘤的形成、代谢、自身免疫、神经炎性和血管疾病过程中具有治疗作用。因此，结核分枝杆菌(MTB)；非结核分枝杆菌疾病；所有涉及免疫和炎症的病毒、细菌、原生动物、真菌和蠕虫病；涉及呼吸器的细菌性肺炎都是BEA的明确靶标。

由于BEA对涉及自噬和相互连接的细胞内信号传导途径的基本生物学信号传导途径的作用，BEA对看似不同疾病过程的一系列疾病都产生有益的影响。BEA能够在恢复对失调的、非生产性炎症的控制的同时刺激先天免疫是其功效的关键所在。许多急性和慢性的传染病、肿瘤类疾病和特发性慢性炎性疾病都与免疫信号传导的失调有关，该免疫信号失调与细胞内和细胞外的自噬受损和信号传导途径失调均有关。作为激素，BEA在整个宿主中引起不同细胞类型的应答，从而使得免疫网络的“动态稳态”得以恢复。该术语暗示了BEA能够恢复免疫系统正常运行，这由如下证明：BEA能够增强先天免疫，下调非生产性炎症，促进Th1细胞介导的免疫过程以及更有效地应答通过模式识别受体(PRR)途径解释的微生物病原相关分子模式(PAMPS)和瘤性危险相关分子模式(DAMPS)威胁。BEA对作为影响适应性免疫系统下游信号传导的专业抗原呈递细胞的树突细胞和巨噬细胞的影响对其对恢复免疫动态稳态的整体系统作用极为重要。

鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium ss.paratuberculosis，MAP)是一种耐酸染色的小杆状细菌，与克罗恩病、类风湿性关节炎、布劳综合征、1型糖尿病、桥本甲状腺炎、多发性硬化和结节病有关。该细菌还会在牛和其它反刍动物中引起约内氏病。BEA可以抑制MTB感染小鼠的细菌增殖并增加TNF-α、IFN-γ和iNOS的表达(参见R.Hernandez-Pando等人(2005))的事实表明BEA不仅可以用于治疗MTB，还可以治疗克罗恩病、类风湿性关节炎、布劳综合征、1型糖尿病、桥本甲状腺炎、多发性硬化、结节病和约内氏病。

MAP被广泛研究以确定其是否与克罗恩病(CD)-一种在人类中发生的慢性炎性肠病，的发病相关。20世纪80年代，从CD患者中分离出MAP为MAP在CD发病机理中的潜在作用提供了第一个直接证据。参见Chiodini，R.等人，“分枝杆菌在炎性肠病中的潜在作用。I.从克罗恩病患者中分离出的一种未分类的分枝杆菌种(Possible role of mycobacteria ininflammatory bowel disease.I.An unclassified Mycobacterium species isolatedfrom patients with Crohn′s disease)“，《消化疾病与科学(Dig.Dis.Sci.)》，29，1073-1079(1984)。预期导致CD患者保护性免疫破坏的机制与MTB患者保护性免疫破坏的机制相似。由于BEA有效治疗MTB，因此预期有效治疗CD。

类风湿关节炎(RA)与CD相关，因为它们共享的遗传易感性、慢性炎症以及采用相似的生物制剂进行治疗。最近的一项研究发现了两者之间的联系：MAP。(Sharp，R.等人，“蛋白酪氨酸磷酸酶非受体2和22型(PTPN2/22)中的多态性与类风湿关节炎的过度增殖性T细胞和分枝杆菌的易感性有关(Polymorphisms in Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor Type 2 and 22(PTPN2/22)Are Linked to Hyper-Proliferative T-Cells andSusceptibility to Mycobacteria in Rheumatoid Arthritis)”，《细胞与感染微生物学前沿(Front.Cell.Infect.Microbiol.)》，第8卷，第11篇(2018))。由于RA和CD病因相同，并且使用相同的药物进行治疗，因此可以合理地预测出可以通过抑制MAP来有效治疗CD的药物也应该对RA有效。由于BEA在CD的动物模型中有效，因此在治疗RA中应该有效。

许多研究表明，多发性硬化与MAP感染有关。参见Cossu，D.等人，“鸟分枝杆菌亚种副结核病与撒丁岛患者中的多发性硬化的关系(Association of Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis with Multiple Sclerosis in Sardinian Patients)”，《公共科学图书馆·综合(PLoS ONE)》6(4)：e18482(2011)。BEA已成功用于治疗同样与MAP有关的结核分枝杆菌。参见Stickney等人(2007)。因此，BEA可用于通过与结核病相同的机制治疗多发性硬化。1型糖尿病(T1DM)是一种多因素自身免疫性疾病，其中胰岛素产生的β细胞群被浸润T淋巴细胞破坏。虽然尚未确定T1DM的确切病因，但不同程度的遗传易感性和环境因素与疾病的进展和结果有关。随着对MAP与克罗恩病之间联系的认识日益增加，推测MAP是一种除克罗恩病之外的隐匿性抗原，也可以认为它触发了T1DM。分枝杆菌蛋白(Hsp65)与胰腺谷氨酸脱羧酶(GAD 65)之间的表位同源性以及婴儿营养研究表明MAP是T1DM的可能触发因素之一。撒丁岛糖尿病患者的PCR和ELISA分析表明，MAP作为T1DM的可能触发因素作用。鉴于BEA抗结核分枝杆菌的功效，可以想到使用BEA制剂来治疗T1DM。

衣原体是革兰氏阴性的专性胞内病原体，并且是多种生物体(范围从人到变形虫)的共生体。肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)是一种感染许多脊椎动物包括人类的呼吸道的专性胞内细菌。肺炎衣原体感染引起无症状肺炎和急性肺炎以及支气管炎，并且与慢性呼吸道疾病如阻塞性肺病(COPD)和哮喘的发展和/或恶化有关，并且感染的发病机理与多种疾病有关，诸如动脉粥样硬化(Blanchard，T.等人，“肺炎衣原体和动脉粥样硬化(Chlamydia neumoniae and atherosclerosis)”Lancet，341，825(1993))、阿尔兹海默病(Balin，B.等人，“肺炎衣原体在阿尔茨海默氏症中的鉴定和定位(Identification andlocalization of Chlamydia pneumoniae in the Alzheimer′s brain”，《医学微生物学与免疫学(Med Microbiol Immunol.)》，187，23-42(1998))、炎性关节炎(Cheryl，V.等人，“持续性衣原体和慢性关节炎(Persistent Chlamydiae and chronic arthritis)”，《关节炎研究(Arthritis Res.)》，4(1)，5-9(2002))、多发性硬化(Sriram，S.等人，“与CNS肺炎衣原体感染相关的多发性硬化(Multiple sclerosis associated with Chlamydiapneumoniae infection of the CNS)”，《神经病学(Neurology)》，50，571-572(1998))、哮喘(Galeone，C.等人，“精准药物在重度哮喘的靶向治疗中：是否有用于(Omics)技术的任何地方？(Precision Medicine in Targeted Therapies for Severe Asthma：Is There AnyPlace for(Omics)Technology？)”，《国际生物医学研究(BioMed ResearchInternational)》，文章ID 4617565，第15页(2018))和慢性阻塞性肺病(COPD)(Blasi，F.等人，“COPD急性加重中的肺炎衣原体感染(Chlamydia pneumoniae infection in acuteexacerbations of COPD)”，《欧洲呼吸杂志(Eur.Respir.J.)为6，19-22(1993))。没有可用的有效疫苗，并且抗生素只能短期使用。提高先天免疫是对抗衣原体所必需的。参见Shimada，K.等人，“对肺炎衣原体感染的先天免疫应答：TLR，NLR和炎症小体的作用(Innateimmune responses to Chlamydia pneumoniae infection：Role of TLRs，NLRs，and theInflammasome)”，《微生物与感染(Microbes Infect.)》，14(14)，1301-1307(2012)。BEA可以刺激先天免疫并增强自噬。增强的自噬可以帮助涉及的巨噬细胞清除感染。因此，BEA可用于治疗衣原体，如其治疗疟疾的有效性所证明的。

最近的研究表明阿尔茨海默病与微生物感染有关，诸如单纯疱疹病毒1型(HSV1)、肺炎衣原体和若干类型的螺旋菌。(Itzhaki，R.等人，“微生物和阿尔茨海默病(Microbesand Alzheimer′s Disease)”，《阿尔茨海默病杂志(J.Alzheimers Dis.)》，51(4)：979-984(2016))。慢性神经胶质激活是阿尔茨海默病脑中伴随病理蛋白积累的突出特征。长期的神经炎症可经由多种途径诱导神经元损伤和死亡。先天免疫不仅对神经元存活率具有直接作用，而且还影响β淀粉样蛋白和tau病理积累，这又可能影响神经变性。因此，先天免疫是阿尔茨海默病发病机理中不可缺少的组分，并且可能构成疾病进展的驱动力。在稳态或病理状态下加强脑中的免疫活性以增加废物清除而不损伤神经元可能是治疗阿尔茨海默病的替代策略。参见Shi，Y.等人，“先天性免疫与阿尔茨海默病之间的相互作用：APOE和TREM2备受关注(nterplay between innate immunity and Alzheimer disease：APOE and TREM2in the spotlight)”，《自然综述免疫学(Nature Reviews Immunology)》，18，759-772(2018)。BEA能够刺激先天免疫，同时重建对人类和动物中失调的和非生产性炎症的控制，因此，它可以通过控制慢性炎症用于治疗阿尔茨海默病。

代谢综合征是一起发生的一组病况——血压增加、血糖高、腰部周围体脂肪过多和胆固醇或甘油三酯水平异常，增加了心脏病、中风和糖尿病的危险。肺炎衣原体也与T2DM相关。

Blasi，F.等人在涉及142名COPD患者的研究中公开了COPD至少部分与肺炎衣原体相关。BEA在人类和动物中刺激先天免疫同时重建对失调的和非生产性炎症的控制的能力表明它可以用于治疗COPD。

哮喘被定义为气道的慢性炎性疾病。它是世界上最常见的慢性疾病之一。即使采用最大程度的医学疗法，许多哮喘患者也没有实现充分的哮喘控制，导致需要额外的抗哮喘药物。根本的生理和免疫过程尚未被完全了解。Black，P等人，“肺炎衣原体感染与哮喘的严重程度有关的血清学证据(Serological evidence of infection with Chlamydiapneumoniae is related to the severity of asthma)”，《欧洲呼吸杂志》，15(2)，254-9(2000)披露肺炎衣原体感染明显与非典型肺炎、哮喘和可能的缺血性心脏病有关。使用BEA治疗可以减少哮喘中的气道炎症，这是因为其有效激活Th-1应答，该应答是调节过敏反应的Th-2细胞因子模式的拮抗剂。

创伤过程涉及早期炎症，并且可能导致′细胞因子风暴′后免疫缺陷。创伤引起全身性反应，包括急性、非特异性、与感染抗性降低反常相关的免疫应答。旨在增强机体抗感染免疫力的治疗显著降低了感染和死亡率。参见Lord，J.等人，“对创伤的全身性免疫反应：病理生理学和治疗方法的概述(The systemic immune response to trauma：an overviewof pathophysiology and treatment)”，Lancet，384(9952)，1455-1465(2014)。BEA恢复免疫稳态的能力将使其有效治疗创伤。

涉及相对免疫缺陷的肿瘤性疾病也是BEA的靶标。大量数据支持的长期存在的假说表明，一些(如果不是大多数)当前被标记为自身免疫性疾病的特发性慢性炎性疾病实际上是由隐匿性感染原引起的。BEA下调损伤性炎症而不进一步损害免疫的能力改进了目前的免疫抑制疗法。免疫疗法正迅速成为癌症的标准治疗方式。CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是靶向肿瘤的优选工具，因为它们检测由所有肿瘤细胞类型表达的MHCI类分子呈递的细胞内抗原。CD4⁺T细胞也是有效的抗肿瘤免疫所必需的。最大化CD4⁺T细胞的辅助功能可提高癌症免疫疗法的效果。参见Borst，J.等人，“CD4+T细胞在癌症免疫学和免疫疗法中的帮助(CD4+T cell help in cancer immunology and immunotherapy)”，《自然综述免疫学》，18，635-647(2018)。已经在人类临床试验中证明BEA增加患者中的CD8⁺水平。(Stickney D.等人(2007))。因此，BEA可以用作癌症免疫治疗剂。

多发性骨髓瘤是一种普遍致命的B细胞恶性肿瘤，其特征为单克隆浆细胞的进行性积累。白介素6(IL-6)已显示是骨髓瘤细胞的中心生长因子。参见Kawano，M.等人，“人多发性骨髓瘤的自分泌产生和对BSF-2/IL-6的需求(Autocrine generation andrequirement of BSF-2/IL-6 for human multiple myelomas)”，《自然(Nature)》，332(6159)，83-85(1988)。尽管许多细胞因子可以刺激IL-6产生，但是在骨髓瘤中，白介素1(IL-1)β似乎是负责骨髓基质细胞旁分泌产生IL-6的主要细胞因子之一。参见Xiong，Y.等人，“确定两组是白细胞介素1的高或低产生者的郁积多发性骨髓瘤患者(Identificationof two groups of smoldering multiple myeloma patients who are either high orlow producers of interleukin-1)”，《干扰素和细胞因子研究杂志(J.InterferonCytokine Res.)》，26(2)，83-95(2006)。临床试验已经显示，基于M-刺突或M-蛋白的多发性骨髓瘤小鼠模型为抗多发性骨髓瘤药物的有效性的预测物。参见Chesi，M.等人，“多发性骨髓瘤基因工程小鼠模型中的药物反应可预测临床疗效(Drug response in a geneticallyengineered mouse model of multiple myeloma is predictive of clinicalefficacy)”，《血液(Blood)》，120(2)，376-385(2012)。BEA恢复Th1和减少IL-1β和IL-6的能力使其成为治疗多发性骨髓瘤的潜在药物。

BEA增强嗜中性粒细胞和巨噬细胞杀死致病微生物的能力，调节过度的炎症反应并改善随后的免疫缺陷状态。因此，它可用于治疗急性感染/炎性病况，诸如肺炎、脓毒症和胰腺炎。

在BEA研发期间使用的许多动物模型已经显示BEA在治疗动物疾病中是有效的。因此，与BEA治疗的人类疾病相当的所有动物疾病也可以用BEA治疗。

发明内容

为了使快速沉淀最小化并防止形成大块固体，以及因此减少或消除药物制剂中的注射部位刺激，本发明提供了由小颗粒BEA制成的悬浮液。在本发明中，BEA的水性悬浮液制剂被设计用于解决当前BEA制剂的问题：稳定性差，更严重的注射部位刺激以及难以制造、储存和使用。

与化学常识和出版物中公开的那些知识相反，本发明显示在本发明的组合物中，BEA作为固体在水中是异常稳定的。认为固体BEA在本发明的组合物中的异常稳定性是因为其在水中的溶解性极差。较差的溶解性会阻止游离水分子进入BEA颗粒，并保护BEA免受水解、差向异构化和其它降解。通过制备固体BEA的水悬浮液制剂，本发明解决了现有制剂的稳定性问题。在本发明的制剂与文献中公开的制剂之间的一一对照的稳定性研究表明，本发明的制剂比已知制剂稳定得多。

通过在本发明的制剂中使用BEA的细颗粒，防止了BEA的快速和无序沉淀及在组织中形成大块固体。该过程同时消除了使用有机溶剂，因而显著地改善了注射部位的刺激。经过对注射部位刺激的广泛研究证明本发明的BEA制剂远远优于已知制剂。

本发明提供了实现以下目的的组合物、制剂和方法。

本发明的第一目的是提供适用于治疗和其它应用诸如免疫调节剂的新制剂和组合物。本发明的新制剂和组合物包括包含BEA半水合物的BEA半水合物组合物及其制备和使用方法。

本发明的第二目的是提供包含式I化合物并使用水作为溶剂的水性悬浮液组合物和制剂。

本发明的第三目的是提供水中可分散的干燥组合物，其可以用作制备含有式I化合物的人类用药物和兽医制剂的中间体。

本发明的第四目的是提供间歇给药方法以将式I化合物递送至主体以增强Th1免疫应答。

本发明的第五目的是提供通过向主体施用含有式I化合物诸如BEA的制剂来调节主体中先天免疫或增强Th1免疫应答的方法。

本发明的第六目的是提供通过向主体施用含有式I化合物诸如BEA的制剂来抑制主体中病原体例如病毒复制的方法。本发明提供了可用于减轻与免疫抑制或Th1免疫应答不足有关的病理状况的一种或多种症状的制剂。

本发明的第七目的是提供制备和使用包含式I化合物的组合物和制剂的方法。

本发明提供了适用于人类用药物用途或兽医用途的包含BEA和一种或多种赋形剂的组合物和制剂。

本发明还提供了用于肠胃外或气溶胶施用的具有BEA和一种或多种赋形剂的水性悬浮液制剂。

本发明进一步提供了用于肠胃外或气溶胶施用的BEA和一种或多种赋形剂的水中可分散的干燥组合物。

本发明进一步提供了制备水性BEA悬浮液的方法。

本发明进一步提供了一种制备BEA和一种或多种赋形剂的水中可分散的干燥组合物的方法。

本发明的组合物包含无定形、晶体、共晶体、多晶型物、共晶体多晶型物形式的式I化合物，包括水合物和溶剂化物，以及一种或多种赋形剂，其中该化合物具有以下结构：

其中n是0-4；

所述溶剂化物是H₂O、C_1-4-OH、HO-C₁-₄-OH、C₁-₄-COOH、C_1-4-COOC_1-4、四氢呋喃、1，4-二噁烷、(CH₃)₂O、(C₂H₅)₂O、HC(O)N(CH₃)₂或(CH₃)₂SO；

X是Cl、Br或I；

R是-H、-Si-(C_1-6烷基)3、酯、硫酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯、膦酯、亚硫酸酯、硫酸酯、酰胺、氨基酸、肽、醚、硫醚、酰基、硫酰基、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫代缩醛、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基部分、任选取代的杂芳基部分、任选取代的单糖、任选取代的寡糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸或聚合物。

本发明进一步提供了包含式I化合物和水的组合物。式I化合物以颗粒形式存在于水中，并且式I化合物作为颗粒处于水中的水性悬浮液中。在组合物中水的含量为至少10％w/w，在组合物中可以为30％w/w或更多。优选地，水的含量可以为65％w/w或更多，更优选地，水的含量可以为70％w/w或更多，并且最优选地，水的含量可以为80％w/w或更多，并且水的含量可以达到90％w/w或更多，并且本发明的组合物仍保持其中的式I化合物的稳定性。

进一步地，本发明提供了水中可分散的干燥组合物，即冻干组合物，其通过将含水的组合物冷冻干燥或冻干来制备。当向该水中可分散的干燥组合物加水使用时，组合物中的式I化合物在水中保持稳定。

在本发明的组合物中，优选地，式I化合物的颗粒的尺寸在0.01μm至15μm的范围内。

本发明的组合物可以进一步包含表面活性剂、悬浮剂和药物赋形剂。

本发明的表面活性剂可以是泊洛沙姆、聚山梨酯、聚氧乙烯蓖麻油，聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇(PEG)-8-辛酸/癸酸和聚乙二醇(PEG)羟基硬脂酸酯、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、油酸钠、胆汁盐或其混合物。

本发明的悬浮剂是纤维素衍生物，诸如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、藻酸盐、阿拉伯胶、黄蓍胶、黄原胶、膨润土、卡波姆、角叉菜胶或其混合物。

药物赋形剂是注射用水、pH调节剂、渗透压调节剂、冻干保护添加剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、药物成分或其混合物。当药物赋形剂是防腐剂时，它可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇、维生素C、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、L-半胱氨酸、氨基酸或其组合。

本发明的组合物可以是包含0.3-25％(w/v)的化合物、0.01-5％(w/v)的表面活性剂、0.01-3％(w/v)的悬浮剂和渗透压调节剂的可注射悬浮液。优选地，渗透压调节剂是氯化钠或右旋糖。

本发明的组合物可以是冻干制剂，其包含式I化合物、表面活性剂、悬浮剂和至少一种冻干保护剂，并且化合物的量为3mg至500mg，化合物与表面活性剂的比例为1∶50-500∶1，并且化合物与悬浮剂的比例为0.1∶10-500∶1。

在本发明的组合物中，溶剂化物可以是水；R可以是氢(H)；X可以是溴(Br)。在本发明的组合物的一个实施例中，溶剂化物是水，R是氢，X是溴，n是0.5，并且该化合物是具有以下结构的16α-溴-3β-羟基-5α-雄甾烷-17酮半水合物：

本发明进一步提供了使用组合物的方法，该方法包括通过肠胃外、口服或气溶胶施用途径向需要治疗的主体施用该组合物的步骤。

本发明进一步提供了一种使用该组合物的方法，该方法包括向需要治疗的主体施用能有效治疗的剂量的该组合物，其中该治疗在主体中用于刺激自噬和先天免疫，调节非生产性炎症，使免疫应答偏向于Th1应答(IFN-γ，细胞免疫途径)或Th2应答，病理状况(诸如病毒或寄生虫感染)或其组合。特别地，该治疗用于感染或失调的炎症，诸如创伤、感染(病毒、细菌、原生动物、真菌和蠕虫)、瘤形成、代谢、自身免疫或神经炎性和炎性血管病症；或结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌、MAP感染、衣原体感染、细菌性肺炎、炎性肠病(克罗恩和溃疡性结肠炎)、多发性骨髓瘤、哮喘、代谢综合征、2型糖尿病、1型糖尿病、阻塞性肺疾病、创伤、多发性硬化、阿尔茨海默病、心脏结节病、类风湿关节炎或非酒精性脂肪性肝病。

本发明进一步提供了适用于人类药物用途或兽医用途的式I化合物和一种或多种赋形剂。本发明的一个实施例包括用于肠胃外或气溶胶施用的具有式I化合物和一种或多种赋形剂的水性悬浮液制剂。本发明的另一个实施例提供了用于肠胃外或气溶胶施用的式I化合物和一种或多种赋形剂的水中可分散的干燥组合物。本发明的又一个相关的实施例提供了制备水性式I化合物悬浮液的方法。本发明的又一个实施例提供了一种制备式I化合物和一种或多种赋形剂的水中可分散的干燥组合物的方法。

附图说明

图1是显示本发明实例6中通过LC-MS/MS处理和分析的BEA血液浓度随时间推移的图。

图2(a)显示了在第0天以各种组合物孵育的巨噬细胞中的胞内活杆菌的数量，即起始计数；图2(b)显示了在第1天，即在孵育24小时后，以各种组合物孵育的巨噬细胞中的胞内活杆菌的数量；图2(c)显示了在第4天，即在孵育4天后，以各种组合物孵育的巨噬细胞中的胞内活杆菌的数量，所有数据均在本发明的实例7中。

图3显示了本发明的实例11中的小鼠M5396B、M5645B和M4982D中的M-刺突值随时间推移的变化。

图4(a)至4(d)显示了本发明的实例10中的实验结果，其中，图4(a)显示了用F1制剂治疗的由链脲佐菌素诱导的2型糖尿病(DM2)小鼠的OGTT结果；图4(b)显示了用F2制剂治疗的链脲佐菌素诱导的2型糖尿病(DM2)小鼠的OGTT结果；图4(c)是OGTT的血糖的曲线下面积(AUC)；图4(d)是与媒介物相比，F1和F2治疗的DM2小鼠的正常葡萄糖水平。

具体实施方式

如本文所用，并且除非另有说明或由上下文暗示，否则以下术语具有本文所定义的含义。

“制剂”或“本发明制剂”是指一种本发明的组合物，其可以向人类或动物肠胃外或气溶胶施用，而无需改变所存在的成分或成分比例的进一步操作。制剂适合于人类或兽医应用。

“本发明的组合物”是一种作为可以用于制备本发明制剂的中间体的组合物，即，需要改变成分或其量以制备制剂。因此，本发明的组合物包括在成为制剂之前需要进一步加工的组合物，例如，混合或添加所需量的成分。

“赋形剂”是指在与本发明的组合物或制剂的其它成分相容的意义上可接受的，并且对要施用该制剂的患者或动物并非过度有害的组分或成分。如本文所用，“赋形剂”包括液体，诸如苯甲酸苄酯、棉籽油、N，N-二甲基乙酰胺、C_2-12醇(例如，乙醇)、甘油、花生油、聚乙二醇(“PEG”)、维生素E、罂粟籽油、丙二醇、红花油、芝麻油、大豆油和植物油。赋形剂包含通常在药物制剂领域中使用的一种或多种组分，例如填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂。

“主体”是指人类或动物。通常，动物是脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如，家猫)、犬科动物(例如，犬)、禽类(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(例如，鳟鱼、鲶鱼和三文鱼)。主体包括前述的任何子集，例如所有上述子集，但不包括一个或多个诸如人类、灵长类动物或啮齿动物的组或物种。

提及“一种或多种式I化合物”或“一种式I化合物”的表述是指存在一种或超过一种(典型地为1、2、3或4，通常为1种)的式I化合物的本发明的组合物或制剂。

如本文所用，“烷基”是指连接的正、仲、叔或环状碳原子，即直链、支链或环状的碳原子。除非另有说明，否则烷基基团或部分中的碳原子数为1至约20，例如，C_1-8烷基表示含有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基部分。示例包括甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、2-丙基(异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(正丁基)、2-甲基-1-丙基(异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)、环丙基、环丁基、环戊基和环己基。

“烯基”是指连接的正、仲、叔或环状碳原子，其中存在一个或多个双键(例如，-CH＝CH-)，典型地为1、2或3，通常为1或2个。除非另有说明，否则烯基基团或部分中的碳原子数为2至约20，例如，C₁-₈烯基是指含有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烯基部分。

“炔基”是指连接的正、仲、叔或环状碳原子，其中存在一个或多个三键(-C≡C-)，典型地为1、2或3，通常为1个。除非另有说明，否则炔基基团或部分中的碳原子数为2至约20，例如，C₁-₈炔基是指含有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的炔基部分。

“芳基”是指苯基或萘基。

“取代的烷基”、“取代的烯基”和“取代的炔基”是指具有连接到碳原子的取代基或中断碳原子链的取代基的烷基、烯基或炔基集团。取代基包括醚(-O-)、酮(-C(O)-)、-OR^PR、-C(O)OR^PR、-C(O)O-、-C(S)OR^PR、-C(S)O-、-OC(O)-、-C(O)H、-OCH2-、-OCH2CH2-、-OCH2O-、-OCH2CH2O-、-NR^PR-、-N(R^PR)2、-NHR^PR、-NHC(O)-、-CH2-NR^PR-、-CH2-NHR^PR、-CH2-NHC(O)-、-C(O)NH-、-C(O)NHR^PR、-OC(O)NR^PR、-OC(O)NHR^PR、-NRPRC(O)NR^PR-、-NR^PRC(O)NHR^PR、-NR^PRCH2-、-NR^PRCH2CH2-、-S-、-SR^PR、-S(O)-、-S(O)(O)-、-S(O)OR^PR、-S(O)H、-CN、-NO2、卤素和这些部分的组合，其中R^PR独立地是氢、保护基团或两个R^PR一起是保护基团。存在超过一个取代基时，独立选择取代基。包含取代基的烯基和炔基通常在从双键除去一个或多个亚甲基部分的碳上被取代，例如至少被一个、两个或多个-CH2-部分隔开。R^PR独立地是氢、保护基团或两个R^PR一起是保护基团。

“杂环”或“杂环的”包括例如但不限于通过引用并入本文的Moss，P.等人，“基于结构的有机化合物和反应中间体的分类名词汇表(GLOSSARY OF CLASS NAMES OF ORGANICCOMPOUNDS AND REACTIVE INTERMEDIATES BASED ON STRUCTURE)”，《理论化学与应用化学(Pure&Appl.Chem.)》，67(819)，1307-1375(1995)中描述的杂环。

杂环的示例包括例如但不限于吡啶基、噻唑基、四氢噻吩基、硫氧化的四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、吲哚烯基(indolenyl)、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、吩噁噻基、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、异吲哚啉基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红酰基(isatinoyl)。

“保护基团”是指防止与其连接的原子参与不需要的反应的部分。例如，对于-OR^PR，R^PR可以是氢或羟基中发现的氧原子的保护基团，而对于-C(O)-OR^PR，R^PR可以是氢或羧基保护基团，对于-SR^PR，R^PR可以是例如氢或硫醇中的硫的保护基团，对于-NHR^PR或-N(R^PR)₂-，R^PR可以是氢或伯胺或仲胺的氮原子保护基团。羟基、胺和其它反应性基团见于式I化合物的例如R¹处。这些基团可能需要保护以防止在分子中其它地方发生的反应。氧、硫或氮原子的保护基团通常用于防止与亲电子化合物的不需要的反应，诸如例如在类固醇化学中使用的酰化。

“酯”是指包含-C(O)-O-结构的部分。典型地，这里使用的酯包含含有约1-50个碳原子(例如，约2-20个碳原子)和0至约10个独立选择的杂原子(例如O、S、N、P、Si)的有机部分，其中该有机部分在例如R¹通过-C(O)-O-结构与式I类固醇核键合，例如有机部分-C(O)-O-类固醇。有机部分通常包含任何上述有机基团中的一个或多个，例如C_1-20烷基部分、C_2-20烯基部分、C_2-20炔基部分、芳基部分、C_2-9杂环或任何这些的取代衍生物，例如包含1、2、3、4或更多个取代基，其中各取代基独立选择。这些有机基团中氢或碳原子的典型取代包括1、2、3、4或更多，通常1、2或3个-O-、-S-、-NR^PR-(包括-NH-)、-C(O)-、＝O、＝S、-N(R^PR)₂(包括-NH₂)、-C(O)OR^PR(包括-C(O)OH)、-OC(O)R^PR(包括-O-C(O)-H)、-OR^PR(包括-OH)、-SR^PR(包括-SH)、-NO₂、-CN、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-O-A8、-S-A8、-C(O)-A8、-OC(O)-A8、-C(O)O-A8、＝N-、-N＝、＝N-OH、-OPO₃(R^PR)₂、-OSO₃H₂或卤素部分或原子，其中每个R^PR是-H、独立选择的保护基团，或者两个R^PR一起包含保护基团，并且A8是C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_1-4烷基-芳基(例如，苄基)、芳基(例如，苯基)或C_0-4烷基-C_2-9杂环。取代是独立选择的。有机部分明显地排除不稳定部分，例如-O-O-，除非此类不稳定部分是可以用来制备化学稳定性足够的化合物以用于本文所述的一种或多种用途的瞬态物种。上面列出的取代基通常是可以用来取代一个或多个碳原子的取代基，例如-O-或-C(O)-，或一个或多个氢原子，例如卤素、-NH₂或-OH。

“硫酯”是指包含-C(S)-O-结构的部分。典型地，如本文所用的硫酯包含含有约1-50个碳原子(例如，约2-20个碳原子)和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，其中有机部分通过-C(S)-O-结构在R²处与式I类固醇核键合，例如，有机部分-C(S)-O-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

“硫缩醛”是指包含-C(O)-S-结构的部分。典型地，如本文所用的硫缩醛包含含有约1-50个碳原子(例如，约2-20个碳原子)和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，其中有机部分通过-C(S)-O-结构在R¹处与式I类固醇核键合，例如，有机部分-C(O)-S-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

“磷酸酯”或“磷酸盐酯”是指包含-O-P(OR^PR)(O)-O-结构的部分，其中R^PR是氢(-H)、保护基团或如关于酯所述的有机部分。典型地，如本文所用的磷酸酯包含氢原子、保护基团或含有约1-50个碳原子和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，该有机部分通过-O-P(O)(O)-O-结构在R¹处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-O-P(O)(O)-O-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

“硫代磷酸酯”是指包含-O-P(SR^PR)(O)-O-结构的部分，其中R^PR是-H、保护基团团或如关于酯所述的有机部分。典型地，如本文所用的硫代磷酸酯包含氢原子、保护基团或含有约1-50个碳原子和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，该有机部分通过-O-P(O)(O)-O-结构在R¹处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-O-P(O)(SH)-O-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

“膦酸酯”是指包含-P(OR^PR)(O)-O-结构的部分，其中R^PR是-H、保护基团或如关于酯所述的有机部分。典型地，如本文所用的膦酸酯包含氢原子、保护基团或含有约1-50个碳原子和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，该有机部分通过-P(OR^PR)(O)-O-结构在R¹处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-P(OR^PR)(O)-O-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

“次膦酸酯(phosphiniester)”是指包含-P(OR^PR)-O-结构的部分，其中R^PR是-H、保护基团或如关于酯所述的有机部分。典型地，如本文所用的次膦酸酯包含氢原子、保护基团或含有约1-50个碳原子和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，该有机部分通过-P(OR^PR)-O-结构在R¹-R⁶处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-P(OR^PR)-O-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

“硫酸酯”是指包含-O-S(O)(O)-O-结构的部分。典型地，如本文所用的硫酸酯包含氢原子、保护基团或含有约1-50个碳原子和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，该有机部分通过-O-S(O)(O)-O-结构在R¹处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-O-S(O)(O)-O-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

“亚硫酸酯”是指包含-O-S(O)-O-结构的部分。典型地，如本文所用的亚硫酸酯包含含有约1-50个碳原子和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，该有机部分通过-O-S(O)-O-结构在R¹处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-O-S(O)-O-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

“酰基基团”是指如关于酯所述的包含1、2、3、4或更多个-C(O)-基团的有机部分。在一些实施例中，-C(O)-基团在R处与类固醇核连接，例如有机部分-C(O)-O-类固醇。

“硫酰基”是指如关于酯所述的包含1、2、3、4或更多个-C(S)-基团的有机部分。在一些实施例中，-C(S)-基团在R处与类固醇核连接，例如有机部分-C(S)-O-类固醇。

“碳酸酯”是指如关于酯所述的包含1、2、3、4或更多个-O-C(O)-O-结构的有机部分。典型地，如本文所用的碳酸酯基团包含含有约1-50个碳原子和O至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，该有机部分通过-O-C(O)-O-结构在R处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-O-C(O)-O-类固醇。

“氨基甲酸酯”是指如关于酯所述的包含1、2、3、4或更多个-NR^PR-C(O)-O-结构的有机部分，其中R^PR是-H、保护基团或有机部分。典型地，如本文所用的氨基甲酸酯基团包含含有约1-50个碳原子和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，该有机部分通过-NR^PR-C(O)-O-结构在R处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-NR^PR-C(O)-O-类固醇。

“硫缩醛”是指包含R^PRS-C(O)-O结构的部分。典型地，如本文所用的硫缩醛包含含有约1-50个碳原子和0至约10个杂原子(例如，O、S、N、P、Si)的有机部分，其中有机部分通过-S-C(O)-O结构在R处与式I类固醇核连接，例如，有机部分-S-C(O)-O-类固醇。有机部分如上文对酯的描述。

如本文所用，“单糖”是指具有经验式(CH₂O)_n的多羟基醛或酮，其中n为3、4、5、6或7。单糖包括开链和闭链形式，但通常为闭链形式。单糖包括六呋喃糖和五呋喃糖，例如2′-脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、它们的2′-脱氧和3′-脱氧衍生物以及它们的2′，3′-二脱氧衍生物。单糖还包括核糖的2′，3′二脱氧二脱氢衍生物。单糖包括葡萄糖、果糖、甘露糖、艾杜糖、半乳糖、阿洛糖、古洛糖、阿卓糖、塔洛糖、岩藻糖、赤藓糖、苏糖、来苏糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘油醛、二羟基丙酮及它们的单脱氧衍生物诸如鼠李糖的D-、L-和DL-异构体。单糖任选地被保护或部分地被保护。

任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基部分和任选取代的杂环是指取代基，包括C_1-20烷基部分、C_2-20烯基部分、C_2-20炔基部分、芳基部分、C_2-9杂环或这些中任何一个的取代衍生物。这些有机基团的典型取代基包括1、2、3、4或更多，通常1或2个-O-、-S-、-NR^PR-、-C(O)-、-N(R^PR)₂、-C(O)OR^PR、-OC(O)R^PR、-OR^PR、-SR^PR、-NO₂、-CN、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-O-A8、-S-A8、-C(O)-A8、-OC(O)-A8、-C(O)O-A8、＝N-、-N＝、-OPO₂R^PR、-OSO₃H或卤素部分或原子，其中R^PR独立地是-H、保护基团，或者两个R^PR一起是保护基团，并且A8是C_1-8烷基、C_1-8烯基、C_1-8炔基、C_1-4烷基-芳基(例如，苄基)、芳基(例如，苯基)或C_1-4烷基-C_1-5杂环。取代是独立选择的。本文所述的有机部分以及本文所述的其它任何部分的有机部分均排除明显不稳定的部分，例如-O-O-，除非此类不稳定的部分是可以用来制备化学稳定性足够的化合物以用于本文所述的一种或多种用途的暂态物种。

任选取代的“单糖”包括任何C3-C7糖，D-、L-或DL-构型，例如赤藓糖、甘油、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、葡糖胺、N-乙酰基神经氨酸、N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰半乳糖胺，其任选地在一个或多个羟基上被取代。合适的取代包括氢；被保护的羟基；羧基；叠氮基；氰基；-O-C_1-6烷基；-S-C_1-6烷基；-O-C_2-6烯基；-S-C_2-6烯基；任选地被保护的胺；任选地被保护的羧基；卤素；硫醇或被保护的硫醇。单糖和类固醇之间的连接是α或β。

任选取代的“寡糖”包括彼此共价连接的两个、三个、四个或更多个任何C3-C7糖。连接的糖可以具有D-、L-或DL-构型。合适的糖和取代如关于单糖所述。寡糖和类固醇之间的连接是α或β，构成寡糖的单糖之间的连接也是如此。

核苷包括3TC、AZT、D4T、ddI、ddC、G、A、U、C、T、dG、dA、dT和dC。

聚合物包括生物相容性有机聚合物，例如PEG和多羟基烷基聚合物。

PEG是指含有约20至约2000000个连接的单体，典型约50-1000个连接的单体，通常约100-300个连接的单体的乙二醇聚合物。聚乙二醇包括含有各种数量的连接单体的PEG，例如，PEG20、PEG30、PEG40、PEG60、PEG80、PEG100、PEG115、PEG200、PEG 300、PEG400、PEG500、PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG 3350、PEG4000、PEG4600、PEG5000、PEG6000、PEG8000、PEG11000、PEG12000、PEG2000000，及其任何混合物。

如本发明所用包括实施例的盐包括式I化合物的盐和复合物，包括药用可接受的、相对无毒的盐。本发明化合物中的一些具有一个或多个在水溶液中典型地在约4-10的pH下携带至少部分正电荷或负电荷的部分，其可参与形成盐、复合物、具有部分盐和部分复合物性质或其它非共价相互作用的组合物，所有这些均称为“盐”。盐通常是生物相容的或药用上可接受的或无毒的，特别是对于哺乳动物细胞而言。生物毒性的盐任选地与本发明化合物的合成中间体一起使用。当需要水溶性组合物时，通常使用一价盐。

金属盐典型地通过使金属氢氧化物与本发明化合物反应来制备。任选地以此方式制备的金属盐的示例为含有Li⁺、Na⁺和K⁺的盐。通过添加合适的金属化合物，可以从溶解度更高的盐溶液中沉淀出溶解度较低的金属盐。本发明的盐可以通过以下形成：将某些有机酸诸如有机羧酸和无机酸诸如烷基磺酸或氢卤酸加到本发明化合物的酸性或碱性中心诸如本发明化合物的嘧啶碱基类似物上的碱性中心。金属盐包括含有Na⁺、Li⁺、K⁺、Ca⁺⁺或Mg⁺⁺的盐。其它金属盐可能包含铝、钡、锶、镉、铋、砷或锌离子。

本发明化合物的盐可包含适当阳离子的组合，诸如碱和碱土金属离子或铵和季铵离子与可存在于本发明的聚合物或单体中的磷酸或膦酸基团的酸阴离子部分的组合。

盐通过标准方法生产，包括将游离碱溶解在含有所选酸的水性、水-醇、或水-有机溶液中，然后任选地将溶液蒸发。游离碱在含有酸的有机溶液中反应，在这种情况下，盐通常直接分离，或者可以通过浓缩溶液分离。

合适的胺盐包括具有足够碱性以形成稳定盐的胺，通常是低毒性的胺，包括三烷基胺(三丙胺、三丁胺、三甲胺)、普鲁卡因、二苄胺、N-苄基-β苯乙胺、二苯羟甲胺、N，N′-二苄基乙二胺、N-乙基哌啶、苄胺和二环己基胺。

盐包括有机磺酸或有机羧酸盐，例如通过将酸加至碱性中心(典型地为胺)来制备。示例性的磺酸包括C_6-16芳基磺酸、C_6-16杂芳基磺酸和C_1-16烷基磺酸，诸如苯基磺酸、α-萘磺酸、β-萘磺酸、(S)-樟脑磺酸、甲基(CH₃SO₃H)、乙基(C₂H₅SO₃H)、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基磺酸。示例性有机羧酸包括C_1-16烷基、C_6-16芳基羧酸和C_4-16杂芳基羧酸，诸如乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、戊二酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、草酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、烟酸和2-苯氧基苯甲酸。

本发明的盐包括由无机酸制成的盐，例如由HF、HCl、HBr、HI、H₂SO₄、H₃PO₄、Na₂CO₃、K₂CO₃、CaCO₃、MgCO₃和NaClO₃制成。任选地与阳离子诸如Ca⁺⁺、Mg⁺⁺、Li⁺、Na⁺或K⁺一起存在的合适的阴离子包括砷酸根、亚砷酸根、甲酸根、山梨酸根、氯酸根、高氯酸根、高碘酸根、重铬酸根、甘氨脱氧胆酸根、胆酸根、脱氧胆酸根、去氧胆酸根、牛磺胆酸根、牛磺脱氧胆酸根、牛磺石胆酸根、四硼酸根、硝酸根、亚硝酸根、亚硫酸根、氨基磺酸根、次硫酸根、亚硫酸氢根、偏亚硫酸氢根、硫代硫酸根、硫氰酸根、硅酸根、偏硅酸根、CN^-、葡萄糖酸根、葡萄糖醛酸根、马尿酸根、苦味酸根、次硫酸根、六氟磷酸根、次氯酸根、次亚氯酸根、硼酸根、偏硼酸根、钨酸根和尿酸根。

盐还包括本发明化合物与一种或多种氨基酸的盐。许多氨基酸适用于本发明，尤其是作为蛋白质组分发现的天然存在的氨基酸，尽管该氨基酸通常为带有含碱性或酸性基团的侧链的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸或谷氨酸，或中性基团，诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。

本发明的组合物包括其未电离的以及两性离子形式的化合物，以及与化学计量量的水的组合，如水合物。

从描述中可以明显看出，本发明化合物(式I化合物)的立体异构体包括在任何或所有不对称原子上的富集或拆分的光学异构体。外消旋混合物和非对映异构体混合物，以及各个光学异构体都可以被分离或合成，从而基本不含它们的对映异构体或非对映异构体伴侣，并且这些都在本发明的范围内。在本发明化合物中，例如在R和X处，可以发现手性中心。

如本文所用，“先天免疫”是指典型地与主体中的非特异性免疫防御机制相关的一种或多种组分。这些组分包括替代补体途径，例如，因子B、因子D和备解素；NK细胞、吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、纤维细胞；抗微生物化学品、例如防御素；物理屏障——皮肤、粘膜上皮；以及某些白介素、趋化因子和细胞因子。先天免疫在抵抗细胞内寄生虫感染例如白细胞感染、肝脏感染和其它感染例如淋巴结感染中起作用。通过本文所述的式I化合物或方法增强先天免疫机制可增强一些病原体例如胞内细菌诸如分枝杆菌或李斯特菌抑制的吞噬溶酶体融合或运动。

如本文所用，对CD分子、特异性免疫细胞亚群、免疫应答等的提及通常使用适用于在人类中发现的分子、细胞等的命名。此类分子、细胞等在其它物种中的类似物或对应物可能具有不同的命名，但都包括在本发明中。对各种CD分子和免疫细胞亚群的命名和功能的描述见于科学文献中。在人类患者的上下文中提及Th0、Th1或Th2细胞和提及Th1或Th2免疫反应是指鼠Th0、Th1或Th2免疫细胞或反应的人类对应物。综述参见例如Carli，M.等人，“人类THl和TH2细胞：功能特性、发育调控和自主性作用(HUMAN THl AND TH2 CELLS：FUNCTIONAL PROPERTIES，REGULATION OF DEVELOPMENT AND ROLE IN AUTOIMMUNITY)”，《自身免疫(Autoimmunity)》，18(4)，301-308(1994)。

“免疫抑制分子”是指诸如环孢菌素、cyclohexamide、丝裂霉素C、阿霉素、紫杉醇和两性霉素B的分子。这些分子倾向于对免疫系统具有毒性，并且具有直接或间接的免疫抑制作用，即对分裂细胞有毒性或它们可以下调免疫。

“类固醇受体”是指基因产物，典型地是可以结合至配体例如天然类固醇或其类似物诸如式I化合物的蛋白质单体或二聚体。类固醇受体包括孤儿类固醇受体。孤儿类固醇受体是天然配体或生物学功能至少部分未知的蛋白质。如本文所用，类固醇受体包括同二聚体，例如SXR和(CARβ)₂，和异二聚体，例如PXR-CARβ或RXR-CARβ。类固醇受体还包括同种型，例如PXR受体的PXR.1和PXR.2，以及类固醇受体的同源物，例如CARβ的同系物，称为MB67。同种型典型地通过一个基因的核RNA的不同剪接途径产生，而同系物典型地是类固醇受体基因的不同拷贝，其中与参考类固醇受体基因产物相比，该基因拷贝仅编码相对小的差异。此类差异最常见于类固醇受体结构的二聚化区域和类固醇结合区域以外的区域。通常同种型和同系物结合与参考基因产物或类固醇受体相同或相似的配体。类固醇受体可以是人类或动物来源的，例如得自源自任何灵长类动物、啮齿动物(包括鼠科)、禽类、绵羊、牛科、马、犬科或猫科物种或物种中的任一个或在本文其它地方或在本文引用的任何参考文献中提及的物种的任何组(例如，科或属)内的任何物种的细胞或组织的细胞、组织或cDNA表达文库。

在本发明的一个实施例中，将BEA研磨至约0.01-200μm，或约0.1-10μm或约0.5-5μm的平均粒度。研磨的BEA的平均粒度或直径因此可以相对小，例如，约0.03-2.0μm或约0.1-1.0μm，或稍大，例如，约0.5-5.0μm或约1-5.0μm。研磨的BEA适用于制备用于人类或兽医使用的固体制剂以及肠胃外和气溶胶制剂。研磨的材料有助于将BEA悬浮在水和赋形剂中，并有助于与固体或固体赋形剂混合。

虽然可以将BEA作为纯化合物施用于主体，但通常以固体制剂形式提供。制剂通常用于制备单位剂量，例如包含约10-1000mg或通常约25-400mg的BEA的、用于口服、颊或舌下施用的片剂、胶囊剂或锭剂。或者，实施例包括用于肠胃外(例如，皮下、真皮下、肌内、腹膜内)和气溶胶施用的液体产品。用于肠胃外和气溶胶施用的此类产品典型地包含浓度为约10-170mg/mL，通常为约20-110mg/mL或约30-100mg/mL的BEA，以及任选的盐、缓冲液或抑菌剂或防腐剂(例如，NaCl、BHA、BHT或EDTA)中的一种或多种。

通常，存在于本发明的组合物和制剂中的式I化合物是在水中与赋形剂的悬浮液。然而，在一些实施例中，例如瞬态组合物，将式I化合物与赋形剂一起悬浮在水中，然后冻干以产生可在水中分散的干燥的组合物。

适用于将式I化合物肠胃外递送给人类或动物的本发明的组合物和制剂典型地包含两种、三种或更多种赋形剂。示例性实施例包括(1)丙二醇、PEG200、PEG300、乙醇和苯甲酸苄酯中的任何两种、三种或四种；和(2)丙二醇、PEG100、PEG200、PEG300、PEG400和苯甲酸苄酯中的任何两种、三种或四种。

R包括通常在生理条件下能够化学和/或酶水解的部分，例如酯、硫酯、碳酸酯、氨基酸、肽和/或氨基甲酸酯。此类部分是独立选择的。典型地，这些部分在类固醇核的R位置上将产生-OH。式I化合物的实施例包括其中R是能够水解的部分(例如，酯、硫酯、碳酸酯、氨基酸、肽或氨基甲酸酯)的实施例。

关于代谢物，本文所述化合物的体内代谢物也落入本发明范围内，在一定程度上，此类产物是新颖的并且相对于现有技术是非显而易见的。此类产物可以例如由于酶或化学过程由所施用的式I化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等产生。因此，本发明包括通过包括以下的方法产生的新颖且非显而易见的化合物：使本发明化合物与主体例如人类、啮齿动物或灵长类动物接触足以产生其代谢产物的时间段。此类产物典型地通过以下来鉴定：制备放射性标记的(例如，¹⁴C、³H、¹³¹I、³²p、³⁵S或⁹⁹Tc)本发明化合物，将其以可检测剂量(例如，大于约0.5mg/kg)肠胃外施用于动物诸如大鼠、小鼠、豚鼠、灵长类动物或人类，使代谢发生足够的时间(典型地，约30秒至30小时)，并从尿、血液或其它生物样品中分离其转化产物。这些产物易于分离，因为它们被标记(其它产物通过使用能够结合在代谢物中存活的表位的抗体来分离)。代谢物结构以常规方式确定，例如通过MS、HPLC或NMR分析确定。通常，代谢物的分析以与本领域技术人员熟知的常规药物代谢研究相同的方式进行。转化产物，只要它们不是在体内以其它方式发现的，都可用于诊断测定中以用于本发明化合物的治疗性给药，即使它们本身不具有治疗活性。

本发明提供了制剂和用于制备制剂的组合物。尽管有可能将活性成分单独施用，但通常以药物制剂形式提供。用于兽医和用于人类使用的本发明制剂包含至少一种活性成分，即式I化合物，与一种或多种其可接受的赋形剂，以及任选地其它治疗成分。

本发明的另一方面涉及包含一种或多种药用的赋形剂或载体的组合物。一种或多种式I化合物(也称为“一种或多种活性成分”)通过适合于待治疗病况的任何途径施用。水性悬浮液制剂和其它式I化合物制剂的合适途径包括口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌内、真皮内、鞘内和硬膜外)和气溶胶。通常，水性悬浮液制剂通过肠胃外途径递送。在其它实施例中，诸如本发明的间歇给药方法，式I化合物可以作为水性悬浮液制剂，作为干燥固体制剂(为口服、局部或肠胃外制剂)存在。应当理解，优选的途径可以随例如主体的病理状况或体重或主体对使用式I化合物的疗法或适合于情形的其它疗法的反应而变化。

制剂包括适合于前述施用途径的那些制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。其技术、赋形剂和制剂通常可在例如《雷明登氏药学全书(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版有限公司(Mack Publishing Co.)，1985年，第17版，Nema等人，《PDA药学科学与技术杂志(PDAJ.Pharm.Sci.Tech.)》1997 51：166-171中找到。制备本发明制剂的方法包括使活性成分与赋形剂结合的步骤。通常通过使活性成分与液体赋形剂或细分的固体赋形剂或两者均匀而紧密地结合在一起，然后，如果合适的话，使产品成型来制备制剂。

适于口服施用的本发明制剂被制备成离散的单位，诸如胶囊、扁囊或片剂，其各自含有预定量的活性成分；粉剂或颗粒；在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分也可以以大丸剂、药糖剂或糊剂存在。

片剂通过压制或模望，任选地与一种或多种辅助成分一起制备。压制片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式的活性成分诸如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状活性成分的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且任选地被配制以使活性成分从其中缓慢或受控释放。

适于局部施用于眼睛的制剂还包括滴眼剂，其中活性成分悬浮于合适的赋形剂中，尤其是在接近中性的pH值，例如约pH 6-8下包含一个或多个电荷的活性成分的水性溶剂。活性成分在此类制剂中的浓度典型地为约0.5-20％w/w，典型地为约1-10％w/w，经常为约2-5％w/w。

适于在口腔中局部施用的制剂包括在调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中含有活性成分的锭剂；包含在惰性基质诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分的糖果锭剂；以及包含在合适的液体赋形剂中的活性成分的漱口剂。

直肠施用的制剂可以作为具有合适基质(包络例如可可脂或水杨酸盐)的栓剂存在。

适于肺内或鼻施用的制剂具有例如0.01至500微米范围内的粒度(包括0.01至500微米范围内的平均粒度，增量为0.1微米或其它增量，例如0.05、0.1、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、20、25、30、35、50、75、100等微米)，其通过鼻道快速吸入或通过口吸入施用以到达肺泡小囊。合适的微粉化制剂包括活性成分的水性或油性溶液或悬浮液。适用于气溶胶、干粉或片剂施用的制剂可以根据常规方法制备，并且可以与其它治疗剂例诸如迄今为止用于治疗或预防如本文所述的病毒或其它感染的化合物一起递送。此类制剂可以例如口服、肠胃外(i.v.、i.m.、s.c.)、局部、气溶胶或通过颊途径施用。

适用于阴道施用的制剂可以作为阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂存在，该制剂除了活性成分外，还含有本领域已知的合适的赋形剂。

适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，从而使制剂与预期接受者的血液等渗；和水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。

制剂存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在临使用前添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。由上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射液和悬浮液。单位剂量制剂是含有如本文所述的活性成分的日剂量或单位日亚剂量或其适当部分的那些。

应当理解，除了上述特别提到的成分之外，本发明制剂可以包括本领域常规的与所讨论的制剂类型有关的其它试剂或赋形剂，例如适于口服施用的那些可以包括调味剂。

本发明进一步提供了兽医组合物，其包含至少一种如上所定义的活性成分与用于其的兽医赋形剂。兽医赋形剂是可用于施用组合物的材料，并且可以是固体、液体或气体材料，该材料在兽医领域是惰性的或可接受的并且与活性成分相容。这些兽医组合物可以口服、肠胃外或通过任何其它所需途径施用。

本发明的制剂包括含有一种或多种活性成分的控释药物制剂(“控释制剂”)，其中活性成分的释放受到控制和调节以允许较少的给药频率或改善给定活性成分的药代动力学或毒性分布。

活性成分的有效剂量至少取决于所治疗病况的性质、毒性、化合物是预防性使用(较低剂量)还是针对活跃的感染或病况、递送方法和药物制剂，并且将由临床医生使用常规剂量递增研究确定。可以预期为每天约0.05至约30mg/kg体重。例如，对于局部递送，约70kg体重的成年人的每日候选剂量将在约1mg至约500mg的范围内，通常在约5mg至约40mg，并且可以采取单或多剂量或施用部位的形式。

实施例包括包含脂质体或脂质复合物的制剂，该脂质体或脂质复合物包含式I化合物，例如BEA或其酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基酸或肽。此类制剂根据已知方法制备，例如美国专利第4,427,649、5,043,165、5,714,163、5,744,158、5,783,211、5,795,589、5,795,987、5,798,348、5,811,118、5,820,848、5,834,016和5,882,678号。脂质体任选地含有另外的治疗剂，例如两性霉素B、顺铂、阿霉素、蛋白酶抑制剂、核苷或核苷酸类似物，诸如本文提及的那些之一。包含脂质体的制剂可以通过任何标准途径例如口服、气溶胶或肠胃外(例如，s.c.、i.v.或i.m.)递送给主体。

治疗应用。式I化合物或通过体内水解或代谢从这些化合物产生的生物活性物质具有许多临床和非临床应用。化合物通常可用于增强Th1免疫应答或降低Th2免疫应答。如本文所用，提及Th1或Th2免疫应答是指通常在哺乳动物中观察到的此类应答，而不是在衍生Th1和Th2术语的鼠类系统中观察到的此类应答。因此，在人类中，Th1细胞优先显示趋化因子受体CXCR3和CCR5，而Th2细胞优先表达CCR4分子和较少量的CCR3分子。

式I化合物的其它用途包括向患有病理状况的主体施用化合物。治疗可以治疗或改善与病理状况相关的病况和/或症状的来源，诸如病原体(病毒、细菌、真菌)感染、恶性肿瘤、不需要的免疫应答，即引起病理和/或症状的免疫应答，例如自身免疫性病况或过敏或病况诸如增殖低下病况，例如正常或受损的组织生长，或伤口愈合或伤烧愈合，或在免疫抑制条件下，例如特征在于没有期望的应答和/或期望的应答程度不足的病况。

许多癌症或恶性肿瘤与不需要的Th2免疫应答或缺乏Th1应答相关。Th1免疫应答不足可能在帮助恶性细胞逃脱免疫监视中起作用。这些病况包括非小细胞肺癌、支气管癌、肾细胞癌症或癌、淋巴瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺或胃腺癌、人乳头瘤病毒相关的宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌、肝癌和皮肤T细胞淋巴瘤(霉菌病、Sezary综合征)。

在一些实施例中，主体的过度增殖或恶性病况可能与一种或多种病原体相关。例如，与HCV或HBV相关的肝细胞癌、与HIV-1或HIV-2相关的卡波西肉瘤、与HTLV I相关的T细胞白血病、与EB病毒相关的伯基特淋巴瘤，或乳头状瘤或与乳头瘤病毒相关的癌(HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 45)或与幽门螺杆菌感染相关的胃腺癌或胃MALT淋巴瘤。在其它实施例中，将式I化合物施用于患有过度增殖病况的主体，该过度增殖病况似乎与病原体无关，例如黑色素瘤或在喉、食道、胃、肠、结肠、卵巢、肺、乳房或中枢神经系统中产生的癌症或前期癌。

在一个示例性的实施例中，患有黑色素瘤或黑色素瘤前体病变的人类患者用含有2-20％BEA(w/w)的局部乳膏制剂治疗。将乳膏应用于原发性痣(发育不良的痣或普通后天性痣)、原发性皮肤黑色素瘤、继发性皮肤黑色素瘤和痣或黑色素瘤周围的皮肤。在实际应用时，在施用乳膏之前，用肥皂清洗待治疗的区域或用醇(例如，乙醇或异丙醇)擦拭待治疗的区域。根据待治疗的区域的大小，每个待治疗的区或病变每天一次或两次施用约0.1-0.4g乳膏，持续约10-20天。在患者恢复正常活动之前，使乳膏在施用部位静置约15-30分钟。在大多数患者中，痣和黑色素瘤的进展受阻，并且在一些病变中观察到显著的消退。初始治疗后，使用与第一轮治疗所述相同的给药，每隔一天施用制剂，持续至少1-4个月。对于这些患者，根据患者医生的建议并在患者知情同意的情况下，任选开始或继续进行治疗前体病变或黑色素瘤的准标疗法，例如二甲基三氮烯基咪唑甲酰胺或亚硝基脲(例如，BCNU、CCNU)。在通过手术除去肿瘤或前体病变，并且该部位已得到充分治愈的情况下，患者任选地每隔一天在该部位和邻近的周围区域继续使用局部制剂至少1至4个月。在一些实施例中，每天连续施用作为口服组合物或制剂的式I化合物，例如对于本身是新化合物的式I化合物而言。例如，在恶性黑色素瘤的情况下，还任选地使用例如以下实例中描述的制剂来全身施用BEA，以每隔一天递送1-5mg/kg/天，持续约1周至约4个月。

在另一个实施例中，基于M-刺突或M-蛋白的多发性骨髓瘤的小鼠模型已经在临床试验中显示是抗多发性骨髓瘤药物的有效性的预测物。(Chesi，M.等人，(2012))。在本体内模型中，BEA显示M-刺突降低了40％(实例11)，表明BEA在治疗多发性骨髓瘤方面是有效的。

在一些实施例中，式I化合物制剂在体内模型中被证明通过调节先天免疫力来有效治疗TB和MAP相关疾病。

由于BEA对涉及自噬和相互连接的细胞内信号传导途径的基本生物学信号传导途径的作用，它对涉及疾病过程看似不同的一系列疾病产生了有益影响。BEA在恢复对失调的、非生产性炎症的控制的同时，刺激先天免疫力的能力是其功效的关键所在。许多急性和慢性传染性、肿瘤性和特发性慢性炎性疾病与免疫信号传导失调有关，免疫信号传导失调与细胞内和细胞外的自噬受损和信号传导途径失调有关。

在一个实施例中，作为一种激素，BEA在整个宿主中引起不同细胞类型的应答，从而导致免疫网络的“动态稳态”得以恢复。本术语暗示BEA恢复免疫系统正常运行的能力，这由BEA增强先天免疫，下调非生产性炎症，促进Th1细胞介导的免疫过程以及更有效地应答通过模式识别受体(PRR)途径解释的微生物病原相关分子模式(PAMPS)和瘤性危险相关分子模式(DAMPS)威胁的能力来证明。

在另一个实施例中，BEA对作为影响适应性免疫系统下游信号传导的专业抗原呈递细胞的树突细胞和巨噬细胞的影响对其对恢复免疫动态稳态的整体系统作用极为重要。

鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)是一种耐酸染色的小杆状细菌。其与克罗恩病、类风湿性关节炎、布劳综合征、1型糖尿病、桥本甲状腺炎、多发性硬化和结节病有关。其还会在牛和其它反刍动物中引起约内氏病。

在又一个实施例中，BEA可以用于抑制MTB感染的小鼠的细菌增殖并增加TNF-α、IFN-γ和iNOS的表达。参见R.Hernandez-Pando等人(2005)。

在另一个实施例中，BEA不仅可以用于治疗MTB，还可以用于治疗克罗恩病、类风湿性关节炎、布劳综合征、1型糖尿病、桥本甲状腺炎、多发性硬化和结节病以及约内氏病，如在本发明的实例5中描述的用于炎性肠病(IBD)的动物模型中所证实的。

Th1免疫应答不足通常与病毒感染有关。病毒感染可能源于DNA或RNA病毒，例如疱疹病毒、嗜肝DNA病毒、腺病毒、逆转录病毒、囊膜病毒、甲病毒、虫媒病毒、黄病毒、鼻病毒、乳突瘤病毒和/或瘟病毒。如本文所用，逆转录病毒包括人类和动物病毒，例如HIV-1、HIV-2、LAV、人T细胞白血病病毒I(“HTLV I”)、HTLV II、HTLV III、SIV、SHIV、FIV、FeLV。另外可能建立病毒感染的病毒，包括其基因组、进化枝、分离株、毒株等，包括人丙型肝炎病毒(“HCV”)、人乙型肝炎病毒(“HBV”)、人甲型肝炎病毒(“HAV”)、鸭肝炎病毒、土拨鼠肝炎病毒、人(“HPV”，例如HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 45)或动物乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒1(“HSV-1”)、单纯疱疹病毒2(“HSV-2”)、人疱疹病毒6(“HHV-6”)、人疱疹病毒8(“HHV-8”)、登革热病毒(1-4型)、西方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒和牛病毒性腹泻病毒。

其它涉及免疫失衡或过度Th2免疫应答的病况包括自身免疫性疾病，诸如SLE(系统性红斑狼疮)、骨质疏松症、多发性硬化、重症肌无力、格雷夫斯病、螨虫相关的溃疡性皮炎、类风湿性关节炎和骨关节炎。过度Th2免疫应答还与不希望的症状或病理(例如，疲劳、疼痛、发烧或感染发生率增加)有关，即与衰老、过敏和炎性病况有关，该炎性病况为诸如囊性纤维化患者的过敏性支气管肺曲霉病、特应性哮喘、过敏性呼吸道疾病、过敏性鼻炎、特应性皮炎、气道高反应性的上皮下纤维化、慢性鼻窦炎、常年性过敏性鼻炎、克罗恩病(区域性肠炎)、溃疡性结肠炎、炎性肠病、纤维化肺泡炎(肺纤维化)。

与过度Th2免疫应答相关或具有与过度Th2免疫应答一致的症状例如疲劳、疼痛、发烧或感染发生率增加的其它临床适应症是精神分裂症、急性脊髓炎、结节病、烧伤、创伤(例如，骨折、出血、手术)和对异种移植的免疫应答。在至少一部分病况的病理学中，这种共有的潜在的免疫因素使一种药剂有效地用于治疗该病况或治疗与不足的Th1应答或过度Th2应答相关的一种或多种症状。在存在不足的Th1应答或不希望的Th2应答的所有病况中，通过根据本文所述的方法施用有效量的式I化合物，实现改善与该病况相关的一种或多种症状。因此，可以使用本文所述的制剂和施用途径间歇地施用式I化合物。

在一些应用中，式I化合物可以直接和/或间接干扰病原体诸如病毒或寄生虫(疟疾)的复制、发育或细胞间传递。主体临床状况的改善可能源于对感染原或恶性细胞的直接影响。对细胞复制的干扰可能源于对一种或多种寄生虫或被感染细胞用来正常复制或代谢的酶的抑制，例如，葡萄糖6-磷酸脱氢酶，其影响细胞产生NADPH(参见例如，Raineri等人，《生物化学(Biochemistry)》1970 9：2233-2243)。该影响可能有助于一些式I化合物可能具有的细胞抑制作用。细胞酶表达或活性的调节也可干扰病原体例如HIV或疟疾寄生虫的复制或发育，或干扰赘生性细胞的复制或发育，例如抑制血管生成。通常，Th1免疫应答增强也会产生临床改善。

BEA的治疗用途源自其对免疫系统的影响。BEA刺激巨噬细胞的自噬，增强先天免疫，调节非生产性炎症并使免疫应答偏向于Th1应答(IFN-γ，细胞免疫途径)。影响免疫力这些基本方面的能力使其可用于涉及感染和失调的炎症的疾病过程。通常，BEA将可用于治疗创伤、感染(病毒、细菌、原生动物、真菌和蠕虫)、瘤形成、代谢、自身免疫或神经炎性和炎性血管病症。具体适应症包括结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌、衣原体感染、细菌性肺炎、炎性肠病(克罗恩和溃疡性结肠炎)、类风湿关节炎、非酒精性脂肪性肝病、多发性硬化和阿尔茨海默病。基本上，BEA可能对涉及炎症和免疫力失调的任何疾病均有帮助。

相关的实施例包括BEA颗粒和一种或多种适用于人类药物用途或兽医用途的赋形剂。另一个相关的实施例包括用于肠胃外或气溶胶施用的BEA颗粒和一种或多种赋形剂的水性悬浮液制剂和水分散性干燥组合物。BEA粒度范围为0.01μm至100μm，优选地0.05μm至10μm，更优选地0.01μm至5μm。

已知BEA易受亲核攻击，并且16α-溴被亲核试剂取代。(Numazawa，M.等人，“1616α-17-酮类固醇的立体选择性水解及其对16α-溴-17-酮和2a-溴-3-酮的水解的远距离取代作用”1985，《类固醇》，45(5)，403-10)。

还已知BEA在16位发生差向异构，并在水的存在下失去手性纯度。(Numazawa，M.等人1982，“相应的16-溴-17-酮的受控碱水解立体定向合成16α-羟基-17-氧代类固醇及其反应机理”，《有机化学杂志(J.Org.Chem)》，47(21).4024-4029)。

由于BEA极难溶于水，因此可注射制剂通常制成非水溶液。由于BEA的化学不稳定性和在水的存在下的差向异构化，非水溶液必须非常干燥，并且为了使其更稳定，水含量通常不能大于0.1％。制剂的灭菌、分装和包装必须在低温下进行。这些制剂也必须在低温下保存。(Ahlem，C.等人，US2003060425A1)。

但是，即使水含量极低，制剂仍不稳定，如以下实例2所示。

本发明的制剂是用于肠胃外和气溶胶施用的水性悬浮液。在制备和储存过程中，它使用水作为溶剂。与文献教导相反，对于本BEA的水基悬浮液制剂和水中可分散的干燥组合物的稳定性研究显示它们是稳定的(如以下实例2所示)。

由于使用了有机溶剂，非水性BEA制剂会引起更严重的疼痛和注射部位刺激。注射后，药物物质(BEA)立即从溶液中沉淀出来。组织中产生的BEA固体也会导致严重的疼痛和注射部位刺激。参见Stickney D.R.等人(2007)；Reading C.等人(2006)；Frincke J.M.等人(2007)；Ahlem，C.等人，US2003060425A1。

在US2003060425A1实施例1中报道的非水性制剂的稳定性测试中，发现，当存在水时，即使仅存在0.1％水，它也不稳定并且容易降解。本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂和水中可分散的干燥组合物在制备和储存过程中使用水作为溶剂代替非水性溶剂。尽管水含量高(＞90％)，但仍显示出值得注意的稳定性，如本发明的实例2所示。

与报道的US2003060425A1的非水性制剂相比，本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂不会引起注射部位刺激并且被身体很好地吸收。它显著减少患者的疼痛并改善患者依从性。它也消除或减少了对组织的损伤，这对于长期使用极为重要，如本发明的实例4所示。

在DSS诱导的大鼠结肠炎模型中，本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂显示出优异的功效，没有明显的毒性。它显著减少了有血便的动物的数量，并增加了因为疾病而缩短的结肠的长度。用本制剂的治疗组的体重没有明显减少。与地塞米松的标准疗法相比，它具有更好的功效，毒性更小。血液化学分析显示，本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂显著减少了白细胞的数量，这表明该测试药物对炎症的治疗有效。它显著增加了巨噬细胞的细胞计数，表明该测试药物对免疫缺陷有效。它显著减少了IL-6水平并改善了IL-6/TNF-α水平，表明Th1应答的增强和Th2应答的抑制，这意味着免疫环境得到改善。免疫器官重量分析显示，本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂对胸腺萎缩没有任何影响，但是显著抑制了脾脏的肿大，这表明该测试药物对炎症的治疗有效，如本发明的实例5所示。

初步的犬PK研究表明，本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂比报道的非水性制剂具有更高的血液BEA暴露和更长的半衰期，表明其具有更好的性能和生物利用度，如本发明实例6所示。

在体外研究中，本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂改善了巨噬细胞杀死细菌的能力并显著减少了细胞内活细菌的数量，如本发明的实例7所示。

在小鼠结核分枝杆菌模型中的平行功效研究中，本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂耐受良好，并且显示出与报道的非水性制剂相同或更好的体内治疗功效。应当注意，气溶胶施用(气管内)比肠胃外施用(皮下)具有更好的效果，如本发明的实例8所示。

总体而言，本发明的BEA颗粒的水性悬浮液制剂和水中可分散的干燥组合物在水中具有异常和出乎意料的稳定性。它可以在室温下保存。它显著改善了诸如PK的性能。它不引起或很少引起注射部位刺激。与报道的非水性制剂相比，它在体内和体外也展示出更好的功效。结果表明它作为免疫调节剂起作用。它增强了Th1应答并减少Th2应答。它刺激巨噬细胞。它显示出抗炎特性。它改善了先天免疫并减轻了免疫缺陷。

在本发明的一个实施例中，式I化合物的水性悬浮液制剂和水中可分散的干燥可注射组合物包含水。在本发明的另一个实施例中，BEA的水性悬浮液制剂和水中可分散的干燥可注射组合物包含水。本发明的一个实施例提供了BEA颗粒的水性悬浮液制剂和水分散性干燥可注射组合物。特征是这些组合物和制剂含有：

(a)BEA颗粒：在本发明中，BEA颗粒的90％小于15μm；优选地90％的颗粒小于10μm，更优选地90％的颗粒小于5μm。

(b)表面活性剂：组合物的表面活性剂是泊洛沙姆、聚山梨酯、聚氧乙烯蓖麻油，聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇(PEG)-8-辛酸/癸酸和聚乙二醇(PEG)羟基硬脂酸酯、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、油酸钠和胆汁盐中的一种或几种的混合物质。优选泊洛沙姆、聚山梨酯、聚乙二醇(PEG)羟基硬脂酸酯。

(c)悬浮剂：悬浮剂是纤维素衍生物诸如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、藻酸盐、阿拉伯胶、黄蓍胶、黄原胶、膨润土、卡波姆、角叉菜胶或其混合物中的一种或几种的混合物质。

(d)其它药物赋形剂：该组合物还可含有其它药物赋形剂，例如注射用水、pH调节剂、渗透压调节剂、冻干保护添加剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、一种或多种其它药物成分。

优选地，渗透压调节剂可以是葡萄糖、蔗糖、海藻糖、果糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油和氯化钠中的一种或多种；冻干保护添加剂可以是葡萄糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、果糖、甘氨酸和白蛋白中的一种或多种；pH调节剂可以是氢氧化钠、盐酸、磷酸、乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、乳酸、氨基酸及其盐中的一种或多种；螯合剂可以是乙二胺四乙酸及其盐中的一种或多种；抗氧化剂可以是与叔丁醇、苯酚、甲酚和苯甲酸盐交联的乙二胺四乙酸盐、苄醇、对羟基苯甲酸酯中；防腐剂可以是维生素C、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠和其它氨基酸l-半胱氨酸。

该组合物可以用于注射，优选地肌内或皮下注射，并且更优选地肌内注射。该组合物也可用于气溶胶施用。单剂量或多剂量类型是该组合物的常用类型；其单剂量通常含有3-500mg的DEA，优选10-200mg。可以将组合物制备成注射或冻干制剂，并且后者是优选的。

该组合物的可注射悬浮液含有0.3-25％(w/v)的BEA，0.01-5％(w/v)的表面活性剂，优选地0.1-1％(w/v)；0.01-3％(w/v)的悬浮剂，优选地0.05-0.8％(w/v)；它还含有渗透压调节剂，优选地氯化钠或右旋糖。

该组合物的冻干制剂在用无菌注射用水稀释后可以用于临床，其含有3-500mg的BEA颗粒，优选地10-200mg。BEA颗粒和表面活性剂的比例为1:50-500:1，优选地1:5-100:1。BEA颗粒和悬浮剂的比例为0.1:10-500:1，优选地1:5-100:1。该组合物至少含有一种冻干保护剂。

本发明还提供了制备组合物的三种方法。第一种方法具有以下步骤：(a)将BEA溶解在适量的溶剂中，添加水，使其重结晶，然后除去溶剂；(b)通过将每种赋形剂溶解在水中来制备赋形剂溶液；(c)将重结晶的BEA分散在赋形剂溶液中；(d)在高压下均质化；以及(e)填充和密封；或填充、冻干和密封。

第二种方法具有以下步骤：(a)通过将每种赋形剂溶解在水中来制备赋形剂溶液；(b)将BEA分散在赋形剂溶液中；(c)在高压下均质化；以及(d)填充和密封；或填充、冻干和密封。

第三种方法具有以下步骤：(a)通过将每种赋形剂溶解在水中来制备赋形剂溶液；(b)将BEA颗粒分散在赋形剂溶液中并连续混合直至其被充分润湿；(c)填充和密封；或填充、冻干和密封。

实例1.制剂和组合物的制备

提供以下制剂/组合物以解释本发明，并描述用于制备含有16α-溴-3β-羟基-5α-雄甾烷-17-酮或其水合物(BEA)的可注射制剂和组合物的材料和方法。所述制剂/组合物决不应解释为限定本发明的范围。

用2种方法制备BEA颗粒。在第一种方法中，将500g BEA半水合物溶解在10L无水乙醇中；在搅拌的同时向溶液中添加40L水；沉淀出白色粉末，过滤，用水洗涤并干燥，以得到BEA颗粒I(467g)。在第二种方法中，将100g BEA半水合物用喷射研磨微粉机微粉化两次，以得到BEA颗粒II(87g)。

组合物1的制剂(100个小瓶)：

制备方法：向其中添加赋形剂以溶于70mL水中，并将溶液的pH调节至约7；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物2的制剂(100个小瓶)：

组合物3的制剂(100个小瓶)：

组合物4的制剂(100个小瓶)：

制备方法：向其中添加赋形剂以溶于70mL水中，并将溶液的pH调节至约7；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物5的制剂(100个小瓶)：

组合物6的制剂(100个小瓶)：

组合物7的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中，并用HCl将溶液的pH调节至约7；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质4次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物8的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约160mL水中；在搅拌下将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至200mL；将溶液(2mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物9的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约80mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质4次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物10的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约80mL水中；在搅拌下将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；将溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物11的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约80mL水中，并用NaOH和HCl将溶液的pH调节至约5；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质4次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物12的制剂(100个小瓶)：

组合物13的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物14的制剂(100个小瓶)：

组合物15的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约150mL水中；在搅拌下将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至200mL；将溶液(2mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

制剂/组合物16(100个小瓶)：

制剂/组合物17(100个小瓶)：

组合物18的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约80mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在800巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物19的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约80mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在400巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后冻干。

组合物20的制剂(100个小瓶)：

组合物21的制剂(100个小瓶)：

组合物22的制剂(100个小瓶)：

组合物23的制剂(100个小瓶)：

组合物24的制剂(100个小瓶)：

组合物25的制剂(100个小瓶)：

组合物26的制剂(100个小瓶)：

组合物27的制剂(100个小瓶)：

组合物28的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中，并用HCl将溶液的pH调节至约7；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质4次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物29的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约160mL水中；在搅拌下将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至200mL；将溶液(2mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物30的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约80mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质4次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物31的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中；在搅拌下将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；将溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物32的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中，并用NaOH和HCl将溶液的pH调节至约5；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质4次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物33的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约80mL水中；在搅拌下将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；将溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物34的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在121℃下消毒8分钟。

组合物35的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒25分钟。

组合物36的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约150mL水中；在搅拌下将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至200mL；将溶液(2mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物37的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在600巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物38的制剂(100个小瓶)：

组合物39的制剂(100个小瓶)：

组合物40的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约80mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在400巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物41的制剂(100个小瓶)：

组合物42的制剂(100个小瓶)：

组合物43的制剂(100个小瓶)：

组合物44的制剂(100个小瓶)：

组合物45的制剂(100个小瓶)：

组合物46的制剂(100个小瓶)：

制备方法：将赋形剂溶于约70mL水中，并用NaOH将溶液的pH调节至约6；将BEA颗粒I分散在所得溶液中，然后添加水以将总体积调节至100mL；用高压均质机在800巴的压力下将溶液均质2次。并将所得的制备溶液(1mL)分别填充入安瓿中，然后在密封后在117℃下消毒30分钟。

组合物47的制剂(100个小瓶)：

组合物48的制剂(100个小瓶)：

实例2.制剂和组合物的稳定性测试

分别将本发明的组合物1-6的制剂和US20030060425A1的实例1的制剂在60℃下储存10天，在40℃±2℃，相对湿度75％±5％下储存30天。取制剂样品分析其BEA和相关物质(降解产物)的浓度。

分析条件如下：HPLC的色谱条件：高效液相色谱仪：Waters-e2685；流动相：乙腈-水(60/40)；色谱柱：C18，4.6×250mm；

检测器：UV；波长：210nm；样品量：20μl；流速：1.2ml/min；柱温：室温。

BEA含量的测定：制备参考物质(BEA标准)的储备溶液，并用流动相稀释以制备标准溶液。分析溶液以制作标准曲线。将样品溶解并用流动相稀释，以使BEA浓度为约1mg/mL。然后分析样品，并基于外标曲线计算BEA的浓度。

相关物质(降解产物)的确定：根据BEA含量测定中所述的方法制备测试溶液。分析溶液，并基于它们相对于BEA的相对浓度计算相关物质的含量。

表2-1.本发明制剂/组合物和现有制剂的稳定性

结果表明，本发明的制剂/组合物1-6的稳定性显著好于WO2000056757A1的实例1。表2-2总结了3种类型制剂的降解程度。

表2-2.降解研究中本发明与公开制剂之间BEA损失的比较

如表2-2所示，对于水分散性BEA组合物，在60℃10天和40℃30天的情况下，BEA的平均变化(组合物/制剂1-3)为0.1％和-1.5％。水性BEA制剂(组合物/制剂4-6)的变化分别为0.7％和1.4％。与之相比，在相同的研究中，非水性BEA制剂(实例1，WO2000056757A1)中BEA的损失为51％和55.7％，比本发明的组合物/制剂差34-428倍。

实例3.颗粒尺寸的确定

根据表3-1中的制剂和组合物1的制剂中描述的方法制备样品，使用CremophorEL、卵磷脂、油酸钠作为表面活性剂(100个小瓶，1mL/小瓶，冻干)。

表3-1.制剂

本发明的组合物1-6的制剂和组合物a-c的比较制剂(组合物1-3的制剂和组合物的比较制剂的冻干可注射组合物)中的每个样品取一滴并根据需要加水悬浮，然后通过显微镜观察，检测到三个显微视野。

表3-2.本发明制剂/组合物的粒度

粒度结果表明制剂/组合物1-6没有明显颗粒团聚，90％的颗粒小于15μm。使用泊洛沙姆作为表面活性剂的样品具有最小的粒度，而在所有的比较制剂/组合物中均发生了颗粒团聚。

实例4.注射部位刺激测试

根据表4-1中的制剂和实例1中组合物4的制剂所述的方法制备样品，它们分别含有6％泊洛沙姆、2％Twain 80和6％聚氧乙烯羟基硬脂酸酯(100mL)。

表4-1.制剂

将153只健康兔子随机分成51组，每组3只兔子。将兔子固定，并将其两侧四头肌上的毛发剃掉。用碘酒和酒精消毒肌肉后，给每只兔子左腿上的四头肌注射1mL测试溶液，并且给右腿上的四头肌注射生理盐水作为对照。注射48小时后处死所有兔子。切除四头肌并分析注射部位刺激(充血、水肿、硬结、变性或坏死)。反应顺序根据表4-2指定。

表4-2.反应顺序

一般情况下，如果兔子的反应得分低于2，则该制剂可用于肌肉内注射，如果兔子的反应得分超过3，则该制剂不能用于肌肉内注射；此外，如果平均反应得分在2与3之间，则可以进行重复测试或考虑其它指标。表4-3显示了反应得分。

表4-3.本发明制剂/组合物和现有制剂引起的注射部位刺激的反应得分

结果表明，本发明的组合物1-48制剂中获得的制剂的注射部位刺激显著低于WO2000056757A1的实例1的注射部位刺激，并且比较制剂/组合物d-f获得的制剂的刺激高于本发明的制剂/组合物的刺激。

实例5.BEA在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中的作用

实验动物：72只ICR小鼠，雄性和雌性，开始实验前的体重为25-29g。

分组：将实验动物随机分成6组，每组12只小鼠：生理盐水组；本发明的制剂/组合物1中获得的BEA的高剂量组(40mg/kg)、中剂量组(20mg/kg)、低剂量组(10mg/kg)；地塞米松(0.1mg/kg)；DSS模型组。

模型复制：给实验小鼠注射3％DSS，并常规地用水喂养7天，重复结肠炎模型。

药物施用：在注射DSS的同一天给小鼠注射测试药物。

实验动物管理：每天观察全身情况，便溏和血便。

在注射药物后3天测试粪便潜血。在第7天进行血液测试，计数巨噬细胞并测定其IL-6和TNF-α。观察到它们的炎症和溃疡水平。取结肠内容物涂片，染色，然后测定G+/G-。取胸腺、脾脏、肝脏进行称重，并计算器官指数。将结肠切片送去病理检查。结果如表5-1所示：

表5-1.BEA对DSS诱导的结肠炎小鼠的影响

*P＜0.01与对照；**P＜0.05与模型；***P＜0.05与初始重量；Dex：地塞米松；对照：生理盐水；模型：喂水DSS

结果的解释：

1.初始重量表示分组时动物的重量。在不同的组之间没有显著差异。在注射测试药物后7天，除了对照组外，所有实验动物的重量都趋于下降。地塞米松组中动物的重量降低，而BEA组中动物的重量没有显著变化。

2.粪便潜血测试：粪便潜血是指消化道内的轻微出血，红细胞被消化和破坏，并且粪便外观没有异常变化。第三天每组均出现粪便潜血动物。

3.有血便的动物：在解剖期间仔细观察结肠内容物并记录内容物中可见的新鲜血液。

4.结肠长度：与对照组相比，模型组中动物的结肠长度明显缩短。DEX和高剂量BEA治疗是有效的。中等剂量比低剂量有效得多。

表5-2 BEA对患有DSS诱导的结肠炎小鼠中的白细胞计数、腹部巨噬细胞计数、IL-6水平和TNF-α水平的影响(平均值±SD，n＝12)

^*P＜0.05，^**P＜0.01与对照，#P＜0.05与模型

结果的解释：

1.血细胞计数：模型组动物的白细胞计数明显增加，而治疗组中增加的白细胞计数显著减少，这表明测试药物对治疗炎症有效。

2.巨噬细胞计数：模型组动物的腹部巨噬细胞计数明显降低，但在BEA组的中剂量中显著增加，这表明测试药物对免疫缺陷有效。

3.细胞因子：DSS模型组中Th2细胞因子计数更高。IL-6水平的显著下降和IL-6/TNF-α水平的改善表明免疫环境的改善。

表5-3 BEA对DSS诱导的结肠炎ICR小鼠的免疫器官重量的影响(平均值±SD，n＝12)

^**P＜0.01与对照；^*P＜0.05与模型

结果的解释：胸腺萎缩和脾脏肿大表明炎性反应。模型组小鼠胸腺趋于萎缩但不显著。与对照组相比，模型组小鼠脾脏肿大显著。DEX显著促进胸腺萎缩和脾脏肿大。BEA对胸腺萎缩没有影响，同时抑制了脾脏肿大，这表明该测试药物对炎症的治疗是有效的。

进一步地，实例中炎性肠病(IBD)的动物模型证实BEA可用于治疗MAP-相关疾病，包括克罗恩病(CD)、类风湿性关节炎(RA)、布劳综合征、1型糖尿病、桥本甲状腺炎、多发性硬化、结节病和约内氏病。BEA在DSS诱导的小鼠结肠炎模型(IBD模型)中的影响的实例证明，本发明的BEA水性制剂比地塞米松(标准治疗和阳性对照)更有效。因为RA和CD具有相同的病因，并用相同的药物治疗，所以预测可通过抑制MAP而有效治疗CD的药物也应该对RA有效是合理的。由于BEA在CD动物模型中有效，所以它应该在治疗RA中有效。因此，BEA可以用于治疗CD和RA。

实例6.不同制剂中BEA的比较犬PK研究

在实验中比较了根据文献(WO2000056757A1的实例1)和本发明(实例1中组合物1的制剂)制备的BEA制剂的犬PK。

将九(9)只雄性比格犬(体重：11-13kg)分成3组，每组3只犬。第一组肌内给予5mg/kg本发明实例1的组合物1的制剂。第二组肌内给予5mg/kg WO2000056757A1的实例1。第三组皮下给予5mg/kg WO2000056757A1的实例1。在0.33、0.67、1、1.5、2、4、6、8、16、24小时、2、3、4、5、6、7天采集血液。通过LC-MS/MS处理和分析样品以测量BEA血液浓度。

如图1所示，结果表明，与WO2000056757A1的实例1的制剂的BEA相比，本发明实例1的组合物1制剂的BEA具有更好的血液暴露。

实例7.BEA制剂对巨噬细胞的体外影响

用结核分枝杆菌参考菌株H37Rv感染人巨噬细胞系，MOI 1至5(每1个巨噬细胞5个细菌)，并与两种不同浓度(5或6M)的7OH-DHEA、天然DHEA、WO2000056757A1的实例1制剂(F1)的BEA以及本发明制剂实例1中组合物1的制剂(F2)的BEA以及姜黄素一起孵育。

1小时(D0)、24小时(1D)和4天(4D)后，洗去胞外细菌，将巨噬细胞裂解并铺板，以确定胞内活杆菌的数量，D0显示吞噬细胞活性，并用于与对照比较，该对照对应于在没有任何化合物的情况下孵育的感染巨噬细胞，除了5M浓度的F2外，所有DHEA衍生物都相当有效。1和4天后，巨噬细胞杀死杆菌，因此DHEA衍生物产生的活杆菌减少，在第4天5M浓度的F1高度显著，接着是5M的F2。结果示于图2(a)、2(b)和2(c)中。(与对照比较时，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005)。

实例8.本发明BEA制剂在小鼠结核分枝杆菌模型中的影响

已经报道了非水性BEA制剂在小鼠模型中具有抗结核分枝杆菌(Hernandez-Pando，R.等人(2005))。本研究的目的是在平行研究中证明本发明的BEA制剂与现有的非水性BEA制剂一样有效。阳性结果证实本发明的制剂可能对现有制剂所显示的所有适应症有效，例如HIV、疟疾和结核分枝杆菌。

在本实验中，F1是基于文献(WO2000056757A1的实例1)制备的BEA制剂。F2是基于本发明(实例1中的组合物1的制剂)制备的BEA制剂。

用结核分枝杆菌菌株H37Rv气管内感染雄性BALB/c小鼠，并且2个月后用F1(WO2000056757A1的实例1的制剂的BEA)或F2(本发明制剂实例1中组合物1的制剂的BEA)通过皮下(SC)或气管内(IT)途径每隔一天治疗8只动物组，1和2个月后安乐死4只动物组，将右肺均质化并铺于固体生长培养基7H9中，21天后计数菌落数，用福尔马林灌注左肺。两种制剂都具有良好的效果，并且与对照相比，菌落形成单位(CFU)显著降低。治疗2个月优于1个月。使用F1或F2的实验的CFU是类似的。通过气管内途径施用2个月后F2略好。这些结果证明本发明的BEA的水性制剂与现有制剂相比是同等或更有效的。

表8-1.BEA制剂在小鼠MT模型中的影响

实例9.本发明BEA制剂在小鼠哮喘模型中的影响

哮喘是由慢性炎性疾病引起的，并且与肺炎衣原体有关(Black，P.等人，《欧洲呼吸杂志》，15(2)，254-9(2000))。鉴于BEA的抗炎作用，预计BEA在治疗哮喘中应该是有效的。本实验被设计为用小鼠哮喘模型证明BEA的功效。

在本实验中，BEA制剂基于本发明制剂(实例1中组合物1的制剂)制备。

两次腹膜内(IP)施用在1mg氢氧化铝(美国伊利诺伊州罗克福德的赛默飞世尔科技(Thermo Scientific))中乳化的10μg鸡蛋卵清蛋白(OVA，V级；西格玛(Sigma))敏化18只8周龄的BALB/c雄性小鼠，总体积为100μl，间隔5天。然后，一个月后，经由气管内(IT)施用0.75％OVA攻击小鼠。在OVA攻击后一小时，以两种不同的施用途径(气管内和皮下(SC))以0.1mL的注射体积以0.2mg/kg的剂量施用BEA制剂，并且每天一剂持续最多7天。然后，在戊巴比妥麻醉下通过放血使动物安乐死。小鼠的支气管肺泡灌洗(BAL)用于确定炎性细胞的总计数。对照小鼠腹膜内(IP)接受盐溶液。所有实验均根据INCMN墨西哥城法规进行。进行两个独立的实验。

表9-1总结了BEA制剂治疗3天和7天后与对照相比支气管肺泡灌洗液中炎性细胞总数的结果。与接受盐水治疗的小鼠相比，气管内和皮下接受BEA制剂的小鼠的炎性细胞计数明显减少，在第3天分别减少67％和71％，在第7天实现炎性细胞计数减少74％和55％。这些结果表明，BEA制剂可有效治疗哮喘。它们还支持BEA制剂可以有效治疗其它肺炎衣原体相关的慢性疾病的预测。

表9-1治疗后支气管肺泡灌洗液中炎性细胞总数

实例10.BEA制剂对小鼠代谢综合征的影响

本实验是基于Ana María Leal-Díaz，M.等人，“来自大叶龙舌兰的龙舌兰汁浓缩物及其提取的皂苷减轻C57BL6小鼠的肥胖和肝脂肪变性并增加阿克曼氏菌(Aguamielconcentrate from Agave salmiana and its extracted saponins attenuated obesityand hepatic steatosis and increased Akkermansia muciniphila in C57BL6 mice)”，Nature(自然)集团《科学报告(Sci.Rep.)》，6，34242(2016)报道的小鼠代谢综合征模型设计的。

用低热量饮食喂养年轻的BALB/c小鼠(3周龄)。在8周龄时，他们经由IP途径接受了一剂链脲佐菌素(100mg)。8周后，分别经由IT、SC和IT+SC以0.2mg/kg向小鼠施用BEA制剂F1和F2，每周3次，持续8周。IT+SC组接受两次剂量。

在BEA制剂治疗的8周结束时，通过在空腹4小时后经由管饲法向每只小鼠施用100μl的8％葡萄糖溶液进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。葡萄糖施用后0、15、30、60和120分钟从尾静脉采集血液样品。使用梯形法则计算AUC。在同一时间段测量正常血液葡萄糖水平。

图4(a)是用F1制剂治疗的链脲佐菌素诱导的2型糖尿病(DM2)小鼠的OGTT结果。图4(b)是用F2制剂治疗的链脲佐菌素诱导的2型糖尿病(DM2)小鼠的OGTT结果。图4(c)是OGTT的血液葡萄糖的曲线下面积(AUC)。

OGTT结果表明，通过IT和SC途径，F1和F2制剂均可有效提高DM2小鼠的葡萄糖耐量水平。AUC数据还表明基于本发明(实例1中的组合物1的制剂)制备的BEA制剂F2优于基于文献(WO2000056757A1的实例1)制备的BEA制剂F1。

图4(d)是与用媒介物治疗相比，用F1和F2治疗的DM2小鼠的正常葡萄糖水平。结果表明，在F1和F2制剂中，BEA均可使DM2小鼠的血液葡萄糖水平正常化。总体而言，本实验的结果表明本发明制剂的BEA是治疗2型糖尿病的良好候选者。

实例11.在Vk*MYC小鼠中评价BEA抗骨髓瘤活性

实验由亚利桑那州斯科茨代尔梅约诊所综合癌症研究中心(ComprehensiveCancer Center,Mayo Clinic，Scottsdale，AZ)的Marta Chesi博士小组进行。实验细节描述于她的出版物(Chesi，M.等人，2012，基因工程小鼠多发性骨髓瘤模型中的药物反应可预测临床疗效(Drug response in a genetically engineered mouse model of multiplemyeloma is predictive ofclinical efficacy)，《血液为，120(2)，376-385)中。评价了3只Vk*MYC小鼠。在第1-5天，第8-12天，通过I.P.施用途径给予M5645B和M5489D小鼠15和20mg/kg/天BEA制剂。分别在第7天和第14天评估M-刺突值。在第1-5天，第8-12天通过I.M.施用途径给予小鼠M536915mg/kg/天BEA制剂，然后在第15-19天通过I.P.施用途径给予小鼠M536915mg/kg/天BEA制剂。分别在第7、14和21天评估M-刺突值。

如图3所示的结果表明，在Vk*MYC小鼠中，以15mg/kg/天实现体内模型中M-刺突降低40％，这强烈表明BEA制剂对多发性骨髓瘤具有活性。由于实例显示BEA具有抗多发性骨髓瘤的活性，这进一步证明了BEA可以用作癌症免疫治疗剂。

Claims

1.一种化合物，其具有式I的结构

其中n是0-4；

所述溶剂化物是H₂O、C_1-4-OH、C_1-4-OH、C_1-4-COOH、C_1-4-COOC_1-4四氢呋喃、1,4-二噁烷、(CH₃)₂O、(C₂H₅)₂O、HC(O)N(CH₃)₂、(CH₃)₂SO或其组合；

X是F、Cl、Br或I；

R是-H、-Si-(C_1-6烷基)3、酰基、硫酰基、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫缩醛、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基部分、任选取代的杂芳基部分、任选取代的单糖、任选取代的寡糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸或聚合物；并且

所述化合物为无定形、晶体、共晶体、多晶型物、共晶体多晶型物或其组合的形式。

2.根据权利要求1所述的组合物，其包含根据权利要求1所述的化合物和水，

其中所述化合物为颗粒形式，并作为所述颗粒稳定在水中的水性悬浮液中；并且

所述水的含量为所述组合物的至少30％w/w。

3.根据权利要求2所述的水分散性干燥组合物，其中所述水分散性干燥组合物通过冷冻干燥根据权利要求2所述的组合物制备，并且所述水分散性干燥组合物中的所述化合物在储存期间和在使用前用稀释剂重构所述水分散性干燥组合物之后保持稳定。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述颗粒的尺寸在0.01μm至15μm的范围内。

5.根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含表面活性剂、悬浮剂和药物赋形剂。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆、聚山梨酯、聚氧乙烯蓖麻油，聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇(PEG)-8-辛酸/癸酸和聚乙二醇(PEG)羟基硬脂酸酯、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、油酸钠、胆汁盐或其混合物。

7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述悬浮剂是纤维素衍生物，诸如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、藻酸盐、阿拉伯胶、黄蓍胶、黄原胶、膨润土、卡波姆、角叉菜胶或其混合物。

8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述药物赋形剂是注射用水、pH调节剂、渗透压调节剂、冻干保护添加剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、药物成分或其混合物。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述药物赋形剂包含防腐剂，并且所述防腐剂是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇、维生素C、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、L-半胱氨酸、氨基酸或其组合。

10.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物是包含0.3-25％(w/v)的所述化合物，0.01-5％(w/v)的所述表面活性剂，0.01-3％(w/v)的所述悬浮剂和渗透压调节剂的可注射悬浮液。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述渗透压调节剂是氯化钠或右旋糖。

12.根据权利要求3所述的组合物，其中所述组合物是冻干制剂，其包含所述化合物、表面活性剂、悬浮剂和至少一种冻干保护剂，并且所述化合物的量为3mg至500mg，所述化合物与所述表面活性剂的比例为1:50-500:1，并且所述化合物与所述悬浮剂的比例为0.1:10-500:1。

13.根据权利要求2所述的组合物，其中所述溶剂化物是水，R是氢，X是溴，n是0.5，并且所述化合物是具有以下结构的16α-溴-3β-羟基-5α-雄甾烷-17酮半水合物：

14.一种使用根据权利要求2所述的组合物的方法，其包括：

通过肠胃外、口服或气溶胶途径施用向需要治疗的主体施用根据权利要求2所述的组合物。

15.一种使用权利要求2所述的组合物的方法，其包括：

向需要治疗的主体施用治疗有效量的根据权利要求2所述的组合物，其中所述治疗用于在主体中刺激自噬和先天免疫，调节非生产性炎症，使免疫应答偏向于Th1应答(IFN-γ，细胞免疫途径)或Th2应答，病理状况或其组合。

16.使用根据权利要求2所述的组合物的方法，其包括：

向需要治疗的主体施用治疗有效量的根据权利要求2所述的组合物，其中所述治疗用于感染或失调的炎症。

17.使用权利要求16所述的组合物的方法，其中所述治疗用于创伤、感染(病毒、细菌、原生动物、真菌和蠕虫)、瘤形成、代谢、自身免疫或神经炎性和炎性血管病症。

18.使用根据权利要求16所述的组合物的方法，其中所述治疗用于结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌、MAP感染、衣原体感染、细菌性肺炎、炎性肠病(克罗恩和溃疡性结肠炎)、多发性骨髓瘤、哮喘、代谢综合征、2型糖尿病、1型糖尿病、阻塞性肺疾病、创伤、多发性硬化、阿尔茨海默病、心脏结节病、类风湿关节炎或非酒精性脂肪性肝病。